Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile

Published: November 3, 2018 doi: 10.3791/58547
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Old Dominion University

Summary

Aquí, describimos un método para purificar enzimas pyrophosphokinase etiqueta histidina y utilizando cromatografía en capa fina de sustratos marcados radiactivamente y productos para análisis de la actividad enzimática in vitro. El ensayo de actividad de la enzima es ampliamente aplicable a la quinasa, ciclasa de nucleótidos o reacción de transferencia de fósforo cuyo mecanismo incluye la hidrólisis de nucleótidos trifosfato.

Abstract

Enzimas quinasa y pyrophosphokinase transfieren del fosfato gamma o la molécula de pirofosfato beta-gamma a partir de precursores de nucleótidos trifosfato a sustratos para crear productos fosforilados. El uso de la γ -32- P etiquetado precursores NTP permite supervisión simultánea de formación de producto y utilización del sustrato por la radiografía. Cromatografía en capa fina (TLC) en las placas de celulosa permite la rápida separación y cuantificación sensible de sustrato y producto. Se presenta un método para la utilización de la cromatografía en capa fina para analizar la actividad pyrophosphokinase de una sintetasa purificada de ppGpp (p). Este método se ha utilizado anteriormente para caracterizar la actividad de sintetasas de nucleótido y dinucleótido cíclicos y es ampliamente conveniente para caracterizar la actividad de cualquier enzima que hidroliza un enlace de nucleótidos trifosfato o transfiere un terminal fosfato a partir de un donante de fosfato a otra molécula.

Introduction

Enzimas quinasa y pyrophosphokinase (o diphospho-quinasa) transferencia de fosfatos a partir de precursores de nucleótidos trifosfato (NTP) a las moléculas de sustrato. Los sustratos pueden incluir otros nucleótidos, aminoácidos o proteínas, carbohidratos y lípidos1. Análisis Bioinformático a veces pueden predecir una enzima cognada sustrato o sustratos basados en la semejanza a las enzimas caracterizadas, pero validación experimental sigue siendo necesario. Del mismo modo, la afinidad de una enzima para sus substratos y la tasa a la que cataliza la reacción de transferencia de fósforo y los efectos de factores inhibidores y otros efectores de la enzima deben ser determinada experimentalmente. Para evitar el agotamiento del precursor del ATP por otras enzimas ATP-consumo presentes en el citoplasma bacteriano, ensayos de actividad cuantitativa requieren proteínas purificadas.

Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad metálica ha sido cubierto completamente en la literatura2,3. Etiquetas de la histidina que consta de seis residuos de histidina consecutivos anexados a la N - o C-terminal de una proteína recombinante permiten rápida purificación por cromatografía de afinidad metálica4,5,6. Estas secuencias son pequeñas comparadas a las proteínas modifican y suelen tener un efecto mínimo en función de la proteína, aunque a veces puede alterar la estabilidad de la proteína o enzima cinética7,8. Etiquetas de histidina en la N - y C-termini de la misma proteína pueden tener diversos efectos, que son difíciles de predecir sin conocer la estructura de la proteína en cuestión. Etiquetas de la histidina se incorporan típicamente durante la clonación de una proteína recombinante mediante el diseño de primers que codifican seis residuos de histidina, ya sea inmediatamente 3' al codón de inicio ATG o inmediatamente 5' al codón de parada del marco abierto de lectura. Después de la amplificación, el gen que contiene hexahistidine es ligado en un vector bajo el control de un promotor inducible y expresado, típicamente en una cepa de laboratorio de e. coli. La proteína de recombinación entonces puede ser aislada en una resina de afinidad que contienen cationes divalentes inmovilizados (generalmente níquel o cobalto)9. Natales metal vinculante proteínas contaminantes pueden eliminarse por titulación con imidazol, que desplaza competitivamente proteína encuadernada2. Finalmente, la proteína Diana es eluida de la columna con altas concentraciones de imidazol. Hay varias fuentes comerciales para las resinas de catión metal inmovilizados, y los fabricantes ofrecen recomendaciones para las condiciones de buffer y concentraciones de imidazol. Después de elución, la proteína puede ser analizada por electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE), dializaron o utilizada inmediatamente en análisis funcionales.

Hay varios métodos para monitorear indirectamente actividad quinasa por acoplamiento hidrólisis de enlace de fosfato de ATP a una segunda reacción que libera o excita un fluoróforo o genera la quimioluminescencia, pero estas reacciones tienen varias partes móviles y pueden ser logísticamente difíciles10. La manera más directa para medir específicamente la actividad de transferencia de fósforo es monitorizar directamente la transferencia de un grupo fosfato radiomarcada de un γ disponibles comercialmente -32-P precursor NTP a un sustrato no radiactiva11 , 12 , 13. mezclas de sustratos radiactivos y productos pueden ser separados y cuantificados por cromatografía en capa fina (TLC). TLC utiliza la movilidad diferencial de los solutos en un solvente dado, permitiendo que el solvente (fase líquida) que migra por acción capilar a través de una superficie (fase sólida) sobre el cual una mezcla de solutos ha sido adsorbido14. Solutos que son pequeñas y carecen de interacciones favorables con la fase sólida se migran largas distancias desde su ubicación inicial a solutos con peso molecular mayor o gran afinidad por el sólido. Para el examen de transferencia de fósforo, partes de fosfato aumentan el peso molecular de las moléculas que se agregan a y agregar la carga iónica negativa a pH neutro o acídico11,12,14. Esto disminuye su movilidad sobre superficies básicas como PEI-celulosa. Cuando se convirtió en tampón de fosfato ácido de potasio, mezclas de mono-, di-, tri-, tetra- y especies pentaphosphate pueden dividirse fácilmente en PEI-celulosa, permitiendo la cuantificación de cada especie (figura 2, figura 3). Estos ensayos se pueden realizar lysates de la célula que contiene la enzima de interés, pero esto incluye el potencial de la actividad de otras quinasas, fosfatasas y ATPasas general a agotar el sustrato o producto. Una cuantitativa en vitro la evaluación de la actividad enzimática, es necesario purificar la enzima de interés.

Guanosina tetraphosphate (ppGpp) y guanosina pentaphosphate (pppGpp) son ribonucleótido señalización moléculas formadas por la transferencia de un pirofosfato grupo de un precursor de la adenosina trifosfato (ATP), respectivamente, un difosfato de guanosina (PIB) o guanosina tetraphosphate (GTP) sustrato15. Estas señales solo ribonucleótido, conocidas colectivamente como (p) ppGpp, median una respuesta todo el celular a la tensión ambiental, conocida como la respuesta estricta en diversas especies bacterianas15,16. Dos clases conservadas de enzimas catalizan la formación de (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homólogo (RSH) enzimas son 'largo' bifuncional (p) ppGpp sintetasa/hidrolasas, nombrado para su semejanza a la RelA y punto (p) ppGpp metabólica enzimas de Escherichia coli que contienen sintetasa, hidrolasa y dominios de regulación, mientras que el pequeño alarmone sintetasa (SAS) enzimas son monofuncionales corto sintetasas exclusivamente encontradas Gram positivas bacterias15, 17 , 18. la bacteria gram positiva formadoras de esporas de Clostridium difficile codifica supuestos genes RSH y SAS19. Aquí, presentamos el análisis de la actividad inicial que confirman que la enzima de C. difficile RSH es una catalítico activa sintetasa de ppGpp (p).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducible por la sobreexpresión de una proteína histidina-tagged

  1. Amplificar el rsh de C. difficile R20291 ADN genómico.
    1. Uso de una polimerasa de alta fidelidad y siga las instrucciones del fabricante.
    2. Rsh de C. difficile utilizando cebadores de amplificación
      rsh_F (GGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG deGGTACCde CA) y
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), que introduce una etiqueta de hexahistidine C-terminal.
      Nota: El KpnI y PstI cortar sitios en las secuencias de la cartilla están en negrita.
    3. Digerir el vector de pMMBneo y el producto PCR de rsh his6 con restricción Pstl y KpnI corte sitios a 37 ° C por 45 min.
    4. Purificar el vector linearizado y los fragmentos PCR mediante electroforesis en gel de agarosa y posterior purificación con un kit de extracción de gel de DNA.
    5. Medir la absorbancia nm 280 (un280) de los vectores y el producto PCR amplificado. Utilice la ecuación Equation 1 para determinar la concentración de ADN de cada fragmento de ADN.
  2. Ligar rsh en pMMBneo para la expresión.
    1. Combinar 25 ng de digerido PMMBneo vector, 125 ng del producto del gene del rsh-his6 , 2 μL de 10 x buffer ligasa y 1 μL de ADN ligasa. Utilice el agua libre de nucleasa para ajustar el volumen total de 20 μL. Incubar a 16 ° C por 16 h.
      Nota: La eficacia de la ligadura depende del tamaño del fragmento y se debe ajustar en base a protocolos de fabricante.
    2. Transformar el producto de vectores ligado en e. coli DH5-α u otra variedad de mantenimiento plásmido recA . Seleccionar las células transformadas en placas de LB con kanamicina 100 de μg/mL e incubar por 16-24 h a 37 ° C.
    3. Pick cuatro colonias de la placa de transformación (s) y cada uno en un plato fresco que contiene 100 kanamicina μg/mL para la extracción de ADN de la raya. Incubar las placas nuevas a 37 ° C durante 16-24 h y seleccione un aislante para la expresión de proteína posterior.
    4. Para confirmar la ligadura acertada de la proteína intacta rsh codificación región, aislar a una colonia de los elegidos en 20 μL de agua, calentar a 95 ° C durante 10 minutos y utilizar como una plantilla para una PCR confirmatoria utilizando la misma cartilla utilizada para amplificar el gen.
  3. Transformar el plásmido verificado según protocolos estándar de transformación de transformación bacteriana plásmido de e. coli e. coli BL21 sistema para producción de proteínas de alta rentabilidad.
  4. RSH-His6 expresa en e. coli.
    1. Seleccione una sola Colonia de e. coli BL21 transformada con pMMBneo::rsh e inocular 2 mL de medio LB con kanamicina 50 de μg/mL. Incubar a 37 ° C 12 – 16 h agitando a 250 rpm.
    2. Inocular 500 mL de medio LB con kanamicina 50 de μg/mL con 0,5 mL del cultivo durante la noche para el crecimiento celular y la expresión de la proteína.
    3. Incubar la cultura de expresión a 37 ° C y 250 rpm en un agitador incubador hasta que la densidad celular alcanza un OD600 0,167 a 37 ° C.
    4. Reducir la temperatura de la incubadora a 30 ° C y esperar 30 minutos para que caiga la temperatura de cultura.
    5. Inducen la expresión de RSH añadiendo isopropílico β-D-thiogalactoside (IPTG) a una concentración final de 0,5 mM. Permita que la inducción se realice durante la noche (de 16 a 18 h) a 30 ° C, agitación a 250 rpm.
    6. De pellets por centrifugación a 3.080 x g durante 30 min a 4 ° C.
      Nota: La pastilla se puede almacenar durante la noche a-20 ° C para purificar proteína diana al día siguiente sin pérdida notable de rendimiento de la proteína o la actividad enzimática.

2. proteína purificación por cromatografía de afinidad níquel

Nota: Seguir directamente con pasos de purificación de proteínas a continuación después de clarificar el lysate de la célula. Almacenar aclaró lisado a 4 ° C durante la noche para la purificación de proteínas posterior reduce la producción de proteína.

  1. Purificar proteínas usando 1 mL de resina de ácido Nitriloacetic de níquel (Ni-NTA) en una columna de gravedad.
    1. El día antes de usar, equilibrar la columna durante la noche a 4 ° C con 2 mL de tampón de equilibrado (10 mM Tris-HCl pH 7.79, 300 mM de NaCl, 50 mM NaH2PO4, lisozima de 0.5 mg/mL, 5 mM de MgCl2, imidazol de 10 mM, 0,25 mM DTT, fenilmetano sulfonilo de 5 mM fluoruro (PMSF), glicerol al 10%).
    2. Al día siguiente poner la columna de 4 ° C a RT antes de cargar el clarificado lisado y dejar reposar ~ 2-3 h.
      Nota: La columna en equilibrio termal es crucial para evitar burbujas de aire formando dentro de la columna.
    3. Resuspender el precipitado obtenido en el paso 1.3.6 en el tampón de lisis (10 mM Tris-HCl pH 7.8, 300 mM de NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 10% glicerol, lisozima de 0.5 mg/mL, imidazol de 10 mM, 0,25 mM DTT y 5 mM PMSF).
    4. Someter a ultrasonidos las células en hielo para intervalos de s 8 x 10, haciendo una pausa 30 s entre pulsos.
    5. Aclarar el lisado por centrifugación a 3.080 x g durante 30 min a 4 ° C utilizando una microcentrífuga.
    6. Preparar lisado con iguales volúmenes de tampón de lisis y aplique el preparado aclaró lisado a la columna y recoge el flujo a través.
    7. Reaplique clarificada lisado paso a la columna y recoger el secundario flujo a través.
    8. Lavar la columna con tampón de lavado 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 50 mM NaH2PO4, imidazol de 30 mM, 10% glicerol). Recoge el flujo a través.
      Nota: La inclusión de 5 mM de MgCl2 en la tampones de lavado y elución es importante para la actividad enzimática de la proteína purificada.
    9. Lavar la columna con tampón de lavado 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2, 50 mM NaH2PO4 e imidazol de 50 mM). Recoge el flujo a través.
    10. Aplicar 2 mL de tampón de elución (10 mM Tris-HCl (pH 7.79), 300 mM de NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10% glicerol e imidazol de 75 mM). Recoger flujo a través de dos fracciones de 1 mL.
      Nota: La columna después de este paso puede almacenarse en tampón de equilibrado a 4 ° C si la misma proteína se purificó en el siguiente ensayo de purificación. La columna puede utilizarse hasta 3 veces si está almacenado correctamente.
  2. Evaluar las fracciones de la columna de la pureza por SDS-PAGE.
    1. Evaluar cualitativamente la purificación de proteínas, ejecutar 20 alícuotas μL de todas aquellas fracciones de la columna en un gel de poliacrilamida 4% / 10% durante 60 minutos a 170 V.
    2. Tinción del gel con azul de Coomassie 0.1% a temperatura ambiente durante 5 h, mecerse suavemente en un eje de balancín del benchtop.
    3. Desteñir el gel en metanol al 40%, 10% de ácido acético glacial durante la noche a temperatura ambiente, mecerse en una mecedora de sobremesa.
      Nota: Un representante de gel está representado en la figura 1.
  3. Dializan eluir fracción 2 de la noche a 4 ° C.
    1. Dializan contra buffer de diálisis (15,7 mM Tris-HCl (pH 7.6), 471,9 mM NaCl, 15,69 mM MgCl2, 1,57 mM DTT, 1,5 mM PMSF y 15.7% de glicerol) en una proporción de 200: 1 utilizando un aparato de diálisis de 1 mL con un 20 kDa de corte de peso molecular (MWCO).
    2. Determinar la concentración de proteína dializado muestra mediante la medición de absorbancia a 280 nm y utilizando el coeficiente de extinción molar calculado de-182085 M cm-1 20.
    3. Almacenar 5 alícuotas μL de la muestra de proteína dializado en alícuotas a-80 ° C hasta su uso.

3. proteína actividad análisis por cromatografía en capa fina

  1. Preparar la placa de cromatografía de capa fina.
    1. Antes de realizar la reacción, preparar polietilamina (PEI)-placas de celulosa por lavado en agua desionizada. Coloque las placas en una cámara de vidrio con agua destilada a una profundidad de ~0.5 cm.
    2. Permita que el agua migrar a la parte superior de la placa.
      Nota: Lava las placas no es estrictamente necesario, las placas pueden utilizarse sin él, pero lavado aumentar la claridad de las imágenes resultantes. Lava las placas en dos direcciones perpendiculares más asegura que cualquier contaminante presente en la resina se aíslan en una esquina de la placa (figura 2).
    3. Sacar las placas de la cámara de cristal y dejar en un estante mesa seco durante la noche (12 – 18 h).
    4. Marcar las placas secas 2,0 cm de un borde con un lápiz suave para indicar donde se aplicarán las muestras para el TLC. Para muestras de 2 μL, se aplican las muestras distanciados no menos de 1,0 cm (figura 2).
      Nota: Esto permite la separación clara entre el terreno adyacente, que es fundamental para la cuantificación de la señal. Como la resina de la celulosa no es rayado, pequeñas marcas de lápiz en la superficie no interferirá con migración de solvente.
    5. Al planear experimentos, siempre deja un punto en cada placa sin usar.
      Nota: Esto proporcionará un carril en blanco para la cuantificación de la muestra (figura 2). Una placa de 20 cm TLC tendrá espacio para 19 puntos.
  2. Ensayo de actividad enzimática
    1. Preparar una mezcla de tampón 5 x que contiene 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), acetato de amonio 25 mM, 10 mM KCl, 1 mM TDT y 0,6 mM ATP.
      Nota: Esta mezcla puede ser preparada en grandes cantidades y congelada en alícuotas μL 10 para su uso posterior. No someta la mezcla a varios ciclos de congelación y descongelación.
    2. Preparar las reacciones individuales que contiene 3 μM RSH, mezcla de tampón de x 1, 0.6 mM PIB, 1,2 mM MgCl2. Añadir 1,0 μCi de γ -32P-ATP por 10 μL de la reacción y agua libre de nucleasa para llevar la reacción hasta un volumen deseado. Agregar el RSH después de los otros componentes se han mezclado, la adición de RSH a la mezcla que contiene nucleótidos inicia el ensayo de actividad enzimática.
      Nota: Volumen de reacción Final dependerá del número de puntos de tiempo muestreado. Para la muestra 2 μL/punto, montar 10 μL de mezcla de reacción para cada 4 puntos de tiempo.
    3. Para controlar para la hidrólisis de ATP de la actividad de nucleasas contaminantes, montar una reacción μL 10 que contienen ninguna proteína e incubar en paralelo. Spot 2 muestras μL en t = 0 y al final del experimento para asegurarse de que no era hidrolizada de ATP en ausencia de proteína.
    4. Inmediatamente bajo adición de RSH, quitar 2 μL y punto en la placa de celulosa PEI etiquetada como t = 0 min muestra.
    5. Incubar la reacción a 37 ° C, quitar 2 alícuotas μL en los puntos de tiempo deseados.
      Nota: Actividad enzimática se interrumpirá cuando la muestra es adsorbida en la placa de celulosa. Espere 10-30 min después de que el último lugar se añade al plato antes del desarrollo para asegurar la completa adsorción y secado de la muestra.
  3. Cromatografía en capa fina
    1. Llene la cámara de cromatografía con 1,5 M 1,5 M KH2PO4 (pH 3.64) a una profundidad de 0,5 cm.
      Nota: El volumen necesario dependerá de las dimensiones de la Cuba de cromatografía. Puede utilizarse cualquier recipiente de vidrio con una nivel inferior que es lo suficientemente ancha para permitir la inserción de la placa de TLC sin doblar como un tanque en desarrollo con la adición de una cubierta. La placa de TLC se puede cortar en tiras más estrechas con un razorblade limpio para permitir el desarrollo en un vaso de precipitados de vidrio cubierta de película plástica.
    2. Sumergir el borde inferior de la placa en solvente. Deje que el solvente migrar a la parte superior de la placa (~ 90 min).
      Nota: Mientras que la migración de solvente se detendrá en la parte superior de la placa y las muestras no se pierdan o correr juntos durante una inmersión más, placas deben no quedar solvente durante la noche. Inmersiones más de 4 h pueden causar la resina desconectar de la placa de respaldo y resultar en la pérdida de señal.
    3. Retire la placa de la Cuba de cromatografía y colóquela sobre una mesa tendedero.
    4. Seque la placa al aire durante la noche.
      Nota: Secado puede acelerarse mediante el uso de un secador de pelo. Secado puede ser evaluada por el color de la resina, que se oscurece cuando está mojado y retomar el color de un plato sin usar cuando esté completamente seco.
    5. Después de que la placa esté seca, envolver la placa en lámina de plástico para evitar la transferencia de material radiactivo en el casete imágenes y analizar por autorradiografía (figura 3).
  4. Análisis de datos
    1. Exponer la placa de celulosa PEI que contienen reacciones separadas en una casete phosphorimager durante 4 h a temperatura ambiente.
      Nota: Esta es la exposición suficiente para producir una imagen muy clara con las concentraciones indicadas de fresco γ -32P-ATP. Si se utilizan menores cantidades de sustratos marcados radiactivamente, tiempo de exposición puede aumentar a 12-16 h.
    2. Imagen de la cinta en un phosphorimager.
    3. Usando proyección de imagen de software con una interfaz gráfica de usuario, dibujar regiones de interés (ROIs) seleccionando el Rectángulo dibujar y utilizar el ratón para dibujar ROIs rectangulares alrededor de uno todos manchas lane y el ATP y el ppGpp dentro de ese carril (figura 3 ).
    4. Utilice los comandos seleccionar, copiar y pegar (o basados en el software de proyección de imagen se utilizan los comandos correspondientes) para dibujar ROIs idénticas en los otros carriles para asegurar que la señal dentro de áreas idénticas en cada carril de medición es el ROI. Incluyen ROIs de un carril sin usar, para ser utilizado como espacios en blanco.
    5. Usando el analizar | Herramientas | ROI Manager | Añadir comandos de software tratamiento de imágenes, seleccione todos los ROIs dibujadas sobre la placa de celulosa PEI.
    6. Usando el analizar | Establecer medidas | Medida comandos, cuantificar la intensidad de señal dentro de cada ROI y exportar las medidas como una hoja de cálculo (figura 3). Restar valores de retorno de la inversión en blanco de las señales experimentales.
    7. Calcular qué porcentaje de la señal de cubiertas dentro de cada carril es atribuible a ATP y ppGpp mediante las fórmulasEquation
      Nota: ROIs pueden ser dibujados y cuantificaron usando software comercial compatible con la phosphorimager o gratuitamente software ImageJ (institutos nacionales de salud).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Se presenta un método para la purificación de la afinidad de una ligasa de (p) ppGpp de Clostridium difficile y la evaluación de su actividad enzimática. Figura 1 muestra la purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad metálica. La segunda fracción de elución (E2) de esta purificación se dializaron y utilizada para el ensayo de actividad enzimática. Figura 2 detalla los pasos necesarios para preparar y llevar a cabo ensayos de pyrophosphotransferase por cromatografía en capa fina. La figura 3 ilustra cómo los datos de estos experimentos es cuantificados con un énfasis apropiado que esconde y conversión de intensidad de la señal en porcentajes. En la Figura 4A, presentamos un autoradiograph TLC representativa de un ensayo de sintetasa (p) ppGpp mediante RSH purificada, una ligasa de C. difficile (p) ppGpp. La ubicación de punto inicial, ppGpp y puntos de ATP son claramente visibles en el autoradiograph, como es el frente del solvente que es visible ya que contiene cantidades de rastro de fosfato inorgánico radiactivo. Moléculas con más moléculas de ácido fosfórico exhiben menos movilidad de la ubicación del punto inicial, ya que tienen mayor peso molecular y carga iónica más negativa; Esto impide su movilidad en la PEI básica-celulosa. A lo largo de 120 min a 37 ° C, acumulación de ppGpp y el agotamiento de ATP son insignificantes en reacciones de falta de la enzima sintetasa, mientras que el agotamiento del ATP y acumulación de ppGpp son evidentes en la presencia de RSH Figura 4A). Figura 4B muestra las señales ATP y ppGpp absolutas de cuatro experimentos. Figura 4 muestra los mismos datos que Figura 4B con las señales absolutas convertidos a porcentajes del total de la señal radiactiva. Esto minimiza la inexactitud debido a error de pipeteo o decaimiento radiactivo y permite que los datos de experimentos llevados a cabo en días diferentes para combinarse sin introducir incertidumbre en los datos.

Figure 1
Figura 1: purificación de la afinidad de RSH de níquel. Un gel de SDS-PAGE de tinción de Coomassie mostrando lisado (L) y centrifugado (CL) lisado de inducido BL21 pMMB::rsh his6 así como el flujo a través (FT), lavar 1 (W1), lava 2 y fracciones de elución (E1 y E2) después de la purificación de níquel afinidad. La fracción E2 se dializaron y se utiliza para posteriores ensayos enzimáticos. Pesos moleculares de los estándares de tamaño de la proteína aparecen a la derecha. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: preparación de las placas de TLC de. (A) las placas se lavan en una dimensión, colocando el borde inferior en el agua (azul). Contaminantes (amarillos) migran a la parte superior de la placa con el solvente. (B) después de que una placa se seca completamente, se lava en una segunda dimensión gira 90 ° en relación con el primer lavado y otra vez permitiendo que el agua migrar a la parte superior de la placa. (C) después de lavado, más contaminantes están aislados en una esquina de la placa. La resina de una lavada placa de TLC se puede marcar suavemente con un lápiz suave para indicar donde se deben disfrutar de las muestras. Para muestras de 2 μL, un mínimo de 1 cm entre puntos asegurará de separación de la muestra adecuado. Las muestras son vistas 2 cm del fondo de la placa. Después de la aplicación de ejemplo, solvente se permite correr a la 'top', donde cualquier contaminante habrá sido aislado por los lavados de agua. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: cuantificación de la señal. Regiones de interés (ROIs) definir el total, ATP y la señal de ppGpp se muestran para un carril en blanco y un carril experimental. Intensidad de la señal dentro de cada ROI en blanco se resta del valor experimental, y las señales de ATP y ppGpp se normalizan a la señal total utilizando las ecuaciones que se muestra para presentar el porcentaje de la señal radiactiva total atribuible a ATP y ppGpp. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. Autoradiograph de una placa de TLC representante: (A) esta imagen muestra el frente del solvente, ATP, ppGpp y ubicaciones de punto iniciales de una reacción que se llevó a cabo mediante purificaron C. difficile RSH. Una reacción de control que contengan ninguna proteína (Parque Nacional) permite la cuantificación de la hidrólisis de ATP no catalizados mientras que un carril en blanco permite la cuantificación exacta de la señal. (B) intensidad de la señal absoluta de ATP y ppGpp durante 120 minutos de incubación con C. difficile RSH. Se muestran las medias y desviaciones estándar de cuatro experimentos independientes. (C) los mismos datos de (B) con el ppGpp señal presentada como un porcentaje del total de la señal radiactiva. acumulación de ppGpp en la no reacción del control de la proteína (Parque Nacional) se muestra en negro. Se muestran las medias y desviaciones estándar de dos experimentos independientes con dos repeticiones técnicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aquí divulgamos la purificación de su etiquetado RSH de C. difficile y presentar un método para la cuantificación de la actividad utilizando cromatografía en capa fina radiactivos. Este método se ha utilizado anteriormente para evaluar la actividad de enzimas de Diguanilato ciclasa de C. difficile, como ligasa de (p) ppGpp, ciclasa de nucleótido, quinasa y las enzimas fosfodiesterasa de otros organismos11,12 ,13,21. Mientras que el método no es nuevo, es ampliamente aplicable a muchos tipos de análisis, y esperamos que los investigadores serán muy útiles su presentación en formato de vídeo.

Los pasos más críticos dentro del protocolo son la purificación de proteínas (medidas 2.1.3–2.1.10), preparación de reacción por cromatografía en capa fina (paso 2.2 – 2.3) y análisis de datos (paso 3.4). Hemos encontrado las siguientes modificaciones a ser especialmente útil: la adición de MgCl2 para los búferes que se utiliza para la purificación de la columna de níquel (medidas 2.1.3–2.1.10) es crucial para la actividad enzimática de la proteína purificada y la presentación de la datos de actividad de la enzima como % ppGpp producción más bien que absoluta ppGpp producido asegura que los datos recogidos en días diferentes, con diferentes de γ -32P-ATP son constantes. Este método es accesible a cualquier grupo de investigación con acceso a un phosphorimager, y el análisis de datos es sencillo. Por cuantificación phosphotransfer actividad como un porcentaje de 32P convertido a ppGpp, aseguramos la reproducibilidad de los datos. Porque los volúmenes de reacción muy pequeños son vistos en las placas de celulosa PEI, hay un potencial significativo para leves imprecisiones pipeteo introducir error significativo en la cantidad absoluta de γ -32P-ATP o 32P ppGpp en una calle determinada en la placa de TLC, pero la distribución de la señal radiactiva entre las formas posibles es independiente de la señal total. Además, el total de la señal radiactiva en un carril determinado puede depender de la edad de la γ -32P-ATP usado en el experimento. 32 P tiene una vida media de 14,3 días, por lo que los análisis independientes realizados varios días de diferencia pueden mostrar diferencias sustanciales en el total de la señal radiactiva detectada pero las cantidades relativas de ATP y de ppGpp radiactivos dependen sólo de la actividad enzimática. Que presenta los datos como 'ppGpp porcentaje' en lugar de ppGpp absoluta señal previene la introducción de ruido aleatorio de error de pipeteo o decaimiento radiactivo. Esto es ilustrado por las diferencias entre Figura 4B y 4 C. Tanto mostrar los medios y las desviaciones estándar de los datos de los misma cuatro experimentos, pero los datos en la figura 4 ha sido normalizados a la señal radiactiva total.

Hemos determinado que la enzima de C. difficile RSH es un funcional ppGpp sintetasa en vitro, capaz de pyrophosphotransfer rápida de phosphodonor de un ATP y un aceptor de PIB. Esta reacción es dependiente de magnesio, que coordina ATP y enlace guanosina por RSH enzimas familia22. Hemos modificado los protocolos del fabricante para la cromatografía de afinidad níquel incluir 5 mM MgCl2 en la lisis y tampones de lavado así como la elución del almacenador intermediario porque hemos encontrado que la depuración en la ausencia de magnesio es perjudicial para la actividad enzimática de la proteína purificada. Esto sugiere que los iones de magnesio pueden jugar un papel no-catalítico en la estabilización de la estructura de la proteína en ausencia de unión de nucleótido, pero más caracterización estructural será necesario confirmarlo.

A nuestro conocimiento, este trabajo es el primer informe publicado de ppGpp síntesis de C. difficile e indica que este organismo es probable utilizar un (p) ppGpp estricta reacción para sobrevivir el estrés extracelular. (p) ppGpp metabolismo nunca se ha divulgado en este patógeno humano importante. Dado que la respuesta estricta está implicada en la persistencia en muchos otros patógenos, es probable que (p) ppGpp-mediada de señalización puede desempeñar un papel en la tolerancia de alta tensión de las células de C. difficile y la alta tasa de recurrencia de C. difficile infección23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran no intereses financieros que compiten u otros conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por NIAID 1K22AI118929-01. EBP fue apoyado por una beca para programa de beca verano investigación de la oficina de investigación en Old Dominion University, Norfolk, Virginia, Estados Unidos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase New England Biolabs (NEB) M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit Qiagen 20021
KpnI restriction enzyme NEB R0142S
PstI restriction enzyme NEB R0140S
T4 DNA ligase NEB M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli NEB C2527I
IPTG Sigma-Aldrich 10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor Beckman Coulter Avanti -
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor Scilogex -
MaxQ SHKE6000 Incubator Thermo Scientific -
Ultrasonic processor Sonics VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin G Biosciences 786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL Thermo Scientific 29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) Spectrum G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell BioRad 1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank General Glass Blowing Company 80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support Sigma-Aldrich Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi Perkin Elmer NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM Bio Basic Canada AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) Alfa Aesar AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen GE Healthcare Life Sciences BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager GE Healthcare Life Sciences -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
  2. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
  3. Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
  4. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  5. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  6. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  7. Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
  8. Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
  9. Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
  10. Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
  11. Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
  12. Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
  13. Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
  14. Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
  15. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical? Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  16. Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
  17. Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
  18. Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
  19. Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
  20. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  21. Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
  22. Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
  23. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
  24. Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
  25. US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).

Tags

Inmunología e infección número 141 purificación de proteínas la etiqueta histidina (p) ppGpp cromatografía en capa fina radionúclido etiquetado pyrophosphokinase phosphotransfer
Una purificación y análisis de actividad <em>In Vitro</em> de una (p) ppGpp sintetasa de <em>Clostridium difficile</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. … More

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. B. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (141), e58547, doi:10.3791/58547 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter