Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En rensning og In Vitro aktivitet Assay for en (p) ppGpp syntetase fra Clostridium difficile

Published: November 3, 2018 doi: 10.3791/58547
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Old Dominion University

Summary

Her, beskriver vi en metode til rensning af histidin-markeret pyrophosphokinase enzymer og anvende tyndtlagskromatografi radioaktive substrater og produkter til assay for enzymatisk aktivitet in vitro. Enzym aktivitet assay er stort set gælder for enhver kinase, nukleotid cyclase eller fosfor-overførsel reaktion hvis mekanisme omfatter nukleotid trifosfat hydrolyse.

Abstract

Kinase og pyrophosphokinase enzymer overføre gamma fosfat eller beta-gamma pyrofosfat gruppe fra nukleotid trifosfat prækursorer til substrater til at oprette fosforyleres produkter. Brugen af γ -32- P mærket NTP prækursorer tillader samtidig overvågning af substrat udnyttelse og produkt dannelsen af radiografi. Tyndtlagskromatografi (TLC) på cellulose plader giver hurtig adskillelse og følsomme kvantificering af substrat og produkt. Vi præsenterer en metode for at anvende tyndtlagskromatografi for at pyrophosphokinase aktiviteten af en renset (p) ppGpp syntetase-analysen. Denne metode har tidligere været anvendt til at karakterisere aktiviteten af cykliske nukleotid og dinucleotid synthetases og er generelt egnet til karakterisering af aktiviteten af et enzym, der hydrolyserer et nukleotid trifosfat bond eller overfører en terminal fosfat fra fosfat donor til en anden molekyle.

Introduction

Kinase og pyrophosphokinase (eller diphospho-kinase) enzymer overføre fosfater fra nukleotid trifosfat (NTP) prækursorer til substrater. Substraterne kan omfatte andre nukleotider, aminosyrer eller proteiner, kulhydrater og lipider1. Bioinformatic analyser kan undertiden forudsige et enzym beslægtet substrater eller substrater baseret på lighed karakteriseret enzymer, men eksperimentel validering er stadig nødvendige. På samme måde, et enzym affinitet for sin substrate(s) og den hastighed, hvormed det katalyserer phosphor-overførsel reaktion, og virkningerne af co-faktorer, hæmmere eller andre enzym effektorer skal bestemmes eksperimentelt. For at undgå nedbrydning af ATP forløber af andre ATP-forbrugende enzymer til stede i bakteriel cytoplasma, kræver kvantitative aktivitet assays oprenset protein.

Protein oprensning af metal affinitet kromatografi er blevet dækket grundigt i litteratur2,3. Histidin tags bestående af seks på hinanden følgende histidinrester føjes til N - eller C-terminalen af en rekombinant protein giver mulighed for hurtig rensning af metal affinitet kromatografi4,5,6. Disse sekvenser er lille i forhold til de proteiner, de ændre og typisk har en minimal effekt på protein funktion, selv om de kan nogle gange ændre protein stabilitet og/eller enzym kinetik7,8. Histidin tags på N - og C-termini af den samme protein kan have forskellige virkninger, som er vanskeligt at forudsige uden at vide det pågældende protein struktur. Histidin tags er typisk indarbejdet i kloning af en rekombinant protein ved at designe primere, der indkode seks histidinrester, enten straks 3' til ATG start codon eller straks 5' til stop-codon af åbne læsning rammen. Efter forstærkning, er hexahistidine-holdige genet forbundet til en vektor under kontrol af en inducerbar promotor og udtrykt, typisk i et laboratorium stamme af E. coli. Rekombination proteiner kan derefter være isoleret på en affinitet harpiks indeholdende immobiliseret divalent kationer (typisk nikkel eller kobolt)9. Forurener indfødte metal-bindende proteiner kan fjernes ved titrering med imidazol, som konkurrencedygtige fortrænger bundet protein2. Endelig, target proteinet elueres af kolonnen med højere koncentrationer af imidazol. Der er flere kommercielle kilder for immobiliseret metal kation harpiks, og fabrikanterne give anbefalinger til buffer betingelser og imidazol koncentrationer. Efter eluering, kan protein være analyseret af sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gelelektroforese (SDS-PAGE), dialysebehandling eller anvendes umiddelbart i funktionelle assays.

Der er flere metoder til indirekte overvåge kinase aktivitet ved at koble ATP fosfat bond hydrolyse til en anden reaktion, der frigiver eller ophidser en fluorophore eller genererer kemiluminescens, men disse reaktioner har flere bevægelige dele og kan være logistisk udfordrende10. Den mest enkle måde at måle specielt fosfor-overførselsaktivitet er direkte overvåge overførsel af en radiolabeled fosfat gruppen fra et kommercielt tilgængelige γ -32-P NTP forløber for en ikke-radiolabeled substrat11 , 12 , 13. blandinger af radiolabeled substrater og produkter kan være adskilt og kvantificeres ved tyndtlagskromatografi (TLC). TLC udnytter opløste stoffer i en given opløsningsmiddel differential mobilitet ved at tillade opløsningsmidler (flydende fase) til at overflytte af kapillaritet hen over en overflade (fast fase), som en blanding af opløste stoffer har været adsorberet14. Opløste stoffer, der er lille og/eller mangler gunstige interaktioner med den faste fase vil overflytte længere afstande fra deres oprindelige placering end opløste stoffer med højere Molekylær vægt eller stor tilhørsforhold til legemet. For undersoegelse af fosfor-overførsel øge fosfat fraspaltning molekylvægt af molekyler, de føjes til, og Tilføj negative ionisk afgift på neutral eller sure pH11,12,14. Dette nedsætter deres mobilitet på et grundlæggende overflade som PEI-cellulose. Når udviklet i sure kalium fosfat buffer, kan blandinger af mono-, di-, tri-, tetra- og pentaphosphate arter adskilles let på PEI-cellulose, giver mulighed for kvantificering af de enkelte arter (figur 2, figur 3). Disse analyser kan udføres ved hjælp af cellelysater der indeholder enzym af interesse, men dette omfatter potentiale for aktiviteten af andre kinaser og fosfataser, generelle ATPases til nedbryder substrat og/eller produkt. For en kvantitativ in vitro- vurdering af enzymaktivitet er det nødvendigt at rense enzym af interesse.

Guanosinmonofosfat tetraphosphate (ppGpp) og guanosinmonophosphat pentaphosphate (pppGpp) er ribonucleotide signalering, molekyler dannet af overførsel af en pyrofosfat gruppen fra en adenosin trifosfat (ATP) forløber, henholdsvis en Guanosinmonofosfat ud (BNP) eller Guanosinmonofosfat tetraphosphate (GTP) substrat15. Disse enkelt ribonucleotide signaler, kollektivt kendt som (p) ppGpp, mægle en celle-wide respons til miljøstress kendt som den strenge svar i forskellige bakteriearter15,16. To bevarede klasser af enzymer katalyserer dannelsen af (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer er 'lang' bifunctional (p) ppGpp syntetase/hydrolaser opkaldt efter deres lighed med Real og SpoT (p) ppGpp metaboliske enzymer fra Escherichia coli , der indeholder syntetase, hydrolase og regulerende domæner, mens små alarmone syntetase (SAS) enzymer er kort monofunctional synthetases findes udelukkende i Gram positive bakterier15, 17 , 18. spore-dannende Gram-positive bakterien Clostridium difficile koder formodede RSH og SAS gener19. Vi præsenterer her, indledende aktivitet assays, der bekræfter, at C. difficile RSH enzym er en katalytisk aktive (p) ppGpp syntetase.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducerbar overekspression af en histidin-mærkede Protein

  1. Forstærke rsh fra C. difficile R20291 genomisk DNA.
    1. Bruge et Hi-Fi-polymerase og Følg fabrikantens anvisninger.
    2. Forstærke C. difficile rsh ved hjælp af primere
      rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) og
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), som indfører en C-terminal hexahistidine tag.
      Bemærk: KpnI og PstI skæres websteder i primer sekvenser er fed.
    3. Fordøje pMMBneo vektor og rsh-his6 PCR produktet med Pstl og KpnI begrænsning skære websteder ved 37 ° C i 45 min.
    4. Rense lineariseret vektor og PCR fragmenter via Agarosen gelelektroforese og efterfølgende rensning med en DNA gel udvinding kit.
    5. Absorbansen 280 nm (en280) af vektor og det amplificerede PCR produkt. Bruge ligningen Equation 1 til bestemmelse af DNA koncentration af hver DNA-fragment.
  2. Ligate rsh i pMMBneo til udtryk.
    1. Kombiner 25 ng af fordøjet PMMBneo vektor, 125 ng rsh his6 gen produkt, 2 μl af 10 x ligase buffer og 1 μL af DNA ligase. Brug nukleasen gratis vand til at justere det samlede volumen til 20 μL. Inkuber ved 16 ° C i 16 h.
      Bemærk: Effekten af ligatur afhænger fragment størrelse og skal være justeret baseret på fabrikanten protokoller.
    2. Omdanne den sammenskrevne vektor produkt til E. coli DH5-α eller en anden recA - plasmid vedligeholdelse stamme. Vælg for transformerede celler på LB plader med 100 μg/mL kanamycin og Ruger i 16-24 timer ved 37 ° C.
    3. Vælge fire kolonier fra transformation plade (s) og streak hver på en frisk plade der indeholder 100 μg/mL kanamycin for DNA isolation. Inkuber de nye plader ved 37 ° C i 16-24 h og vælge én isolat for efterfølgende protein udtryk.
    4. For at bekræfte den succesfulde ligatur af den intakte rsh protein kodende region, pick en koloni af valgt isolere i 20 μL af vand, varme ved 95 ° C i 10 min, og bruge som en skabelon for en bekræftende PCR ved hjælp af den samme primer anvendes til at forstærke genet.
  3. Omdanne de verificerede plasmid ifølge standard transformation protokoller for E. coli bakterieplasmid omdannelse til E. coli BL21 system for højt udbytte protein produktion.
  4. Express RSH-His6 i E. coli.
    1. Vælg en enkelt koloni af E. coli BL21 omdannet med pMMBneo::rsh og podes 2 mL af LB medium med 50 μg/mL kanamycin. Der inkuberes ved 37 ° C 12-16 h under omrystning ved 250 omdrejninger i minuttet.
    2. Podes 500 mL af LB medie som indeholder 50 μg/mL kanamycin med 0,5 mL af overnight kultur for cellevækst og protein udtryk.
    3. Inkuber udtryk kultur ved 37 ° C og 250 rpm i en inkubator shaker indtil cellen tæthed når en OD600 0,167 ved 37 ° C.
    4. Reducere inkubator temperaturen til 30 ° C og vente 30 min for kultur temperaturen at falde.
    5. Fremkalde RSH udtryk ved at tilføje isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) til en endelig koncentration på 0,5 mM. Tillad induktion skal finde sted natten over (for 16 – 18 h) ved 30 ° C, rysten på 250 rpm.
    6. Pellet ved centrifugering ved 3,080 x g i 30 min. ved 4 ° C.
      Bemærk: Pellet kan opbevares natten over ved-20 ° C for rensning target protein den følgende dag uden mærkbart tab af protein udbytte eller enzymatisk aktivitet.

2. protein oprensning af nikkel affinitet kromatografi

Bemærk: Fortsætte direkte med protein oprensning fremgangsmåden nedenfor efter afklaring cellen lysate. Lagring af afklaret lysate ved 4 ° C natten over for efterfølgende protein oprensning reducerer protein udbytte.

  1. Rense protein ved hjælp af 1 mL af nikkel-Nitriloacetic syre (Ni-NTA) harpiks på en tyngdekraft kolonne.
    1. Dagen før brug, Blandingen henstår kolonnen natten over ved 4 ° C med 2 mL af ækvilibrering buffer (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 0,5 mg/mL Lysozym, 5 mM MgCl2, 10 mM imidazol, 0,25 mM DTT, 5 mM phenylmethane sulfonyl fluorid (PMSF), 10% glycerol).
    2. Den følgende dag bringe kolonnen fra 4 ° C til RT forud for lastning af klarede lysate og lad det stå til ~ 2-3 h.
      Bemærk: At bringe kolonnen at termisk ligevægt er afgørende for at undgå luftbobler danner i kolonnen.
    3. Resuspenderes fremstillet i trin 1.3.6 i lysisbuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,8, af 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 10% glycerol, 0,5 mg/mL Lysozym, 10 mM imidazol, 0,25 mM DTT og 5 mM PMSF).
    4. Der sonikeres celler på is til 8 x 10 s intervaller, pause 30 s mellem pulser.
    5. Præcisere de lysate ved centrifugering ved 3,080 x g i 30 min. ved 4 ° C ved hjælp af en microcentrifuge.
    6. Forberede lysate med lige store mængder af lysisbuffer derefter anvende den prepped afklaret lysate til kolonnen og indsamle gennemstrømnings-.
    7. Genanvende klarede lysate gennemstrømning til kolonnen og indsamle de sekundære gennemstrømnings.
    8. Kolonnen udvaskes med wash buffer 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 30 mM imidazol, 10% glycerol). Indsamle gennemstrømnings.
      Bemærk: Optagelse af 5 mM MgCl2 i vask og eluering buffere er vigtigt for enzymatisk aktivitet af oprenset protein.
    9. Kolonnen udvaskes med vaskebuffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4 og 50 mM imidazol). Indsamle gennemstrømnings.
    10. Anvende 2 mL eluering buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10% glycerol og 75 mM imidazol). Indsamle gennemstrømnings i to portioner på 1 mL.
      Bemærk: Kolonnen efter dette trin kan gemt i ækvilibrering buffer ved 4 ° C, hvis den samme protein vil blive renset i den næste rensning assay. Kolonnen kan bruges op til 3 gange, hvis gemt korrekt.
  2. Vurdere kolonne brøker for renhed af SDS-PAGE.
    1. Kvalitativt vurdere protein oprensning, køre 20 μL delprøver af alle kolonne fraktioner på en 4/10% polyacrylamid gel for 60 min. ved 170 V.
    2. Pletten gel med 0,1% Coomassie blå ved stuetemperatur for 5 h, rocking forsigtigt på en benchtop rocker.
    3. Destain gel i 40% methanol, 10% iseddike natten over ved stuetemperatur, vuggende på en benchtop rocker.
      Bemærk: En repræsentativ gel er afbilledet i figur 1.
  3. Dialyze elueres fraktion 2 natten over ved 4 ° C.
    1. Dialyze mod dialyse buffer (15,7 mM Tris-HCl (pH 7,6), 471.9 mM NaCl, 15.69 mM MgCl2, 1.57 mM DTT, 1,5 mM PMSF og 15,7% glycerol) på en 200: 1 ratio hjælp en 1 mL dialyse enhed med en 20 kDa molekylvægt cut-off (MWCO).
    2. Bestemme koncentrationen af dialysebehandling protein prøve ved måling af absorbans ved 280 nm og ved hjælp af den beregnede molær ekstinktion koefficient 82085 M-1cm-1 20.
    3. Gemme 5 μl delprøver af dialysebehandling protein prøven opbevares i alikvoter ved-80 ° C indtil brug.

3. protein aktivitet Assay ved tyndtlagskromatografi

  1. Forberede tyndt lag kromatografi plade.
    1. Inden du udfører reaktionen, forberede polyethyleneimine (PEI)-cellulose plader ved vask i ionbyttet vand. Læg pladerne i et glas kammer med dobbelt destilleret vand i en dybde af ~0.5 cm.
    2. Tillade vand at migrere til toppen af pladen.
      Bemærk: Vaske pladerne er ikke strengt nødvendige, som plader kan anvendes uden det, men vask øger klarheden af resulterende billeder. Vaske pladerne i to vinkelrette retninger yderligere sikrer, at alle forurenende stoffer til stede i harpiksen er isoleret i et hjørne af pladen (figur 2).
    3. Bringe pladerne ud af glas salen og forlade på en benchtop rack til tørre natten over (12-18 h).
    4. Markere de tørre plader 2,0 cm fra kanten med en blød blyant til at angive, hvor prøverne vil blive anvendt til TLC. For 2 μl prøver, anvende prøver ikke mindre end 1,0 cm fra hinanden (figur 2).
      Bemærk: Dette giver klar adskillelse mellem tilstødende spot, som er kritiske for signal kvantificering. Så længe cellulose harpiksen ikke er ridset, lille vil blyant mærker på overfladen ikke forstyrre opløsningsmiddel migration.
    5. Når du planlægger eksperimenter, altid forlade ét sted på hver plade ubrugt.
      Bemærk: Dette vil give en tom lane for prøven kvantificering (figur 2). En 20 cm TLC plade vil have plads til 19 steder.
  2. Enzym aktivitet assay
    1. Forbered en 5 x buffer blanding indeholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM ammoniumacetat, 10 mM KCl, 1 mM DTT og 0,6 mM ATP.
      Bemærk: Denne blanding kan tilberedes i store mængder og frosset i 10 μL delprøver til senere brug. Udsæt ikke mix for flere fryse-tø cykler.
    2. Udarbejde individuelle reaktioner der indeholder 3 μM RSH, 1 x buffer mix, 0,6 mM BNP, 1,2 mM MgCl2. Tilføje 1,0 μCi af γ -32P-ATP pr. 10 μL af reaktion og bruge nukleasen gratis vand til at bringe reaktion op til en ønskede volumen. Tilføj RSH efter de andre komponenter har været blandede, som tilsætning af RSH til nukleotid-holdige mix indleder enzymatisk aktivitet assay.
      Bemærk: Endelige reaktion volumen vil afhænge af antallet af timepoints prøver. For at prøve 2 μl/tidspunkt, samle 10 μL af reaktionsblandingen for hver 4 timepoints.
    3. For at kontrollere for ATP hydrolyse fra kontaminerende nukleasen aktivitet, samle en 10 μL reaktion der indeholder ingen protein og inkuberes det parallelt. Spot 2 μl prøver på t = 0 og slutningen af forsøget at sikre, at ATP ikke var hydrolyseres i mangel af protein.
    4. Straks efter tilsætning af RSH, fjerne 2 μl og spot det på mærket PEI-cellulose pladen som t = 0 min prøve.
    5. Inkuber reaktion ved 37 ° C, fjerne 2 μl delprøver på ønskede timepoints.
      Bemærk: Enzymatisk aktivitet ophører, når prøven er adsorberet på cellulose plade. Vente 10 – 30 min, efter den sidste spot føjes til plade før udvikling for at sikre komplet adsorption og prøve tørring.
  3. Tyndtlagskromatografi
    1. Fyld kromatografi kammer med 1,5 M 1,5 M KH2PO4 (pH 3.64) i en dybde af 0,5 cm.
      Bemærk: Lydstyrken behov vil afhænge af dimensionerne af kromatografi tank. Enhver glasbeholder med en plan bund, der er bred nok til at tillade indsættelse af TLC-pladen uden at bøje kan bruges som en udvikling tank med tilføjelse af et dække. TLC-pladen kan skæres ind i snævrere strimler med en ren razorblade at muliggøre en udvikling i et glas bægerglas dækket i plastfolie.
    2. Fordybe den nederste kant af pladen i opløsningsmiddel. Giver mulighed for at overflytte til toppen af pladen (~ 90 min).
      Bemærk: Mens opløsningsmiddel migration vil raste på toppen af pladen og prøver vil ikke tabt eller løbe sammen under en længere fordybelse, plader bør ikke efterlades i opløsningsmiddel natten over. Immersions længere end 4 h kan forårsage harpiks til at løsne sig fra pladen opbakning og resultere i tab af signal.
    3. Fjerne pladen fra kromatografi tank og placere den på en benchtop tørrestativ.
    4. Tillad plade til luft tørre natten over.
      Bemærk: Tørring kan fremskyndes ved hjælp af en hårtørrer. Tørhed kan vurderes ved farven af harpiks, som bliver mørkere, når de er våde og tilbagevenden til farven på en ubrugt plade når helt tørt.
    5. Når pladen er tør, wrap pladen i plastfolie at undgå overførsel af radioaktivt materiale til den billeddiagnostiske kassette og analysere ved Autoradiografi (figur 3).
  4. Dataanalyse
    1. Udsætte PEI-cellulose pladen som indeholder adskilte reaktioner på en phosphorimager kassette i 4 timer ved stuetemperatur.
      Bemærk: Dette er tilstrækkelig eksponering til at give et meget klart billede ved hjælp af de angivne koncentrationer af frisk γ -32P-ATP. Hvis lavere mængder af radioaktive substrat bruges, kan eksponeringstiden forhøjes til 12-16 h.
    2. Billede kassette på en phosphorimager.
    3. Brug software til billedbehandling med en grafisk brugergrænseflade, tegne regioner af interesse (ROIs) ved at vælge Tegne rektanglet og ved hjælp af musen til at tegne rektangulære ROIs omkring en hele lane og ATP og ppGpp steder indeholdt i denne lane (figur 3 ).
    4. Brug Vælg, kopier, og Indsæt kommandoer (eller tilsvarende kommandoer baseret på imaging software bliver brugt) at trække identiske ROIs inden for de andre baner for at sikre, at ROIs måler signal inden for identiske områder i hver bane. Omfatte ROIs fra en ubrugt lane, der skal bruges som blindprøver.
    5. Ved hjælp af analysere | Værktøjer | ROI Manager | Tilføj kommandoer af billedbehandlingsprogrammer, Vælg alle ROIs trukket på PEI cellulose plade.
    6. Ved hjælp af analysere | Sæt målinger | Foranstaltning kommandoer, kvantificere signal intensitet inden for hver ROI og eksportere målingerne som et regneark (figur 3). Trække blank ROI værdierne fra eksperimentel signaler.
    7. Beregne, hvor stor en procentdel af det blændede signal inden for hver lane er kan henføres til ATP og ppGpp ved hjælp af formlerEquation
      Bemærk: ROIs kan drages og quantitated ved hjælp af kommerciel software kompatibel med phosphorimager eller frit tilgængelige ImageJ software (National Institutes of Health).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi præsenterer en metode til affinitet rensning af en (p) ppGpp syntetase fra Clostridium difficile og vurderingen af dets enzymatiske aktivitet. Figur 1 viser den protein oprensning opnåede ved metal affinitet kromatografi. Den anden eluering (E2) fraktion fra denne rensning blev dialysebehandling og anvendes til enzymatisk aktivitet assay. Figur 2 beskriver de nødvendige trin til at forberede og udføre pyrophosphotransferase assays ved tyndtlagskromatografi. Figur 3 illustrerer, hvordan data fra disse eksperimenter er quantitated med en vægt på passende afblænding og omstilling af signal intensitet til procenter. I figur 4Apræsenterer vi en repræsentativ TLC autoradiograph af en (p) ppGpp syntetase analyse ved hjælp af renset RSH, en C. difficile (p) ppGpp syntetase. Indledende spot placering, ppGpp og ATP steder kan ses på autoradiograph, som er væskefronten, der er synlige, fordi det indeholder spormængder af radiolabeled uorganisk fosfat. Molekyler med flere fosforsyre fraspaltning udviser mindre mobilitet fra den oprindelige placering, spot, som de har større Molekylær vægt og mere negative ionisk afgift; Dette hindrer deres mobilitet på den grundlæggende PEI-cellulose. I løbet af 120 minutter ved 37 ° C er ppGpp ophobning og ATP udtynding ubetydelig i reaktioner mangler syntetase enzymet, mens både ATP udtynding og ppGpp ophobning er umiddelbart indlysende i RSH figur 4A). Figur 4B viser de absolutte ATP og ppGpp signaler fra fire forsøg. Figur 4 c viser de samme data som figur 4B med de absolutte signaler konverteres til procenter af de samlede radioaktive signal. Dette minimerer unøjagtigheder på grund af pipettering fejl og/eller radioaktivt henfald og giver mulighed for data fra forsøg udført på forskellige dage for at samles uden at indføre usikkerhed til data.

Figure 1
Figur 1: nikkel affinitet rensning af RSH. En Coomassie farvede SDS-PAGE gel viser lysate (L) og centrifugeret lysate (CL) af inducerede BL21 pMMB::rsh-his6 samt flow-gennem (FT), vask 1 (W1), vask 2 og eluering (E1 og E2) fraktioner efter nikkel affinitet rensning. E2 fraktion var dialysebehandling og bruges til efterfølgende enzymatiske assays. Molekylær vægt af protein størrelse standarder er vist til højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: forberedelse af TLC plader. (A) pladerne skylles i en dimension ved at placere den nederste kant i vand (blå). Forurenende stoffer (gule) migrere til toppen af pladen med opløsningsmiddel. (B) efter en plade er tørret helt, det er vasket i en anden dimension ved at dreje det 90 ° i forhold til den første vask og igen giver vand til at migrere til toppen af pladen. (C) efter vask, alle forurenende stoffer er isoleret i et hjørne af pladen. Harpiksen af en vasket TLC-pladen kan mærkes forsigtigt med en blød blyant til at angive, hvor prøverne bør være plettet. For 2 μl prøver, vil mindst 1 cm mellem steder sikre passende stikprøve adskillelse. Prøverne er spottet 2 cm fra bunden af pladen. Efter eksempelprogram, er opløsningsmiddel tilladt at køre til "top," hvor alle forurenende stoffer vil have været isoleret af skylninger med vand. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Signal kvantificering. Regioner af interesse (ROIs) definere totalen, er ATP og ppGpp signalet vist for en tom lane og en eksperimentel lane. Signal intensitet inden for hvert tomt ROI trækkes fra den eksperimentelle værdi, og ATP og ppGpp signaler er normaliseret til den samlede signal ved hjælp af ligninger vist at præsentere procentdelen af den samlede radioaktive signal kan henføres til ATP og ppGpp. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Autoradiograph af en repræsentativ TLC-pladen: (A) dette billede viser væskefronten, ATP, ppGpp og indledende spot placeringer af en reaktion, der foretages under anvendelse af renset C. difficile RSH. En kontrol reaktion der indeholder ingen protein (Nielsen) giver mulighed for kvantificering af reaktionen ATP hydrolyse mens en tom lane tillader nøjagtige signal kvantificering. (B) absolut signal intensiteter af ATP og ppGpp under 120 minutter af inkubationen med C. difficile RSH. Vist er de midler og standardafvigelser af fire uafhængige forsøg. (C) de samme data fra (B) med ppGpp signal præsenteret som en procentdel af de samlede radioaktive signal. ppGpp ophobning i ingen protein (Nielsen) kontrol reaktion er vist i sort. Vist er de midler og standardafvigelser af to uafhængige forsøg med to tekniske replikater hver. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her rapporterer vi en rensning af hans markeret RSH fra C. difficile og præsentere en metode for aktivitet kvantificering ved hjælp af radiolabeled tyndtlagskromatografi. Denne metode har tidligere været anvendt til at vurdere aktiviteten af diguanylate cyclase enzymer fra C. difficile, samt (p) ppGpp syntetase, nukleotid cyclase, kinase og phosphodiesterase enzymer fra andre organismer11,12 ,13,21. Metoden er ikke roman, det gælder stort set for mange typer af assay, og vi håber forskerne vil finde sin præsentation i video format nyttige.

De mest kritiske trin i protokollen er protein oprensning (trin 2.1.3–2.1.10), reaktion forberedelse til tyndtlagskromatografi (trin 2.2-2,3) og dataanalyse (trin 3,4). Vi har fundet følgende ændringer være navnlig hjælpsom: tilsætning af MgCl2 til buffere anvendes til nikkel kolonne rensning (trin 2.1.3–2.1.10) er afgørende for den enzymatiske aktivitet af oprenset protein, og præsentationen af den enzym aktivitetsdata som % ppGpp produceret snarere end absolut ppGpp produceret sikrer, at data på forskellige dage, med forskellige af γ -32P-ATP er konsekvent. Denne metode er tilgængelig for enhver forskningsgruppe med adgang til en phosphorimager, og data analysen er ligetil. Af quantitating phosphotransfer aktivitet som en procentdel af 32P konverteret til ppGpp, vi sikre data reproducerbarhed. Fordi meget små reaktion diskenheder er spottet på PEI-cellulose plader, er der betydelige muligheder for lille pipettering unøjagtigheder at indføre betydelige fejl i den absolutte mængde af γ -32P-ATP eller 32P-ppGpp i en given lane er uafhængig af den samlede signal til stede på TLC-pladen, men fordelingen af de radioaktive signal mellem de mulige former. Derudover kan de samlede radioaktive signal i en given lane afhænge af en alder af γ -32P-ATP anvendes i forsøget. 32 P har en halveringstid på 14,3 dage, så uafhængige assays udføres flere dages mellemrum kan vise betydelige forskelle i den samlede radioaktive signal opdaget men de relative mængder af radiolabeled ATP og ppGpp kun afhænge af enzymaktiviteten. Præsentere data som 'procent ppGpp' i stedet for absolutte ppGpp forhindrer signal indførelsen af tilfældige støj fra pipettering fejl eller radioaktivt henfald. Dette illustreres af forskellene mellem figur 4B og 4 C. Både vise de midler og standardafvigelser af data fra de samme fire forsøg, men dataene i figur 4 c er blevet normaliseret til de samlede radioaktive signal.

Vi har besluttet, at C. difficile RSH enzym er en funktionel ppGpp syntetase i vitro, kan hurtige pyrophosphotransfer fra et ATP phosphodonor og en BNP acceptor. Denne reaktion er afhængig af magnesium, som koordinerer ATP og Guanosinmonofosfat bindende ved RSH familie enzymer22. Vi har ændret producent protokoller for nikkel affinitet kromatografi med 5 mM MgCl2 i lysis og vask buffere samt eluering buffer fordi vi har fundet, at rensning i mangel af magnesium er skadelig for den enzymatisk aktivitet af oprenset protein. Dette tyder på, at magnesiumioner kan spille en ikke-katalytisk rolle i at stabilisere protein struktur i mangel af nukleotid bindende, men yderligere strukturelle karakterisering vil være nødvendigt at bekræfte dette.

Til vores viden, dette arbejde er den første offentliggjorte rapport af ppGpp syntese i C. difficile og angiver, at denne organisme er tilbøjelige til at udnytte (p) ppGpp-medieret strenge svar for at overleve ekstracellulære stress. (p) ppGpp metabolisme er aldrig før blevet rapporteret i denne vigtige menneskelige patogen. I betragtning af at den strenge svar er impliceret i persistens i mange andre patogener, er det sandsynligt, at (p) ppGpp-medieret signalering kan spille en rolle i høj stresstolerance af C. difficile celler og den høje tilbagefald af C. difficile infektion23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser eller andre interessekonflikter.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af NIAID 1K22AI118929-01. EBP blev støttet af en sommer Research Fellowship Program tilskud fra Office of Research på Old Dominion Universitet, Norfolk, Virginia, USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase New England Biolabs (NEB) M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit Qiagen 20021
KpnI restriction enzyme NEB R0142S
PstI restriction enzyme NEB R0140S
T4 DNA ligase NEB M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli NEB C2527I
IPTG Sigma-Aldrich 10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor Beckman Coulter Avanti -
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor Scilogex -
MaxQ SHKE6000 Incubator Thermo Scientific -
Ultrasonic processor Sonics VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin G Biosciences 786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL Thermo Scientific 29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) Spectrum G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell BioRad 1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank General Glass Blowing Company 80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support Sigma-Aldrich Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi Perkin Elmer NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM Bio Basic Canada AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) Alfa Aesar AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen GE Healthcare Life Sciences BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager GE Healthcare Life Sciences -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
  2. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
  3. Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
  4. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  5. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  6. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  7. Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
  8. Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
  9. Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
  10. Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
  11. Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
  12. Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
  13. Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
  14. Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
  15. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical? Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  16. Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
  17. Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
  18. Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
  19. Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
  20. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  21. Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
  22. Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
  23. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
  24. Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
  25. US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).

Tags

Immunologi og infektion udstede 141 Protein oprensning histidin tag (p) ppGpp tyndtlagskromatografi radionukleid mærkning pyrophosphokinase phosphotransfer
En rensning og <em>In Vitro</em> aktivitet Assay for en (p) ppGpp syntetase fra <em>Clostridium difficile</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. … More

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. B. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (141), e58547, doi:10.3791/58547 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter