Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

En rening och In Vitro aktivitet Assay för en (p) ppGpp kväveoxidsyntas från Clostridium difficile

Published: November 3, 2018 doi: 10.3791/58547
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Chemistry and Biochemistry, Old Dominion University

Summary

Här, beskriver vi en metod för rening av histidin-taggade pyrophosphokinase enzymer och utnyttja tunnskiktskromatografi av radioaktivt märkt substrat och produkter till assay för enzymatisk aktivitet in vitro. Enzym aktivitet analysen är i stort sett tillämpliga till Kinas, nukleotid cyclase eller fosfor-överföring reaktion vars mekanism inkluderar nukleotid trifosfat hydrolys.

Abstract

Kinas och pyrophosphokinase enzymer överför gamma fosfatet eller den beta-gamma pyrofosfat biexponentiellt från nukleotid trifosfat prekursorer till substrat att skapa fosforyleras produkter. Användning av γ -32- P märkt NTP prekursorer tillåter samtidig övervakning av substrat utnyttjande och produkten bildandet av radiografi. Tunnskiktskromatografi (TK) på cellulosa tallrikar tillåter snabb separation och känsliga kvantifiering av substrat och produkt. Vi presenterar en metod för att utnyttja den tunnskiktskromatografi för att assay pyrophosphokinase aktiviteten av en renad ppGpp kväveoxidsyntas (p). Denna metod har tidigare använts för att karakterisera aktiviteten av cykliska nukleotid och dinukleotid synthetases och passar i stort sett kännetecknar aktiviteten hos ett enzym som hydrolyserar en nukleotid trifosfat obligation eller överför en terminal fosfat från en fosfat donator till en annan molekyl.

Introduction

Kinas och pyrophosphokinase (eller uridin-Kinas) enzymer överföra fosfater från nukleotid adenosintrifosfat (NTP) prekursorer till substrat molekyler. Substratesna kan inkludera andra nukleotider, aminosyror eller protein, kolhydrater och lipider1. Bioinformatiska analyser kan ibland förutsäga ett enzym cognate substrat eller substrat baserat på likheten med kännetecknas enzymer, men experimentell validering är fortfarande nödvändig. Likaså frändskapet av ett enzym för dess substrate(s) och den hastighet som det katalyserar phosphor-överföring reaktionen, och effekterna av co-faktorer,-hämmare, eller andra enzym effektorer måste bestämmas experimentellt. För att undvika utarmning av ATP precursoren av andra ATP-krävande enzymer som förekommer i bakteriell cytoplasman, kräver kvantitativa aktivitet analyser renat protein.

Protein rening av metall affinitetskromatografi har täckts noga i litteratur2,3. Histidin tags bestående av sex på varandra följande histidin rester bifogas till N - eller C-terminus av ett rekombinant protein kan snabba rening av metall affinitet kromatografi4,5,6. Dessa sekvenser är små jämfört med de proteiner de ändra och vanligtvis har minimal inverkan på proteinfunktion, även om de ibland kan förändra protein stabilitet eller enzym kinetik7,8. Histidin taggar på N - och C-termini av samma protein kan ha olika effekter, som är svåra att förutsäga utan att känna till strukturen för proteinet som är i fråga. Histidin Taggar ingår vanligtvis under kloning av ett rekombinant protein genom att utforma primers som kodar sex histidin rester, antingen omedelbart 3' till den ATG start Codonen eller omedelbart 5' till den stop kodon av ramen öppen läsning. Efter förstärkning, är hexahistidine-innehållande genen sammanskrivna i en vektor under kontroll av en inducerbara arrangören och uttryckt, vanligtvis i ett laboratorium stam av E. coli. Rekombination proteinet kan sedan vara isolerad på en affinitet harts innehållande immobiliserade divalenta katjoner (vanligen nickel eller kobolt)9. Kontaminerande infödda metall-bindande proteiner kan avlägsnas genom titrering med Imidazol, som konkurrenskraftigt förflyttar bundna protein2. Slutligen elueras målproteinet från kolonnen med högre koncentrationer av Imidazol. Det finns flera kommersiella källor för immobiliserade metall ering hartser, och tillverkarna tillhandahåller rekommendationer för buffert villkor och Imidazol koncentrationer. Efter eluering, kan protein vara analyseras av sodium dodecyl sulfate-polyakrylamid gelelektrofores (SDS-PAGE), dialyseras eller används omedelbart i funktionella analyser.

Det finns flera metoder för att indirekt övervaka Kinas aktivitet av koppling ATP fosfat bond hydrolys till en andra reaktion som frigör eller retar en fluorophore eller genererar chemiluminescence, men dessa reaktioner har flera rörliga delar och kan vara logistiskt utmanande10. Det enklaste sättet att mäta specifikt phosphor-överföring verksamhet är att direkt övervaka överföring av en radioaktivt märkt fosfatgrupp från ett kommersiellt tillgängliga γ -32-P NTP föregångare till en icke-radioaktivt substrat11 , 12 , 13. blandningar av radiomärkt substrat och produkter kan separeras och kvantifieras genom tunnskiktskromatografi (TK). TLC använder tredjeparts koncentrationsfördelningen i ett givet lösningsmedel differentiell rörlighet genom att låta lösningsmedlet (flytande fas) migrera genom kapillärkraften över en yta (fast fas) som en blandning av koncentrationsfördelningen varit adsorberade14. Koncentrationsfördelningen som är små och/eller saknar gynnsamma interaktioner med den fasta fasen kommer att migrera längre avstånd från sin ursprungliga plats än koncentrationsfördelningen med högre molekylvikt eller stor frändskap för fast. För granskning av fosfor-överföring öka fosfat beståndsdelarna molekylvikten för molekyler de läggs till och Lägg till negativ jonisk laddning neutral eller sura pH11,12,14. Detta minskar deras rörlighet på en grundläggande yta såsom PEI-cellulosa. När utvecklat i sura kalium fosfatbuffert, kan blandningar av mono-, di-, tri-, tetra- och pentaphosphate arter lätt separeras på PEI-cellulosa, möjliggör kvantifiering av varje art (figur 2, figur 3). Sådana analyser kan utföras med cell lysates som innehåller enzymet av intresse, men detta inkluderar potentialen för aktiviteten av andra kinaser, fosfataser och allmänna ATPases att tömma de substrat eller produkt. För en kvantitativ in vitro- bedömning av enzymaktivitet är det nödvändigt att rena enzymet av intresse.

Guanosinmonofosfat tetraphosphate (ppGpp) och guanosinmonofosfat pentaphosphate (pppGpp) är ribonucleotid signaling molekyler som bildas av överföring av en pyrofosfat grupp från en adenosintrifosfat (ATP) föregångare till, respektive en guanosinmonofosfat diphosphate (BNP) eller guanosinmonofosfat tetraphosphate (GTP) substrat15. Dessa enda ribonucleotid signaler, gemensamt benämnda (p) ppGpp, förmedlar ett cell-wide svar på miljömässig stress kallas den stränga svaren i olika bakteriearter15,16. Två bevarade klasser av enzym katalyserar bildandet (p) ppGpp15,17 Rel/Spo homolog (RSH) enzymer är 'lång' bifunktionell (p) ppGpp kväveoxidsyntas/Hydrolaser uppkallad efter deras likhet till förbindelser och plats (p) ppGpp metabola enzymer från Escherichia coli som innehåller kväveoxidsyntas, hydrolas och reglerande domäner, medan små alarmone kväveoxidsyntas (SAS) enzymer är kort monofunktionella synthetases hittade exklusivt i Gram positiva bakterier15, 17 , 18. sporbildande grampositiva bakterien Clostridium difficile kodar förmodad RSH och SAS gener19. Här presenterar vi inledande aktivitet-analyser som bekräftar att enzymet C. difficile RSH är en katalytiskt aktiv ppGpp kväveoxidsyntas (p).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. inducerbara överuttryck av en histidin-taggade Protein

  1. Förstärka rsh från C. difficile R20291 genomiskt DNA.
    1. Använd en HiFi-polymeras och följ tillverkarens anvisningar.
    2. Förstärka C. difficile rsh använder grundfärger
      rsh_F (CAGGTACCGGTTATATGCATGATAAAGAATTACAAG) och
      rsh_R (CCCTGCAGCTAATGGTGATGGTGATGGTGATTTGTCATTCTATAAATAC), som introducerar en C-terminal hexahistidine tagg.
      Obs: De KpnI och PstI skär platser i primer sekvenser är fetstil.
    3. Smälta pMMBneo vektorn och rsh-his6 PCR-produkten med Pstl och KpnI begränsning skär platser vid 37 ° C i 45 min.
    4. Rena linearized vektorn och PCR-fragmenten via agaros gel-elektrofores och efterföljande rening med en DNA gel extraction kit.
    5. Mät 280 nm absorbans (en280) vektorn och amplifierade PCR-produkten. Använd ekvationen Equation 1 att bestämma DNA koncentrationen av varje DNA-fragment.
  2. Ligera rsh i pMMBneo för uttryck.
    1. Kombinera 25 ng av smält PMMBneo vektor, 125 ng av rsh-his6 genprodukten, 2 μL 10 x ligase buffert och 1 μL av DNA-ligase. Använd nuclease gratis vattnet för att justera den totala volymen till 20 μL. Inkubera vid 16 ° C för 16 h.
      Obs: Effekten av ligering beror på fragment storlek och måste justeras baserat på tillverkaren protokoll.
    2. Omvandla ligated vector produkten till E. coli DH5-α eller en annan recA - plasmiden underhåll stam. Välj för transformerade celler på LB plattor med 100 μg/mL kanamycin och inkubera i 16 – 24 timmar vid 37 ° C.
    3. Plocka fyra kolonier från omvandling plattan (s) och streak varje på en färsk platta innehållande 100 μg/mL kanamycin för DNA isolering. Inkubera nya plattorna vid 37 ° C för 16 – 24 h och välj ett isolat för den efterföljande proteinuttryck.
    4. För att bekräfta den framgångsrika ligering av proteinet intakt rsh kodande regionen, plocka en koloni av valt isolera in 20 μL av vatten, värm vid 95 ° C i 10 min, och använda som mall för en bekräftande PCR använder samma primer används för att förstärka genen.
  3. Omvandla verifierade plasmiden enligt standard omvandling protokoll för E. coli bakterieplasmid omvandling till E. coli BL21 system för hög kapacitet proteinproduktion.
  4. Express RSH-His6 i E. coli.
    1. Välj en enda koloni av E. coli BL21 omvandlas med pMMBneo::rsh och Inokulera 2 mL LB medium med 50 μg/mL kanamycin. Inkubera vid 37 ° C 12 – 16 h under omskakning vid 250 rpm.
    2. Inokulera 500 mL LB medium innehållande 50 μg/mL kanamycin med 0,5 mL av celltillväxt och proteinuttryck övernattning kulturen.
    3. Inkubera kulturens uttryck vid 37 ° C och 250 rpm i en inkubator shaker tills cell densiteten når en OD600 0,167 vid 37 ° C.
    4. Minska inkubator temperaturen till 30 ° C och vänta 30 min för kultur temperaturen sjunka.
    5. Framkalla RSH uttryck genom att lägga till isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) till en slutlig koncentration av 0,5 mM. Att induktion att äga rum över natten (för 16 – 18 h) vid 30 ° C, skaka vid 250 rpm.
    6. Pellet genom centrifugering vid 3 080 x g under 30 minuter vid 4 ° C.
      Obs: Pelleten kan lagras över natten vid-20 ° C för rening målproteinet följande dag utan märkbar förlust av protein avkastningen eller enzymaktivitet.

2. protein rening av Nickel affinitetskromatografi

Obs: Fortsätt direkt med protein rening stegen nedan efter att klargöra cellen lysate. Lagra klargöras lysate vid 4 ° C över natten för efterföljande protein rening minskar protein avkastningen.

  1. Rena protein med 1 mL av Nickel-Nitriloacetic syra (Ni-NTA) harts på en gravitation kolumn.
    1. Dagen före användning, låt jämvikta kolonnen över natten med 4 ° C med 2 mL Jämviktstiden buffert (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 0,5 mg/mL lysozym, 5 mM MgCl2, 10 mM Imidazol, 0,25 mM DTT, 5 mM phenylmethane sulfonyl fluor (PMSF), 10% glycerol).
    2. Följande dag ta med kolumnen från 4 ° C till RT före lastningen den klargj橬一j lysate och låt den stå för ~ 2-3 h.
      Obs: Att föra kolumnen till termisk jämvikt är avgörande för att undvika luftbubblor bildas inom kolumnen.
    3. Återsuspendera pelleten erhölls i steg 1.3.6 i lyseringsbuffert (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 10% glycerol, 0,5 mg/mL lysozym, 10 mM Imidazol, 0,25 mM DTT och 5 mM PMSF).
    4. Sonikera celler på is för 8 x 10 s intervall, pausa 30 s mellan pulser.
    5. Klargöra den lysate genom centrifugering vid 3 080 x g i 30 minuter vid 4 ° C med en mikrocentrifug.
    6. Applicera sedan förbereda lysate med lika volymdelar lyseringsbuffert den preppad förtydligas lysate till kolumnen och samla genomflöde.
    7. Återapplicera skirat lysate genomflöde till kolumnen och samla den sekundära genomflöde.
    8. Tvätta kolonnen med tvättbuffert 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4, 30 mM Imidazol, 10% glycerol). Samla genomflöde.
      Obs: Införande av 5 mM MgCl2 i wash och eluering buffertar är viktigt för enzymatisk aktivitet av renat protein.
    9. Tvätta kolonnen med tvättbuffert 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 50 mM NaH2PO4 och 50 mM Imidazol). Samla genomflöde.
    10. Applicera 2 mL eluering buffert (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 50 mM NaH2PO4, 10% glycerol och 75 mM Imidazol). Samla genomflöde i två fraktioner av 1 mL vardera.
      Obs: Kolumnen efter detta steg kan lagras i Jämviktstiden buffert vid 4 ° C om samma protein kommer att renas i nästa rening-analysen. Kolumnen kan användas upp till 3 gånger om lagras korrekt.
  2. Bedöma kolumn fraktioner för renhet av SDS-PAGE.
    1. Att kvalitativt bedöma protein rening, köra 20 μL alikvoter av alla kolumn fraktioner på en 4% / 10% polyakrylamid gel för 60 min på 170 V.
    2. Fläcken gelen med 0,1% Coomassie blå i rumstemperatur i 5 h, gunga försiktigt på en bänkmonterade rocker.
    3. Avfärga gelen i 40% metanol, 10% ättiksyra över natten i rumstemperatur, gungande på en bänkmonterade rocker.
      Obs: En representativ gel avbildas i figur 1.
  3. Dialyze eluera bråkdel 2 övernattning på 4 ° C.
    1. Dialyze mot dialys buffert (15,7 mM Tris-HCl (pH 7,6), 471.9 mM NaCl, 15.69 mM MgCl2, 1,57 mM DTT, 1,5 mM PMSF och 15,7% glycerol) i förhållandet 200: 1 med en 1 mL dialys enhet med en 20 kDa molekylvikt cut-off (MWCO).
    2. Bestämma koncentrationen av dialyseras protein prov genom att mäta absorbansen vid 280 nm och med beräknade molar absorption koefficient 82085 M-1cm-1 20.
    3. Lagra 5 μL alikvoter av dialyseras protein provet i alikvoter vid-80 ° C fram till användning.

3. protein aktivitet Assay genom tunnskiktskromatografi

  1. Förbereda tunt lager kromatografi plattan.
    1. Innan du utför reaktionen, förbereda polyethyleneimine (PEI)-cellulosa plattor genom tvättning i avjoniserat vatten. Lägg plattorna i en glas kammare med dubbel destillerat vatten på ~0.5 cm djup.
    2. Tillåt vatten att migrera till toppen av plattan.
      Obs: Tvätta plattorna inte är absolut nödvändigt, som plattorna kan användas utan den, men tvätt ökar tydligheten i resulterande bilder. Tvätta plattorna i två vinkelräta riktningar ytterligare säkerställer att eventuella föroreningar i kådan är isolerade i ena hörnet av plattan (figur 2).
    3. Föra plattorna ur glas kammaren och låt verka en bänkmonterade rack att torka över natten (12 – 18 h).
    4. Markera torr plattorna 2,0 cm från ena kanten med en mjuk penna att indikera där proven kommer att tillämpas för TLC. För 2 μL prover, gälla prover inte mindre än 1,0 cm mellanrum (figur 2).
      Obs: Detta tillåter tydlig åtskillnad mellan angränsande plats, vilket är avgörande för signal kvantifiering. Så länge cellulosa kådan inte är repad, små stör blyertsmarkeringarna på ytan inte lösningsmedel migration.
    5. När du planerar experiment, alltid lämna en plats på varje platta oanvända.
      Obs: Detta ger en tom lane för provet kvantifiering (figur 2). En 20 cm TLC-plattan kommer att ha plats för 19 ställen.
  2. Enzym aktivitet assay
    1. Förbereda en 5 x buffert blandning innehållande 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM ammoniumacetat, 10 mM KCl, 1 mM DTT och 0.6 mM ATP.
      Obs: Denna blandning kan förberedas i stora mängder och fryst i 10 μL alikvoter för senare användning. Utsätt inte blanda flera frysning-tining cykler.
    2. Förbereda enskilda reaktioner som innehåller 3 μM RSH, 1 x buffert mix, 0.6 mM BNP, 1,2 mM MgCl2. Lägg till 1,0 μCi av γ -32P-ATP per 10 μL av reaktion och använda nuclease fritt vatten för att få reaktionen till en önskad volym. Lägga till RSH efter andra komponenter har varit blandade, som tillägg av RSH till nukleotid-innehållande mixen initierar den enzymatiska aktivitet assay.
      Obs: Sista reaktionsvolym beror på antalet tidpunkter provtas. För att prova 2 μL/tidpunkt, montera 10 μL av reaktionsblandningen för varje 4 tidpunkter.
    3. För att styra för ATP hydrolys från kontaminerande nuclease aktivitet, montera en 10 μL reaktion som innehåller ingen protein och inkubera det parallellt. Plats 2 μl prov vid t = 0 och i slutet av experimentet att säkerställa att ATP inte var hydrolyseras i avsaknad av protein.
    4. Omedelbart efter tillägg av RSH, ta bort 2 μL och upptäcka det på märkt PEI-cellulosa plattan som t = 0 min provet.
    5. Inkubera reaktionen vid 37 ° C, ta bort 2 μL alikvoter vid önskade tidpunkter.
      Obs: Enzymatisk aktivitet upphör när provet är adsorberas på cellulosa plattan. Vänta 10 – 30 min efter sista plats läggs till plattan innan utveckling för att säkerställa fullständig adsorption och prov torkning.
  3. Tunnskiktskromatografi
    1. Fyll kromatografi kammaren med 1,5 M 1,5 M KH2PO4 (pH 3,64) till ett djup av 0,5 cm.
      Obs: Volymen behövs beror på måtten på kromatografivannan. Alla glasbehållare med en nivå botten som är tillräckligt bred för att tillåta införande av TLC plattan utan att böja kan användas som en utvecklande tank med tillägg av en cover. På TLC-plattan kan skäras i smalare remsor med en ren razorblade att möjliggöra utveckling i en glasbägare omfattas i plastfilm.
    2. Fördjupa den nedre kanten av plattan i lösningsmedel. Låt lösningsmedelsfronten vandra till toppen av plattan (~ 90 min).
      Obs: Medan lösningsmedel migration kommer att stoppa överst på plattan och prover inte förlorat eller köra tillsammans under en längre nedsänkning, plattor bör inte lämnas i lösningsmedel över natten. Immersions längre än 4 h kan orsaka harts att lossna från plattan bakningen och resultera i förlust av signal.
    3. Avlägsna plattan från kromatografivannan och placera den på en bänkmonterade Torkställ.
    4. Låt plattan till luft torka över natten.
      Obs: Torkning kan påskyndas med hjälp av en hårtork. Torrhet kan bedömas av färgen på harts, som kommer att mörkna när det är vått och återgång till färgen på en oanvänd plattan när det är helt torrt.
    5. När plattan är torr, Linda plattan i plastfilm att undvika överföring av radioaktivt material i imaging kassetten och analysera genom autoradiografi (figur 3).
  4. Analys av data
    1. Exponera PEI-cellulosa plattan som innehåller separerade reaktioner på en phosphorimager kassett för 4 h i rumstemperatur.
      Obs: Detta är tillräcklig exponering ge en mycket tydlig bild med angivna koncentrationerna av färska γ -32P-ATP. Om du använder lägre mängder av radioaktivt märkt substrat kan exponeringstiden ökas till 12-16 h.
    2. Bild kassett på en phosphorimager.
    3. Med programvara för bildåtergivning med ett grafiskt användargränssnitt, rita regioner av intresse (ROIs) genom att välja Rita rektangel och använda musen för att rita rektangulära ROIs omkring en hela lane och ATP och ppGpp ställen som finns inom det lane (figur 3 ).
    4. Använd kommandona Markera, kopiera, och klistra in (eller motsvarande kommandon baserat på avbildningsprogrammet används) Rita identiska ROIs inom de andra köer för att säkerställa att ROIs mäter signalen inom identiska områden i varje körfält. Inkludera ROIs från en oanvänd lane, att användas som tomma.
    5. Använda analysera | Verktyg | ROI Manager | Lägg till kommandon av avbildningsprogrammet, markera alla de ROIs dras på PEI cellulosa plattan.
    6. Använda analysera | Ange mått | Åtgärd kommandon, kvantifiera signal intensiteten inom varje ROI och exportera mätningarna som ett kalkylblad (figur 3). Subtrahera tomma ROI värden från experimentell signaler.
    7. Beräkna vilken procentandel av den utelämnade signalen inom varje lane är hänförlig till ATP och ppGpp använda formlerEquation
      Obs: ROIs kan dras och quantitated med kommersiell programvara som är kompatibel med phosphorimager eller fritt tillgänglig ImageJ programvara (National Institutes of Health).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi presenterar en metod för affinitet rening av en (p) ppGpp kväveoxidsyntas från Clostridium difficile och bedömningen av dess enzymatiska aktivitet. Figur 1 visar protein rening uppnås genom metall affinitetskromatografi. Den andra eluering (E2) fraktionen från denna rening var dialyseras och används för enzymatisk aktivitet haltbestämning. Figur 2 Detaljer nödvändiga åtgärder för att förbereda och genomföra pyrophosphotransferase analyser av tunnskiktskromatografi. Figur 3 illustrerar hur data från dessa experiment är quantitated med betoning på lämpliga blanking och omvandling av signalintensitet till procentsatser. I figur 4Apresenterar vi en representativ TLC autoradiograph en (p) ppGpp kväveoxidsyntas analys med hjälp av renat RSH, en C. difficile (p) ppGpp kväveoxidsyntas. Första plats plats, ppGpp och ATP fläckar syns tydligt på autoradiograph, som är lösningsmedel framsidan som syns eftersom det innehåller spårmängder av radiomärkt oorganiskt fosfat. Molekyler med mer fosforsyra beståndsdelarna uppvisar mindre rörlighet från första plats plats, eftersom de har större molekylvikt och mer negativ jonisk laddning; Detta hindrar deras rörlighet på den grundläggande PEI-cellulosan. Under 120 minuter vid 37 ° C, ppGpp ackumulering och ATP utarmning är försumbar i reaktioner saknar enzymet kväveoxidsyntas, medan både ATP utarmning och ppGpp ackumulering är uppenbart i närvaro av RSH figur 4A). Figur 4B visar de absoluta ATP och ppGpp signalerna från fyra experiment. Figur 4 c visar samma data som figur 4B med absoluta signalerna omvandlas till procentsatser av den totala radioaktiva signalen. Detta minimerar felaktigheter på grund av pipettering fel eller radioaktivt sönderfall och gör data från experiment som utförs på olika dagar till poolas utan att införa osäkerhet till data.

Figure 1
Figur 1: Nickel affinitet rening av RSH. En Coomassie-färgade SDS-PAGE gel visar lysate (L) och centrifugeras lysate (CL) av inducerad BL21 pMMB::rsh-his6 samt genomströmmande (FT), tvätta 1 (W1), tvätta 2 och eluering (E1 och E2) fraktioner efter nickel affinitet rening. E2 bråket var dialyseras och används för efterföljande enzymatisk analyser. Molekylvikter av protein storlek standarder visas till höger. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: beredning av TLC plattor. (A) Plattorna tvättas i en dimension genom att placera underkanten i vatten (blå). Föroreningar (gul) migrera till toppen av plattan med lösningsmedel. (B) efter en tallrik är torkat helt, det tvättas i en andra dimension genom att vrida den 90 ° i förhållande till den första tvätten och igen låta vatten att migrera till toppen av plattan. (C) efter tvätt, alla föroreningar är isolerade i ena hörnet av plattan. Kådan av en tvättad TLC-plattan kan märkas försiktigt med en mjuk blyertspenna att indikera där prover bör upptäckas. För 2 μL prover, kommer att minst 1 cm mellan ställen säkerställa lämpligt stickprov separation. Prover är spotted 2 cm från 'botten' av plattan. Efter exempelprogrammet får lösningsmedel köras till den 'toppen,' där eventuella föroreningar kommer har isolerats av de vatten tvättarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Signal kvantifiering. Regioner av intresse (ROIs) definierar totalen, visas ATP och ppGpp signal för en tom lane och en experimentell lane. Signalintensitet inom varje tomt ROI subtraheras från värdet experimental och ATP och ppGpp signalerna är normaliserad till totala signalen med hjälp av ekvationer som visat att presentera procentandelen av den totala radioaktiva signalen hänförligt till ATP och ppGpp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4. Autoradiograph av en representativ TLC-plattan: (A) den här bilden visar lösningsmedel framsidan, ATP, ppGpp och första plats platser av en reaktion som utförs med hjälp av renat C. difficile RSH. En kontroll reaktion som innehåller ingen protein (n.p.) tillåter kvantifiering av okatalyserad ATP hydrolys medan en tom lane tillåter korrekt signal kvantifiering. (B) absolut signal intensiteter av ATP och ppGpp under 120 minuter inkubation med C. difficile RSH. Som visas är de medelvärden och standardavvikelser av fyra oberoende experiment. (C), (B) samma data med ppGpp signalen presenteras som en procentandel av den totala radioaktiva signalen. ppGpp ackumulering i den ingen protein (n.p.) kontrollreaktionen visas i svart. Som visas är de medelvärden och standardavvikelser av två oberoende experiment med två tekniska replikat varje. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här rapporterar vi rening av hans-taggade RSH från C. difficile och presenterar en metod för aktivitet kvantifiering med radiomärkt tunnskiktskromatografi. Denna metod har tidigare använts för att bedöma aktivitet diguanylate cyclase enzymer från C. difficile, samt (p) ppGpp kväveoxidsyntas, nukleotid cyclase, Kinas och fosfodiesteras enzymer från andra organismer11,12 ,13,21. Metoden är inte ny, det är allmänt tillämplig på många typer av analysen, och vi hoppas forskare hittar sin presentation i videoformat till hjälp.

De viktigaste stegen inom protokollet är protein rening (steg 2.1.3–2.1.10), reaktion förberedelse för tunnskiktskromatografi (steg 2.2 – 2.3) och dataanalys (steg 3,4). Vi har hittat följande ändringar vara särskilt användbart: tillägg av MgCl2 till buffertar används för nickel kolumn rening (steg 2.1.3–2.1.10) är avgörande för den enzymatiska aktiviteten av renat protein och presentationen av den enzymet aktivitetsdata som % ppGpp produceras snarare än absoluta ppGpp produceras säkerställer att data som samlas på olika dagar, med olika γ-32P-ATP är konsekvent. Metoden är tillgänglig till någon forskargrupp med tillgång till en phosphorimager och dataanalys är okomplicerat. Av quantitating phosphotransfer aktivitet som en procentandel av 32P konverterat till ppGpp kan vi säkerställa data reproducerbarhet. Eftersom mycket liten reaktion volymer är fläckig på PEI-cellulosa plattorna, finns det betydande potential för mindre pipettering felaktigheter att införa betydande fel i den absoluta mängden γ -32P-ATP eller 32P-ppGpp i en given lane på TLC plattan, men fördelningen av radioaktivt signalen mellan de möjliga formerna är oberoende av den totala signalen är närvarande. Dessutom kan den totala radioaktiva signalen i ett visst körfält bero på åldern av γ -32P-ATP används i experimentet. 32 P har en halveringstid på 14,3 dagar, så oberoende analyser utförs flera dagars mellanrum kan visa betydande skillnader i de totala radioaktiva signal upptäckt men de relativa mängderna radioaktivt märkt ATP och ppGpp beror endast på enzymaktivitet. Presentera data som 'procent ppGpp' snarare än absoluta ppGpp förhindrar signal införandet av slumpmässigt brus från pipettering fel eller radioaktivt sönderfall. Detta illustreras av skillnaderna mellan figur 4B och 4 C. Både Visa medel och standardavvikelser av data från samma fyra experimenten, men data i figur 4 c har varit normaliserad till den totala radioaktiva signalen.

Vi har fastställt att enzymet C. difficile RSH en funktionell ppGpp kväveoxidsyntas i vitro, klarar av snabba pyrophosphotransfer från en ATP-phosphodonor och en BNP-acceptor. Denna reaktion är beroende av magnesium, som samordnar ATP och guanosinmonofosfat bindning av RSH familj enzymer22. Vi har ändrat tillverkaren protokollen för nickel affinitetskromatografi inkludera 5 mM MgCl2 i Lys och tvätta buffertar samt elueringen buffert eftersom vi har funnit att rening i avsaknad av magnesium är skadligt för den enzymaktivitet av renat protein. Detta tyder på att magnesium joner kan spela en icke-katalytisk roll för att stabilisera proteinstruktur i avsaknad av nukleotid bindande, men ytterligare strukturella karakterisering kommer att behöva bekräfta detta.

Till vår kunskap, detta arbete är den första publicerade rapporten av ppGpp syntes i C. difficile och anger att denna organism är sannolikt att utnyttja en (p) ppGpp-medierad stränga reaktion för att överleva extracellulära stress. (p) ppGpp metabolism har aldrig tidigare rapporterats i denna viktiga mänskliga patogener. Eftersom den stränga svaren är inblandad i persistens i många andra patogener, är det sannolikt att (p) ppGpp-medierad signalering kan spela en roll i hög stress toleransen av C. difficile celler och hög Återfallsfrekvensen av C. difficile infektion23,24,25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande ekonomiska intressen eller andra intressekonflikter.

Acknowledgments

Detta arbete finansierades av NIAID 1K22AI118929-01. EBP stöddes av en sommar Fellowship Program forskningsanslag från Office av forskningen vid Old Dominion University, Norfolk, Virginia, USA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Inducible overexpression of a histidine-tagged protein
Phusion polymerase New England Biolabs (NEB) M0530L
QIAEX II DNA Gel Extraction Kit Qiagen 20021
KpnI restriction enzyme NEB R0142S
PstI restriction enzyme NEB R0140S
T4 DNA ligase NEB M0202
NEB® 5-alpha Competent E. coli (High Efficiency) NEB C2987I
BL21 (DE3) Competent E. coli NEB C2527I
IPTG Sigma-Aldrich 10724815001
JXN-26 centrifuge with JLA 10.500 rotor Beckman Coulter Avanti -
Microcentrifuge with D3024/D3024R rotor Scilogex -
MaxQ SHKE6000 Incubator Thermo Scientific -
Ultrasonic processor Sonics VC-750
Protein purification by nickel affinity chromatography
Ni-NTA resin G Biosciences 786-940/941
Pierce Disposable Gravity columns, 10 mL Thermo Scientific 29924
1 mL Spectra/ Por float-A-lyzer G2 dialysis device (MWCO: 20-kD) Spectrum G235033
Mini-Protean Electrophoresis Cell BioRad 1658004
Protein activity assay by thin layer chromatography
Thin layer chromatograph (TLC) development tank General Glass Blowing Company 80-3
Polyethylenimine (PEI)-cellulose plates (20 cm x 20 cm, 100 μm thickness) with polyester support Sigma-Aldrich Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml lead, 100 μCi Perkin Elmer NEG002A
Adenosine 5’-triphosphate (ATP) 100 mM Bio Basic Canada AB0311
Guanosine-5’-diphosphate disodium salt (GDP) Alfa Aesar AAJ61646MC/E
Storage phosphor screen GE Healthcare Life Sciences BAS-IP TR 2040 E Tritium Screen
Storm 860 phosphorimager GE Healthcare Life Sciences -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cheek, S., Ginalski, K., Zhang, H., Grishin, N. V. A comprehensive update of the sequence and structure classification of kinases. BMC Structural Biology. 5 (1), 6 (2005).
  2. Porath, J. Immobilized metal ion affinity chromatography. Protein Expression and Purification. 3 (4), 263-281 (1992).
  3. Arnau, J., Lauritzen, C., Pedersen, J. Cloning strategy, production and purification of proteins with exopeptidase-cleavable His-tags. Nature Protocols. 1 (5), 2326-2333 (2006).
  4. Porath, J., Carlsson, J., Olsson, I., Belfrage, G. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258 (5536), 598-599 (1975).
  5. Smith, M. C., Furman, T. C., Ingolia, T. D., Pidgeon, C. Chelating peptide-immobilized metal ion affinity chromatography. A new concept in affinity chromatography for recombinant proteins. Journal of Biological Chemistry. 263 (15), 7211-7215 (1988).
  6. Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nature Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  7. Booth, W. T., et al. Impact of an N-terminal Polyhistidine Tag on Protein Thermal Stability. ACS Omega. 3 (1), 760-768 (2018).
  8. Thielges, M. C., Chung, J. K., Axup, J. Y., Fayer, M. D. Influence of histidine tag attachment on picosecond protein dynamics. Biochemistry. 50 (25), 5799-5805 (2011).
  9. Chaga, G. S. Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography: past, present and future. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 49 (1-3), 313-334 (2001).
  10. Ma, H., Deacon, S., Horiuchi, K. The challenge of selecting protein kinase assays for lead discovery optimization. Expert opinion on drug discovery. 3 (6), 607-621 (2008).
  11. Tamayo, R., Tischler, A. D., Camilli, A. The EAL domain protein VieA is a cyclic diguanylate phosphodiesterase. Journal of Biological Chemistry. 280 (39), 33324-33330 (2005).
  12. Purcell, E. B., McKee, R. W., McBride, S. M., Waters, C. M., Tamayo, R. Cyclic Diguanylate Inversely Regulates Motility and Aggregation in Clostridium difficile. Journal of Bacteriology. 194 (13), 3307-3316 (2012).
  13. Purcell, E. B., Tamayo, R. Identification and characterization of cyclic nucleotide phosphodiesterases. Methods in Molecular Biology. 1016, 235-243 (2013).
  14. Ross, P., et al. Control of cellulose synthesis Acetobacter xylinum. A unique guanyl oligonucleotide is the immediate activator of the cellulose synthase. Carbohydrate Research. 149 (1), 101-117 (1986).
  15. Potrykus, K., Cashel, M. (p)ppGpp: still magical? Annual Review of Microbiology. 62, 35-51 (2008).
  16. Boutte, C. C., Crosson, S. Bacterial lifestyle shapes stringent response activation. Trends in Microbiology. 21 (4), 174-180 (2013).
  17. Nanamiya, H., et al. Identification and functional analysis of novel (p)ppGpp synthetase genes in Bacillus subtilis. Molecular Microbiology. 67 (2), 291-304 (2008).
  18. Gaca, A. O., et al. Basal Levels of (p)ppGpp in Enterococcus faecalis: the Magic beyond the Stringent Response. mBio. 4 (5), (2013).
  19. Sebaihia, M., et al. The multidrug-resistant human pathogen Clostridium difficile has a highly mobile, mosaic genome. Nature Genetics. 38 (7), 779-786 (2006).
  20. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic Acids Research. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  21. Purcell, E. B., et al. A nutrient-regulated cyclic diguanylate phosphodiesterase controls Clostridium difficile biofilm and toxin production during stationary phase. Infection and Immunity. , (2017).
  22. Mechold, U., Murphy, H., Brown, L., Cashel, M. Intramolecular Regulation of the Opposing (p)ppGpp Catalytic Activities of RelSeq, the Rel/Spo Enzyme from Streptococcus equisimilis. Journal of Bacteriology. 184 (11), 2878-2888 (2002).
  23. Dalebroux, Z. D., Svensson, S. L., Gaynor, E. C., Swanson, M. S. ppGpp Conjures Bacterial Virulence. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 74 (2), 171-199 (2010).
  24. Bartlett, J. G. Clostridium difficile: progress and challenges. Annals of the New York Academy of Sciences. 1213, 62-69 (2010).
  25. US Department of Health and Human Services. , Centers for Disease Control and Prevention, US Department of Health and Human Services. Atlanta, GA. (2013).

Tags

Immunologi och infektion utfärda 141 Protein rening histidin tagga (p) ppGpp tunnskiktskromatografi radionuklid märkning pyrophosphokinase phosphotransfer
En rening och <em>In Vitro</em> aktivitet Assay för en (p) ppGpp kväveoxidsyntas från <em>Clostridium difficile</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. … More

Pokhrel, A., Poudel, A., Purcell, E. B. A Purification and In Vitro Activity Assay for a (p)ppGpp Synthetase from Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (141), e58547, doi:10.3791/58547 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter