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Immunology and Infection

एक शुद्धि और इन विट्रो में गतिविधि परख के लिए एक (पी) ppGpp Synthetase से क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल

Published: November 3, 2018 doi: 10.3791/58547
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Old Dominion University

Summary

यहां, हम शुद्ध histidine के लिए एक विधि का वर्णन-टैग pyrophosphokinase एंजाइमों और radiolabelled सब्सट्रेट और एंजाइमी गतिविधि के लिए परख करने के लिए उत्पादों की पतली परत क्रोमैटोग्राफी का उपयोग इन विट्रो में। एंजाइम गतिविधि परख मोटे तौर पर किसी भी कळेनासे, न्यूक्लियोटाइड cyclase, या फास्फोरस-हस्तांतरण प्रतिक्रिया जिसका तंत्र न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट hydrolysis शामिल करने के लिए लागू है ।

Abstract

कळेनासे और pyrophosphokinase एंजाइम न्यूक्लियोटाइड उत्पादों को बनाने के लिए ट्राइफॉस्फेट phosphorylated पुरोगामी से गामा फॉस्फेट या बीटा-गामा pyrophosphate moiety को स्थानांतरित करते हैं । γ-३२-P लेबल NTP पुरोगामी का उपयोग रेडियोग्राफी द्वारा सब्सट्रेट उपयोग और उत्पाद गठन के एक साथ निगरानी की अनुमति देता है । पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) फाइबर प्लेट पर तेजी से जुदाई और संवेदनशील सब्सट्रेट और उत्पाद की ठहराव की अनुमति देता है । हम एक शुद्ध (पी) ppGpp synthetase की pyrophosphokinase गतिविधि परख करने के लिए पतली परत क्रोमैटोग्राफी के उपयोग के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं । इस विधि पहले चक्रीय न्यूक्लियोटाइड और dinucleotide synthetases की गतिविधि की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया है और एक hydrolyzes न्यूक्लियोटाइड बांड ट्राइफॉस्फेट या एक टर्मिनल स्थानांतरण कि किसी भी एंजाइम की गतिविधि निस्र्पक के लिए मोटे तौर पर उपयुक्त है फास्फेट एक फॉस्फेट दाता से दूसरे अणु के लिए ।

Introduction

कळेनासे और pyrophosphokinase (या diphospho-कळेनासे) एंजाइमों न्यूक्लियोटाइड ट्राइफॉस्फेट से फॉस्फेट स्थानांतरण (NTP) अग्रदूतों सब्सट्रेट अणुओं के लिए. सब्सट्रेट अन्य न्यूक्लियोटाइड, अमीनो एसिड या प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, और लिपिड1शामिल कर सकते हैं । Bioinformatic जोडकर कभी-कभार एक एंजाइम के cognate सब्सट्रेट या सब्सट्रेट्स की विशेषता एंजाइमों की समानता के आधार पर भविष्यवाणी कर सकते हैं, लेकिन प्रयोगात्मक सत्यापन अभी भी आवश्यक है । इसी तरह, अपने सब्सट्रेट (एस के लिए एक एंजाइम के संबध) और दर जिस पर यह फास्फोरस catalyzes-स्थानांतरण प्रतिक्रिया, और सह कारकों के प्रभाव, अवरोधकों, या अन्य एंजाइम प्रभाव का निर्धारण किया जाना चाहिए प्रयोग. अंय एटीपी से एटीपी अग्रदूत साबित बैक्टीरिया कोशिका द्रव्य में मौजूद एंजाइमों की कमी से बचने के लिए, मात्रात्मक गतिविधि परख शुद्ध प्रोटीन की आवश्यकता है ।

धातु संबध क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन शुद्धिकरण साहित्य2,3में अच्छी तरह से कवर किया गया है । Histidine टैग लगातार छह Histidine अवशेषों से मिलकर N-या सी एक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की टर्मिनस के लिए संलग्न धातु संबध क्रोमैटोग्राफी4,5,6द्वारा तेजी से शुद्धि की अनुमति देते हैं । इन दृश्यों प्रोटीन वे संशोधित करने और आम तौर पर प्रोटीन समारोह पर एक न्यूनतम प्रभाव है की तुलना में छोटे हैं, हालांकि वे कभी-कभार प्रोटीन स्थिरता और/या एंजाइम कैनेटीक्स7,8बदल सकते हैं । एन पर Histidine टैग-और सी-टर्मिनी एक ही प्रोटीन के विभिंन प्रभाव है, जो सवाल में प्रोटीन की संरचना जाने के बिना भविष्यवाणी मुश्किल हो सकता है । Histidine टैग आमतौर पर एक रिकॉमबिनेंट प्रोटीन की क्लोनिंग प्राइमरों कि छह Histidine अवशेषों सांकेतिक शब्दों में बदलना, या तो तुरंत 3 ' ATG शुरू codon या तुरंत 5 ' के लिए खुला पढ़ने के फ्रेम के रोकने के codon के लिए शामिल हैं । प्रवर्धन के बाद, hexahistidine जीन युक्त एक वेक्टर में एक inducible प्रमोटर के नियंत्रण में ligated है और व्यक्त की है, आमतौर पर ई. कोलाईके एक प्रयोगशाला तनाव में । पुनर्संयोजन प्रोटीन तो एक समानता मैटीरियल divalent cations युक्त राल पर अलग किया जा सकता है (आमतौर पर निकल या कोबाल्ट)9। दूषित देशी धातु-बाध्यकारी प्रोटीन अनुमापन द्वारा imidazole के साथ हटाया जा सकता है, जो प्रतिस्पर्धी सीमित प्रोटीन2विस्थापित करता है । अंत में, लक्ष्य प्रोटीन imidazole के उच्च सांद्रता के साथ कॉलम से eluted है । वहां स्थिर धातु कटियन रेजिन के लिए कई वाणिज्यिक स्रोत हैं, और निर्माताओं बफर शर्तों और imidazole सांद्रता के लिए सिफारिशें प्रदान करते हैं । रेफरेंस के बाद, प्रोटीन सोडियम dodecyl सल्फेट-polyacrylamide जेल ट्रो (एसडीएस-PAGE), dialyzed, या कार्यात्मक परख में तुरंत इस्तेमाल किया द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है ।

वहां परोक्ष रूप से एक दूसरी प्रतिक्रिया है कि विज्ञप्ति या एक fluorophore उत्तेजित या chemiluminescence उत्पंन करने के लिए एटीपी फॉस्फेट बांड hydrolysis युग्मन द्वारा कळेनासे गतिविधि की निगरानी करने के लिए कई तरीके हैं, लेकिन इन प्रतिक्रियाओं कई चलती भागों है और हो सकता है रसद10चुनौतीपूर्ण । विशेष रूप से उपाय फास्फोरस-हस्तांतरण गतिविधि के लिए सबसे सरल तरीका सीधे एक गैर-radiolabeled सब्सट्रेट11 करने के लिए एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध γ-३२-P NTP अग्रदूत से एक radiolabeled फॉस्फेट समूह के हस्तांतरण की निगरानी करने के लिए है , 12 , 13. radiolabeled सब्सट्रेट और उत्पादों का मिश्रण अलग किया जा सकता है और पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) द्वारा quantified । टीएलसी विलायक (तरल चरण) एक सतह (ठोस चरण) है जिस पर solutes का मिश्रण14adsorbed किया गया है भर में केशिका कार्रवाई द्वारा विस्थापित करने की अनुमति देकर एक दिया विलायक में solutes के अंतर गतिशीलता का इस्तेमाल करता है । Solutes कि छोटे और/या ठोस चरण के साथ कमी अनुकूल बातचीत उच्च आणविक भार या ठोस के लिए महान समानताएं के साथ Solutes से अपने प्रारंभिक स्थान से अब दूरी की ओर पलायन होगा । फास्फोरस की परीक्षा के लिए-स्थानांतरण, फास्फेट moieties अणुओं वे करने के लिए जोड़ रहे हैं की आणविक वजन में वृद्धि, और तटस्थ या अंलीय पीएच11,12,14पर नकारात्मक ईओण चार्ज जोड़ने । इस तरह पी-फाइबर के रूप में एक बुनियादी सतह पर उनकी गतिशीलता कम हो जाती है । जब अंलीय पोटेशियम फॉस्फेट बफर में विकसित, मोनो के मिश्रण-, di-, त्रिकोणीय, टेट्रा-, और pentaphosphate प्रजातियों आसानी से पी-फाइबर पर अलग किया जा सकता है, प्रत्येक प्रजाति (चित्रा 2, चित्रा 3) के ठहराव की अनुमति. ऐसे परख सेल ब्याज के एंजाइम युक्त lysates का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह अंय kinases, phosphatases की गतिविधि के लिए क्षमता भी शामिल है, और सामांय ATPases सब्सट्रेट और/ के लिए एक मात्रात्मक में इन विट्रो एंजाइम गतिविधि का आकलन, यह ब्याज की एंजाइम को शुद्ध करने के लिए आवश्यक है.

Guanosine tetraphosphate (ppGpp) और Guanosine pentaphosphate (pppGpp) एक ribonucleotide pyrophosphate (एटीपी) के अग्रदूत से एक adenosine समूह के हस्तांतरण द्वारा गठित अणुओं संकेत ट्राइफॉस्फेट हैं, क्रमशः, एक Guanosine diphosphate (जीडीपी) या guanosine tetraphosphate (GTP) सब्सट्रेट15. इन एकल ribonucleotide संकेतों, सामूहिक रूप से (पी) ppGpp के रूप में जाना जाता है, पर्यावरण विविध जीवाणु प्रजातियों15,16में कड़े जवाब के रूप में जाना जाता तनाव के लिए एक सेल व्यापक प्रतिक्रिया मध्यस्थता । एंजाइमों के दो के संरक्षण वर्गों उत्प्रेरित (पी) के गठन के ppGpp15,17 रिलायंस एनर्जी/homolog (RSH) एंजाइमों ' लंबे ' है bifunctional (पी) ppGpp synthetase/hydrolases के लिए उनकी समानता के लिए नामांकित रिला और स्पॉट (पी) ppGpp चयापचय एंजाइमों ई कोलाई जिसमें synthetase, hydrolase, और विनियामक डोमेन होते हैं, जबकि छोटे alarmone synthetase (SAS) एंजाइमों लघु monofunctional synthetases में विशेष रूप से पाए जाते हैं ग्राम सकारात्मक बैक्टीरिया15, 17 , 18. बीजाणु बनाने वाले चने-पॉजिटिव जीवाणु क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल encodes ख्यात RSH और एसएएस जीन19. यहां, हम प्रारंभिक गतिविधि परख कि पुष्टि करते है कि सी. डिफीसाइल RSH एंजाइम एक उत्प्रेरक सक्रिय (पी) ppGpp synthetase है वर्तमान ।

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Protocol

1. Inducible एक Histidine के व्यक्त-प्रोटीन टैग

  1. बढ़ाना rsh से C. डिफीसाइल R20291 जीनोमिक DNA.
    1. एक उच्च निष्ठा पोलीमरेज़ का प्रयोग करें और निर्माता के निर्देशों का पालन करें ।
    2. बढ़ाना C. डिफीसाइल rsh प्राइमरों का उपयोग
      rsh_F (सीएGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) और
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), जो सी-टर्मिनल hexahistidine टैग का परिचय देती है ।
      नोट: प्राइमरी जुगाड़ में KpnI और PstI कट साइट्स बोल्ड हो जाती हैं ।
    3. pMMBneo वेक्टर और rsh-his6 पीसीआर उत्पाद डाइजेस्ट Pstl और KpnI प्रतिबंध के साथ ३७ ° c पर ४५ मिनट के लिए साइटों कटौती ।
    4. रैखिक वेक्टर और agarose जेल ट्रो और एक डीएनए जेल निष्कर्षण किट के साथ बाद में शुद्धि के माध्यम से पीसीआर टुकड़े शुद्ध ।
    5. वेक्टर और प्रवर्धित पीसीआर उत्पाद के २८० एनएम अवशोषक (एक२८०) को मापने । समीकरण Equation 1 का उपयोग करने के लिए प्रत्येक डीएनए टुकड़ा के डीएनए एकाग्रता निर्धारित करते हैं ।
  2. अभिव्यक्ति के लिए pMMBneo में Ligate rsh ।
    1. गठबंधन 25 पचा PMMBneo वेक्टर के एनजी, rsh के १२५ एनजी -his6 जीन उत्पाद, 2 10x ligase बफर के μL, और डीएनए μL के 1 ligase । कुल मात्रा को 20 μL में समायोजित करने के लिए nuclease मुक्त पानी का उपयोग करें । 16 एच के लिए 16 डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
      नोट: बंधाव की प्रभावकारिता टुकड़ा आकार पर निर्भर करता है और निर्माता प्रोटोकॉल के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए.
    2. ई. कोलाई DH5-α या एक और recA- प्लाज्मिड रखरखाव तनाव में ligated वेक्टर उत्पाद रूपांतरण । ३७ डिग्री सेल्सियस पर १०० μg/एमएल कनमीसिन और 16 के लिए गर्मी के साथ पौंड प्लेटों पर रूपांतरित कोशिकाओं के लिए चुनें-24 ज ।
    3. परिवर्तन की थाली से चार कालोनियों उठाओ (ओं) और लकीर प्रत्येक डीएनए अलगाव के लिए १०० μg/एमएल कनमीसिन युक्त एक ताजा थाली पर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर 16 के लिए नई प्लेट्स-24 ज और बाद में प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक अलग का चयन करें ।
    4. बरकरार rsh प्रोटीन क्षेत्र कोडन के सफल बंधाव की पुष्टि करने के लिए, चुना के एक कॉलोनी उठाओ पानी की 20 μL में अलग, 10 मिनट के लिए ९५ डिग्री सेल्सियस पर गर्मी, और एक पुष्टि पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग एक ही प्राइमर का उपयोग करने के लिए जीन बढ़ाना इस्तेमाल किया.
  3. उच्च उपज प्रोटीन उत्पादन के लिए ई. कोलाई BL21 प्रणाली में ई. कोलाई बैक्टीरियल प्लाज्मिड परिवर्तन के लिए मानक परिवर्तन प्रोटोकॉल के अनुसार सत्यापित प्लाज्मिड रूपांतरण ।
  4. एक्सप्रेस RSH-His6 में ई. कोलाई.
    1. ई. कोलाई BL21 की एक एकल कॉलोनी का चयन pMMBneo के साथ तब्दील::rsh और inoculate ५० μg/एमएल कनमीसिन के साथ पौंड मध्यम के 2 मिलीलीटर । ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन 12-16 घंटे जबकि २५० rpm पर मिलाते हुए ।
    2. Inoculate ५०० मिलीलीटर के पौंड मध्यम से ५० μg/एमएल कनमीसिन के साथ सेल विकास और प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए रातोंरात संस्कृति की ०.५ मिलीलीटर ।
    3. ३७ डिग्री सेल्सियस और २५० rpm में एक मशीन की सघनता में अभिव्यक्ति संस्कृति की मशीन जब तक सेल घनत्व ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक आयुध डिपो६०० ०.१६७ तक पहुंचता है ।
    4. 30 ° c करने के लिए मशीन तापमान को कम करने और ड्रॉप करने के लिए संस्कृति के तापमान के लिए 30 मिनट रुको ।
    5. ०.५ mM के अंतिम एकाग्रता के लिए isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) जोड़कर RSH अभिव्यक्ति प्रेरित । प्रेरण की अनुमति दें रात भर जगह लेने के लिए (16 के लिए-18 एच) 30 डिग्री सेल्सियस पर, २५० rpm में मिलाते हुए ।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ३,०८० x g पर केंद्रापसारक द्वारा गोली ।
      नोट: गोली रात में संग्रहीत किया जा सकता है-20 ° c प्रोटीन उपज या एंजाइमी गतिविधि के ध्यान देने योग्य हानि के बिना लक्ष्य प्रोटीन अगले दिन शुद्ध करने के लिए ।

2. निकल अपनत्व क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रोटीन शुद्धि

नोट: सेल lysate को स्पष्ट करने के बाद नीचे दिए गए प्रोटीन शुद्धि चरणों के साथ सीधे जारी रखें । बाद में प्रोटीन शुद्धि के लिए रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर lysate स्पष्ट भंडारण प्रोटीन उपज को कम कर देता है ।

  1. एक गुरुत्वाकर्षण कॉलम पर निकल-Nitriloacetic एसिड (Ni-ंत्) राल का 1 मिलीलीटर का उपयोग कर प्रोटीन को शुद्ध ।
    1. उपयोग करने से पहले दिन, equilibration बफर के 2 मिलीलीटर के साथ 4 ° c पर रात भर कॉलम equilibrate (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.७९, ३०० मिमी NaCl, ५० मिमी णः2पीओ4, ०.५ मिलीग्राम/एमएल lysozyme, 5 मिमी MgCl2, 10 मिमी imidazole, ०.२५ मिमी डीटीटी, 5 मिमी phenylmethane sulfonyl फ्लोराइड (PMSF), 10% ग्लिसरॉल).
    2. निंनलिखित दिन 4 ° c से कॉलम लाने के लिए आरटी से पहले स्पष्ट lysate लोड हो रहा है और इसे ~ 2-3 एच के लिए खड़े हो जाओ ।
      नोट: थर्मल संतुलन के लिए कॉलम लाने के लिए हवा कॉलम के भीतर बनाने के बुलबुले से बचने के लिए महत्वपूर्ण है ।
    3. lysis बफर में चरण 1.3.6 में प्राप्त गोली resuspend (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच ७.८, ३०० मिमी NaCl, 5 मिमी MgCl2, ५० मिमी णः2पीओ4, 10% ग्लिसरॉल, ०.५ मिलीग्राम/एमएल lysozyme, 10 मिमी imidazole, ०.२५ मिमी डीटीटी और 5 मिमी PMSF).
    4. बर्फ पर Sonicate कोशिकाओं 8 x 10 s अंतराल के लिए, दालों के बीच 30 एस रोक.
    5. ३,०८० पर 30 मिनट के लिए एक्स जी में केंद्रापसारक द्वारा lysate स्पष्ट 4 डिग्री सेल्सियस एक microcentrifuge का उपयोग कर ।
    6. lysis बफर के बराबर मात्रा के साथ lysate तैयार फिर लागू prepped स्तंभ के लिए lysate स्पष्ट है और प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
    7. स्पष्ट lysate प्रवाह-के माध्यम से स्तंभ को पुन लागू करें और द्वितीयक प्रवाह-के माध्यम से संग्रहीत ।
    8. वॉश बफर 1 के साथ कॉलम धो (10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.७९), ३०० मिमी NaCl, 5 मिमी MgCl2, ५० मिमी णः2पीओ4, 30 मिमी imidazole, 10% ग्लिसरॉल). प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
      नोट: वॉश और रेफरेंस बफ़र्स में 5 एमएम MgCl2 का समावेश, शुद्ध प्रोटीन की एंजाइमी गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है ।
    9. वॉश बफर 2 (10 मिमी Tris-एचसीएल (पीएच ७.७९), ३०० मिमी NaCl, 5 मिमी MgCl2, ५० मिमी णः2पीओ4 और ५० मिमी imidazole) के साथ कॉलम धो लें । प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
    10. 2 एमएल रेफरेंस बफर (10 एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ७.७९), ३०० एमएम NaCl, ५० एमएम णः2पीओ4, 10% ग्लिसरॉल और ७५ एमएम imidazole) लागू करें । 1 मिलीलीटर प्रत्येक के दो भागों में प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा ।
      नोट: इस चरण के बाद कॉलम equilibration बफर में 4 ° c पर संग्रहीत किया जा सकता है अगर एक ही प्रोटीन अगले शोधन परख में शुद्ध किया जाएगा । यदि ठीक से संग्रहीत किया जाए तो स्तंभ 3 बार तक उपयोग किया जा सकता है ।
  2. एसडीएस-पृष्ठ द्वारा शुद्धता के लिए स्तंभ अंशों का आकलन करें.
    1. गुणात्मक रूप से प्रोटीन शुद्धि का आकलन करने के लिए, सभी स्तंभ अंशों की 20 μL aliquots को 4%/10% polyacrylamide जेल पर ६० मिनट के लिए १७० V पर चलाएं ।
    2. 5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर ०.१% Coomassie नीले रंग के साथ जेल दाग, एक benchtop झूली कुरसी पर धीरे से कमाल ।
    3. ४०% मेथनॉल, 10% हिमनदों एसिटिक एसिड कमरे के तापमान पर रातोंरात में जेल दाग, एक benchtop झूली कुरसी पर कमाल ।
      नोट: एक प्रतिनिधि जेल चित्रा 1में चित्र है.
  3. Dialyze elute अंश 2 रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस पर ।
    1. डायलिसिस बफर के खिलाफ Dialyze (१५.७ एमएम Tris-एचसीएल (पीएच ७.६), ४७१.९ एमएम NaCl, १५.६९ एमएम MgCl2, १.५७ एमएम डीटीटी, १.५ एमएम PMSF, और १५.७% ग्लिसरॉल) एक 200:1 अनुपात में एक साथ 1 एमएल डायलिसिस डिवाइस का इस्तेमाल कर 20 केडीए आणविक वेट कट-ऑफ (MWCO) कर रहे हैं ।
    2. २८० एनएम में अवशोषण को मापने और परिकलित दाढ़ विलुप्त गुणांक ८२०८५ एम-1सेमी-1 20का उपयोग करके dialyzed प्रोटीन नमूने की एकाग्रता का निर्धारण ।
    3. स्टोर 5 μL aliquots में dialyzed प्रोटीन नमूने के aliquots पर-८० ° c उपयोग तक ।

3. प्रोटीन क्रोमैटोग्राफी पतली परत द्वारा गतिविधि परख

  1. पतली परत क्रोमैटोग्राफी प्लेट तैयार कर लें ।
    1. प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने से पहले, polyethyleneimine (पी) तैयार करें-पानी में धोने के द्वारा फाइबर प्लेट । एक ग्लास चैंबर में प्लेटें डबल आसुत जल के साथ ~ ०.५ cm की गहराई में रखें ।
    2. पानी को प्लेट के ऊपर से माइग्रेट करने दें ।
      नोट: प्लेटें धोना सख्ती से आवश्यक नहीं है, के रूप में प्लेटें इसके बिना इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन धोने के परिणामस्वरूप छवियों की स्पष्टता में वृद्धि करता है । दो सीधा दिशाओं में प्लेटें धुलाई आगे सुनिश्चित करता है कि किसी भी दूषित राल में मौजूद संथाली के एक कोने में अलग कर रहे है (चित्रा 2) ।
    3. ग्लास चैंबर के बाहर प्लेट लाओ और एक benchtop रैक पर छोड़ने के लिए रात भर सूखी (12-18 एच) ।
    4. सूखी प्लेटों को एक किनारे से २.० सेमी की ओर एक नरम पेंसिल से इंगित करने के लिए चिह्नित करें जहां नमूने टीएलसी के लिए लागू किए जाएंगे । 2 μL नमूनों के लिए, नमूने से कम नहीं १.० सेमी के अलावा (चित्रा 2) लागू होते हैं ।
      नोट: यह आसंन स्थान है, जो संकेत ठहराव के लिए महत्वपूर्ण है के बीच स्पष्ट जुदाई की अनुमति देता है । जब तक फाइबर राल खरोंच नहीं है, सतह पर छोटे पेंसिल के निशान विलायक प्रवास के साथ हस्तक्षेप नहीं करेगा ।
    5. जब प्रयोग की योजना बना, हमेशा प्रत्येक प्लेट अप्रयुक्त पर एक स्थान छोड़ दें ।
      नोट: यह नमूना ठहराव (चित्रा 2) के लिए एक खाली लेन प्रदान करेगा । एक 20 सेमी टीएलसी प्लेट 19 स्थानों के लिए कमरा होगा ।
  2. एंजाइम गतिविधि परख
    1. ५० mm Tris-HCl (pH ७.५), 25 mm अमोनियम एसीटेट, 10 mm KCl, 1 mm डीटीटी और ०.६ mm एटीपी युक्त 5x बफर मिक्स तैयार करें ।
      नोट: यह मिश्रण बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए 10 μL aliquots में जम जाता है । कई फ्रीज-गल चक्र के लिए विषय मिश्रण मत करो ।
    2. 3 माइक्रोन RSH, 1x बफर मिक्स, ०.६ मिमी सकल घरेलू उत्पाद, १.२ मिमी MgCl2युक्त व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं तैयार करें । जोड़ें १.० μCi की γ-३२P-एटीपी प्रति 10 μL की प्रतिक्रिया और उपयोग nuclease मुक्त पानी एक वांछित मात्रा तक प्रतिक्रिया लाने के लिए. अंय घटकों के बाद RSH जोड़ें मिश्रित किया गया है, के रूप में न्यूक्लियोटाइड युक्त मिश्रण करने के लिए RSH के अलावा एंजाइमी गतिविधि परख शुरू ।
      नोट: अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा timepoints नमूना की संख्या पर निर्भर करेगा. 2 μL/timepoint नमूना करने के लिए, प्रत्येक 4 timepoints के लिए प्रतिक्रिया मिश्रण के 10 μL इकट्ठा ।
    3. nuclease गतिविधि दूषित से एटीपी hydrolysis के लिए नियंत्रण करने के लिए, कोई प्रोटीन युक्त एक 10 μL प्रतिक्रिया इकट्ठा और समानांतर में यह मशीन । टी = 0 पर 2 μL नमूने स्पॉट और प्रयोग के अंत में यह सुनिश्चित करना है कि एटीपी प्रोटीन के अभाव में hydrolyzed नहीं था ।
    4. तुरंत RSH के अलावा पर, 2 μL निकालें और यह लेबल पी-फाइबर प्लेट पर टी = 0 न्यूनतम नमूना के रूप में हाजिर ।
    5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया की मशीन, वांछित timepoints पर 2 μL aliquots को हटाने ।
      नोट: एंजाइमी गतिविधि जब नमूना फाइबर प्लेट पर adsorbed है संघर्ष करेंगे । रुको 10-30 मिनट के बाद अंतिम स्थान के लिए पूरी सोखना और नमूना सुखाने सुनिश्चित करने के लिए विकास से पहले थाली में जोड़ा जाता है ।
  3. बारीक परत क्रोमैटोग्राफी
    1. क्रोमैटोग्राफी चैंबर को १.५ मीटर १.५ मीटर KH2पीओ4 (पीएच ३.६४) के साथ ०.५ सेमी की गहराई तक भरें ।
      नोट: मात्रा की जरूरत क्रोमैटोग्राफी टैंक के आयामों पर निर्भर करेगा । एक स्तर नीचे है कि काफी व्यापक है झुकने के बिना टीएलसी प्लेट की प्रविष्टि की अनुमति के साथ किसी भी गिलास कंटेनर एक कवर के अलावा के साथ एक विकासशील टैंक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है । टीएलसी प्लेट प्लास्टिक फिल्म में कवर एक गिलास चोंच में विकास को सक्षम करने के लिए एक स्वच्छ razorblade के साथ संकीर्ण स्ट्रिप्स में काटा जा सकता है ।
    2. विलायक में थाली के नीचे किनारे विसर्जित कर दिया । विलायक प्लेट (~ ९० मिनट) के शीर्ष करने के लिए विस्थापित करने की अनुमति दें ।
      नोट: जबकि विलायक प्रवास प्लेट और नमूनों के शीर्ष पर रुक जाएगा खो दिया है या एक लंबे समय विसर्जन के दौरान एक साथ नहीं चलेंगे, प्लेटों विलायक में रातोंरात नहीं छोड़ा जाना चाहिए । विसर्जन से अधिक 4 ज राल को थाली समर्थन से अलग है और संकेत के नुकसान में परिणाम कर सकते हैं ।
    3. क्रोमैटोग्राफी टैंक से थाली निकालें और यह एक benchtop सुखाने रैक पर जगह है ।
    4. थाली सूखी हवा रात भर के लिए अनुमति देते हैं ।
      नोट: एक हेयर सुखाने के प्रयोग से सुखाने में तेजी आ सकती है । सूखापन राल के रंग से मूल्यांकन किया जा सकता है, जो जब गीला अंधा होगा और एक अप्रयुक्त थाली के रंग में लौटने जब पूरी तरह से शुष्क ।
    5. बाद प्लेट सूखी है, प्लास्टिक फिल्म में लपेट प्लेट को इमेजिंग कैसेट को रेडियोधर्मी सामग्री के हस्तांतरण से बचने और autoradiography द्वारा विश्लेषण (चित्रा 3) ।
  4. डेटा विश्लेषण
    1. कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए एक phosphorimager कैसेट के लिए अलग प्रतिक्रियाओं युक्त पी-फाइबर प्लेट बेनकाब ।
      नोट: यह एक बहुत स्पष्ट ताजा γ-३२पी-एटीपी के संकेत सांद्रता का उपयोग कर छवि उपज के लिए पर्याप्त जोखिम है । यदि radiolabelled सब्सट्रेट की कम मात्रा में इस्तेमाल किया जाता है, जोखिम समय 12-16 ज को बढ़ाया जा सकता है ।
    2. छवि एक phosphorimager पर कैसेट ।
    3. एक ग्राफिकल यूजर इंटरफेस के साथ इमेजिंग सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, ड्रा आयत का चयन और माउस का उपयोग कर एक पूरी गली और एटीपी और ppGpp कि लेन के भीतर समाहित धब्बे के आसपास आयताकार ROIs आकर्षित करने के द्वारा ब्याज (ROIs) के क्षेत्रों आकर्षित (चित्रा 3 ).
    4. का प्रयोग करें , कॉपी, और पेस्ट कमानों (या इसी इमेजिंग सॉफ्टवेयर के आधार पर आज्ञाओं का इस्तेमाल किया जा रहा है) अंय गलियों के भीतर समान ROIs आकर्षित करने के लिए सुनिश्चित करें कि ROIs प्रत्येक लेन में समान क्षेत्रों के भीतर संकेत को मापने रहे हैं । एक अप्रयुक्त लेन से ROIs शामिल हैं, कारतूस के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा ।
    5. का उपयोग कर विश्लेषण । उपकरण । रॉय प्रबंधक । इमेजिंग सॉफ्टवेयर के आदेश जोड़ें, पी फाइबर प्लेट पर तैयार ROIs के सभी का चयन करें ।
    6. का उपयोग कर विश्लेषण । माप सेट करें । उपाय आदेश, प्रत्येक रॉय के भीतर संकेत तीव्रता यों तो और एक स्प्रेडशीट (चित्रा 3) के रूप में माप निर्यात । प्रयोगात्मक संकेतों से रिक्त ROI मान घटाना.
    7. प्रत्येक लेन के भीतर रिक्त संकेत का क्या प्रतिशत की गणना एटीपी और ppGpp फार्मूले का उपयोग करने के लिए कारण हैEquation
      नोट: ROIs तैयार किया जा सकता है और quantitated phosphorimager या स्वतंत्र रूप से उपलब्ध ImageJ सॉफ्टवेयर (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों) के साथ संगत वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ।

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Representative Results

हम क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल से एक (p) ppGpp synthetase के संबध शुद्धिकरण के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं और इसकी एंजाइमी गतिविधि का आकलन करते हैं । चित्रा 1 धातु संबध क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्राप्त प्रोटीन शुद्धि को दर्शाता है । इस शुद्धि से दूसरे रेफरेंस (E2) अंश को dialyzed किया गया और एंजाइमी गतिविधि परख के लिए इस्तेमाल की गई. चित्रा 2 विवरण के लिए तैयार करने के लिए और पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा pyrophosphotransferase परख बाहर ले आवश्यक कदम । चित्रा 3 कैसे इन प्रयोगों से डेटा उचित रिक्त और प्रतिशत करने के लिए संकेत तीव्रता के रूपांतरण पर एक जोर के साथ quantitated है दिखाता है । चित्रा 4aमें, हम एक प्रतिनिधि टीएलसी autoradiograph के एक (पी) ppGpp synthetase परख का उपयोग कर शुद्ध RSH, एक सी. डिफीसाइल (पी) ppGpp synthetase वर्तमान । प्रारंभिक जगह स्थान, ppGpp, और एटीपी स्पॉट autoradiograph पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, के रूप में विलायक सामने है कि दिखाई दे रहा है, क्योंकि यह radiolabeled अकार्बनिक फॉस्फेट की मात्रा का पता लगाने में शामिल है । और अधिक फास्फोरस एसिड moieties के साथ अणुओं प्रारंभिक जगह स्थान से कम गतिशीलता प्रदर्शन, के रूप में वे अधिक से अधिक आणविक भार और नकारात्मक ईओण चार्ज है; यह बुनियादी पी-फाइबर पर उनकी गतिशीलता में बाधा उत्पंन । ३७ डिग्री सेल्सियस पर १२० मिनट के पाठ्यक्रम पर, ppGpp संचय और एटीपी घट synthetase एंजाइम की कमी प्रतिक्रियाओं में नगण्य हैं, जबकि दोनों एटीपी कमी और ppGpp संचय RSH चित्रा 4aकी उपस्थिति में आसानी से स्पष्ट कर रहे हैं). चित्रा 4B चार प्रयोगों से निरपेक्ष एटीपी और ppGpp संकेतों से पता चलता है. चित्रा 4c कुल रेडियोधर्मी संकेत के प्रतिशत में परिवर्तित निरपेक्ष संकेतों के साथ चित्रा 4B के रूप में एक ही डेटा से पता चलता है. यह pipetting त्रुटि और/या रेडियोधर्मी क्षय के कारण अशुद्धियों को कम करता है और डेटा के लिए अनिश्चितता शुरू करने के बिना परित किया जा करने के लिए विभिन्न दिनों पर किया प्रयोगों से डेटा की अनुमति देता है ।

Figure 1
चित्रा 1: निकेल RSH के अपनत्व शुद्धि । एक Coomassie-सना हुआ एसडीएस-पृष्ठ जेल lysate (एल) और प्रेरित BL21 pMMB के केंद्रापसारक lysate (सीएल) दिखा::rsh-his6 के रूप में अच्छी तरह से प्रवाह के माध्यम से (फुट), धो 1 (W1), धो 2, और रेफरेंस (E1 और E2) अंश के बाद निकल अपनत्व शुद्धि । E2 अंश dialyzed और बाद में एंजाइमी परख के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रोटीन आकार मानकों के आणविक भार सही पर दिखाए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: टीएलसी प्लेट्स की तैयारी । (A) प्लेट्स को पानी में नीचे किनारे रखकर एक आयाम में धोया जाता है (नीला). दूषित पदार्थों (पीला) विलायक के साथ थाली के शीर्ष करने के लिए पलायन । (ख) एक थाली पूरी तरह से सूख जाने के बाद, यह पहले धोने के सापेक्ष ९० ° घूर्णन द्वारा एक दूसरे आयाम में धोया जाता है और फिर से पानी थाली के शीर्ष करने के लिए विस्थापित करने की अनुमति । (ग) धोने के बाद, किसी भी संदूषण को प्लेट के एक कोने में पृथक कर रहे हैं । एक धोया टीएलसी प्लेट की राल एक नरम पेंसिल के साथ धीरे से चिह्नित किया जा सकता है इंगित करने के लिए जहां नमूनों देखा जाना चाहिए । 2 μL नमूने के लिए, धब्बे के बीच 1 सेमी की एक ंयूनतम पर्याप्त नमूना जुदाई सुनिश्चित करेगा । नमूने थाली के ' नीचे ' से 2 सेमी देखा जाता है । नमूना आवेदन के बाद, विलायक ' शीर्ष करने के लिए चलाने के लिए अनुमति दी है, ' जहां कोई भी दूषित पानी बहाकर द्वारा अलग किया गया होगा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सिग्नल ठहराव । ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) कुल, एटीपी, और ppGpp संकेत परिभाषित एक खाली लेन और एक प्रयोगात्मक लेन के लिए दिखाए जाते हैं । प्रत्येक रिक्त रॉय के भीतर संकेत तीव्रता प्रयोगात्मक मूल्य से घटाया है, और एटीपी और ppGpp संकेतों कुल रेडियोधर्मी एटीपी और ppGpp के लिए विशेषता संकेत का प्रतिशत पेश करने के लिए दिखाया समीकरण का उपयोग कर संकेत करने के लिए सामान्यीकृत हैं. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. एक प्रतिनिधि टीएलसी प्लेट की Autoradiograph: (क) यह छवि विलायक सामने, एटीपी, ppGpp, और एक प्रतिक्रिया के प्रारंभिक स्थान स्थानों से पता चलता है शुद्ध ग. डिफीसाइल RSH का उपयोग कर । कोई प्रोटीन युक्त रिएक्शन (n.p.) uncatalyzed एटीपी hydrolysis की ठहराव की अनुमति देता है जबकि एक कोरा लेन सटीक सिग्नल ठहराव की अनुमति देता है । (ख) सी डिफीसाइल RSH के साथ मशीन के १२० मिनट के दौरान एटीपी और ppGpp के निरपेक्ष संकेत तीव्रता । दिखाए गए चार स्वतंत्र प्रयोगों के साधन और मानक विचलन हैं. (ग) कुल रेडियोधर्मी संकेत के एक प्रतिशत के रूप में प्रस्तुत ppGpp संकेत के साथ (ख) से एक ही डेटा. कोई प्रोटीन में ppGpp संचय (n.p.) नियंत्रण प्रतिक्रिया काले रंग में दिखाया गया है । दिखाया दो तकनीकी के साथ दो स्वतंत्र प्रयोगों का मतलब है और मानक विचलन है प्रत्येक प्रतिकृति । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम सी डिफीसाइल से अपने-टैग RSH की शुद्धि की रिपोर्ट और गतिविधि के लिए एक विधि वर्तमान radiolabeled पतली परत क्रोमैटोग्राफी का उपयोग कर ठहराव । इस विधि से पहले सी. डिफीसाइलसे diguanylate cyclase एंजाइमों की सक्रियता का आकलन किया गया है, साथ ही (पी) ppGpp synthetase, न्यूक्लियोटाइड cyclase, कळेनासे और अन्य जीवों से फोस्फोडाईस्टेरेज एंजाइमों को11,12 ,१३,२१. जबकि विधि उपंयास नहीं है, यह मोटे तौर पर परख के कई प्रकार के लिए लागू है, और हम आशा है कि शोधकर्ताओं वीडियो प्रारूप में अपनी प्रस्तुति उपयोगी मिलेगा ।

प्रोटोकॉल के भीतर सबसे महत्वपूर्ण कदम प्रोटीन शुद्धि (कदम 2.1.3-2.1.10), पतली परत क्रोमैटोग्राफी के लिए प्रतिक्रिया तैयारी (कदम 2.2-2.3), और डेटा विश्लेषण (३.४ कदम) हैं । हम निंनलिखित संशोधनों के लिए विशेष रूप से उपयोगी हो पाया है: MgCl2 के अलावा निकेल कॉलम शोधन के लिए इस्तेमाल किया बफ़र्स के लिए (कदम 2.1.3-2.1.10) शुद्ध प्रोटीन की एंजाइमी गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण है, और की प्रस्तुति एंजाइम गतिविधि डेटा के रूप में% ppGpp का उत्पादन किया बजाय निरपेक्ष ppGpp उत्पादित सुनिश्चित करता है कि डेटा अलग दिनों पर एकत्र, γ-३२P-एटीपी के विभिन्न के साथ संगत कर रहे हैं. यह विधि किसी phosphorimager तक पहुंच के साथ किसी भी शोध समूह तक पहुंच योग्य है, और डेटा विश्लेषण सीधा है । ३२पी के प्रतिशत के रूप में quantitating phosphotransfer गतिविधि द्वारा ppGpp में परिवर्तित, हम डेटा reproducibility सुनिश्चित करते हैं । क्योंकि बहुत छोटी प्रतिक्रिया मात्रा बेई-फाइबर प्लेट पर देखा जाता है, वहां मामूली pipetting अशुद्धियों के लिए महत्वपूर्ण क्षमता γ-३२पी एटीपी या ३२पी-ppGpp की निरपेक्ष मात्रा में एक दिया लेन में महत्वपूर्ण त्रुटि का परिचय है टीएलसी प्लेट पर, लेकिन संभव रूपों के बीच रेडियोधर्मी संकेत का वितरण वर्तमान कुल संकेत से स्वतंत्र है । इसके अलावा, एक दिया लेन में कुल रेडियोधर्मी संकेत γ-३२पी-एटीपी प्रयोग में इस्तेमाल की उम्र पर निर्भर कर सकते हैं । ३२ पी १४.३ दिनों की एक आधा जीवन है, तो स्वतंत्र परख कई दिन प्रदर्शन के अलावा कुल रेडियोधर्मी संकेत में पर्याप्त अंतर दिखा सकते है पता चला लेकिन radiolabeled एटीपी और ppGpp के सापेक्ष मात्रा में केवल एंजाइम गतिविधि पर निर्भर हैं । ' प्रतिशत ppGpp ' के रूप में डेटा पेश करने के बजाय निरपेक्ष ppGpp संकेत pipetting त्रुटि या रेडियोधर्मी क्षय से यादृच्छिक शोर की शुरूआत रोकता है. यह आंकड़ा 4B और 4c के बीच के मतभेदों से सचित्र है . दोनों ही चार प्रयोगों से डेटा के साधन और मानक विचलन प्रदर्शित करते हैं, लेकिन चित्रा 4c में डेटा कुल रेडियोधर्मी संकेत करने के लिए सामान्यीकृत किया गया है.

हमने तय किया है कि सी. डिफीसाइल RSH एंजाइम एक कार्यात्मक ppGpp synthetase इन विट्रो, एक एटीपी pyrophosphotransfer से तेजी से phosphodonor में सक्षम है और एक सकल घरेलू उत्पाद स्वीकारकर्ता है । यह प्रतिक्रिया मैग्नीशियम, जो RSH परिवार के एंजाइमों द्वारा एटीपी और guanosine बाध्यकारी निर्देशांक पर निर्भर है22। हम निकल संबध क्रोमैटोग्राफी के लिए निर्माता प्रोटोकॉल संशोधित किया है lysis में 5 मिमी MgCl2 शामिल करने के लिए और धोने बफ़र्स के रूप में अच्छी तरह से रेफरेंस बफर क्योंकि हमने पाया है कि मैग्नीशियम के अभाव में शुद्धि के लिए हानिकारक है एंजाइमी शुद्ध प्रोटीन की गतिविधि । यह पता चलता है कि मैग्नीशियम आयनों न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी के अभाव में प्रोटीन संरचना स्थिर करने में एक गैर उत्प्रेरक भूमिका निभा सकते हैं, लेकिन आगे संरचनात्मक लक्षण वर्णन करने के लिए यह पुष्टि करने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।

हमारे ज्ञान के लिए, यह काम सी. डिफीसाइल में ppGpp संश्लेषण की पहली प्रकाशित रिपोर्ट है और इंगित करता है कि इस जीव एक (पी) ppGpp-मध्यस्थता कड़े प्रतिक्रिया extracellular तनाव जीवित रहने के लिए उपयोग करने की संभावना है. (पी) ppGpp चयापचय पहले कभी नहीं इस महत्वपूर्ण मानव रोगज़नक़ में सूचित किया गया है । यह देखते हुए कि कड़े प्रतिक्रिया हठ में कई अंय रोगजनकों में फंसा है, यह संभावना है कि (p) ppGpp-मध्यस्थता संकेतन सी डिफीसाइल कोशिकाओं के उच्च तनाव सहिष्णुता में एक भूमिका निभा सकता है और c. डिफीसाइल की उच्च पुनरावर्तन दर संक्रमण२३,२४,२५.

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Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों या हित के अंय संघर्ष की घोषणा ।

Acknowledgments

यह काम NIAID 1K22AI118929-01 द्वारा वित्तपोषित था । EBP पुराने अधिराज्य विश्वविद्यालय, नॉरफ़ॉक, वर्जीनिया, संयुक्त राज्य अमेरिका में अनुसंधान के कार्यालय से एक ग्रीष्मकालीन अनुसंधान फैलोशिप कार्यक्रम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase New England Biolabs (NEB) M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit Qiagen 20021
KpnI restriction enzyme NEB R0142S
PstI restriction enzyme NEB R0140S
T4 DNA ligase NEB M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli NEB C2527I
IPTG Sigma-Aldrich 10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor Beckman Coulter Avanti -
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor Scilogex -
MaxQ SHKE6000 Incubator Thermo Scientific -
Ultrasonic processor Sonics VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin G Biosciences 786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL Thermo Scientific 29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) Spectrum G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell BioRad 1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank General Glass Blowing Company 80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support Sigma-Aldrich Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi Perkin Elmer NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM Bio Basic Canada AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) Alfa Aesar AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen GE Healthcare Life Sciences BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager GE Healthcare Life Sciences -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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इम्यूनोलॉजी व संक्रमण अंक १४१ प्रोटीन शुद्धिकरण histidine तग (प) ppGpp पतली परत क्रोमैटोग्राफी रेडियोन्यूक्लाइड लेबलिंग pyrophosphokinase phosphotransfer
एक शुद्धि और इन <em>विट्रो में</em> गतिविधि परख के लिए एक (पी) ppGpp Synthetase से <em>क्लोस्ट्रीडियम डिफीसाइल</em>
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Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. … More

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. B. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (141), e58547, doi:10.3791/58547 (2018).

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