Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Een zuivering en In Vitro activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van Clostridium difficile

Published: November 3, 2018 doi: 10.3791/58547
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Old Dominion University

Summary

Hier beschrijven we een methode voor de zuivering van histidine-gelabelde pyrophosphokinase enzymen en met behulp van Dunnelaagchromatografie van radioactief gelabelde substraten en producten voor de enzymatische activiteit in vitroassay. De enzym activiteit bepaling geldt in grote lijnen aan kinase, nucleotide cyclase, of fosfor-overdracht reactie waarvan mechanisme nucleotide trifosfaat hydrolyse omvat.

Abstract

Kinase en pyrophosphokinase enzymen overbrengen in de gamma-fosfaat of het beta-gamma pyrofosfaat deel van nucleotide trifosfaat precursors substraten gefosforyleerd producten te maken. Het gebruik van γ -32- P label NTP precursoren zorgt voor de gelijktijdige opvolging van substraat gebruik en product vorming door radiografie. Dunnelaagchromatografie (TLC) op cellulose platen kan snelle scheiding en gevoelige kwantificering van substraat en product. Presenteren we een methode voor het gebruik van de dunne-laag chromatografie te assay de pyrophosphokinase activiteit van een gezuiverde (p) ppGpp synthetase. Deze methode is eerder gebruikt voor het karakteriseren van de activiteit van cyclische nucleotide en dinucleotide synthetases en is in grote lijnen geschikt voor het karakteriseren van de activiteit van een enzym dat een nucleotide trifosfaat obligatie ontstabiel of overdraagt van een terminal fosfaat uit een fosfaat donor aan een andere molecule.

Introduction

Kinase en pyrophosphokinase (of diphospho-kinase) enzymen overbrengen fosfaten uit nucleotide trifosfaat (NTP) precursoren substraat moleculen. De substraten kunnen omvatten andere nucleotiden, aminozuren of eiwitten, koolhydraten en vetten1. Bioinformatic analyses kunnen soms voorspellen van een enzym cognaat substraat of substraten op basis van de gelijkenis met gekarakteriseerd enzymen experimentele validatie is echter nog steeds nodig. Ook de affiniteit van een enzym voor haar substrate(s) en het tarief waartegen het katalyseert de fosfor-overdracht-reactie, en de effecten van cofactoren, remmers, of andere enzym effectoren moeten experimenteel worden bepaald. Kwantitatieve activiteit testen vereisen om te voorkomen dat de uitputting van de voorloper van de ATP door andere ATP-verbruikende enzymen aanwezig in bacteriële cytoplasma, gezuiverde eiwit.

Eiwitreiniging door metalen affiniteitchromatografie is grondig gecoverd in de literatuur2,3. Histidine tags bestaande uit zes opeenvolgende histidine residuen toegevoegd aan de N - of C-terminus van een recombinant eiwit toestaan snelle zuivering door metal affinity chromatografie4,5,6. Deze sequenties zijn klein in vergelijking met de eiwitten ze wijzigen en hebben meestal een minimaal effect op eiwitfunctie, hoewel ze soms eiwitstabiliteit en/of enzyme kinetics7,8kunnen wijzigen. Histidine tags op de N - en C-termini van hetzelfde eiwit kunnen verschillende gevolgen hebben, die moeilijk te voorspellen, zonder de structuur van het eiwit in kwestie. Histidine tags zijn meestal tijdens het klonen van een recombinant eiwit door het ontwerpen van inleidingen die zes histidine residuen, ofwel onmiddellijk coderen 3' aan de ATG start codon of onmiddellijk 5' naar de stop codon van het open leesraam opgenomen. Na versterking, is het gen hexahistidine-bevattende afgebonden in een vector onder de controle van een afleidbare promotor en uitgedrukt, meestal in een laboratorium stam van E. coli. Het eiwit recombinatie kan vervolgens worden geïsoleerd op een hars van de affiniteit met daarin geïmmobiliseerdet divalente kationen (meestal nikkel of kobalt)9. Besmetting van inheemse metaal-bindende proteïnen kan worden verwijderd door titratie met imidazool, die concurrerend afhankelijke eiwitten2 verdringt. Ten slotte is het doel eiwit uit de kolom met hogere concentraties van imidazool geëlueerd. Er zijn verschillende commerciële bronnen voor geïmmobiliseerdet metalen catie harsen en de fabrikanten bieden aanbevelingen voor de buffer voorwaarden en imidazol concentraties. Na elutie, kan eiwit worden geanalyseerd door natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gelelektroforese (SDS-pagina), dialyzed of onmiddellijk gebruikt in functionele testen.

Er zijn verschillende methoden om niet indirect kinaseactiviteit controleren door de hydrolyse van ATP fosfaat bond koppelen aan een tweede reactie die loslaat of een fluorophore opwekt of Chemoluminescentie genereert, maar deze reacties hebben meerdere bewegende delen en kan logistiek uitdagende10. De eenvoudigste manier om te meten specifiek fosfor-overdracht activiteit is rechtstreeks volgen de overdracht van een radiolabeled fosfaatgroep van een commercieel beschikbare γ -32-P NTP voorloper van een niet-radiolabeled substraat11 , 12 , 13. mengsels van radiolabeled substraten en producten kunnen worden gescheiden en gekwantificeerd door de dunne laag chromatografie (TLC). TLC maakt gebruik van de differentiële mobiliteit van opgeloste stoffen in een bepaald oplosmiddel doordat het oplosmiddel (vloeibare fase) migreren door capillaire actie over een oppervlak (vaste fase) waarop een mengsel van opgeloste stoffen geadsorbeerde14is geweest. Opgeloste stoffen die zijn klein en/of gebrek aan gunstige interactie met de vaste fase zal migreren langere afstanden vanaf hun oorspronkelijke locatie dan opgeloste stoffen met een hoger molecuulgewicht of grote affiniteit voor de vaste stof. Voor de bestudering van fosfor-overdracht, fosfaat wordt verhoogd het molecuulgewicht van moleculen ze worden toegevoegd aan, en voeg negatieve Ionische lading aan neutrale of zure pH11,12,14. Dit vermindert hun mobiliteit op een fundamentele oppervlak zoals PEI-gemengd met cellulose. Wanneer ontwikkeld in zure kalium fosfaatbuffer, kunnen de mengsels van mono-, di-, tri-, tetra- en pentaphosphate soorten gemakkelijk worden gescheiden op PEI-cellulose, waardoor kwantificering van elke soort (Figuur 2, figuur 3). Dergelijke tests kunnen worden uitgevoerd met behulp van cel lysates met het enzym van belang, maar hierbij het potentieel voor de activiteit van andere kinases, fosfatasen genaamd, en algemene ATPasen aan het uitputten van het substraat en/of product. Een kwantitatieve in vitro beoordelingvan enzymactiviteit is het noodzakelijk voor het zuiveren van het enzym van belang.

Calciumguanosine tetraphosphate (ppGpp) en calciumguanosine pentaphosphate (pppGpp) zijn ribonucleotide signalering moleculen gevormd door de overdracht van een pyrofosfaat groep uit een voorloper van adenosinetrifosfaat (ATP) aan, respectievelijk, een calciumguanosine difosfaat (BBP) of calciumguanosine tetraphosphate (GTP) substraat15. Deze interne ribonucleotide signalen, gezamenlijk bekend als (p) ppGpp, bemiddelen een cel-brede reactie op milieudruk bekend als de strenge reactie in verschillende bacteriesoorten15,16. Twee geconserveerde klassen van enzymen katalyseren de vorming van (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymen zijn 'lang' bifunctionele (p) ppGpp synthetase/hydrolases is vernoemd naar hun gelijkenis met de EXTE en SpoT (p) ppGpp metabole enzymen van Escherichia coli die bevatten synthetase, hydrolase en regelgevende domeinen, terwijl kleine alarmone synthetase (SAS) enzymen korte monofunctional synthetases gevonden uitsluitend in Gram positieve bacteriën15, zijn 17 , 18. de spore-vormende gram-positieve bacterie Clostridium difficile codeert putatief RSH en SAS genen19. Hier presenteren we testen van de eerste activiteit die bevestigen dat de C. difficile RSH-enzym een catalytically actieve (p) ppGpp synthetase is.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. afleidbare overexpressie van een Histidine-gelabelde proteïnen

  1. Amplify rsh van C. difficile R20291 genomic DNA.
    1. Gebruik van een polymerase van hifi- en volg de instructies van de fabrikant.
    2. Versterken van C. difficile rsh gebruikend inleidingen
      rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) en
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), waarin een C-terminal hexahistidine code wordt ingevoerd.
      Opmerking: De KpnI- en PstI knippen van sites in de primer sequenties zijn vet.
    3. De vector pMMBneo verteren en het PCR-product van rsh-his6 met Pstl en KpnI beperking snijd sites bij 37 ° C gedurende 45 minuten.
    4. Het zuiveren van de gelineariseerde vector en de PCR-fragmenten via agarose gelelektroforese en latere zuiveren met een DNA kit voor de extractie van de gel.
    5. Meet de 280 nm extinctie (een280) van de vectoren en de vergrote PCR product. De vergelijking gebruiken Equation 1 om te bepalen van de concentratie van de DNA van elk fragment van DNA.
  2. Afbinden rsh in pMMBneo voor de expressie.
    1. Combineer 25 ng van verteerd PMMBneo vector, 125 ng rsh-his6 gene product, 2 μL van 10 x ligase buffer en 1 μL van DNA ligase. Gebruik de nuclease gratis water het totale volume aan 20 μL aanpassen. Incubeer bij 16 ° C voor 16 h.
      Opmerking: De werkzaamheid van afbinding hangt af van de grootte van het fragment en moet worden aangepast op basis van fabrikant protocollen.
    2. Transformeer de ligaturen vectorproduct in E. coli DH5-α of een ander recA - plasmide onderhoud stam. Selecteer voor getransformeerde cellen op LB platen met 100 μg/mL kanamycine en incubeer gedurende 16-24 uur bij 37 ° C.
    3. Kies van vier kolonies van de transformatie plaat (s) en strijk elk op een verse plaat met 100 μg/mL kanamycine om DNA te isoleren. Incubeer de nieuwe platen bij 37 ° C gedurende 16-24 uur en selecteer één isolaat voor de latere eiwit expressie.
    4. Om te bevestigen de succesvolle Afbinding van het eiwit van de intact rsh regio codering, pick een kolonie van de gekozen isoleren in 20 μL van water, warmte bij 95 ° C gedurende 10 min, en gebruiken als een sjabloon voor een bevestigende PCR met behulp van de dezelfde primer gebruikt om te vergroten van het gen.
  3. Transformeren de geverifieerde plasmide volgens standaard transformatie protocollen voor E. coli bacterieel plasmide transformatie in E. coli BL21 systeem voor hoge opbrengst eiwitproductie.
  4. Express RSH-His6 in E. coli.
    1. Selecteer een één kolonie van E. coli BL21 getransformeerd met pMMBneo::rsh en 2 mL LB medium met kanamycine van 50 μg/mL beënten. Incubeer bij 37 ° C 12 – 16 h terwijl het schudden van 250 toeren per minuut.
    2. Inoculeer 500 mL LB opslagmedium met 50 μg/mL kanamycine met 0,5 mL van de overnachting cultuur voor celgroei en eiwit expressie.
    3. Incubeer de expressie cultuur bij 37 ° C en 250 rpm in een incubator shaker totdat de celdichtheid een OD600 0.167 bij 37 ° C. bereikt
    4. Verlaag de temperatuur van de incubator tot 30 ° C en wacht 30 min voor de temperatuur van de cultuur te laten vallen.
    5. Induceren RSH expressie door isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) toe te voegen aan een definitieve concentratie van 0,5 mM. Toestaan dat de inductie plaatsvinden 's nachts (voor 16-18 h) bij 30 ° C, schudden bij 250 omwentelingen per minuut.
    6. Pellet door centrifugeren bij 3,080 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
      Opmerking: De pellet kan 's nachts achtergelaten worden bij-20 ° C voor het zuiveren van doel eiwitten de volgende dag zonder merkbaar verlies van eiwit opbrengst of enzymatische activiteit.

2. eiwitreiniging door de chromatografie van de affiniteit van nikkel

Opmerking: Verder rechtstreeks met eiwit zuivering stappen hieronder na de verduidelijking van de cel lysate. Opslaan verduidelijkt lysate bij 4 ° C's nachts voor latere eiwitreiniging het eiwit opbrengst vermindert.

  1. Zuiveren van eiwit gebruik van 1 mL van nikkel-Nitriloacetic zuur (Ni-NTA) hars in een gravity-kolom.
    1. De dag vóór gebruik, de kolom 's nachts bij 4 ° C met 2 mL evenwichtsinstelling buffer (10 mM Tris-HCl pH 7.79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO40,5 mg/mL lysozym, 5 mM MgCl2, 10 mM imidazool, 0,25 mM DTT, 5 mM phenylmethane sulfonyl equilibreer fluoride (PMSF), 10% glycerol).
    2. De volgende dag brengen de kolom van 4 ° C tot RT vóór het laden van de geklaarde lysate en laat het staan voor ~ 2 – 3 h.
      Opmerking: De kolom om thermisch evenwicht is van cruciaal belang om te voorkomen dat luchtbellen vormen binnen de kolom.
    3. Resuspendeer de pellet in stap 1.3.6 in de lysis-buffermengsel (10 mM Tris-HCl pH 7,8, van 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 10% glycerol, 0,5 mg/mL lysozym, 10 mM imidazool, 0,25 mM DTT en 5 mM PMSF) verkregen.
    4. Bewerk ultrasone trillingen ten cellen op ijs voor 8 x 10 s intervallen, onderbreken van 30 s tussen pulsen.
    5. Verhelder de lysate door centrifugeren bij 3,080 x g gedurende 30 minuten bij 4 ° C met behulp van een microcentrifuge.
    6. Bereiden lysate met gelijke hoeveelheid lysis-buffermengsel, dan gelden de klaargestoomd verduidelijkt lysate naar de kolom en verzamel de doorstroming.
    7. Opnieuw geklaarde lysate doorstroming op de kolom en verzamel de secundaire doorstroomtest.
    8. Was de kolom met was buffer 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 30 mM imidazool, 10% glycerol). Verzamel de doorstroming.
      Opmerking: Opname van 5 mM MgCl2 in de wash en elutie buffers is belangrijk voor enzymatische activiteit van de gezuiverde proteïne.
    9. Was de kolom met was buffer 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4 en 50 mM imidazol). Verzamel de doorstroming.
    10. 2 mL elutie buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10% glycerol en 75 mM imidazol) van toepassing. Verzamelen doorstroomtest in twee breuken van elk 1 mL.
      Opmerking: De kolom na deze stap kan worden opgeslagen in de evenwichtsinstelling buffer bij 4 ° C als hetzelfde eiwit zal gereinigd worden in de volgende bepaling van de zuivering. De kolom kan worden gebruikt tot 3 keer als adequaat opgeslagen.
  2. Beoordelen kolom breuken voor zuiverheid door SDS-PAGE.
    1. Om te beoordelen kwalitatief EiwitReiniging, 20 μL aliquots van alle fracties van de kolom op een 4/10% polyacrylamidegel gedurende 60 minuten op 170 V worden uitgevoerd.
    2. Vlek de gel met 0,1% Coomassie blue bij kamertemperatuur voor 5 h, rocking zachtjes op een benchtop rocker.
    3. Destain de gel in 40% methanol, 10% ijsazijn 's nachts bij kamertemperatuur, rocken op een benchtop rocker.
      Opmerking: Een representatieve gel is afgebeeld in Figuur 1.
  3. Dialyze Elueer breuk 2 's nachts bij 4 ° C.
    1. Dialyze tegen dialyse buffer (15.7 mM Tris-HCl (pH 7,6), 471.9 mM NaCl, 15.69 mM MgCl2, 1.57 mM DTT, 1.5 mM PMSF en 15,7% glycerol) bij een 200: 1 verhouding met behulp van een 1 mL dialyse-apparaat met een 20 kDa molecuulgewicht licht-donkerscheiding (MWCO).
    2. Bepaal de concentratie van dialyzed eiwitSteekproef door het meten van de absorptie bij 280 nm en het gebruik van de berekende molaire extinctie coëfficiënt 82085 M-1cm-1 20.
    3. Bewaren 5 μl aliquots van het monster dialyzed eiwit in aliquots bij-80 ° C tot gebruik.

3. eiwit activiteit Assay door Dunnelaagchromatografie

  1. De dunne laag chromatografie plaat voor te bereiden.
    1. Bereiden voordat u de reactie uitvoert, polyethyleneimine (PEI)-cellulose platen door wassen in gedeïoniseerd water. Plaats de platen in een glas kamer met dubbel gedestilleerd water tot een diepte van ~0.5 cm.
    2. Het toestaan van water om te migreren naar de bovenkant van de plaat.
      Opmerking: Wassen van de platen is niet strikt noodzakelijk is, zoals platen kunnen worden gebruikt zonder het, maar wassen de duidelijkheid van de resulterende afbeeldingen verhoogt. Wassen van de platen in twee loodrechte richtingen verder zorgt ervoor dat alle in de hars aanwezige contaminanten in een hoek van de plaat (Figuur 2) worden geïsoleerd.
    3. De platen uit de glazen zaal brengen en laat op een benchtop rek naar droge overnachting (12-18 h).
    4. Markeer de droge platen 2,0 cm vanaf een van de randen met een zacht potlood om aan te geven waar de monsters worden toegepast voor TLC. Toepassing voor 2 μL monsters, monsters niet minder dan 1,0 cm uit elkaar (Figuur 2).
      Opmerking: Hierdoor duidelijke scheiding tussen aangrenzende plek, die is van cruciaal belang voor de kwantificering van het signaal. Zolang de hars cellulose niet gekrast, kleine is zal potlood op het oppervlak niet interfereren met oplosmiddel migratie.
    5. Bij de planning van experimenten, laat altijd een plek op elke plaat ongebruikte.
      Opmerking: Dit zal voorzien in een lege lane monster kwantificering (Figuur 2). Een 20 cm TLC-plaat zal hebben ruimte voor 19 plekken.
  2. Enzym activiteit assay
    1. Bereid een 5 x buffer mix met 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 25 mM ammoniumacetaat, 10 mM KCl, 1 mM DTT en 0,6 mM ATP.
      Opmerking: Deze mix kan worden bereid in grote hoeveelheden en bevroren in 10 μL aliquots voor later gebruik. Stel niet bloot mix aan meerdere bevriezen-ontdooien cycli.
    2. Individuele reacties met 3 μM 1 x buffer mix, 0.6 mM BBP, RSH, 1.2 mM MgCl2voor te bereiden. Voeg 1.0 aanbevolen γ -32P-ATP per 10 μL van reactie en nuclease gratis water gebruiken om de reactie tot een gewenste volume. Voeg de RSH nadat de andere componenten zijn gemengd, zoals de toevoeging van RSH aan de nucleotide-bevattende mix de enzymatische activiteit assay initieert.
      Opmerking: Laatste reactie volume zal afhangen van het aantal timepoints bemonsterd. Als u monsters 2 μL/timepoint, wilt monteren 10 μL van reactiemengsel voor elke 4 timepoints.
    3. Om te controleren voor ATP-hydrolyse van contaminerende nuclease activiteit, monteren een 10 μL reactie die geen eiwitten bevatten en het parallel uit te broeden. Ter plaatse 2 μL monsters op t = 0 en aan het einde van het experiment om ervoor te zorgen dat ATP werd niet gehydrolyseerd bij gebrek aan eiwit.
    4. Onmiddellijk na toevoeging van RSH, verwijderen 2 μL en spot het op de gelabelde PEI-gemengd met cellulose bord als de t = 0 min monster.
    5. Incubeer de reactie bij 37 ° C, het verwijderen van 2 μL aliquots op gewenste tijdstippen.
      Opmerking: Enzymatische activiteit zal ophouden wanneer het monster op de plaat cellulose is geadsorbeerd. 10-30 min wachten nadat de laatste plek is toegevoegd aan de plaat vóór ontwikkeling om ervoor te zorgen volledige adsorptie en monster drogen.
  3. Dunnelaagchromatografie
    1. Vul de chromatografie-zaal met 1.5 M 1.5 M KH2PO4 (pH 3.64) tot een diepte van 0,5 cm.
      Opmerking: Het volume nodig zal afhangen van de afmetingen van de chromatografie-tank. Op elk soort recipiënt van glas met een niveau bodem die breed genoeg is om opneming van de TLC-plaat zonder bukken kan worden gebruikt als een ontwikkelende tank met de toevoeging van een cover. De TLC-plaat kan worden gesneden in smallere repen met een schone razorblade ontwikkeling in een bekerglas van glas, bedekt met plastic folie mogelijk te maken.
    2. Dompel de onderrand van de plaat in het oplosmiddel. Het toestaan van het oplosmiddel om te migreren naar de bovenkant van de plaat (~ 90 min).
      Opmerking: Hoewel oplosmiddel migratie bij de bovenkant van de plaat stoppen zal en monsters zal niet worden verloren of lopen samen tijdens een langere onderdompeling, platen mag niet worden overgelaten in oplosmiddel 's nachts. Duiken langer dan 4 uur kan de hars loskoppelen van de plaat die back-ups maken en resulteren in verlies van signaal.
    3. Verwijderen de plaat uit de tank chromatografie en plaats deze op een benchtop Droogrek.
    4. Laat de plaat in de lucht droog 's nachts.
      Opmerking: Drogen kan versneld worden door het gebruik van een haardroger. Droogte kan worden beoordeeld door de kleur van de hars, die zal donkerder als het NAT en terugkeer naar de kleur van een ongebruikte plaat wanneer volledig droog.
    5. Nadat de plaat droog is, wikkel de plaat in plastic folie te voorkomen van de overdracht van radioactief materiaal aan de beeldvorming cassette en analyseren met behulp van autoradiografie (Figuur 3).
  4. Data-analyse
    1. Bloot de PEI-gemengd met cellulose plaat met gescheiden reacties op een cassette phosphorimager voor 4 uur bij kamertemperatuur.
      Opmerking: Dit is voldoende blootstelling aan een heel duidelijk beeld met behulp van de aangegeven concentraties van verse γ -32P-ATP opleveren. Als lagere hoeveelheden radioactief gelabelde substraat worden gebruikt, kan blootstellingstijd wordt verhoogd naar 12-16 h.
    2. Het imago van de cassette op een phosphorimager.
    3. Met behulp van beeldbewerkingssoftware met een grafische gebruikersinterface, regio's of Interest (ROIs) tekenen door selecteren Rechthoek tekenen en de muis te gebruiken tot het opstellen van rechthoekige ROIs rondom één hele lane en de ATP en ppGpp vlekken deel uitmaakt van dat lane (Figuur 3 ).
    4. Gebruik de opdrachten voor selecteren, kopiëren en plakken (of de bijbehorende opdrachten op basis van de denkbaar software wordt gebruikt) tot het opstellen van identieke ROIs binnen de andere rijstroken om ervoor te zorgen dat de ROI signaal binnen identieke gebieden in elke baan meten. ROIs omvatten van een ongebruikte lane, om te worden gebruikt als lege cellen.
    5. Met behulp van de analyseren | Tools | ROI Manager | Toevoegen opdrachten van de imaging software, selecteert u alle de ROIs getrokken op de PEI cellulose plaat.
    6. Met behulp van de analyseren | Instellen van metingen | Maatregel opdrachten, kwantificeren van de signaalsterkte binnen elke ROI en de metingen exporteren als een werkblad (Figuur 3). Lege waarden van de ROI van experimentele signalen aftrekken.
    7. Berekenen welk percentage van het gewiste signaal binnen elke rijstrook te wijten is aan ATP en ppGpp met de formulesEquation
      Opmerking: ROIs kunnen worden getrokken en quantitated met behulp van commerciële software compatibel met de phosphorimager of vrij beschikbare ImageJ software (National Institutes of Health).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Presenteren we een methode voor de zuivering van de affiniteit van een (p) ppGpp synthetase van Clostridium difficile en de beoordeling van de enzymatische activiteit. Figuur 1 toont de eiwitreiniging bereikt door metalen affiniteitchromatografie. Het tweede deel van de elutie (E2) van deze reiniging was dialyzed en gebruikt voor de bepaling van de enzymatische activiteit. Figuur 2 geeft het nodige voorbereiden en uitvoeren van pyrophosphotransferase assays door Dunnelaagchromatografie. Figuur 3 ziet u hoe gegevens uit deze experimenten is quantitated met een nadruk op passende blanking en omzetting van signaalsterkte in percentages. In figuur 4Apresenteren wij een vertegenwoordiger TLC-autoradiograph van een (p) ppGpp synthetase bepaling met behulp van gezuiverde RSH, een C. difficile (p) ppGpp synthetase. De eerste plek locatie, ppGpp en ATP vlekken zijn duidelijk zichtbaar op de autoradiograph, aangezien de oplosmiddelen voorzijde die zichtbaar is omdat het bevat sporen van radiolabeled anorganisch fosfaat. Moleculen met meer fosforzuur wordt vertonen minder mobiliteit vanuit de eerste plek locatie, als ze grotere molecuulgewicht en meer negatieve Ionische lading hebben; Dit belemmert hun mobiliteit op de fundamentele PEI-gemengd met cellulose. In de loop van 120 minuten bij 37 ° C zijn ppGpp accumulatie en ATP uitputting te verwaarlozen in reacties ontbreekt de synthetase enzyme, terwijl zowel de ATP uitputting en de accumulatie van de ppGpp gemakkelijk herkenbaar in het bijzijn van de RSH figuur 4A zijn). Figuur 4B toont de absolute ATP en ppGpp signalen van vier experimenten. Figuur 4C toont dezelfde gegevens als figuur 4B met de absolute signalen omgezet in percentages van de totale radioactieve signaal. Hierdoor minimaliseert onjuistheden door pipetting fout en/of radioactief verval en kunnen gegevens uit experimenten uitgevoerd op verschillende dagen te worden samengevoegd zonder invoering van onzekerheid in de gegevens.

Figure 1
Figuur 1: nikkel affiniteit zuivering van RSH. Een Coomassie gebeitste SDS-pagina gel tonen lysate (L) en gecentrifugeerde lysate (CL) van geïnduceerde BL21 pMMB::rsh-his6 evenals de doorstroming (FT), 1 (W1) wassen, wassen 2 en elutie (E1 en E2) breuken na nikkel affiniteit zuivering. De Fractie van de E2 was dialyzed en gebruikt voor latere enzymatische tests. Molecuulgewicht van eiwit grootte normen worden weergegeven aan de rechterkant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: voorbereiding van TLC platen. (A) plaatjes worden gespoeld in één dimensie door het plaatsen van de onderste rand in water (blauw). Contaminanten (geel) migreren naar de bovenkant van de plaat met oplosmiddel. (B) na een plaat wordt volledig gedroogd, het wordt gewassen in een tweede dimensie door roteren 90 ° ten opzichte van de eerste wassen en opnieuw waardoor water om te migreren naar de bovenkant van de plaat. (C) na het wassen, ieder verontreinigingen zijn geïsoleerd in een hoek van de plaat. De hars van een gewassen TLC-plaat kan voorzichtig worden gemarkeerd met een zacht potlood om aan te geven waar de monsters moeten worden gespot. Voor 2 μL monsters, zal een minimum van 1 cm tussen vlekken zorgen voor een adequaat monster scheiding. Monsters zijn bevlekt 2 cm vanaf de 'onderkant' van de plaat. Na de voorbeeldtoepassing, oplosmiddel mag worden uitgevoerd naar de 'top,' waar eventuele verontreinigingen zal op zodanige wijze geïsoleerd door het water wast. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: signaal kwantificering. Regio's van belang (ROIs) vaststelling van de totaal, worden ATP en ppGpp signaal weergegeven voor een lege lane en een experimentele lane. Signaal intensiteit binnen elke lege ROI wordt afgetrokken van de waarde van de experimentele en de ATP en ppGpp signalen zijn genormaliseerd naar de totale signaal met behulp van de vergelijkingen aangetoond dat het percentage van het totale radioactieve signaal toe te schrijven aan ATP en ppGpp presenteren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4. Autoradiograph van een representatieve TLC-plaat: (A) dit beeld toont de oplosmiddelen voorkant, ATP, ppGpp en eerste plek plaatsen van een reactie uitgevoerd met behulp van gezuiverd C. difficile RSH. Een reactie van de controle die geen eiwitten (n.p.) bevatten kunt kwantificering van neerkomt ATP-hydrolyse, terwijl een lege lane nauwkeurige signaal kwantificering kunt. (B) Absolute signaal intensiteiten van ATP en ppGpp gedurende 120 minuten incubatie met C. difficile RSH. Getoond worden de gemiddelde en standaardafwijking van vier onafhankelijke experimenten. (C) dezelfde gegevens uit (B) met de ppGpp signaal gepresenteerd als een percentage van het totale radioactieve signaal. ppGpp accumulatie in de geen eiwit (n.p.) controle reactie wordt weergegeven in het zwart. Getoond worden de gemiddelde en standaardafwijking van twee onafhankelijke experimenten met twee technische replicatieonderzoeken elke. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier melden we de zuivering van zijn-gelabeld RSH van C. difficile en presenteer een methode voor de kwantificering van de activiteit met behulp van radiolabeled Dunnelaagchromatografie. Deze methode is eerder gebruikt om de activiteiten beoordelen van diguanylate cyclase enzymen van C. difficile, evenals (p) ppGpp synthetase, nucleotide cyclase, kinase en fosfodiësterase enzymen uit andere organismen11,12 ,13,21. Terwijl de methode niet nieuw is, het is breed toepasbare aan vele soorten assay, en wij hopen onderzoekers zal nuttig zijn presentatie in video-formaat.

De belangrijkste stappen in het protocol zijn de eiwitreiniging (stappen 2.1.3–2.1.10), reactie voorbereiding voor dunne laag chromatografie (stap 2.2 – 2.3) en data-analyse (stap 3.4). Wij hebben de volgende wijzigingen in het vooral nuttig gevonden: de toevoeging van MgCl2 om de buffers gebruikt voor nikkel kolom zuivering (stappen 2.1.3–2.1.10) is van cruciaal belang voor de enzymatische activiteit van de gezuiverde eiwit, en de presentatie van de enzym activiteitsgegevens als % ppGpp geproduceerd eerder dan het absolute ppGpp geproduceerd zorgt ervoor dat gegevens op verschillende dagen, met verschillende γ-32P-ATP stroken. Deze methode is toegankelijk voor elke onderzoeksgroep met toegang tot een phosphorimager, en de data-analyse is eenvoudig. Door quantitating phosphotransfer activiteit als een percentage van 32P geconverteerd naar ppGpp, wij zorgen voor reproduceerbaarheid van de gegevens. Omdat het zeer kleine reactie volumes zijn bevlekt op de platen van PEI-gemengd met cellulose, is er een groot potentieel voor lichte pipetting onjuistheden om significante tekortkomingen in de absolute hoeveelheid γ -32P-ATP of 32P-ppGpp in een bepaalde baan op de TLC-plaat, maar de verdeling van het radioactieve signaal tussen de mogelijke vormen is onafhankelijk van het totale signaal aanwezig. De totale radioactieve signaal in een bepaalde baan kan bovendien afhankelijk van de leeftijd van de γ -32P-ATP gebruikt in het experiment. 32 P heeft een halfwaardetijd van 14.3 dagen, dus onafhankelijke tests uitgevoerd enkele dagen uit elkaar kunnen tonen aanzienlijke verschillen in de totale radioactieve signaal gedetecteerd, maar de relatieve hoeveelheid radiolabeled ATP en ppGpp alleen afhankelijk enzymactiviteit. Presentatie van de gegevens als 'percentage ppGpp' in plaats van absolute ppGpp signaal voorkomt u dat de invoering van willekeurige ruis uit pipetting fout of radioactief verval. Dit wordt geïllustreerd door de verschillen tussen figuur 4B en 4 C. Zowel weergeven en de standaardafwijking van de gegevens uit de dezelfde vier experimenten, maar de gegevens in figuur 4C heeft op de totale radioactieve signaal is genormaliseerd.

We hebben vastgesteld dat de C. difficile RSH-enzym een functionele ppGpp synthetase in vitro, geschikt voor snelle pyrophosphotransfer van een ATP-phosphodonor en een BBP acceptor is. Deze reactie is afhankelijk van magnesium, die ATP en calciumguanosine bindend door RSH familie enzymen22 coördineert. We hebben bewerkt de protocollen van de fabrikant voor de chromatografie van de affiniteit van nikkel om 5 mM MgCl2 onder de lysis en wassen buffers, alsmede de elutie buffer omdat we hebben gevonden dat zuivering in de afwezigheid van magnesium ten koste van gaat de enzymatische activiteit van de gezuiverde proteïne. Dit suggereert dat magnesium ionen kunnen een niet-katalytische rol in het stabiliseren van de eiwitstructuur in de afwezigheid van de nucleotide-bindende, maar verdere structurele karakterisering zullen nodig zijn om dit te bevestigen.

Om onze kennis, dit werk is de eerste gepubliceerde rapport van ppGpp synthese in C. difficile en geeft aan dat dit organisme kunnen gebruik maken van een (p) ppGpp-gemedieerde strenge reactie om te overleven van extracellulaire stress. (ppGpp metabolisme p) is nooit eerder gemeld in deze belangrijke menselijke pathogenen. Gezien het feit dat de strenge reactie is betrokken bij persistentie in vele andere ziekteverwekkers, is het waarschijnlijk dat (p) ppGpp-bemiddelde signalering een rol bij de hoge stress tolerantie van C. difficile cellen en het tarief van de hoge herhaling van C. difficile spelen kan infectie23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.

Acknowledgments

Dit werk werd gefinancierd door NIAID 1K22AI118929-01. EBP werd gesteund door een subsidie van zomer Research Fellowship programma uit de Office of Research bij Old Dominion University, Norfolk, Virginia, Verenigde Staten.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase New England Biolabs (NEB) M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit Qiagen 20021
KpnI restriction enzyme NEB R0142S
PstI restriction enzyme NEB R0140S
T4 DNA ligase NEB M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli NEB C2527I
IPTG Sigma-Aldrich 10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor Beckman Coulter Avanti -
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor Scilogex -
MaxQ SHKE6000 Incubator Thermo Scientific -
Ultrasonic processor Sonics VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin G Biosciences 786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL Thermo Scientific 29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) Spectrum G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell BioRad 1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank General Glass Blowing Company 80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support Sigma-Aldrich Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi Perkin Elmer NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM Bio Basic Canada AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) Alfa Aesar AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen GE Healthcare Life Sciences BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager GE Healthcare Life Sciences -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
  2. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
  3. Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
  4. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  5. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  6. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  7. Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
  8. Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
  9. Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
  10. Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
  11. Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
  12. Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
  13. Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
  14. Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
  15. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical? Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  16. Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
  17. Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
  18. Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
  19. Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
  20. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  21. Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
  22. Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
  23. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
  24. Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
  25. US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).

Tags

Immunologie en infectie EiwitReiniging histidine label (p) ppGpp Dunnelaagchromatografie radionuclide labeling pyrophosphokinase phosphotransfer
Een zuivering en <em>In Vitro</em> activiteit Assay voor een (p) ppGpp Synthetase van <em>Clostridium difficile</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. … More

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. B. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (141), e58547, doi:10.3791/58547 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter