Summary
Aqui, descrevemos um método para a purificação de enzimas pyrophosphokinase histidina-tag e utilizando cromatografia em camada fina dos produtos a ensaiar para a atividade enzimática em vitroe substratos marcadas com radioisótopos. O ensaio da atividade da enzima é amplamente aplicável a quinase, ciclase nucleotídeo ou reação de transferência de fósforo, cujo mecanismo inclui a hidrólise de nucleotídeos trifosfato.
Abstract
Quinase e pyrophosphokinase enzimas transferir o fosfato gama ou a fracção de pirofosfato de beta-gama de precursores de nucleotídeo trifosfato para substratos para criar produtos fosforilados. O uso de γ -32- P rotulado precursores NTP permite a monitorização simultânea de formação de produto e utilização de substrato por radiografia. Cromatografia em camada fina (TLC) em placas de celulose permite a separação rápida e sensível quantificação do substrato e produto. Apresentamos um método para a utilização da cromatografia de camada fina para analisar a atividade de pyrophosphokinase de uma sintetase de ppGpp purificado (p). Este método anteriormente foi usado para caracterizar a atividade de sintetases nucleotídeo e dinucleótido cíclicas e é amplamente apropriado para caracterizar a atividade de uma enzima que hidrolisa um vínculo de trifosfato de nucleotídeos ou transfere um terminal fosfato de um doador de fosfato para outra molécula.
Introduction
Quinase e pyrophosphokinase (ou diphospho-quinase) enzimas transferir fosfatos de precursores de nucleotídeo trifosfato (NTP) para as moléculas do substrato. Os substratos podem incluir outros nucleotídeos, aminoácidos ou proteínas, carboidratos e lipídios1. Análises de Bioinformatic às vezes podem prever de uma enzima cognato substrato ou substratos com base na similaridade de enzimas caracterizadas, mas validação experimental ainda é necessária. Da mesma forma, a afinidade de uma enzima para sua substrate(s) e a taxa na qual ele catalisa a reação de transferência de fósforo e os efeitos de co-fatores, inibidores ou outros efetores da enzima devem ser determinado experimentalmente. Para evitar o esgotamento do precursor ATP por outras consumidores de ATP enzimas presentes no citoplasma bacteriana, ensaios de atividade quantitativa exigem proteína purificada.
Purificação de proteínas por cromatografia de afinidade metal tem sido coberta completamente na literatura2,3. Tags de histidina, consistindo de seis resíduos de histidina consecutivos anexados a N - ou C-terminal de uma proteína recombinante permitir rápida purificação por cromatografia de afinidade metal4,5,6. Essas sequências são pequenas em comparação com as proteínas que eles modificar e geralmente têm um efeito mínimo na função da proteína, embora às vezes eles podem alterar a estabilidade da proteína e/ou cinética de enzima7,8. Etiquetas de histidina na N - e C-termini da mesma proteína podem ter efeitos diferentes, que são difíceis de prever sem conhecer a estrutura da proteína em questão. Etiquetas de histidina normalmente são incorporadas durante a clonagem de uma proteína recombinante por projetar primers que codificam seis resíduos de histidina, também imediatamente 3' para o códon de início ATG ou imediatamente 5' para o códon de parada do quadro de leitura aberto. Após amplificação, o gene contendo hexahistidine é ligado em um vetor sob o controle de um promotor inducible e expresso, normalmente em um laboratório cepa de e. coli. Então, a proteína de recombinação pode ser isolada em uma resina de afinidade que contém cátions divalentes imobilizado (normalmente níquel ou cobalto)9. Contaminar as proteínas de ligação de metal nativas pode ser removido por titulação com imidazol, que competitivamente desloca limite da proteína2. Finalmente, a proteína alvo é eluída da coluna com concentrações mais altas de imidazol. Existem várias fontes comerciais para resinas de cátion de metal imobilizado, e os fabricantes fornecem recomendações para as condições de reserva e concentrações de imidazol. Após a eluição, proteína pode ser analisada por eletroforese em gel polyacrylamide do sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE), diálise ou usada imediatamente em ensaios funcionais.
Existem vários métodos para monitorar indiretamente a atividade da quinase pelo acoplamento de hidrólise de ligação de fosfato de ATP para uma segunda reação que libera ou excita um fluoróforo ou gera quimioluminescência, mas estas reações possuem várias partes móveis e podem ser logisticamente desafiadoras10. A maneira mais simples para medir especificamente a atividade de transferência de fósforo é diretamente monitorar a transferência de um grupo fosfato radiolabeled de um γ comercialmente disponível -32-P precursor do NTP para um substrato não-radiolabeled11 , 12 , 13. as misturas de substratos radiolabeled e produtos podem ser separadas e quantificadas por cromatografia de camada fina (TLC). TLC utiliza a mobilidade diferencial de solutos em um determinado solvente, permitindo que o solvente (fase líquida) a migrar por acção capilar através de uma superfície (fase sólida) no qual uma mistura de solutos tem sido adsorvida14. Solutos que são pequenas e/ou faltam de interações favoráveis com a fase contínua irão migrar longas distâncias da sua localização inicial do que solutos com maiores pesos moleculares ou grande afinidade para o sólido. Para exame de transferência de fósforo, metades de fosfato aumentam o peso molecular das moléculas são adicionados a eles e adicionar carga iônica negativa em pH neutro ou ácido11,12,14. Isso diminui sua mobilidade em uma superfície básica como PEI-celulose. Quando desenvolvido em tampão de fosfato ácido de potássio, misturas de mono-, di-, tri-, tetra- e espécies de pentaphosphate podem ser facilmente separadas na PEI-celulose, permitindo a quantificação de cada espécie (Figura 2, Figura 3). Tais ensaios podem ser executados usando lisados celulares contendo a enzima de interesse, mas isso inclui o potencial para a atividade de outros quinases e fosfatases ATPase geral para esgotar o substrato e/ou produto. Para uma avaliação quantitativa em vitro da atividade da enzima, é necessário purificar a enzima de interesse.
Hexaetilo de guanosina (ppGpp) e guanosina pentaphosphate (pppGpp) são ribonucleótido sinalização moléculas formadas pela transferência de um pirofosfato de grupo de um precursor de trifosfato de adenosina (ATP), respectivamente, um guanosina difosfato (PIB) ou guanosina (GTP) de hexaetilo substrato15. Estes sinais ribonucleótido único, coletivamente conhecidos como ppGpp (p), mediam uma resposta de toda a célula ao estresse ambiental, conhecido como a resposta rigorosa em diversas espécies bacterianas15,16. Duas classes conservadas de enzimas catalisam a formação de (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homólogo (RSH) enzimas são 'longo' bifuncional (p) ppGpp sintetase/hidrolases chamado por sua semelhança com o real e o ponto (p) ppGpp metabólica enzimas de Escherichia coli que contêm sintetase, hidrolase e domínios normativos, enquanto pequenas alarmone sintetase (SAS) enzimas são curto monofuncionais sintetases encontradas exclusivamente no Gram positivo bactérias15, 17 , 18. a bactéria Gram-positiva formadoras de esporos Clostridium difficile codifica putativo RSH e SAS genes19. Aqui, apresentamos os ensaios de atividade inicial que confirmam que a enzima de c. difficile RSH é uma sintetase de ppGpp cataliticamente ativo (p).
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Protocol
1. inducible superexpressão de uma proteína Histidine-tag
- Amplifica o rsh de c. difficile R20291 DNA genômico.
- Use um polymerase de alta-fidelidade e siga as instruções do fabricante.
- Amplificar a c. difficile rsh usando as primeiras demão
rsh_F (GGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG deGGTACCde CA) e
rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), que introduz uma marca de hexahistidine do C-terminal.
Nota: O KpnI e PstI sites nas sequências de cartilha de corte estão em negrito. - Digerir o vetor de pMMBneo e o produto PCR do rsh-his6 com restrição Pstl e KpnI corte sites a 37 ° C por 45 min.
- Purifica o vetor tornado linear e os fragmentos PCR através de eletroforese em gel de agarose e purificação subsequente com um kit de extração do gel de ADN.
- Medir a absorvância de nm 280 (280) do vetor e o produto do PCR amplificado. Usar a equação
para determinar a concentração de DNA de cada fragmento de DNA.
- Ligate rsh em pMMBneo para a expressão.
- Combinar 25 ng do vetor de PMMBneo digerido, 125 ng do produto do gene rsh-his6 , 2 μL de 10x buffer de ligase e 1 μL de DNA ligase. Use a água livre de nuclease para ajustar o volume total de 20 μL. Incube a 16 ° C durante 16 h.
Nota: A eficácia da ligadura depende do tamanho do fragmento e deve ser ajustada com base em protocolos do fabricante. - Transforme o produto vetorial ligado em Escherichia coli DH5-α ou outro recA - plasmídeo manutenção estirpe. Selecione para células transformadas em placas LB com 100 canamicina μg/mL e incubar durante 16 – 24 h a 37 ° C.
- Escolher quatro colônias da placa de transformação (s) e marcam cada um em um prato fresco contendo 100 canamicina μg/mL para o isolamento do DNA. Incubar as novas placas a 37 ° C para 16 – 24 h e selecione um isolado para a expressão da proteína subsequente.
- Para confirmar a sucesso da ligadura da proteína intacta rsh região de codificação, escolher uma colônia dos escolhidos isolar em 20 μL de água, aqueça a 95 ° C por 10 min e usar como um modelo para um confirmação do PCR usando o mesmo primer usado para amplificar o gene.
- Combinar 25 ng do vetor de PMMBneo digerido, 125 ng do produto do gene rsh-his6 , 2 μL de 10x buffer de ligase e 1 μL de DNA ligase. Use a água livre de nuclease para ajustar o volume total de 20 μL. Incube a 16 ° C durante 16 h.
- Transforme o plasmídeo verificado de acordo com os protocolos padrão de transformação transformação de plasmídeo bacteriano de Escherichia coli em Escherichia coli BL21 sistema para produção de proteína de alto rendimento.
- RSH-His6 expresso em e. coli.
- Selecione uma única colônia de e. coli BL21 transformada com pMMBneo::rsh e inocular 2 mL de meio LB com 50 canamicina μg/mL. Incubar a 37 ° C 12 – 16 h agitando a 250 rpm.
- Semear em 500 mL de meio LB contendo 50 canamicina μg/mL 0,5 ml da cultura para o crescimento celular e a expressão da proteína durante a noite.
- Incubar a cultura de expressão a 37 ° C e 250 rpm em um shaker incubadora até a densidade celular atinge uma OD600 0.167 a 37 ° C.
- Reduzir a temperatura da incubadora a 30 ° C e esperar 30 min para a temperatura de cultura soltar.
- Induzi a expressão RSH adicionando isopropil-β-D-thiogalactoside (IPTG) a uma concentração final de 0.5 mM. Permita a indução terá lugar durante a noite (para 16-18 h) a 30 ° C, agitação a 250 rpm.
- Pelota por centrifugação a 3.080 x g, durante 30 min a 4 ° C.
Nota: O sedimento pode ser armazenado durante a noite a-20 ° C para a purificação da proteína alvo no dia seguinte sem perda perceptível de rendimento de proteína ou de atividade enzimática.
para determinar a concentração de DNA de cada fragmento de DNA.2. proteínas purificação por cromatografia de afinidade de níquel
Nota: Continue diretamente com etapas de purificação da proteína fornecidas abaixo após esclarecendo o lisado celular. Armazenando esclareceu lisado a 4 ° C durante a noite para purificação da proteína subsequente reduz o rendimento de proteína.
- Purifica a proteína usando 1 mL de resina de ácido Nitriloacetic de níquel (Ni-NTA) em uma coluna de gravidade.
- No dia antes de usar, equilibrar a coluna durante a noite a 4 ° C, com 2 mL de tampão de equilíbrio (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM de NaCl, 50mm NaH2PO4, lisozima 0,5 mg/mL, 5 mM MgCl2, imidazol 10 mM, 0,25 mM DTT, sulfonil de phenylmethane de 5 mM fluoreto (PMSF), 10% de glicerol).
- No dia seguinte traz a coluna de 4 ° C a RT antes de carregar o esclareceu lisado e deixe ficar por ~ 2-3 h.
Nota: Trazer a coluna para o equilíbrio térmico é crucial para evitar bolhas de ar, formando-se dentro da coluna. - Ressuspender o precipitado obtido na etapa 1.3.6 no buffer de lise (10 mM Tris-HCl pH 7.8, 300 mM de NaCl, 5 mM MgCl2, 50mm NaH2PO4, 10% de glicerol, lisozima de 0,5 mg/mL, imidazol 10 mM, 0,25 mM DTT e 5 mM PMSF).
- Proceda à sonicação células no gelo para intervalos de 8 x 10 s, pausando 30 s entre pulsos.
- Clarificar o lisado por centrifugação a 3.080 x g, durante 30 min a 4 ° C, usando um microcentrifuge.
- Prepare o lisado com volumes iguais de Lise, em seguida, aplique o preparado esclareceu lisado à coluna e coletar o escoamento.
- Reaplique esclareceu lisado de passagem para a coluna e coletar o escoamento secundário.
- Lave a coluna com tampão de lavagem 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 5 mM MgCl2, 50mm NaH2PO4, imidazole 30mm, 10% de glicerol). Colete o escoamento.
Nota: A inclusão de 5 mM MgCl2 nos buffers de lavagem e eluição é importante para a atividade enzimática da proteína purificada. - Lave a coluna com tampão de lavagem 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 5 mM MgCl2, 50mm NaH2PO4 e imidazol 50mm). Colete o escoamento.
- Aplica 2 mL de tampão de eluição (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 50mm NaH2PO4, 10% de glicerol e imidazol 75 mM). Colete o escoamento em duas frações de 1 mL cada.
Nota: A coluna após esta etapa pode ser armazenada no buffer de equilibração a 4 ° C se a mesma proteína vai ser purificada no próximo ensaio da purificação. A coluna pode ser usada até 3 vezes se armazenado corretamente.
- Avalie fracções de coluna para a pureza por SDS-PAGE.
- Para avaliar qualitativamente a purificação de proteínas, execute 20 alíquotas μL de todas as frações de coluna em um gel de polyacrylamide 4 10% por 60 min em 170 V.
- Mancha do gel com azul de Coomassie 0,1% à temperatura ambiente por 5h, balançando suavemente sobre um roqueiro de bancada.
- Destain o gel em metanol a 40%, 10% de ácido acético glacial durante a noite à temperatura ambiente, balançando em um balancim de bancada.
Nota: Um gel representativo é retratado na Figura 1.
- Dialize eluir fração 2 durante a noite a 4 ° C.
- Dialize contra buffer de diálise (15,7 mM Tris-HCl (pH 7,6), 471,9 mM NaCl, 15,69 mM MgCl2, glicerol de TDT, 1,5 mM PMSF e 15,7% 1,57 mM) na proporção de 200:1 usando um aparelho de diálise de 1 mL com um 20 kDa peso molecular de corte (MWCO).
- Determinar a concentração da proteína dializados amostra medindo a absorbância em 280 nm e usando a extinção molar calculado coeficiente 82085 M-1cm-1 20.
- Loja 5 alíquotas μL da amostra proteína dializados em alíquotas a-80 ° C até o uso.
3. proteína atividade doseamento por cromatografia em camada fina
- Prepare a placa de cromatografia em camada fina.
- Antes de realizar a reação, preparar polyethyleneimine (PEI)-placas de celulose por lavagem em água desionizada. Coloque as placas em uma câmara de vidro com água bidestilada a uma profundidade de ~0.5 cm.
- Permitir que a água migrar para o topo da placa.
Nota: As placas de lavagem não é estritamente necessário, como placas podem ser usadas sem ele, mas lavar roupa faz aumentar a clareza das imagens resultantes. Lavar as placas em duas direções perpendiculares mais garante que quaisquer contaminantes presentes na resina são isolados em um canto da placa (Figura 2). - Leva os pratos fora da câmara de vidro e deixar em uma cremalheira de bancada para secar durante a noite (12 – 18 h).
- Marca as chapas secas 2,0 cm de uma borda com um lápis macio para indicar onde as amostras serão aplicadas para TLC. Para 2 amostras μL, aplicam-se as amostras não inferior a 1,0 cm separada (Figura 2).
Nota: Isto permite a separação clara entre local adjacente, que é fundamental para a quantificação do sinal. Enquanto a resina de celulose não é riscado, pequenas marcas de lápis na superfície não interferirá com migração do solvente. - Durante o planejamento de experimentos, sempre deixe uma mancha em cada prato não utilizados.
Nota: Isto irá fornecer uma pista em branco para quantificação da amostra (Figura 2). Uma placa de 20 cm TLC terá espaço para 19 pontos.
- Ensaio da atividade enzimática
- Prepare uma mistura de 5 x tampão contendo 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), acetato de amônio 25 mM, 10 mM KCl, 1 milímetro DTT e 0,6 mM ATP.
Nota: Esta mistura pode ser preparada em grandes quantidades e congelada em 10 alíquotas μL para uso posterior. Não submeta a mistura a múltiplos ciclos de congelamento e descongelamento. - Prepare as reações individuais contendo 3 μM RSH, 1 mistura de reserva x, PIB, de 0,6 mM, 1,2 mM MgCl2. Adicionar 1,0 μCi de γ -32P-ATP por 10 μL de reação e usar água livre de nuclease para trazer a reação até um volume desejado. Adicione o RSH depois que foram misturados os outros componentes, como a adição de RSH à mistura contendo nucleotídeos inicia o ensaio de atividade enzimática.
Nota: Reaccional Final dependerá do número de momentos amostrados. Para a amostra 2 μL/Commit, monte 10 μL da mistura de reação para cada 4 momentos. - Para controlar para a hidrólise de ATP de contaminante atividade nuclease, montar uma reação em 10 μL não contendo nenhuma proteína e incube-lo em paralelo. Ponto 2 amostras μL em t = 0 e no final do experimento para garantir que o ATP não foi hidrolisado na ausência de proteína.
- Imediatamente após a adição de RSH, remover 2 μL e manchá-lo na placa de celulose-PEI rotulada como o t = 0 min amostra.
- Incube a reação a 37 ° C, retirar 2 alíquotas μL em momentos desejados.
Nota: A atividade enzimática cessará quando a amostra é adsorvida na placa de celulose. Espere de 10 a 30 min após a última vaga é adicionada ao prato antes de desenvolvimento para garantir a completa absorção e secagem da amostra.
- Prepare uma mistura de 5 x tampão contendo 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), acetato de amônio 25 mM, 10 mM KCl, 1 milímetro DTT e 0,6 mM ATP.
- Cromatografia em camada fina
- Encha a câmara de cromatografia com 1,5 M 1,5 M KH2PO4 (pH 3.64) a uma profundidade de 0,5 cm.
Nota: O volume necessário dependerá das dimensões do tanque cromatografia. Qualquer recipiente de vidro com uma nível inferior que é suficientemente ampla para permitir a inserção da placa de TLC sem dobra pode ser usado como um tanque em desenvolvimento com a adição de uma capa. A placa de TLC pode ser cortada em tiras mais estreitas com uma lâmina de barbear limpa para permitir o desenvolvimento num copo de vidro coberto com filme plástico. - Mergulhe a borda inferior da placa num solvente. Deixe o solvente migrar para o topo da placa (~ 90 min).
Nota: Enquanto a migração do solvente será interrompido na parte superior da placa e não serão perdidas ou correr juntos durante uma imersão mais amostras, placas não devem ser deixadas em solvente durante a noite. Mais de 4 h de imersões podem causar a resina desconectar-se da placa de apoio e resultar em perda de sinal. - Retire a placa do tanque de cromatografia e coloque-o sobre uma bancada de cavalete.
- A placa de ar deixe secar durante a noite.
Nota: Secagem pode ser acelerado pelo uso de um secador de cabelo. Secura pode ser avaliada pela cor da resina, que vai escurecer quando molhado e retorno para a cor de uma placa não utilizada quando estiver completamente seco. - Depois que a placa está seca, enrole a placa em filme plástico para evitar a transferência de material radioativo ao estojo de imagem e analise por autoradiografia (Figura 3).
- Encha a câmara de cromatografia com 1,5 M 1,5 M KH2PO4 (pH 3.64) a uma profundidade de 0,5 cm.
- Análise de dados
- Expor a placa de celulose-PEI contendo reações separadas para uma gaveta de phosphorimager para 4 h à temperatura ambiente.
Nota: Esta é uma exposição suficiente para produzir uma imagem muito clara usando as concentrações indicadas de fresco γ -32P-ATP. Se a menor quantidade de substrato marcadas com radioisótopos é utilizada, tempo de exposição pode ser aumentado para 12-16 h. - Imagem da gaveta em um phosphorimager.
- Usando o software de imagem com uma interface gráfica do usuário, desenhar as regiões de interesse (ROIs) selecionando Desenhar retângulo e usando o mouse para desenhar ROIs retangulares em torno dos pontos de lane e o ATP e ppGpp inteiras contidos dentro lane (Figura 3 ).
- Usar os comandos selecionar, copiar e colar (ou comandos correspondentes baseados no software de imagens sendo usado) desenhar ROIs idênticos dentro as outras vias para garantir que o ROIs são medir sinal dentro de áreas idênticas em cada raia. Incluem ROIs de uma faixa não utilizada, para ser usado como espaços em branco.
- Usando o analisar | Ferramentas | ROI Manager | Adicionar comandos do software de imagem, selecione todos o ROIs desenhado na placa de celulose de PEI.
- Usando o analisar | Definir medidas | Medida comandos, quantificar a intensidade de sinal dentro de cada ROI e exporte as medições como uma planilha (Figura 3). Subtrai valores em branco do ROI de sinais experimentais.
- Calcular qual a percentagem do sinal branco dentro de cada raia é atribuível à ATP e ppGpp usando as fórmulas
Nota: ROIs podem ser desenhados e quantificados utilizando software comercial compatível com o phosphorimager ou software ImageJ livremente disponível (National Institutes of Health).
- Expor a placa de celulose-PEI contendo reações separadas para uma gaveta de phosphorimager para 4 h à temperatura ambiente.
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Representative Results
Apresentamos um método para a purificação da afinidade de uma sintetase do ppGpp (p) de Clostridium difficile e a avaliação da sua actividade enzimática. A Figura 1 demonstra a purificação de proteínas, obtida por cromatografia de afinidade de metal. A segunda fração de eluição (E2) desta purificação foi diálise e utilizada para o ensaio de atividade enzimática. A Figura 2 detalha as etapas necessárias para preparar e realizar ensaios de pyrophosphotransferase por cromatografia em camada fina. A Figura 3 ilustra como os dados destas experiências é quantificados com ênfase em anular apropriada e conversão de intensidade de sinal em percentagens. Na Figura 4A, apresentamos um autoradiograph TLC representativo de um ensaio de sintetase (p) ppGpp usando RSH purificada, um c. difficile (p) ppGpp sintetase. O local de ponto inicial, ppGpp e manchas de ATP são claramente visíveis sobre o autoradiograph, como é a frente do solvente que é visível, porque contém vestígios de radiolabeled do fosfato inorgânico. Moléculas com mais partes de ácido fosfórico apresentam menor mobilidade local do ponto inicial, como eles têm maior peso molecular e carga iônica mais negativa; isto dificulta sua mobilidade sobre a celulose-PEI básica. Ao longo de 120 min a 37 ° C, ppGpp acumulação e depleção de ATP são insignificantes em reações a falta da enzima sintetase, enquanto tanto a depleção de ATP e a acumulação de ppGpp são aparentes na presença de RSH Figura 4A). Figura 4B mostra os sinais de ATP e ppGpp absolutos de quatro experimentos. A Figura 4 mostra os mesmos dados como Figura 4B com os sinais absolutos convertido em percentagens do total sinal radioativo. Isto minimiza imprecisões devido a erros de pipetagem e/ou decaimento radioativo e permite que os dados de experimentos realizados em dias diferentes, seja agrupado sem introduzir incerteza para os dados.
Figura 1: níquel purificação da afinidade do RSH. Um gel de SDS-PAGE manchadas de Coomassie mostrando lisado (L) e centrifugado lisado (CL) de induzido BL21 pMMB::rsh-his6 , bem como o escoamento (FT), lavar 1 (W1), lave 2 e fracções de eluição (E1 e E2) após a purificação da afinidade de níquel. A fração E2 foi diálise e usada para posteriores ensaios enzimáticos. Pesos moleculares de padrões de tamanho de proteína são mostrados à direita. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: preparação de placas do TLC. (A) placas são lavadas em uma dimensão, colocando a borda inferior na água (azul). Contaminantes (amarelos) migram para o topo da placa com o solvente. (B) depois de um prato é secado completamente, é lavado em uma segunda dimensão girando-a 90 ° em relação a primeira lavagem e novamente permitindo água migrar para o topo da placa. (C) depois de lavar, mais contaminantes são isolados em um canto da placa. A resina de uma placa de TLC lavada pode ser marcada suavemente com um lápis macio para indicar onde as amostras devem ser manchadas. Para 2 amostras μL, um mínimo de 1 cm entre pontos irá garantir a separação adequada da amostra. As amostras estão manchadas do 'fundo' da placa de 2 cm. Após a aplicação da amostra, solvente pode ser executado para o 'top' onde qualquer contaminante será foram isolado por lavagens a água. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: quantificação do sinal. Regiões de interesse (ROIs) definindo o total, ATP e sinal de ppGpp são mostradas para uma faixa em branco e uma faixa experimental. Intensidade de sinal dentro de cada ROI em branco é subtraída o valor experimental, e os sinais de ATP e ppGpp são normalizados para o total de sinal usando as equações mostradas para apresentar a porcentagem do total sinal radioativo atribuível à ATP e ppGpp. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Autoradiograph de uma placa de TLC representante: (A) esta imagem mostra a frente do solvente, ATP, ppGpp e locais de ponto iniciais de uma reação executada utilizando purificada c. difficile RSH. Uma reação de controle não proteicos (Parque Nacional) permite a quantificação da hidrólise de ATP uncatalyzed enquanto uma faixa em branco permite a quantificação exata do sinal. (B) as intensidades de sinal absoluto de ATP e ppGpp durante 120 minutos de incubação com c. difficile RSH. São mostradas as médias e desvios-padrão de quatro experimentos independentes. (C), os mesmos dados de (B) com o ppGpp sinal apresentado como uma porcentagem do total sinal radioativo. ppGpp acumulação na reação sem controle de proteína (Parque Nacional) é mostrada em preto. São mostrados os meios e os desvios-padrão dos dois experimentos independentes com dois técnicos repetições cada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui nós relatamos a purificação do RSH com sua Tag de c. difficile e apresentar um método para a quantificação de atividade usando cromatografia em camada fina radiolabeled. Este método foi usado anteriormente para avaliar a atividade das enzimas de ciclase diguanylate de c. difficile, bem como sintetase do ppGpp (p), ciclase de nucleotídeos, quinase e enzimas fosfodiesterase de outros organismos11,12 ,13,21. Enquanto o método não é novo, é amplamente aplicável a muitos tipos de ensaio, e esperamos que os investigadores encontre sua apresentação em formato de vídeo útil.
Os passos mais críticos dentro do protocolo são a purificação de proteínas (2.1.3–2.1.10 de passos), preparação de reação para cromatografia de camada fina (passo 2.2 – 2.3) e análise de dados (passo 3.4). Encontramos as seguintes modificações para ser especialmente útil: a adição de MgCl2 para os buffers usados para purificação da coluna de níquel (2.1.3–2.1.10 passos) é crucial para a atividade enzimática da proteína purificada e a apresentação da dados de atividade enzimática como % ppGpp produziram um pouco do que absoluta ppGpp produzido garante que os dados coletados em dias diferentes, com diferentes de γ -32P-ATP são consistentes. Este método é acessível a qualquer grupo de pesquisa com acesso a um phosphorimager, e a análise dos dados é simples. Por dosar a atividade phosphotransfer como uma porcentagem de 32P convertido para ppGpp, asseguramos a reprodutibilidade de dados. Porque volumes muito pequenos de reação são identificados nas chapas de PEI-celulose, existe um potencial significativo de pequenas imprecisões pipetagem apresentar erro significativo na quantidade absoluta de γ -32P-ATP ou 32P-ppGpp em uma determinada faixa na placa de TLC, mas a distribuição do sinal radioativo entre as formas possíveis é independente do sinal total presente. Além disso, o total de sinal radioativo em uma determinada faixa pode depende da idade da γ -32P-ATP usado no experimento. 32 P tem uma meia-vida de 14,3 dias, então independentes ensaios realizados dias de diferença podem mostrar diferenças substanciais no total sinal radioativo detectado, mas a quantidade relativa de radiolabeled ATP e ppGpp depende somente atividade enzimática. Apresentando os dados como 'por cento ppGpp' ao invés de absoluto ppGpp sinal impede a introdução de ruído aleatório de pipetagem erro ou decaimento radioativo. Isto é ilustrado pelas diferenças entre Figura 4B e 4 C. Tanto exibir os meios e os desvios-padrão dos dados das experiências de quatro mesmos, mas os dados na Figura 4 tem sido normalizados para o total de sinal radioativo.
Nós determinamos que a enzima de c. difficile RSH é um funcional ppGpp sintetase em vitro, capaz de rápida pyrophosphotransfer de um phosphodonor de ATP e um aceitador do PIB. Esta reação é dependente de magnésio, que coordena o ATP e vinculação de guanosina por RSH enzimas família22. Modificamos os protocolos do fabricante para a cromatografia de afinidade de níquel incluir 5 mM MgCl2 na Lise e buffers de lavagem, bem como a eluição do buffer porque achamos que a purificação na ausência de magnésio é prejudicial para o atividade enzimática da proteína purificada. Isto sugere que íons de magnésio podem desempenhar um papel não-catalítica em estabilizar a estrutura da proteína na ausência de ligação de nucleotídeos, mas ainda mais caracterização estrutural será necessária confirmá-lo.
A nosso conhecimento, este trabalho é o primeiro relatório publicado de síntese ppGpp em c. difficile e indica que este organismo é susceptível de utilizar uma (p) ppGpp-resposta mediada por rigorosas para sobreviver estresse extracelular. (p) ppGpp metabolismo nunca antes tem sido relatado neste importante patógeno humano. Dado que a resposta rigorosa está implicada na persistência em muitos outros patógenos, é provável que (p) mediada por ppGpp sinalização pode desempenhar um papel na tolerância de estresse elevado de células de c. difficile e a taxa de recorrência elevada de c. difficile infecção23,24,25.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIAID 1K22AI118929-01. EBP foi apoiado por uma bolsa de programa verão Research Fellowship do escritório de pesquisa na Universidade de Old Dominion, Norfolk, Virginia, EUA.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inducible overexpression of a histidine-tagged protein | |||
| Phusion polymerase | New England Biolabs (NEB) | M0530L | |
| QIAEX II DNA Gel Extraction Kit | Qiagen | 20021 | |
| KpnI restriction enzyme | NEB | R0142S | |
| PstI restriction enzyme | NEB | R0140S | |
| T4 DNA ligase | NEB | M0202 | |
| NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C2987I | |
| BL21 (DE3) Competent E. coli | NEB | C2527I | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | 10724815001 | |
| JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor | Beckman Coulter Avanti | - | |
| Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor | Scilogex | - | |
| MaxQ SHKE6000 Incubator | Thermo Scientific | - | |
| Ultrasonic processor | Sonics | VC-750 | |
| Protein purification by nickel affinity chromatography | |||
| Ni-NTA resin | G Biosciences | 786-940/941 | |
| Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL | Thermo Scientific | 29924 | |
| 1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) | Spectrum | G235033 | |
| Mini-Protean Electrophoresis Cell | BioRad | 1658004 | |
| Protein activity assay by thin layer chromatography | |||
| Thin layer chromatograph (TLC) development tank | General Glass Blowing Company | 80-3 | |
| Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support | Sigma-Aldrich | Z122882-25EA | |
| ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi | Perkin Elmer | NEG002A | |
| Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM | Bio Basic Canada | AB0311 | |
| Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) | Alfa Aesar | AAJ61646MC/E | |
| Storage phosphor screen | GE Healthcare Life Sciences | BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen | |
| Storm 860 phosphorimager | GE Healthcare Life Sciences | - |
References
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