Summary
هنا، يمكننا وصف طريقة لتنقية الإنزيمات معلم الحامض الأميني بيروفوسفوكيناسي واستخدام طبقة رقيقة اللوني من ركائز راديولابيليد ومنتجات الاعتداء للنشاط الأنزيمي في المختبر. مقايسة نشاط إنزيم قابل للتطبيق على نطاق واسع لأي كيناز، cyclase النوكليوتيدات، أو رد فعل الفوسفور ونقل إليه الذي يتضمن التحلل ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات.
Abstract
إنزيمات كيناز وبيروفوسفوكيناسي نقل الفوسفات غاما أو مجموعة بيروفوسفات بيتا-غاما من السلائف ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات إلى ركائز لخلق منتجات فوسفوريلاتيد. الاستخدام γ-32-ف المسمى السلائف NTP يسمح الرصد المتزامن الركازة الانتفاع والمنتج تكوين بالأشعة. طبقة رقيقة اللوني (TLC) على لوحات السيلولوز يسمح الفصل السريع والكمي الحساسة للركيزة والمنتج. نحن نقدم طريقة لاستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة الاعتداء نشاط بيروفوسفوكيناسي سينثاتيز بجب (ف) المنقي. هذا الأسلوب قد استخدمت سابقا لوصف نشاط دوري سينثيتاسيس النوكليوتيدات ودينوكليوتيدي، وهو مناسبة على نطاق واسع لوصف نشاط أي إنزيم هيدروليزيس ثلاثي الفوسفات النوكليوتيدات سندات أو نقل محطة طرفية الفوسفات من مانح فوسفات إلى جزيء آخر.
Introduction
إنزيمات كيناز وبيروفوسفوكيناسي (أو ديفوسفو-كيناز) نقل الفوسفات من النوكليوتيدات ثلاثي الفوسفات (NTP) السلائف إلى جزيئات الركازة. يمكن أن تتضمن ركائز أخرى النيوكليوتيدات والأحماض الأمينية أو البروتينات والكربوهيدرات والدهون1. في بعض الأحيان يمكن التنبؤ بها تحليلات Bioinformatic الركازة المشابهة لأنزيم أو ركائز استناداً إلى التشابه للإنزيمات تتميز، ولكن لا يزال من الضروري التحقق التجريبي. وبالمثل، تقارب إنزيم substrate(s)، ومعدل أنه يحفز رد الفعل الفوسفور والنقل، وآثار العوامل المشتركة، ومثبطات، أو المستجيبة الإنزيم يجب أن يتحدد تجريبيا. تجنب استنزاف السلائف ATP بسائر الإنزيمات ATP المستهلكة الموجودة في السيتوبلازم البكتيري، تتطلب فحوصات النشاط كمية البروتين المنقي.
تنقية البروتين اللوني تقارب معدنية قطعت تماما في الأدب2،3. تسمح العلامات الحامض الأميني تتكون من ستة بقايا الحامض الأميني على التوالي إلحاق إلى N-أو ج-المحطة بروتين المؤتلف تنقية السريع بتقارب معدنية اللوني4،،من56. تسلسل هذه صغيرة مقارنة بالبروتينات تعديلها، وعادة ما يكون له تأثير ضئيل على وظيفة البروتين، على الرغم من أنها يمكن أن تغير في بعض الأحيان الاستقرار البروتين و/أو إنزيم حركية7،8. يمكن أن يكون الحامض الأميني العلامات في ن-وج-تيرميني للبروتين نفس تأثيرات مختلفة، والتي يصعب التنبؤ بها دون معرفة هيكل البروتين في السؤال. وأدرجت العلامات الحامض الأميني عادة أثناء استنساخ بروتين المؤتلف بتصميم كبسولة تفجير ترميز ستة الحامض الأميني البقايا، أما فورا 3 'إلى كودون بدء ATG أو فورا 5' إلى كودون وقف الإطار القراءة المفتوحة. بعد التضخيم، متصلة إلى ناقل تحت سيطرة مروج إيندوسيبلي الجينات المحتوية على هيكساهيستيديني وأعرب عادة في مختبر سلالة كولاي. ثم يمكن أن تكون معزولة جزئ البروتين راتنج تقارب المحتوية على الكاتيونات divalent المعطل تداولها (عادة من النيكل أو الكوبالت)9. يمكن إزالة تلويث الأصلية ملزمة معدنية البروتينات بالمعايرة مع ايميدازول، الذي يزيح تنافسية البروتين ملزمة2. وأخيراً، هو التيد البروتين المستهدف من العمود مع تركيزات أعلى من ايميدازول. هناك عدة مصادر تجارية الراتنجات الموجبة معدنية المعطل تداولها، والشركات المصنعة تقديم توصيات بشأن شروط المخزن المؤقت وتركيزات ايميدازول. بعد شطف، يمكن تحليلها بواسطة الصوديوم دوديسيل كبريتات-polyacrylamide هلام التفريد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) البروتين أو دياليزيد أو استخدامها على الفور في الاختبارات الوظيفية.
هناك عدة طرق لمراقبة النشاط كيناز غير مباشر باقتران التحلل بوند الفوسفات ATP إلى رد فعل ثاني الذي يثير فلوروفوري أو النشرات أو يولد تشيميلومينيسسينسي، ولكن ردود الفعل هذه لها عدة أجزاء متحركة، ويمكن أن تكون 10من الناحية اللوجستية الصعبة. الطريقة الأكثر مباشرة لقياس نشاط نقل الفوسفور على وجه التحديد مباشرة رصد نقل مجموعة الفوسفات راديولابيليد من المتاحة تجارياً γ-32-P السلائف NTP للركيزة غير راديولابيليد11 , 12 , 13-يمكن فصل خليط من ركائز راديولابيليد والمنتجات وكمياً بطبقة رقيقة اللوني (TLC). ويستخدم TLC تفاضلية تنقل الذوائب في مذيب معين عن طريق السماح المذيبات (الطور السائل) ترحيل بعمل شعري عبر سطح (المرحلة الصلبة) التي كانت مزيجاً الذوائب الممتزة14. سيتم ترحيل الذوائب الصغيرة و/أو تفتقر إلى تفاعلات إيجابية مع المرحلة الصلبة مسافات أطول من مواقعها الأولية من الذوائب مع الأوزان الجزيئية أعلى أو الانتماءات كبيرة الصلبة. لدراسة نقل الفوسفور، مويتيس الفوسفات زيادة الوزن الجزيئي للجزيئات أنها تضاف إلى، وإضافة تهمة الأيونية السالبة في الأس الهيدروجيني المحايدة أو الحمضية11،،من1214. هذا يقلل من قدرتها على الحركة على سطح أساسية مثل السيلولوز بي. عندما وضعت في المخزن المؤقت لفوسفات البوتاسيوم الحمضية، يمكن فصل المخاليط مونو-دي-، ثلاثي، رباعي، والأنواع بينتافوسفاتي سهولة في بي-السليلوز، السماح للتحديد الكمي لكل نوع من الأنواع (الشكل 2، الشكل 3). يمكن إجراء هذه الاختبارات باستخدام ليساتيس الخلية التي تحتوي على الإنزيم للفائدة، ولكن هذا يشمل احتمال نشاط أخرى مؤنزم، فوسفاتاسيس، وأتباسيس العامة لاستنزاف الركيزة و/أو المنتج. تقييم كمي في المختبر لنشاط إنزيم، من الضروري تنقية إنزيم الفائدة.
جوانوسيني تيترافوسفاتي (بجب) وجوانوسيني بينتافوسفاتي (ببجب) ريبونوكليوتيدي إشارات الجزيئات التي شكلتها نقل بيروفوسفات المجموعة من سلائف الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP)، على التوالي، guanosine diphosphate (الناتج المحلي الإجمالي) أو جانسين الركيزة تيترافوسفاتي (غتب)15. هذه الإشارات ريبونوكليوتيدي واحد، المعروفة ببجب (p)، التوسط استجابة على مستوى الخلية للإجهاد البيئي المعروف باسم الاستجابة الصارمة في الأنواع البكتيرية المتنوعة15،16. فئتين مصانة من الإنزيمات تحفيز التشكيل (ف) بجب15،17 Rel/مكتب التخطيط الاستراتيجي الإنزيمات هومولوج (RSH) 'طويلة' بيفونكشونال (ف) بجب سينثاتيز/هيدرولاسيس اسمه للتشابه بهم إلى ريلى والفور (ف) بجب الأيضية إنزيمات من الإشريكيّة القولونية التي تحتوي على سينثاتيز هيدرولاز والمجالات التنظيمية، بينما الإنزيمات سينثاتيز (SAS) الارمون الصغيرة سينثيتاسيس مونوفونكشونال قصيرة وجدت حصرا في غرام البكتيريا إيجابية15، 17 , 18-بكتيريا إيجابية تشكيل بوغ المطثيّة العسيرة بترميز الجينات RSH و SAS المفترضة19. هنا، نحن نقدم فحوصات النشاط الأولية التي تؤكد أن الإنزيم RSH جيم سينثاتيز بجب (ف) حفازة نشطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إيندوسيبلي أوفيريكسبريشن بروتين الحامض الأميني معلم
- تضخيم rsh من جيم R20291 الحمض النووي.
- استخدام بوليميريز عالية الدقة واتبع إرشادات الشركة المصنعة.
- تضخيم rsh جيم باستخدام أجهزة الإشعال
rsh_F (كريسجتاككجتاتاتجكاتجاتااجاتاكاج) و
rsh_R (CCكتجكاجكتاتجتجاتجتجاتجتجاتتجتكاتكتاتااتاك)، الذي يقدم علامة هيكساهيستيديني ج--المحطة طرفية.
ملاحظة: يتم كبني وبسطي قطع مواقع في تسلسل التمهيدي الغامق. - هضم متجه بمبنيو وقطع المنتج بكر rsh-his6 مع تقييد بستل وكبني المواقع في 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة.
- تنقية الموجه خطية والشظايا بكر عبر [اغروس] هلام التفريد وتنقية اللاحقة مع مجموعة استخراج هلام الحمض النووي.
- قياس امتصاص نانومتر 280 (280) من الناقل وتضخيم لمنتج PCR. استخدام المعادلة
لتحديد تركيز الحمض النووي لكل جزء من الحمض النووي.
- اضطر rsh إلى بمبنيو للتعبير.
- ضم 25 نانوغرام من هضم بمبنيو ناقل، 125 نغ rsh-his6 الجين المنتج و 2 ميكروليتر من 10 × ليجاسى المخزن المؤقت 1 ميكروليتر من ليجاسى الحمض النووي. استخدام الماء مجاناً نوكلياسي لضبط الحجم الإجمالي إلى 20 ميكروليتر. احتضان في 16 درجة مئوية ح 16.
ملاحظة: فعالية ربط يعتمد على حجم الشظايا ويجب تعديلها استناداً إلى الشركة المصنعة للبروتوكولات. - تحويل المنتج ناقلات الواصلة إلى كولاي DH5-α أو recA- آخر سلالة بلازميد على الصيانة. حدد الخلايا المحولة على ألواح رطل مع 100 ميكروغرام/مل كاناميسين واحتضانها ح 16 – 24 في 37 درجة مئوية.
- اختيار أربع مستعمرات من لوحة التحويل (s) ومتتالية كل منها على لوحة جديدة تحتوي على 100 ميكروغرام/مل كاناميسين لعزل الحمض النووي. احتضان لوحات جديدة في 37 درجة مئوية ح 16 – 24 وحدد عزل واحد للتعبير البروتين اللاحقة.
- للتأكد من ربط ناجحة من البروتين سليمة rsh ترميز المنطقة، اختيار مستعمرة المختار عزل إلى 20 ميكروليتر من المياه، الحرارة عند 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، واستخدامه كقالب لبكر توكيدي استخدام التمهيدي نفسها المستخدمة لتضخيم الجينات.
- ضم 25 نانوغرام من هضم بمبنيو ناقل، 125 نغ rsh-his6 الجين المنتج و 2 ميكروليتر من 10 × ليجاسى المخزن المؤقت 1 ميكروليتر من ليجاسى الحمض النووي. استخدام الماء مجاناً نوكلياسي لضبط الحجم الإجمالي إلى 20 ميكروليتر. احتضان في 16 درجة مئوية ح 16.
- تحويل بلازميد تم التحقق منها وفقا لبروتوكولات التحويل القياسي لتحويل بلازميد البكتيريا كولاي إلى نظام BL21 كولاي لإنتاج البروتين عالية الغلة.
- وأعرب عن His6 RSH في كولاي.
- حدد مستعمرة واحدة من BL21 كولاي تحول مع بمبنيو::rsh وتطعيم 2 مل متوسطة رطل مع 50 ميكروغرام/مل كاناميسين. احتضان عند 37 درجة مئوية ح 12 – 16 بينما تهز 250 لفة في الدقيقة.
- تطعيم 500 مل من رطل المتوسطة التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل كاناميسين مع 0.5 مل ثقافة بين عشية وضحاها لنمو الخلايا والبروتين التعبير.
- احتضان ثقافة التعبير في 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة في شاكر حاضنة حتى تصل إلى كثافة الخلية القطر خارجي600 0.167 عند 37 درجة مئوية.
- خفض درجة حرارة الحاضنة إلى 30 درجة مئوية وانتظر 30 دقيقة لدرجة الحرارة إلى إسقاط ثقافة.
- حمل RSH التعبير عن طريق إضافة الأيزوبروبيل β-د-ثيوجالاكتوسيدي (إيبتج) بتركيز نهائي من 0.5 مم. السماح للحث أن تتم بين ليلة وضحاها (على ح 16 – 18) عند 30 درجة مئوية، تهز 250 لفة في الدقيقة.
- بيليه بالطرد المركزي في 3,080 س ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: بيليه يمكن تخزينها بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية لتنقية البروتين المستهدف في اليوم التالي دون فقدان ملحوظ لإنتاج البروتين أو النشاط الأنزيمي.
لتحديد تركيز الحمض النووي لكل جزء من الحمض النووي.2-البروتين تنقية بالنيكل التقارب اللوني
ملاحظة: تواصل مباشرة مع البروتين تنقية الخطوات الواردة أدناه بعد توضيح الخلية ليستي. تخزين توضيح في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها لتنقية البروتين اللاحقة يقلل إنتاج البروتين.
- تنقية البروتين باستخدام 1 مل راتنج "حمض" نيتريلواسيتيك نيكل (ني-جاتا) على عمود جاذبية.
- قبل يوم من استخدام، وحجته العمود بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع 2 مل من المخزن المؤقت للموازنة (10 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.79، 300 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم نة2بو4، lysozyme 0.5 ملغ/مل، 5 ملم مجكل2، ايميدازول 10 ملم، 0.25 مم DTT، السلفونيل فينيلميثاني 5 مم فلوريد (بمسف)، والغليسيرول 10%).
- وفي اليوم التالي جلب العمود من 4 درجة مئوية إلى RT قبل تحميل توضيح ليساتي واسمحوا أنها تقف ~ 2-3 ح.
ملاحظة: يصل العمود إلى التوازن الحراري أمر حاسم لتجنب فقاعات الهواء التي تشكل داخل العمود. - ريسوسبيند بيليه التي تم الحصول عليها في الخطوة 1.3.6 في المخزن المؤقت لتحلل (10 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.8، 300 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم مجكل2, 50 مم نة2ص. ب4، 10% والغليسيرول، lysozyme 0.5 ملغ/مل، ايميدازول 10 ملم، DTT 0.25 و 5 ملم بمسف).
- Sonicate الخلايا على الجليد لفترات s 8 × 10، الإيقاف المؤقت 30 ثانية بين النبضات.
- توضيح بالطرد المركزي في 3,080 س ز لمدة 30 دقيقة عند 4 درجة مئوية باستخدام ميكروسينتريفوجي.
- إعداد مع كميات متساوية من تحلل المخزن المؤقت ثم قم بتطبيق هيأهم توضيح إلى العمود وجمع في التدفق من خلال.
- تطبيق أوضح ليستي التدفق من خلال العمود وجمع في الثانوي التدفق من خلال.
- أغسل العمود مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 1 (مم تريس-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.79)، 300 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم مجكل2، 50 مم نة2بو4، 30 ملم ايميدازول، والغليسيرول 10% من 10). جمع في التدفق من خلال.
ملاحظة: إدراج 5 مم مجكل2 في مخازن غسل وشطف مهم للنشاط الأنزيمي من البروتين المنقي. - أغسل العمود مع المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي 2 (10 ملم تريس-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.79)، كلوريد الصوديوم، مجكل2، 5 ملم 50 ملم نة2بو4 و 50 مم ايميدازول 300 ملم). جمع في التدفق من خلال.
- تطبيق 2 مل شطف المخزن المؤقت (10 ملم تريس-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.79)، 300 مم كلوريد الصوديوم، 50 مم NaH2بو4، والغليسيرول 10% وايميدازول 75 مم). جمع التدفق عبر في اثنين من الكسور 1 مل.
ملاحظة: يمكن تخزين العمود بعد هذه الخطوة في المخزن المؤقت للموازنة في 4 درجات مئوية إذا كان سيتم تنقية البروتين نفسه في مقايسة تنقية القادم. يمكن استخدام العمود يصل إلى 3 إضعاف إذا كانت مخزنة بشكل صحيح.
- تقييم الكسور العمود للنقاء من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة.
- تقييم نوعي تنقية البروتين، تشغيل 20 ميكروليتر مختبرين لكل عمود الكسور على جل بولياكريلاميدي 4/10% لمدة 60 دقيقة في 170 الخامس.
- الهلام مع 0.1% أخذ الأزرق في درجة حرارة الغرفة ح 5، تعصف بلطف على الروك benchtop من وصمة عار.
- ديستين الهلام في الميثانول 40%، 10% حمض الخليك الجليدية بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة، هزاز على الروك benchtop.
ملاحظة: صورة هلام ممثل في الشكل 1.
- دياليزي الوت جزء 2 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- دياليزي ضد المخزن المؤقت للغسيل الكلوي (مم 15.7 تريس-HCl (درجة الحموضة 7.6)، مم 471.9 كلوريد الصوديوم، 15.69 مم مجكل2، الجلسرين DTT و 15.7% 1.5 مم بمسف مم 1.57) بنسبة 200: 1 استخدام جهاز غسيل الكلي 1 مل مع وقف وزن الجزيئي كاتشين 20 (موكو).
- تحديد تركيز العينة البروتين دياليزيد عن طريق قياس امتصاص في 280 نانومتر واستخدام انقراض المولى المحسوبة معامل 82085 M-1سم-1 20.
- تخزين 5 مختبرين ميكروليتر من عينة دياليزيد البروتين في مختبرين في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3-البروتين نشاط الإنزيم بطبقة رقيقة اللوني
- إعداد لوحة كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة.
- قبل القيام برد فعل، إعداد بولييثيلينيميني (جزيرة الأمير إدوارد)-لوحات السيلولوز بالغسيل في المياه. وضع اللوحات في حجرة زجاجية مع الماء المقطر مزدوجة إلى عمق ~0.5 سم.
- تسمح للماء بترحيل إلى الجزء العلوي من اللوحة.
ملاحظة: غسالة الأطباق ليس ضروريا تماما، كما يمكن استخدام لوحات دون ذلك، ولكن الغسيل زيادة وضوح الصور الناتجة. الغسيل اللوحات في اتجاهين عمودي أيضا يضمن أن يتم عزل أي ملوثات موجودة في الراتنج في إحدى زوايا اللوحة (الشكل 2). - إخراج اللوحات من قاعة الزجاج ويترك على رف benchtop إلى الجافة بين عشية وضحاها (ح 12 – 18).
- مارك لوحات الجافة 2.0 سم من حافة واحدة مع قلم رصاص لينة للإشارة إلى حيث سيتم تطبيق العينات ل TLC. 2 ميكروليتر عينات، تطبيق نماذج لا تقل عن 1.0 سم عن بعضها البعض (الشكل 2).
ملاحظة: يسمح هذا الفصل بوضوح بين بقعة المتاخمة لها، الذي حاسم بالنسبة لإشارة التحديد الكمي. طالما راتنج السليولوز ليست صغيرة، وخدش علامات القلم الرصاص على السطح لن تتداخل مع الهجرة المذيبات. - عند التخطيط للتجارب، دائماً ترك بقعة واحدة على كل لوحة غير المستخدمة.
ملاحظة: هذا سيوفر ممر فارغة لتحديد حجم العينة (الشكل 2). لوحة 20 سم TLC سيكون مجالاً للبقع 19.
- تحليل نشاط إنزيم
- إعداد مزيج المخزن مؤقت 5 x تحتوي على 50 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، خلات الأمونيوم 25 مم، 10 مم بوكل، القيمة 1 و 0.6 مم ATP.
ملاحظة: قد أعدت بكميات كبيرة هذا المزيج والمجمدة في 10 ميكروليتر مختبرين لاستخدامها في وقت لاحق. لا تعرض المزيج لدورات تجميد أذاب متعددة. - إعداد ردود الفعل الفردية التي تحتوي على 3 ميكرومتر RSH، 1 x المخزن المؤقت ميكس، 0.6 مم الناتج المحلي الإجمالي، 1.2 مم مجكل2. إضافة μCi 1.0 γ-32ف-ATP كل 10 ميكروليتر من رد فعل واستخدام المياه مجاناً نوكلياسي لتحقيق رد فعل ما يصل إلى وحدة تخزين المطلوب. إضافة RSH بعد أن كانت مختلطة المكونات الأخرى، كما إضافة RSH إلى مزيج المحتوية على النوكليوتيدات يبدأ تحليل النشاط الأنزيمي.
ملاحظة: حجم الرد النهائي سيتوقف على عدد تيميبوينتس أخذ عينات منها. لأخذ عينات 2 ميكروليتر/تيميبوينت، تجميع 10 ميكروليتر من خليط رد فعل لكل تيميبوينتس 4. - للتحكم في للتحلل ATP من تلويث نوكلاس النشاط، تجميع فعل 10 ميكروليتر يحتوي على بروتين لا واحتضان أنه بالتوازي. بقعة 2 ميكروليتر العينات عند t = 0 وفي نهاية التجربة إلى ضمان أن لا كان تحلل ATP في غياب البروتين.
- فورا عند إضافة RSH، إزالة ميكروليتر 2 وبقعة على لوح بي-السليلوز مسماة ك t = 0 دقيقة عينة.
- تبني رد فعل على 37 درجة مئوية، وإزالة 2 ميكروليتر مختبرين في تيميبوينتس المرجوة.
ملاحظة: سوف توقف النشاط الأنزيمي عند العينة هي تمتز فوق لوحة السليلوز. انتظر 10 – 30 دقيقة بعد إضافة آخر بقعة على لوحة أمام التنمية لضمان الامتزاز كاملة وتجفيف العينة.
- إعداد مزيج المخزن مؤقت 5 x تحتوي على 50 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، خلات الأمونيوم 25 مم، 10 مم بوكل، القيمة 1 و 0.6 مم ATP.
- طبقة رقيقة اللوني
- ملء الدائرة اللوني مع 1.5 "م 1.5 م خ"2ص4 (pH 3.64) بعمق 0.5 سم.
ملاحظة: وحدة التخزين اللازمة سيتوقف على أبعاد الدبابة اللوني. يمكن استخدام أي حاوية الزجاج مع أسفل مستوى تكون واسعة بما يكفي للسماح بالإدراج لصفيحة TLC دون الانحناء كخزان نامية بالإضافة إلى غطاء. ويمكن خفض صفيحة TLC إلى شرائح أضيق مع ريزربليد نظيفة لتمكينها من تطوير في كوب زجاج المشمولة في غشاء بلاستيكي. - تزج الحافة السفلي اللوحة في المذيبات. تسمح المذيب لترحيل إلى الجزء العلوي من اللوحة (~ 90 دقيقة).
ملاحظة: بينما سيتم وقف الهجرة المذيبات في الجزء العلوي من اللوحة ولن تفقد عينات أو تشغيل معا خلال هو غمر أطول، لوحات لا ينبغي أن تترك في المذيبات بين عشية وضحاها. يمكن أن يسبب الغمر أطول من 4 ح الراتنج فصل من لوحة النسخ ويؤدي إلى فقدان الإشارة. - إزالة اللوحة من خزان اللوني ووضعه على benchtop تجفيف الرف.
- تسمح اللوحة للهواء الجاف بين عشية وضحاها.
ملاحظة: التجفيف يجوز التعجيل باستخدام الشعر أكثر جفافاً. ويمكن تقييم جفاف بلون الراتنج، التي سوف تلقي بظلالها عندما تكون رطبة والعودة إلى اللون من صفيحة غير المستخدمة عندما يجف تماما. - بعد جفاف اللوحة، التفاف اللوحة في غشاء بلاستيكي تجنب نقل المواد المشعة للكاسيت التصوير وتحليل من خلال أوتوراديوجرافي (الشكل 3).
- ملء الدائرة اللوني مع 1.5 "م 1.5 م خ"2ص4 (pH 3.64) بعمق 0.5 سم.
- تحليل البيانات
- تعرض لوحة بي-السليلوز التي تحتوي على ردود الفعل المنفصلين إلى كاسيت فوسفوريماجير ح 4 في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذا هو التعرض كافية لتعطي صورة واضحة جداً باستخدام تركيزات الطازجة γ-32ف-ATP المشار إليه. إذا كان يتم استخدام كميات أقل من الركازة راديولابيليد، يمكن زيادة وقت التعرض إلى ح 12-16. - صورة الكاسيت على فوسفوريماجير.
- باستخدام برنامج التصوير مع واجهة مستخدم رسومية، رسم "المناطق ذات الأهمية" (رويس) بتحديد رسم مستطيل باستخدام الماوس لرسم مستطيلة رويس الواردة حول البقع لين و ATP وبجب كامل داخل هذا الممر (الرقم 3 ).
- استخدام أوامر تحديد ونسخ، ولصق (أو أوامر المقابلة استناداً إلى برامج التصوير المستخدمة) رسم رويس متطابقة داخل الحارات الأخرى لضمان أن رويس يتم قياس الإشارات داخل مناطق مماثلة في كل حارة. وتشمل رويس من لين غير مستخدمة، وستستخدم كفراغات.
- استخدام تحليل | أدوات | إدارة العائد على الاستثمار | إضافة أوامر برامج التصوير، حدد كافة رويس مرسومة على لوحة السليلوز بي.
- استخدام تحليل | تعيين قياسات | قياس الأوامر، قياس كثافة إشارة داخل كل عائد الاستثمار والتصدير القياسات كجدول بيانات (الشكل 3). طرح قيم دوروا فارغة من إشارات التجريبية.
- حساب النسبة المئوية للإشارة استبدالها داخل كل حارة يعزى إلى ATP وبجب باستخدام الصيغ
ملاحظة: يمكن استخلاصها رويس و quantitated استخدام البرمجيات التجارية متوافقة مع فوسفوريماجير أو متوفرة بحرية ImageJ البرمجيات (المعاهد الوطنية للصحة).
- تعرض لوحة بي-السليلوز التي تحتوي على ردود الفعل المنفصلين إلى كاسيت فوسفوريماجير ح 4 في درجة حرارة الغرفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نقدم طريقة لتنقية تقارب سينثاتيز بجب (ف) من المطثيّة العسيرة وتقييم نشاطها الأنزيمي. يوضح الشكل 1 تنقية البروتين حققها اللوني تقارب معدنية. كان الكسر شطف (E2) الثانية من تنقية هذه دياليزيد وتستخدم لتحليل النشاط الأنزيمي. الشكل 2 تفاصيل الخطوات اللازمة لإعداد وإجراء فحوصات بيروفوسفوترانسفيراسي بطبقة رقيقة اللوني. ويوضح الشكل 3 كيف هو كوانتيتاتيد البيانات من هذه التجارب مع تركيز على تقطيع المناسبة وتحويل كثافة إشارة إلى النسب المئوية. في الشكل 4A، نقدم أوتوراديوجراف TLC ممثل للمقايسة سينثاتيز بجب (ف) استخدام المنقي RSH، سينثاتيز بجب جيم (ف). موقع البقعة الأولى، بجب والبقع ATP يتم مرئية بوضوح في أوتوراديوجراف، كما جبهة المذيب مرئياً لأنه يحتوي على كميات ضئيلة من الفوسفات غير العضوي راديولابيليد. الجزيئات مع أكثر حامض الفوسفوريك مويتيس يحمل أقل التنقل من موقع بقعة الأولية، كما أنها أكبر من الأوزان الجزيئية والتهمة الأيونية أكثر سلبية؛ وهذا يعوق قدرتهم على الحركة في بي-السليلوز الأساسية. مدى 120 دقيقة عند 37 درجة مئوية، تراكم بجب واستنفاد ATP لا تذكر في ردود الفعل التي تفتقر إلى الإنزيم سينثاتيز، بينما يتم استنفاد ATP وتراكم بجب بادية للعيان حضور RSH الشكل 4A). ويبين الشكل 4B إشارات ATP وبجب المطلقة من أربع تجارب. يبين الشكل 4 نفس البيانات الشكل 4B مع إشارات المطلق تحويلها إلى النسب المئوية لمجموع الإشارات المشعة. هذا يقلل من أخطاء بسبب خطأ بيبيتينج و/أو الاضمحلال الإشعاعي ويسمح للبيانات من التجارب التي يؤديها في أيام مختلفة تجميع دون إدخال الشك إلى البيانات.
رقم 1: النيكل تقارب تنقية RSH. هلام الملطخة بأخذ الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عرض ليساتي (L) وفصل ليساتي (CL) من فعل BL21 بممب::rsh-his6 ، وكذلك في التدفق من خلال (قدم)، يغسل 1 (W1)، وغسل 2، والكسور (E1 و E2) شطف بعد تنقية تقارب النيكل. وكان الكسر E2 دياليزيد والمستخدمة لفحوصات الانزيمية اللاحقة. يتم إظهار الأوزان الجزيئية لمعايير حجم البروتين على اليمين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: إعداد لوحات TLC. لوحات (A) يتم غسلها في بعد واحد بوضع الحافة السفلي في الماء (أزرق). ترحيل الملوثات (أصفر) إلى الجزء العلوي من اللوحة مع المذيب. (ب) بعد هو المجففة لوحة تماما، هو غسلها في بعد ثاني بتدويرها 90 درجة بالنسبة للغسيل الأولى ومرة أخرى السماح بالمياه إلى الهجرة إلى الجزء العلوي من اللوحة. يتم عزل الملوثات (ج) بعد الغسل، أي في إحدى زوايا اللوحة. قد يتم وضع علامة الراتنج من صفيحة TLC غسلها برفق مع قلم رصاص لينة للإشارة إلى حيث ينبغي أن يكون رصدت العينات. 2 ميكروليتر عينات، سيضمن الحد أدنى من 1 سم بين النقاط الفصل عينة كافية. عينات رصدت 2 سم من 'القاعدة' من اللوحة. بعد تطبيق نموذج، مسموح بالمذيبات لتشغيل إلى 'أعلى،' حيث أي ملوثات سوف يكون تم عزلة بواسطة يغسل الماء. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إشارة التحديد الكمي- تحديد المجموع المناطق ذات الاهتمام (رويس)، ترد ATP، وإشارة بجب لممر فارغ ولين تجريبية. كثافة إشارة داخل كل دوروا فارغة يخصم من قيمة تجريبية، ويتم تطبيع إشارات ATP وبجب إلى إشارة مجموع استخدام المعادلات سيظهر لعرض النسبة المئوية لمجموع إشارة المشعة يمكن أن تعزى إلى ATP وبجب. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4. أوتوراديوجراف صفيحة TLC تمثيلية: (A) هذه الصورة يبين جبهة المذيب، ATP، بجب، ومواقع البقعة الأولى من رد فعل القيام باستخدام تنقية جيم RSH. رد فعل عنصر تحكم الذي يحتوي على لا البروتين (أرستها) يسمح التحديد الكمي للتحلل المائي ATP أونكاتاليزيد بينما يسمح ممر فارغ إشارة دقيقة التحديد الكمي. (ب) إشارة مطلقة كثافات ATP وبجب خلال 120 دقيقة حضانة مع جيم RSH. يظهر هي الوسائل والانحرافات المعيارية لأربع تجارب مستقلة. (ج) نفس البيانات من (ب) مع بجب إشارة قدم كنسبة مئوية من مجموع الإشارات المشعة. تراكم بجب في مراقبة البروتين (أرستها) أي رد يرد باللون الأسود. يظهر هي الوسائل والانحرافات المعيارية لتجربتين مستقلة مع اثنين كل التقنية replicates. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نحن تقرير تنقية RSH صاحب معلم من جيم وتقديم طريقة لتقدير حجم النشاط باستخدام كروماتوغرافيا الطبقة الرقيقة راديولابيليد. سابقا وقد استخدم هذا الأسلوب لتقييم نشاط الإنزيمات سيكلاسي ديجوانيلاتي من جيم، فضلا عن (ف) بجب سينثاتيز، cyclase النوكليوتيدات، كيناز والأنزيمات فوسفوديستريس من سائر الكائنات الحية11،12 13، ،21. بينما الأسلوب ليس جديداً، نطاق واسع ينطبق على العديد من أنواع الفحص، ونأمل أن الباحثين سوف تجد في العرض التقديمي بتنسيق الفيديو مفيدة.
الخطوات الأكثر أهمية ضمن البروتوكول هي تنقية البروتين (الخطوات 2.1.3–2.1.10)، وإعداد رد فعل لطبقة رقيقة اللوني (الخطوة 2، 2، 2-3)، وتحليل البيانات (الخطوة 3، 4). لقد وجدنا بالتعديلات التالية أن تكون مفيدة بشكل خاص: إضافة مجكل2 للمخازن المؤقتة المستخدمة لتنقية النيكل العمود (الخطوات 2.1.3–2.1.10) حاسم بالنسبة للنشاط الأنزيمي من البروتين المنقي، والعرض تنتج بيانات نشاط إنزيم بجب % بدلاً من بجب المطلقة التي أنتجت يضمن أن البيانات التي تم جمعها في أيام مختلفة، مع مختلف من γ-32ف-ATP تتسق. هذا الأسلوب الوصول إلى أي فريق البحث بالوصول إلى فوسفوريماجير، وتحليل البيانات مباشرة. قبل كوانتيتاتينج فوسفوترانسفير النشاط كنسبة مئوية من 32ف تحويلها إلى بجب، علينا أن نضمن إمكانية تكرار نتائج البيانات. لأنه تم اكتشاف كميات صغيرة جداً من رد فعل على لوحات السيلولوز بي، وهناك إمكانيات كبيرة لعدم الدقة بيبيتينج طفيف لإدخال خطأ كبيرا في الكمية المطلقة γ-32ف-ATP أو 32فبجب في ممر معين على صفيحة TLC، ولكن توزيع إشارة المشعة بين الأشكال الممكنة مستقلة عن الإشارة الإجمالية الحالية. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تعتمد الإشارات المشعة الإجمالية في ممر معين على سن γ-32ف-ATP التي استخدمت في التجربة. 32 ف نصف عمر 14.3 يوما، وحتى إجراء فحوصات مستقلة إلى جانب عدة أيام يمكن أن تظهر اختلافات كبيرة في إشارة المشعة مجموع الكشف عن ولكن المبالغ النسبية راديولابيليد ATP وبجب تعتمد فقط على نشاط إنزيم. عرض البيانات ك 'النسبة المئوية بجب' بدلاً من بجب مطلقة إشارة يمنع إدخال ضجيج عشوائي من الخطأ بيبيتينج أو الانحلال الإشعاعي. ويتضح ذلك من الاختلافات بين الشكل 4B و جيم 4 كل عرض الوسائل والانحرافات المعيارية للبيانات من التجارب الأربعة نفسها، ولكن قد تم تطبيع البيانات في الشكل 4 إلى إشارة المشعة الإجمالية.
لقد حددنا أن الإنزيم RSH جيم بجب فنية سينثاتيز في المختبر، قادرة على بيروفوسفوترانسفير السريع من فوسفودونور ATP ويقبلون الناتج المحلي الإجمالي. رد الفعل هذا مرهون بالمغنيسيوم، التي تنسق ATP وملزم جانسين RSH الإنزيمات الأسرة22. لقد قمنا بتعديل البروتوكولات المصنعة للنيكل التقارب اللوني تشمل 5 مم مجكل2 في تحلل ومخازن المياه والصرف الصحي، فضلا عن شطف المخزن المؤقت نظراً لأننا وجدنا أن تنقية في الغياب المغنيسيوم ضار النشاط الأنزيمي للبروتين المنقي. وهذا يوحي بأن أيونات المغنيسيوم قد تلعب دوراً غير حفاز في استقرار هيكل البروتين في غياب النوكليوتيدات ملزمة، ولكن كذلك التوصيف الهيكلي سيكون ضروريا لتأكيد هذا.
على حد علمنا، هذا العمل هو التقرير المنشور الأول من التوليف بجب في جيم ، وتشير إلى أن هذا الكائن من المرجح أن تستخدم استجابة (ف) صارمة بجب بوساطة للبقاء على قيد الحياة خارج الخلية الإجهاد. (أبلغ بجب الأيض ع) ابدأ من قبل في هذا الممرض البشرية الهامة. ونظرا لأن استجابة صارمة المتورطة في استمرار في العديد من مسببات الأمراض الأخرى، فمن المحتمل أن بجب بوساطة الإشارات (ف) قد تلعب دوراً في التسامح الضغوط العالية للخلايا جيم ومعدل تكرار عالية جيم العدوى23،،من2425.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية أو غيرها تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم تمويل هذا العمل من نييد 1K22AI118929-01. وأيد EBP "الصيف زمالة برنامج منحة بحثية" من "مكتب بحوث" جامعة القديمة دومينيون، نورفولك، فيرجينيا، الولايات المتحدة الأمريكية.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | - | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | - | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | - | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | - |
References
- Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
- Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
- Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
- Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
- Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
- Graslund, S., et al.
- Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
- Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
- Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
- Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
- Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
- Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
- Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
- Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
- Potrykus, K., Cashel, M.
- Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
- Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
- Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
- Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
- Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
- Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
- Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
- Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
- Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
- US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).
