Summary
Burada adrenal bezlerin fareler üzerinden ayırma, dokuları düzeltmek, onları bölüm ve ayirt boyama gerçekleştirmek için bir yöntem mevcut.
Abstract
Ayirt antijenleri dokularda tespiti fluorochrome Birleşik antikorlar istihdam ile köklü bir teknik ve uygulamaları geniş bir yelpazede vardır. Algılama antijenleri karakterizasyonu ve birden çok hücre türü tanımlaması için sağlar. Böbrekler üzerinde bulunan ve mezenkimal hücreler tabakası tarafından Kapsüllü, böbrek üstü bezi endokrin organ farklı Embriyoda kökenleri ile iki farklı dokular, mesonephric ara mesoderm kaynaklı dış korteks ve sinir tarafından oluşan olduğunu iç medulla Crest kaynaklı. Adrenal medulla katekolaminler (Yani, adrenalin, noradrenalin) üretir, ancak adrenal korteks steroidler (Yani, mineralocorticoids, sebepler, cinsiyet hormonları), salgılar. Adrenal araştırma yürütürken, farklı fonksiyonları ile benzersiz hücre ayırt edebilmek önemlidir. Burada bir protokol sağlar bir dizi sıralı adımları böbreküstü bezinin hücre tipleri tanımlamak için ayirt boyama elde etmek için gerekli açıklar bizim laboratuvarda geliştirilmiştir. Biz ilk fare böbreküstü bezlerinin diseksiyon fiksasyon, işleme ve parafin doku gömme takip periadrenal yağ mikroskobik kaldırma odaklanmak. Biz o zaman bir döner microtome ile doku bloklarını kesit tanımlamak. Son olarak, en iyi sinyal sağlamak için non-spesifik antikor bağlama ve autofluorescence en aza indirmek için geliştirdiğimiz böbreküstü bezlerinin immünfloresan boyama için bir protokol ayrıntı.
Introduction
İmmünhistokimya doku bileşenleri belirli hücresel moleküller ve konjuge antikorlar1algılamak için sonraki boyama teknikleri antikor kullanımı ile tespit için bir tekniktir. Bu immunohistokimyasal yordam belirli fiksasyon gerektirir ve spesifik antijen için sık sık ampirik olarak belirlenir dokuların işleme, doku ve antikor kullanılan2. Fiksasyon doku ve böylece sağlam cep ve hücre altı yapıları ve ifade desenleri Bakımı "orijinal" durumunu korumak çok önemlidir. Daha fazla işleme ve yordamlar katıştırma doku immünhistokimya içeren histolojik araştırmalar için kullanılan ince dilimler halinde kesit için hazırlamak için gerekli.
Immunostaining chromogenic veya floresan algılama ile gerçekleştirilebilir. Chromogenic algılama çözünür bir substrat çözünmez bir renkli ürün haline dönüştürmek için sana bir enzim kullanımı gerektirir. Bu enzim (birincil antikor) antijen tanıma antikor Birleşik iken, daha sık birincil antikor (yani, ikincil antikor) tanıma antikor Birleşik. Bu teknik son derece duyarlıdır; enzimatik reaksiyon gelen kaynaklanan renkli ürün photostable ve görüntüleme için sadece aydınlık alan mikroskop gerektirir. Ancak, chromogenic immunostaining devrilmesinden sonra bir renk devrilmesinden sonra diğer bir maske yapabilirsiniz bu yana, ortak yerelleştirmek iki protein görselleştirmek çalışırken uygun olmayabilir. Co boyama söz konusu olduğunda, ayirt daha avantajlı olduğu ispatlanmıştır. Ayirt gelişiyle Albert Coons ve doku antijenleri floresein ile işaretli antikorlar ile tanımlamak ve ultraviyole ışık3altındaki kesitli dokuları onları görselleştirmek için bir sistem geliştiren iş arkadaşları, atfedilir. Floresans algılama uyarma sonra ışık yayan bir fluorophore ile Birleşik bir antikor temel alır. Farklı dalga boylarında, emisyon ile birkaç fluorophores (ile örtüşme) hiç veya çok az olduğundan, bu algılama yöntemi birden çok protein çalışmaları için idealdir.
Böbrek üstü bezi böbrek yer alan ve mezenkimal kapsül tarafından çevrili iki embryologically farklı bileşenleri ile karakterize eşleştirilmiş bir organdır. Süre nöral crest elde edilen iç medulla, adrenalin, noradrenalin ve dopamin gibi katekolaminler üretmek mesonephric ara mesoderm elde edilen dış adrenal korteks steroid hormon salgılıyor. Adrenal korteks farklı sınıflar steroid hormon salgılayan her bölgesi ile üç konsantrik bölgelerde histolojik olarak ve işlevsel olarak ayrılmıştır: elektrolit homeostazı düzenleyen mineralocorticoids dış zona glomerulosa (zG) üretir ve intravasküler hacim; Orta zona fasciculata (zF), doğrudan stres tepkisi plazma glikoz artırmak için enerji depoları seferberlik aracılığıyla arabuluculuk glukokortikoid zG altında salgılar; ve steroid öncüleri (Yani, dehidroepiandrosteron (DHEAS))4sentezler iç zona reticularis (zR), seks.
Adrenokortikal zonation bazı varyasyon türler arasında mevcuttur: Örneğin, Mus musculus zR yoksun. Benzersiz Doğum sonrası X-bölgenin M. musculus acidophilic cytoplasms5küçük lipid-yoksul hücreleri ile karakterize fetal korteks bir kalıntı var. X-bölge ergenlik erkek farelerde ve dişi farelerde ilk gebelik sonrası, kaybolur veya yavaş yavaş değil yetiştirilen kadın6,7' dönüştürdü. Organizasyon periferik kök ve progenitör hücre içinde ve zG bitişik olduğu gibi Ayrıca, tortuosity ve zG sergiler kalınlığı türler arasında varyasyon olarak işaretlenmiş. Rat, aksine diğer kemirgen zG ve zF arasında görünür farklılaşmamış bölge (zU) bir kök hücre bölge ve/veya geçici ataları yükseltecek bir bölge olarak bu işlevleri vardır. ZU fareler için benzersiz olan ya da sadece daha belirgin hücre kümesi düzenlenen bilinmeyen8,9' dur.
Hücreler adrenal korteksin bütün steroid hormonlar10,11habercisi hizmet kolesterol esterleri depolamak lipid damlacıkları içerir. Terim "steroidogenesis" kolesterol üzerinden bir serisi steroidogenic faktörü 1 (SF1), Ifade steroidogenic potansiyel bir belirtecidir etkinlik dahil enzimatik reaksiyonların steroid hormonlarının üretim süreci tanımlar. Böbreküstü bezinde Sf1 ifade sadece korteks12hücrelerde bulunur. İlginç bir çalışma ile steroidogenic potansiyel13adrenokortikal hücrelerde endojen biotin ifade buldum. Daha yüksek bir arka planda biotin/streptavidin tabanlı boyama yöntemleri, endojen biotin streptavidin ile Birleşik antikor tarafından algılanması nedeniyle nedeni olabileceği gibi bu da bu özelliği aynı zamanda steroidogenic ayırt etmek için istihdam olabilir diğer nüfus böbreküstü bezi, Yani, endotel, kapsül ve medulla hücreleri içinde hücrelerden.
Sempatik pregangliyonik nöronlar tarafından innervated, adrenal medulla bazofilik hücreler tarafından epinefrin ve norepinefrin içeren ayrıntılı bir sitoplazma ile karakterizedir. Medulla hücreleri "kromafin" kahverengi pigment oksidasyon14sonrası formu katekolaminler yüksek içerik nedeniyle adlandırılır. Tirozin hidroksilaz (TH) hızı sınırlaması adım katekolaminler sentez ve böbrek üstü bezi tromboksan, medulla15içinde ifade enzimdir.
Burada fare böbreküstü bezleri, parafin ve kesit ve adrenal bölümlerde oluşturan hücresel türlerini belirlemek için boyama ayirt gerçekleştirmek için bir yöntem içinde katıştırma için onların işlem yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut Adrenal korteks ve medulla. Bu iletişim kuralı laboratuarımızda rutin olarak bizim araştırmada kullanılan birden çok antikorlar ile immunostaining için bir standarttır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntemleri kurumsal olarak onaylanmış protokolleri kullanımı ve bakımı hayvanlar Michigan Üniversitesi'nde üniversite Komitesi İKB altında uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. ameliyat için hazırlık
- Ameliyat öncesi günde %4 paraformaldehyde (PFA) hazırlamak / fosfat tamponlu tuz (PBS). Donmuş aliquots durumunda bir çözülme ve 4 ° C'de depolamak için devam
Not: % 4 İngiltere'de yılın daha 48 h için istikrarlı değildir.
Dikkat: PFA zehirlidir, deriyle ve gözle temastan kaçının ve uygun bir kaba atın. - Ameliyat günü, cerrahi aletler makas ve forseps % 70 etanol (alkol) ile sterilize hazırlamak ve bir kağıt havlu kuru bildirin.
- 24-şey plaka dolu yer 1 x PBS ile (1 mL/iyi yeterli) nedense odamızda buz kovası içinde.
Not: Adrenal ameliyattan sonra bu çok iyi kültür yemek tutulacaktır.
2. adrenal diseksiyon
- Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış standart protokolleri takip fare ötenazi. Ötenazi ölüm (örneğin işten çıkarma) sağlamak için ikincil yöntemi gereklidir.
- Ötenazi isoflurane aşırı doz tarafından fare kadar solunum durur isoflurane buharı ile dolu bir odaya koyun, daha sonra fareyi odasından kaldırmak için bir yüzey üzerinde yatıyordu ve servikal çıkığı gerçekleştirin.
Not: Çoğu ötanazi yöntemleri için hayvan sıkıntıya neden ve hipofiz-adrenal eksen ve medüller katekoiamin sürüm aktivasyon karıştırıcı değişken eklemek çünkü stres çalışmaları için uygun değildir. Bu durumda, işten çıkarma benimsemeye önerilen yöntemdir.
- Ötenazi isoflurane aşırı doz tarafından fare kadar solunum durur isoflurane buharı ile dolu bir odaya koyun, daha sonra fareyi odasından kaldırmak için bir yüzey üzerinde yatıyordu ve servikal çıkığı gerçekleştirin.
- Fareyi sırtüstü yatıyordu, karın ve yanları % 70 ile kesi bölgeyi sterilize alkol.
Not: kürk tıraş kısırlık artacak olsa da, bu belirli uygulama için bu gerekli değildir. - Makas kullanarak karın ortasında deriyi kesme, cilt periton ayırmak, fare kesme çevresindeki deri pinching ve iki zıt yönlerde (kaudal ve rostral) çekerek deskin. Sonra karın zarını arka sol ve sağ yanları erişene dek kesti.
- Fare böbreküstü bezi kesme çevreleyen yağ dokusu çevresinde çıkarın ve 1 x PBS ile dolu ve buz üzerinde tutulması 24-multiwell plaka yerleştirin.
3. Peri-böbreküstü yağ kaldırma
- Diseksiyon mikroskop altında böbreküstü temel bir camına yerleştirin veya sahne plaka üzerinde bir petri ışık kaynağı getirin, büyütme oranını seçin ve tüm böbrek üstü açık bir görünümünü elde etmek için odağı ayarlayın.
Not: kullanılan büyütme kişisel tercihlerine bağlı olarak değişebilir. Toplam büyütme 30 X bir planı objektifle 1 X, 3 X zoom ve iyi bir görüş alanı ile tüm bezi görselleştirmek için mercek 10 X sağlar. - Hızlı bir şekilde bitişik yağlı doku böbreküstü susuzluktan kaçınarak iki 25 G iğneler ile kaldırın. Tüm yağ kaldırılmadan önce bu durumda hareket böbreküstü geri kuyunun içine 1-2 min için 1 x PBS içeren ve yağ kaldırma işlemine devam etmek.
- 2 min için 2 x 1 x PBS içinde yıkayın.
4. doku işleme ve katıştırma
- Dokular %4 oranında tamir PFA/PBS 4 ° c 2 h için sallanan bir platformda.
- 4 kaldırmak % PFA ve yıkama 1 x PBS kurcalayarak, 3 x 4 ° C'de 15 dakika her
Dikkat: PFA zehirli ve tehlikeli atık olduğunu; dikkatli kimyasal bir başlık altında ele ve tehlikeli atık konteyner içine atılması gerekir. - Adrenal % 50 kuluçkaya alkol 4 ° c 2 h için sallanan bir platformda.
- Kuluçkaya adrenal % 70 alkol en az 2 h sallanan bir platformda 4 ° C'de.
Not: dokusuyla gömmek için işleme devam değil, adrenal % 70'saklanabilir alkol 4 ° C'de Uzun süreli depolama % 70 kaçınarak alkol ve doku en kısa zamanda işleme devam etmeden daha iyi kaliteli örnekleri verir. - Gazlı bez içinde kaydırma ve kaset gömme bir doku içine alarak işleme doku böbreküstü hazırlamak. Kaset %70 alkol ve mağaza 4 ° C'de doku işlemci taşımak için hazır kadar dolu bir kavanoz yerleştirin. Tablo 1 ' de rapor olarak programlanmış doku işlemci kaset takın ve çalıştırın.
- Kaset 65 ° C'de erimiş parafin ile dolu bir gömme istasyonu içine transfer Bir soğutma istasyonu yoksa, yanında soğuk soğutma tepsisi getirin.
- Gömme bir kalıp etiket ve kaset katıştırma doku açın. Forseps bir çift kullanarak, gazlı bez paketini açmak ve böbreküstü istenen konumda merkezi tabanının gömme kalıp yavaşça yerleştirin. Erimiş parafin böbreküstü dökün. Gerekirse, başka türlü kalıp kalıp içinde hareket edebilir konumunu güvenli forseps ile böbreküstü tutun.
- Yavaşça gömme kalıp soğutma tepsisi taşımak ve parafin sertleştirme kadar bekleyin. Bundan sonra kesit kolaylaştırmak için gömme kalıpları bir serin yerde muhafaza ediniz.
5. bir döner Microtome ile kesit
- Başlamadan önce microtome temiz olup olmadığını kontrol edin, uzakta tüm atılan parafin artıkları fırça, bıçak (ya da bıçak) bilenmiş 's sağlamak, iç mekanizması petrol ve tam blok tutucu gerekirse geri çek.
- Mikroskop slaytlar bir dizi etiket (olumlu kullanılıyorsa veya doku kaybını önlemek için kaplı ( Tablo malzemelerigörmek)), bir slayt daha sıcak grubu 37 ° C'de onları yatıyordu ve autoclaved tip 1 Ultrasaf Su üstünde tepe-in her slayt dağıtmak.
- Bölüm kalınlığı 5 mikron ayarla.
- Microtome bıçak bıçak tutucu Ekle, bıçak açısını kontrol, bıçak yuvasına sıkıca güvenliğini sağlayın ve parafin blok ve blok tutucu Gümrükleme kontrol edin.
- Blok sahibi en yüksek konumuna getirin ve, eğer olanaklı, çalışma kolu kilitlemek, parafin blok kalıptan çıkarın ve sıkıca kelepçe ile güvenli hale getirme bloğu tutucusuna yerleştirin. Bıçak merkezi hattı ile sokağın karşı karşıya olduğu yüzey açısı 20 ° olmalıdır. Gerekirse, parafin blok yeniden ayarlayabilirsiniz.
Dikkat: Bıçak keskin. - Daha önce kilitli el tekerlek kaldırın ve yüzünü microtome bıçak kenar ile düzey olana parafin blok daha düşük. Düzenli bir ritim ile el tekerleğini döndürün. İlk düzeltme parafin kaldırmak ve adrenal ortaya çıkarmak için gerçekleştirin.
- El tekerlek dönme tutmak ve böbreküstü sonuna kadar bölüm. Aydınlık alan veya diseksiyon mikroskop doku bölümleri varlığını denetlemek için kullanın. Şerit'ten bıçak ayırmak ve bir çift daha forseps yardımıyla cam slayt üzerinde koydu su yerleştirin. Şerit bir yüzeye yerleştirin, dikkatlice streç ve sonra slayt üzerinde monte yararlı olabilir.
- Sıcak plaka üzerinde kuru slayt izin. O zaman onları düz bir slayt tepsi üzerinde yatıyordu ve su hala mevcut ise gece veya daha uzun 37 ° C'de pişirin. Kuru bir kez, slaytları bir slayt kutusu oda sıcaklığında saklayın.
- Kullanılan ekipman yerine koy ve microtome temiz.
6. ayirt
- İmmunostaining için istediğiniz slaytları seçin ve bir slayt sahibi koyun.
- Sıcak plaka üzerinde 0.01 M sitrat pH kaynamaya 2.0 ile dolu bir ölçek getir. Arabellek hacmi kabı boyutuna bağlıdır ve (dikkate alınması gereken bazı buharlaşma ihtiyaçları) kaynama sırasında slaytlara bölümleri kapsayan için yeterli olması gerekir. Alüminyum folyo ile kabı kapağı.
Not: Kullanılabilir (bkz: tartışma) antijen alımı için diğer yöntemlerdir. - % 100 ksilen 2 slaytlar deparaffinize x 5 min için. Aşağıdaki serisi kullanarak slaytları rehydrate: %100 alkol 2 x 5 dk, % 70 alkol 2 x 5 dk, 5 dk 1 Ultrasaf Su yazın.
Not: deparaffinization sonra bu bölümler kurumasına izin önemlidir: doku gerekir her zaman bölümlerde arabellekleri veya çözümleri ile yordamı sonuna kadar veya doku yapısı hasar görebilir. - Antijen alma için slaytlar bir metal slayt sahibi ve alüminyum folyo olmadan sitrat kaynar ile ölçek yerleştirin. 10 dakika kaynamaya izin.
- Kabı sıcak plaka kaldırmak ve 20 dk. yapmak için adrenal bölümleri ile tampon hala tutulduğundan emin soğumaya bırakın.
- Engelleme çözüm hazırlamak. Piyasada bulunan boyama kullanarak Temsilcisi sonuçları için istihdam kiti Eğer (bkz. Tablo malzeme), bir tüp içinde fare IG engelleme reaktif ve %5 normal keçi serum 1,25 mL 1 x PBS, 1 damla (yaklaşık 45 µL eşit) ekleyin. Engelleme çözüm 4 ° C'de veya buz çalışma sırasında saklar.
Not: kullanılan serum ikincil antikor'ın ana türler üzerinde bağlıdır. Burada ikincil antikorlar keçi kaldırdı kullanılmıştır. Diğer antikorları için farklı serum konsantrasyonları gerekli olabilir. Ampirik olarak çeşitli konsantrasyonları test ederek doğru serum konsantrasyonu belirlemek. - Slaytları 1 x PBS ve yıkama 3 x 10 dk her hafif sallanan ile bir rocker üzerinde içeren bir Coplin kavanoza aktarın.
- Oksijen bir oda boyama için hazırlayın.
- Yavaşça, PBS bir slayttan kapalı sarsmak; Slayt alt aşırı PBS silmek için bir hav bırakmayan Temizleme işlemi ile silin.
- Hidrofobik özellikleri ile slaytlar için özel bir işaretleyici kullanarak, cam yüzey mürekkep çözüm bölümüne yayılmasını önlemek için kuru olduğundan emin yapma adrenal her bölümü çevreleyen bir daire çizin. Dikkatle gerekirse, yüzey kuru silin. Slayt oksijen odasına koyun.
- Hızlı bir şekilde, 50 µL (veya bölümler örtecek kadar) pipet çözüm her bölüme engelleme. Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
Not: gerekli çözüm cilt engelleme değişebilir; Bu bölümler de çözüm ile kaplıdır önemlidir. - 7.5 mL 1 x PBS ile piyasada bulunan kitinden Dilüent çözüm hazırlamak, 600 µL protein konsantre hisse senedi çözüm ve % 5 normal keçi serum (veya herhangi bir diğer serum ve engelleme çözümde kullanılan toplama). Dilüent çözüm 4 ° C'de veya çalışırken buzda saklayın.
- Dilüent çözümde uygun konsantrasyonlarda birincil antikorlar sulandrarak birincil antikor çözümleri hazırlayın. Co boyama, her antikor bir aliquot yeni bir tüp içinde eklemek ve karışımı yavaşça. Antikorlar ve antikor çözümleri kullanıma hazır kadar buza koyun.
Not: Burada çalıştırmaya başladık anti-SF1 antikor tavşan kaldırdı ve bir anti-TH antikor fare kaldırdı. Antikor hazırlamak için yönetmen olarak çalışma çözümleri uygulayın.- SF1 çalışma çözüm için bir tüp içinde anti-SF1 antikor 1 µL Dilüent çözüm (son konsantrasyon 1,5 µg/mL) 999 µL için ekleyin. TH çalışma çözüm için bir tüp içinde 1 µL anti-TH antikor 499 µL Dilüent çözüm (tahmini son konsantrasyon 2-6 µg/mL) ekleyin.
- SF1 + TH için taze bir tüp antikor çalışma karışımda pipet 250 µL SF1 çalışma çözüm ve 250 µL TH çalışma çözüm. Pipetting tarafından karışımı yavaşça. Buz üstünde depolar.
- Slayt 1 x PBS içeren bir Coplin kavanoza aktarın ve hafif sallanan ile bir rocker üzerinde 3 x 5 min için yıkama.
- PBS, pipet SF1 + TH antikor çalışma karışımı (veya diğer birincil antikor çözüm) her bölümünde fazlalığı kapalı silerek sonra slaytları oksijen odasına geri yer oksijen odası kapatın ve gece 4 ° C'de bırakın
- Ertesi gün, bir Coplin içine slaytlar 1 x PBS içeren kavanoz ve hafif sallanan ile bir rocker üzerinde 3 x 15 dakika yıkayın taşıyın.
- Slaytları yıkarken, uygun toplama kullanarak Dilüent çözüm ikincil antikor çözümde hazırlayın. Co boyama yapmak, her ikincil antikor çözüm eşit miktarda yeni bir tüp içinde ekleyin. Pipetting tarafından karışımı yavaşça. Buz üstünde depolar. Tüpler ışıktan korumak ve buz üzerinde kullanıma hazır kadar saklayın.
Not: Burada, keçi kaldırdı 488 nm floresan boya etiketli Anti-fare ve keçi kaldırdı 549 floresan boya etiketli Anti-tavşan kullanılan ikincil antikor vardır. İkincil antikor çözüm Dilüent çözüm (son konsantrasyonları 1,2 µg/mL) 799 µL içinde her ikincil antikor 0.5 µL ekleyerek hazırlanmıştır. - PBS fazlalığı çıkardıktan sonra geri oksijen odasında slaytlar yer, hızlı bir şekilde adrenal bölümlerinde ikincil antikor çözüm pipette, oksijen odası kapatın ve ışıktan korumak. Oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
- 1 x PBS bir Coplin kavanoza slaytlar yıkama ve 3 x 15 dk için hafif sallanan ile bir rocker ışıktan korumak emin yıkayın.
- 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) çözüm nükleer boyama için hazırlamak: DAPI (20 mg/mL) 1 µL 1 ml 1 x PBS.
Not: Mavi-floresan nükleer counterstain da Höchst boya kullanılarak elde edilebilir. - Adrenal bölümler üzerine DAPI çözüm pipet, ışıktan kapak ve 7 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 1 x PBS bir Coplin kavanoza slaytlar yıkama ve 3 x 5 min için bir rock'çı nazik slaytları ışıktan koruyarak sallanan ile yıkayın.
- Doğrudan güneş ışığı korumalı bir alanda bir cam yatıyordu, ve 60 µL veya 3 damla ayirt kapak cam yüzeyi boyunca için uygun montaj aracının pipet.
- Yavaşça bir slayt arka kapak cam doğru aşağı yönde ve montaj aracısında ile kapak cam doku bölümler yüz bu yüzden, paralel slayt konum bir hav bırakmayan silin silin. Hafifçe cam slaytta basın ve hiçbir hava kabarcığı kapak cam ve slayt arasında sıkışıp emin olun.
- Gerekirse, hava kabarcıklarının ve montaj Ajan fazlalığı kaldırmak için daha fazla basınç uygulayın.
- Bir karanlık konteyner ve tedavi, oda sıcaklığında en az 24 saat (ya da kullanılan montaj aracı bilgi sayfasında belirtilen zaman) slayt yatırmak ve görüntüleme için devam edin.
7. görüntüleme
Not: bir fotoğraf makinesine bağlı bir floresan mikroskop tespit ve uyarma kararlı dalga boylarında, sonra dokular tarafından yayılan floresans yakalamak için gereklidir. Açık iken, antikor ikincil seçmek hatırlamak olan uyarma fluorochromes ile Birleşik ve emisyon spectra donanımları ile uyumlu değildir önemlidir. Görüntüleme ayarlarını mikroskop ve görüntüleri yakalamak için kullanılan yazılım göre değişir. Adrenal bölümleri görüntüleme için geçerli bazı temel kurallar vardır, bu çekim hızı emin olmak gibi kamera kazanç ayarları ve ışık kaynağı yoğunluğu sabit tutulur.
- Işık kaynağı ve kamerayı açın, üreticinin yönergeleri izleyerek görüntüleme yazılımını başlatın.
Not: Bu eylemlerin sırasını ekipman kullanılan bağlı olarak farklı olabilir. - Slayt sahne alanı'nda güvenli, objektif kapağı açın ve mikroskop göz mercekleri seyir kullanın nükleer boyama (DAPI) Kanal ve düşük büyütme (4 X) slayt üzerinde doku tanımlamak için: adrenal bölümleri küçüktür ve onların görselleştirme biraz zaman gerektirebilir.
- Daha yüksek bir büyütme (10 X), odağı değiştirmek ve panjurları kapa.
Not: Gereksiz yere uzun Fuar photobleaching, sinyal kaybına kaynaklanan neden olabilir ışık altında önlemek önemlidir. - Yazılım komutlarını kullanarak, objektif (10 X) ve kanal (DAPI) kullanýlýr, pozlama süresi ayarlamak (1 s, sinyal çok güçlü ya da zayıf ise ayarlanabilir). Varsa, canlı görüntüleme (değil satın alma) için binning '2 X 2' dönüşüm geçirmesine 'Orta', ' 20 MHz hıza okuma' için ayarlayın. Kullanılan yazılım görüntüleme sonunda ölçek çubuğu görüntülenmiyorsa, ölçek çubuğu seçeneği seçin ve bar pozisyon istenilen yerde.
- Objektif kapağı açın, odağı gerekirse yeniden ayarlamak ve kanallar (FITC, TRITC, DAPI) geçin. Mikroskop otomatikleştirilmezse sahne alanı taşımadan her kanalda böbrek üstü bir resim çekmek ve kullanılan kanal seçimi ayarlamak emin olun. Bir kez bitmiş panjurları kapa.
Not: yazılım otomatik olarak onları kurtarmak değildir diye istihdam ayarları yazın. - Save resimler.
Not: Birleştirilmiş resimler kez mikroskop'ın yazılım veya diğer grafik editörü yazılım paketleri kullanılarak oluşturulabilir. - Görüntüleme bölümünde ve/veya daha yüksek bir büyütme ile diğer alanlar için yineleyin.
Not: Bir 20 X büyütme kez daha kısa bir çekim hızı (Yani, 800 ms) gerektirir. - Görüntüleme sonunda, doğru sırayla tüm ekipman kapa.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 bir şematik yukarıda açıklanan tüm Protokolü'nün temsil eder. Adrenal bezlerin fareler--dan hasat, bitişik yağ dokusu bir diseksiyon mikroskop altında kaldırılır ve böbreküstü sonra %4 oranında sabit PFA. Bu adımdan sonra adrenal işlenir ve parafin içinde gömülü ve mikroskop slaytlar üzerine yatırılır ince dilimler halinde organ kesmek için bir microtome ile kesitli. Bölümleri kurutma sonra ayirt yapıldığını ve bölümleri mikroskop görüntüsü.
Bitişik yağ (Şekil 2A) kaldırılması daha fazla işleme ve böbreküstü bezlerinin kesit kolaylaştırmak için önemlidir. Başarılı çevreleyen yağ dokusu çıkarılması burada böbreküstü kolayca algılanabilir, fazladan yağ görünür Şekil 2' deB, gösterilir. Bu adımı sırasında bu önemlidir, ancak, böbrek üstü bezi dışarı kuru veya bu izin doku yapısına zarar. Kuruluk tanınabilir olduğunda böbreküstü kırışık görünüm (Şekil 2C) varsayar. Bu sorun kolayca 1 x PBS böbreküstü yağ kaldırılması ile devam etmeden önce nemlendirilmesi tarafından üstesinden gelebilir.
Bu iletişim kuralı Şekil 3' te sunulan aşağıdaki son sonuçlar elde. Ayirt görüntüleri iki farklı büyüklüklerde adlı bir böbrek üstü bezinin immunostaining göstermektedir. Sitoplazmik yeşil boyama etiketleri medulla hücreleri ise kırmızı nükleer SF1 boyama adrenokortikal hücreleri Etiketler. Dış kapsül steroidogenic (SF1 negatif) olmadığından nükleer mavi (DAPI) boyama tarafından etiketlenir.
Resim 1 : Şematik Gösterim Protokolü'nün. Böbreküstü bezleri hasat ve bitişik yağ dokusunu sonra dokular %4 oranında sabit parafin gömmek için işlenen ve kesitli PFA. Bu bölümleri immunostained vardır ve floresan mikroskop görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Peri-böbreküstü yağ kaldırılması. (A) yağ böbreküstü bezi diseksiyon mikroskop altında kaldırılır çevreleyen. (B) böbrek üstü bezi temizleme sonra. (C) kurutma doku ve bu örneği hidrasyon gerektirir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Böbreküstü bezinin ayirt görüntüleme. Bir böbrek üstü bezinin ayirt düşsel (vasıl farklı büyüklüklerde) örneği lekeli adrenal korteks işaretleyicilerle (SF1, nükleer boyama) ve adrenal medulla (TH, sitoplazmik yeşil). Çekirdek (DAPI) mavi olarak etiketlenir. C: kapsül; CO: korteks; m: medulla. Ölçek çubukları 200 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Reaktif | İstasyonu | Sıcaklık | Süresi |
| % 70 alkol | 1 | RT | 1 h |
| %90 alkol | 2 | RT | 1 h |
| %90 alkol | 3 | RT | 1 h |
| Mutlak alkol | 4 | RT | 1 h |
| Mutlak alkol | 5 | RT | 1 h |
| Mutlak alkol | 6 | RT | 1 h |
| Mutlak alkol | 7 | RT | 1 h |
| Ksilen | 8 | RT | 1 h |
| Ksilen | 9 | RT | 1 h |
| Ksilen | 10 | RT | 1 h |
| Parafin mumu | 11 | 62 ° C | 1 h |
| Parafin mumu | 12 | 62 ° C | 1 h |
| Parafin mumu | 13 | 62 ° C | 1 h |
Tablo 1: Doku işlemci programı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı için hazırlık birlikte fare böbreküstü bezlerinin yalıtım ve kesitli parafin gömülü fare adrenal boyama yöntemi açıklanır.
Biz test diğer protokoller için karşılaştırıldığında, bu ayirt Protokolü bizim Laboratuvarda kullanılan antikor çoğunluğu için uygun kanıtlamıştır. Ancak, belirli durumlarda boyama sonuçlarını iyileştirmek için bazı ayarlamalar gerekebilir. Kolayca değiştirilebilir ve test bir fiksasyon uzunluğu değişkendir. Diğer laboratuvarlarda fiksasyon saat 12-24 h16için genişletilir iken bizim laboratuvar % 4 kuluçka İngiltere'de yılın 1 h 4 h için değişebilir. Bizim ellerde, ancak, daha uzun bir fiksasyon zaman artan arka plandaki seslere yol açtı ve birkaç antikorlar rutin olarak bizim araştırmada kullanılan görüntülemek için değildi.
Antijen alma pH de boyama başarısında bir rol oynayabilir. Isı kaynaklı epitope alma (HIER) ticari olarak kullanılabilir çözümler pH asidik alkali yanı sıra diğer şirket içinde yapılan arabellekleri sitrat (pH 6), ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA, pH 8), gibi Tris-EDTA arasında değişen istihdam ederek yapılabilir (pH 9), Tris (pH 10). Enzimatik tedavi ayrıca antijen maskesini için bir seçenek olabilir. Deparaffinized slaytlar bir enzim (örneğin İndinavir K) uygun bir konsantrasyon içeren bir çözüm ile sınırlı bir süre için kuluçka HIER için alternatif bir yöntem olabilir. Bu, ancak, enzim konsantrasyon titre ve aşırı sindirim doku17olumsuz etkileyebilir beri ideal kuluçka zamanı belirlemek için önemlidir.
Engelleme arabellek seçiminde de gidermek için başka bir değişkendir. Normal keçi serum ve bu iletişim kuralı (birincil fare antikorlar IgG endojen fare nedeniyle yüksek arka plan önlemek için fare dokular üzerinde kullanırken bu durumda uygun) belirtilen ticari olarak mevcut engelleme arabellek kullanımı yanı sıra, vardır ek seçenekler protein çözümleri (Sığır serum albumin (BSA) veya kuru süt) veya diğer ticari olarak mevcut arabellekleri gibi kullanılabilir. Bu arabellek, biotin streptavidin kullanarak yöntemi alarak biotin gibi boyama ile engelleyebilir maddeler içermez emin olmak önemlidir.
Böbreküstü bezi sık sık immunostaining lipid yüksek autofluorescence nedeniyle zorlu yapabilirsiniz yüksek lipid içeriği ile karakterize bir endokrin organ bulunmaktadır. Ayrıca, üzerinden fare ve sıçanların böbreküstü cortices autofluorescent intrasitoplazmik lipofuscin, sarı renkli kahverengi aralıkları bir pigmente taneli ve amorf materyal zengindir. Bu sorunu çözmek için bileşikler Sudan siyah B (SBB) gibi lipofuscins18tarafından oluşturulan floresans gidermek. İyi bir boyama sonucu ödün vermez bir başka faktör kan hücrelerinin bulunmasıdır. Hemoglobin eritrositler içinde mevcut emer dalga boylarında ışık < 600 nm ve -ebilmek yayılan bu dalga boyu19,20fluorochromes ile müdahale. Perfüzyon teknikleri doku gemiler kan hücreleri temizlemek için kullanılan iken, nükleer counterstaining gerçekleştirmeden önce 10 mM bakır sülfat pH 5 kullanımı da istenmeyen floresans21bastırmak yardımcı olabilir.
Bu iletişim kuralı bir kritik adrenal diseksiyon adımdır. Böbrek üstü bezi konumu in situbulmak zor olabilir bir organdır: farelerde, bezleri küçük ve konumlarını biraz değişken olmasıdır. Özellikle büyük hayvanlarda, adrenal bezleri ve bunun sonucunda onların yalıtım tespiti ile protokol bu adımı sırasında çevrenin açık bir görünümü var çok önemlidir bu nedenle engelleyebilir yağ dokusu tarafından da çevrilidir. Peri-böbreküstü yağ kaldırma kaldırılması hassas bir adımdır. Özellikle dikkat adrenal için yağ ayırma sırasında kapsül rüptürü vermemek için ödenmesi gerekmektedir. Bezi ayrıca işlemi sırasında doku hasarı önlemek için PBS ile nemli tutulmalıdır.
Kesit zaman bölümlerde küçük bir kısmı adrenal dokusunun varlığı tespit doku hipopigmentasyon nedeniyle işleme adımdan sonra zor olabilir. Mikroskop balmumu dokudan yüksek beklentileri karşılayan kesit sırasında çok yararlıdır.
Parafin gömülü bölümlerinde Immunostaining doku morfolojisi koruyarak ilgi immunolabeling proteinler için değerli bir teknik var. Burada sunulan bu yöntem floresans algılama dayanır ve özellikle birden çok birincil antikorlar istihdam çalışmaları için işlevseldir, floresans sinyal ışığa duyarlı iken ve kolayca kaybolabilir veya slaytları değil işlenir Eğer zayıflamış düzgün (Yani, uzun süreli pozlama ışık mikroskobu için veya ortam ışığı gereksiz maruz). Ayrıca, floresans sinyal kalitesi bir düşüş zaman içinde fark edebilirsiniz. Bu sorun photostable ve uzun yıllar boyunca görselleştirildiği chromogenic algılama kullanarak önlenebilir. Bu yöntem, ancak, floresans algılama, daha yüksek hassas etiketleme ve aynı zamanda yapılan bir çalışmada çeşitli proteinlerin etiketleme gibi avantajları eksik.
Parafin katıştırma işlemek ve birden fazla doku örnekleri depolamak için uygun bir yöntemdir. Ancak, kendisi katıştırma parafin için işleme doku floresan gazetecilere endogenously muhabir hedefleme spesifik bir antikor kullanımı olmadan bazı transjenik hayvanlar ifade görüntüleme için uygun değildir. Dondurma floresan protein yıkımı önlemek ve mikroskop altında doğrudan kendi görselleştirme izin vermek için bir yöntemdir. İlave bir antikor kullanımı kaçınarak bir avantaj temsil edebilir. Doku morfoloji etkiler çünkü Öte yandan, dondurma da sınırlama; Ayrıca kesit için farklı donanımları gerektirir ve slaytlar ve doku blok depolama yalnızca dondurucular mümkündür.
Bir büyük sınırlama kesitli bir doku görüntüleme yüksek uzaysal çözünürlük yapısal bileşenler görüntüleri elde etmek için yeteneğidir. Doku kompozisyon, aslında, çünkü ışık penetrasyon etkiler ve yanlış çözünürlükte açabilir görüntüleme kalitesini belirlemede önemli bir değişkendir. Böbrek üstü bezi22saçılma ışık neden lipidler zengin bir dokudur. Aynı zamanda bir yüksek lipid içeriğe sahiptir, beyin doku Temizleme teknikleri netlik, BABB, iDISCO ve 3DISCO gibi doku görselleştirme, izin için daha iyi görüntüleme ve 3D doku rekonstrüksiyonu23geliştirmek için geliştirilmiştir. Bu teknikler araştırmacılar-are-mek şartıyla yüksek kalitede veri görüntüleme ve dokular çeşitli aralığına adapte, ve, gelecekte, adrenal de görüntüleme için bu yöntemleri istihdam istiyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Biz Dr Mohamad Zubair onun önerileri ve işyerinde bu protokol teknik yardım için teşekkür ederim. Bu eser diyabet Ulusal Enstitüsü ve sindirim ve böbrek hastalıkları, ulusal kurumları Sağlık Araştırma Bursu 2R01-DK062027 (için G.D.H) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24-well cell culture plate | Nest Biotechnology Co. | 0412B | |
| Disposable needles 25 G x 5/8" | Exel International | 26403 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Paraplast plus | McCormik scientific | 39502004 | Paraffin for tissue embedding |
| Shandon biopsy cassettes II with attached lid | Thermo scientific | 1001097 | Cassettes for tissue processing |
| High Profile Microtome Blades | Accu-Edge | 4685 | Disposable stainless steel blades |
| Peel-a-way disposable plastic tissue embedding molds | Polysciences Inc. | 18986 | Truncated, 22 mm square top tapered to 12 mm bottom |
| Superfrost Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | 75 mm x 25 mm x 1 mm |
| Xylene | Fisher Chemical | X5P1GAL | |
| 200 Proof Ethanol | Decon Labs, Inc. | ||
| Certi-Pad Gauze pads | Certified Safety Mfg, Inc | 231-210 | 3" x 3. Sterile latex free gauze pads |
| M.O.M kit | Vector laboratories | BMK-2202 | For detecting mouse primary antibodies on mouse tissue |
| KimWipes | Kimtech | 34155 | Wipes 4.4 inch x 8.4 inch |
| Super PAP PEN | Invitrogen | 00-8899 | Pen to draw on slides |
| Microscope cover glass | Fisherbrand | 12-544-D | Size: 22 x 50 x 1.5 |
| DAPI | Sigma | D9542 | (Prepared in 20 mg/mL stock) |
| ProLong Gold antifade reagent | Molecular Probes | P36930 | Mounting agent for immunofluorescence |
| X-cite series 120Q | Lumen Dynamics | Light source | |
| Coolsnap Myo | Photometrics | Camera | |
| Optiphot-2 | Nikon | Microscope | |
| microtome | American Optical | ||
| Tissue embedder | Leica | EG1150 H | |
| Tissue processor | Leica | ASP300S | |
| Normal goat serum | Sigma | G9023 | |
| Mouse anti-TH | Millipore | MAB318 | Primary antibody |
| Rabbit anti-SF1 | Ab proteintech group (PTGlabs) | custom made | Primary antibody |
| Alexa-488 Mouse IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 115-545-003 | Secondary antibody |
| Dylight-549 Rabbit IgG raised goat | Jackson ImmunoResearch | 111-505-003 | Secondary antibody |
| Citrate acid anhydrous | Fisher Chemical | A940-500 | |
| NIS-Elements Basic Research | Nikon | Software for imaging |
References
- Brandtzaeg, P. The increasing power of immunohistochemistry and immunocytochemistry. Journal of Immunological Methods. 216 (1-2), 49-67 (1998).
- Matos, L. L., Trufelli, D. C., de Matos, M. G., da Silva Pinhal, M. A. Immunohistochemistry as an important tool in biomarkers detection and clinical practice. Biomark Insights. 5, 9-20 (2010).
- Coons, A. H., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 47 (2), 200-202 (1941).
- Lerario, A. M., Finco, I., LaPensee, C., Hammer, G. D. Molecular Mechanisms of Stem/ Progenitor Cell Maintenance in the Adrenal Cortex. Frontiers in Endocrinology. 8, (2017).
- Yates, R., et al. Adrenocortical Development, Maintenance, and Disease. Endocrine Gland Development and Disease. 106, 239-312 (2013).
- Jones, I. C. Variation in the Mouse Adrenal Cortex with Special Reference to the Zona Reticularis and to Brown Degeneration, Together with a Discussion of the Cell Migration Theory. Quarterly Journal of Microscopical Science. 89 (1), 53 (1948).
- Sucheston, M. E. C., Samuel, M. The Transient-Zone in the Human and Mouse Adrenal Gland. The Ohio Journal of Science. 72, n2 (March, 1972) 120-126 (1972).
- Guasti, L., Paul, A., Laufer, E., King, P. Localization of Sonic hedgehog secreting and receiving cells in the developing and adult rat adrenal cortex. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 117-122 (2011).
- Pihlajoki, M., Dorner, J., Cochran, R. S., Heikinheimo, M., Wilson, D. B. Adrenocortical zonation, renewal, and remodeling. Frontiers in Endocrinology. 6, 27 (2015).
- Farese, R. V., Walther, T. C. Lipid Droplets Finally Get a Little R-E-S-P-E-C-T. Cell. 139 (5), 855-860 (2009).
- Shen, W. J., Azhar, S., Kraemer, F. B. Lipid droplets and steroidogenic cells. Experimental Cell Research. 340 (2), 209-214 (2016).
- Finco, I., LaPensee, C. R., Krill, K. T., Hammer, G. D. Hedgehog signaling and steroidogenesis. Annual Review of Physiology. 77, 105-129 (2015).
- Paul, A., Laufer, E. Endogenous biotin as a marker of adrenocortical cells with steroidogenic potential. Molecular and Cellular Endocrinology. 336 (1-2), 133-140 (2011).
- Lowe, J., Anderson, P. Stevens & Lowe's Human Histology, 4th Edition. , Elsevier/Mosby. 263-285 (2015).
- Nagatsu, T. Genes for human catecholamine-synthesizing enzymes. Neuroscience Research. 12 (2), 315-345 (1991).
- Berthon, A., et al. Age-dependent effects of Armc5 haploinsufficiency on adrenocortical function. Human Molecular Geneticst. 26 (18), 3495-3507 (2017).
- Brown, C. Antigen retrieval methods for immunohistochemistry. Toxicologic Pathology. 26 (6), 830-831 (1998).
- Billinton, N., Knight, A. W. Seeing the wood through the trees: a review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Analytical Biochemistry. 291 (2), 175-197 (2001).
- Hirsch, R. E., San George, R. C., Nagel, R. L. Intrinsic fluorometric determination of the stable state of aggregation in hemoglobins. Analytical Biochemistry. 149 (2), 415-420 (1985).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of Red Blood Cell Autofluorescence for Immunocytochemistry on Fixed Embryonic Mouse Tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81, 28 (2017).
- Watson, J. Suppressing autofluorescence of erythrocytes. Biotechnic & Histochemistry. 86 (3), 207 (2011).
- Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs. eNeuro. 2 (3), (2015).
- Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nature Protocols. 7 (11), 1983-1995 (2012).
