Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

पूर्व Vivo Corneal अंग संस्कृति मॉडल के लिए घाव भरने की पढ़ाई

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

एक पूर्व vivo corneal अंग संस्कृति मॉडल के लिए एक प्रोटोकॉल घाव भरने के अध्ययन के लिए उपयोगी बताया गया है । इस मॉडल प्रणाली एक संगठित 3 डी कोशिकीय वातावरण में अपक्षयी चिकित्सा या दवा विषाक्तता को बढ़ावा देने के लिए एजेंटों के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

कॉर्निया एक मॉडल प्रणाली के रूप में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है घाव भरने का अध्ययन । उत्पंन करने के लिए और दो आयामी (2d) और तीन आयामी (3 डी) संस्कृति में प्राथमिक स्तनधारी कोशिकाओं का उपयोग करने की क्षमता न केवल corneal जीव विज्ञान के बारे में, लेकिन यह भी घाव भरने, myofibroblast जीव विज्ञान के बारे में जानकारी का खजाना उत्पंन किया है, और सामांय में scarring . प्रोटोकॉल का लक्ष्य myofibroblast विकास को बढ़ाता है, जो scarring की विशेषता के लिए एक परख प्रणाली है । हम एक corneal अंग संस्कृति पूर्व वीवो मॉडल सुअर आंखों का उपयोग कर प्रदर्शित करता है । इस पूर्वकाल keratectomy घाव में, अभी भी दुनिया में कॉर्निया एक परिपत्र ब्लेड के साथ घायल हो जाता है एक trephine बुलाया । पूर्वकाल कॉर्निया के लगभग 1/3 के एक प्लग उपकला सहित हटा दिया जाता है, तहखाने झिल्ली, और स्ट्रोमा के पूर्वकाल हिस्सा. घायल होने के बाद, कॉर्निया दुनिया से काट रहे हैं, एक कोलेजन पर घुड़सवार/आधार, और दो सप्ताह के लिए प्रसंस्कृत के साथ पूरक-सीरम मुक्त मध्यम स्थिर विटामिन सी के साथ सेल प्रसार और extracellular मैट्रिक्स स्राव में वृद्धि करने के लिए निवासी fibroblasts । पूर्वकाल स्ट्रोमा में myofibroblasts के सक्रियण चंगा कॉर्निया में स्पष्ट है । इस मॉडल को घाव बंद परख, myofibroblasts और fibrotic मार्करों के विकास के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और विषविज्ञान अध्ययन के लिए । इसके अलावा, छोटे अणु अवरोधकों के प्रभाव के साथ ही जीन पछाड़ना के लिए लिपिड मध्यस्थता सिरना अभिकर्मक इस प्रणाली में परीक्षण किया जा सकता है ।

Introduction

चोट, आघात, या संक्रमण से उत्पंन कॉर्निया में scarring दुर्बल opacities और स्थाई दृष्टि हानि के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इस प्रकार, वहां एक महत्वपूर्ण रास्ते कि चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए लक्षित किया जा सकता है की पहचान की जरूरत है । वर्तमान उपचार के विकल्प सीमित है और मुख्य रूप से corneal प्रत्यारोपण, जो दुनिया भर में रोगियों के लिए सुलभ नहीं है के शामिल हैं । दोनों मानव (चित्रा 1) और पशु कॉर्निया 2d और 3 डी सेल संस्कृति अध्ययन1,2के लिए उपयोग किया जा सकता है । मानव शव कॉर्निया प्रत्यारोपण के लिए उपयुक्त नहीं नेत्र बैंकों या केंद्रीकृत ऊतक बैंकों (राष्ट्रीय रोग अनुसंधान इंटरचेंज (NDRI)) से प्राप्त किया जा सकता है, और पशु आंखें एक वधशाला से प्राप्त किया जा सकता है । प्राथमिक corneal उपकला कोशिकाओं, stromal fibroblasts, और अधिक हाल ही में, endothelial कोशिकाओं, अलग किया जा सकता है और घाव भरने के लिए इन ऊतकों से संस्कृति और विषविज्ञान अध्ययन3,4,5. अंधा नेत्र रोग के आणविक आधार को समझने के महत्व के अलावा, ऊतक की पहुँच और संस्कृति प्राथमिक कोशिकाओं के लिए क्षमता कॉर्निया अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल प्रणाली बना दिया है । कॉर्निया सामांय कॉर्निया के रूप में scarring पर एजेंटों के प्रभाव के परीक्षण के लिए आदर्श है पारदर्शी और घाव के कुछ प्रकार के opacities या fibrotic निशान बनाने के (6में समीक्षा की) । vivo corneal घाव हीलिंग मॉडल में कई भी बड़े पैमाने पर किया गया है scarring अध्ययन के लिए उपयोग1। कम उपयोग किया गया है पूर्व vivo corneal घाव हीलिंग 7 मॉडल,8 कि यहां विस्तार से वर्णन है । इस विधि के लक्ष्य को scarring एक 3d कोशिकीय corneal पूर्व vivo मॉडल प्रणाली में fibrotic निर्माताओं द्वारा विशेषता परिणामों को बढ़ाता है ।

Corneal उपकला घाव है कि उपकला तहखाने झिल्ली का उल्लंघन नहीं करता है सामान्य रूप से 24-72 ज9के भीतर बंद हो जाता है. जल्द ही घायल होने के बाद, उपकला के किनारे पर कोशिकाओं के प्रसार और उपकला मुक्त सतह में पलायन शुरू, उपकला बाधा समारोह को पुनर्स्थापित करने के लिए. यह गतिविधि क्रमिक रूप से corneal बेसल कोशिका प्रसार के सक्रियकरण के बाद पहले और, एक बाद की अवस्था में, बाहरी अंग क्षेत्र पर स्थित अग्रदूत कोशिकाओं के उपकला कोशिका द्रव्यमान10,11की वसूली प्राप्त करने के लिए. इन घावों अक्सर scarring बिना चंगा । हालांकि, एक घाव है कि स्ट्रोमा में तहखाने झिल्ली प्रवेश निशान गठन में अक्सर परिणाम1। corneal stromal घाव भरने के बाद, स्ट्रोमा अंतर निवासी stromal कोशिकाओं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अस्थि मज्जा-व्युत्पंन fibrocytes12,13,14सहित कई मूल की कोशिकाओं के साथ आबाद है । Fibrotic scarring एक चिकित्सा घाव में myofibroblasts के हठ की विशेषता है । इन रोग myofibroblasts फोकल आसंजन में integrins के संचय के माध्यम से वृद्धि हुई आसंजन का प्रदर्शन, सिकुड़ा α-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) तनाव फाइबर, और extracellular मैट्रिक्स (ECM) के स्थानीय सक्रियण-तनहा अव्यक्त-रूपांतरित वृद्धि कारक-बीटा (TGFβ) । उपकला-व्युत्पन्न कोशिकाओं के भेदभाव, उपकला mesenchymal संक्रमण (EMT) के रूप में जाना जाता है, भी निशान गठन6करने के लिए योगदान कर सकते हैं.

घाव भरने के बाद कोशिका विभेद और apoptosis के बीच एक नाजुक संतुलन होता है । क्योंकि तहखाने झिल्ली में उल्लंघन, प्लेटलेट के रूप में वृद्धि कारक वृद्धि कारक (PDGF) और आंसू से TGFβ और उपकला स्नान स्ट्रोमा, उत्प्रेरण myofibroblast भेदभाव, autocrine सक्रियण के एक निरंतर TGFβ पाश, और के रूप में असंगठित fibrotic ECM का स्राव१५,१६. चंगा घाव में myofibroblasts के हठ धुंध और कॉर्निया में scarring को बढ़ावा देता है (चित्रा 2) । हालांकि, regenerativeी चंगा घाव में हालांकि myofibroblasts का विकास, वे apoptose और इस तरह अनुपस्थित रहे है या काफी चंगा ऊतक में संख्या में कमी (संदर्भ 6 में समीक्षा की,10) । इस प्रकार, fibrotic scarring पर अनुसंधान के अणुओं है कि अत्यधिक myofibroblast विकास या myofibroblast हठ17,18को रोकने को लक्षित करने पर कम भाग में ध्यान केंद्रित किया है । क्योंकि myofibroblast हठ दोनों scarring और सभी ऊतकों में fibrotic रोग की विशेषता19, कॉर्निया एक मॉडल प्रणाली फाइब्रोसिस के जनरल सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए के रूप में उपयोगी हो सकता है ।

हमारे मॉडल प्रणाली में, कॉर्निया एक बेलनाकार एक trephine कहा जाता है जबकि अभी भी दुनिया में ब्लेड के साथ घायल हो गया है । मानव और सुअर कॉर्निया या तो एक 6 या 7 मिमी trephine के साथ घायल हो सकते हैं; खरगोश कॉर्निया के लिए एक 6 मिमी trephine पसंद है । सुअर कॉर्निया आकार में मानव कॉर्निया के समान है । क्योंकि वे लागत प्रभावी और आसानी से बड़ी संख्या में उपलब्ध हैं, सुअर कॉर्निया नियमित रूप से अंग संस्कृति के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इसके अलावा, एंटीबॉडी और मानव के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए बनाया siRNAs लगातार पार-7सुअर के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की है । घाव भरने के बाद, कॉर्निया दुनिया से बरकरार limbus के साथ कटौती कर रहे है और एक आगर पर घुड़सवार/ कॉर्निया सीरम में संस्कृति मुक्त मीडिया के अलावा विटामिन सी स्थिर fibroblast प्रसार और ECM20जमाव अनुकरण कर रहे हैं । न तो सीरम और न ही विकास कारकों के अलावा myofibroblast गठन7प्रेरित करने की जरूरत है । कॉर्निया नियमित रूप से तय कर रहे है और संस्कृति के दो सप्ताह के बाद प्रोटोकॉल के लिए कार्रवाई की । जीन पछाड़ना के लिए, या घाव भरने पर एक एजेंट के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, घाव7 या एक घुलनशील एजेंट को मीडिया के लिए जोड़ा जा सकता है, क्रमशः8घाव के बाद घाव में सिरना के साथ इलाज किया जा सकता है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. अंग संस्कृति

  1. तैयारी
    1. आगर समाधान निम्नानुसार तैयार करें. एक छोटी सी कुप्पी में, 1% आगर और 1 मिलीग्राम/एमएल गोजातीय कोलेजन DMEM में तैयार-20 मिलीलीटर तक F12 । एक गर्म थाली पर उबाल लाने के लिए । घोल को ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में डाल दें । एक गर्म थाली पर एक पानी स्नान में ट्यूब प्लेस जमना से समाधान रखने के लिए ।
    2. पूरक सीरम-मुक्त मीडिया (SSFM) सामग्री की तालिकामें प्रदान की गई रचना के अनुसार तैयार करें ।
      नोट: SSFM तैयार करने के लिए आवश्यक राशि कॉर्निया की संख्या पर निर्भर करता है संसाधित किया जाना है । आमतौर पर 30 मिलीलीटर 4 कॉर्निया के लिए पर्याप्त मीडिया है ।
  2. विच्छेदन
    नोट: एक विच्छेदन डाकू या एक रासायनिक डाकू में इस कदम का प्रदर्शन । आंखें अभी भी व्यक्तिगत बैग में संलग्न के लिए ग्लोब की रक्षा के ढक्कन के साथ भेज रहे हैं ।
    1. एक इथेनॉल साफ काट बोर्ड पर एक सीधे किनारे सर्जिकल ब्लेड के साथ पलकों से globes निकालें । आंख से अतिरिक्त फैटी ऊतक निकालें या तो एक ब्लेड या एक छोटे कैंची का उपयोग (3सी, बी) ।
    2. ढक्कन से दुनिया को हटाने के बाद, संदंश के साथ पीछे ग्लोब पकड़ो और तुरंत फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में आंख डुबकी । जल्दी से यह 10% आयोडीन में 3x डुबकी (एक १०० मिलीलीटर चोंच में) । जल्दी से पंजाब में 2x डुबकी (~ १०० मिलीलीटर एक चोंच में, परिवर्तन पंजाब अक्सर) ।
    3. एक साफ तौलिया या ऊतक का उपयोग करना, पर्याप्त दबाव के साथ आंख circumferentially लपेटो करने के लिए एक तना हुआ corneal सतह trephine के साथ काट दिया है ।
      नोट: ध्यान रखना तौलिया या कॉर्निया संपर्क से ऊतक को रोकने के लिए ।
  3. जख्मी
    1. एक 6 मिमी trephine का उपयोग करने के लिए कॉर्निया के केंद्र घाव । पूरे कॉर्निया के माध्यम से एक पूर्ण मोटाई घाव बनाने के बिना उपकला और पूर्वकाल स्ट्रोमा घुसना.
      नोट: यदि endothelium प्रवेश किया है, दबाव और रिसाव तरल पदार्थ का एक नुकसान देखा जाएगा । इस मामले में आंख छोड़ दी जानी चाहिए ।
    2. कॉर्निया के केंद्र में trephine प्लेस, यह १८० ° दक्षिणावर्त और काउंटर दक्षिणावर्त 5x (हर बार दिशा बदल जाता है यह एक समय के रूप में गिनती), जबकि घाव गहरा करने के लिए प्रकाश दबाव लागू करने के लिए घुमाएगी ।
      नोट: घाव अब काफी गहरा होना चाहिए करने के लिए एक ऊतक प्रालंब संदंश की एक जोड़ी का उपयोग कर उठाया जा करने की अनुमति । यदि यह मामला दोहराने चरण 1.3.2 नहीं है ।
    3. किनारों से प्रालंब उठा । एक ही समय में, या तो दूसरे हाथ से या एक दूसरे व्यक्ति के साथ, एक ब्लेड का उपयोग करें, दुनिया के समानांतर काटने के लिए दूर ऊतक काट के रूप में संदंश को घाव मार्जिन के भीतर बंद पूर्वकाल कॉर्निया लिफ्ट जारी है । इस कदम के समापन पर एक परिपत्र घाव कॉर्निया के केंद्र पर स्थित होना चाहिए ( चित्र3 सी, 3 डीदेखें) ।
  4. काटने और ग्लोब से कॉर्निया हटाने
    1. ऊतक के साथ आँख पकड़ना, एक छोटा सा चीरा 1 मिमी एक ब्लेड के साथ कॉर्निया के किनारे से दूर कर ताकि limbus अंग संस्कृति में शामिल है ।
    2. छोटे, तेज कैंची का उपयोग पूर्व चरण में बनाया चीरा तक पहुँचने के लिए दुनिया भर में कटौती, कॉर्निया भर में एक मिलीमीटर मार्जिन रखने के लिए limbus बरकरार.
    3. पंजाब के 1 मिलीलीटर, घाव ओर बढ़ते जब तक नीचे के साथ एक ६० mm डिश में कॉर्निया प्लेस ।
  5. बढ़ते
    1. सुनिश्चित करें कि आगर एक गर्म तापमान (लगभग 25 डिग्री सेल्सियस) के लिए आ गया है ।
    2. संदंश के दो जोड़े के साथ कॉर्निया के दो किनारों को पकड़ कर एक कप बनाने के साथ endothelial ओर । जब तक यह भरा हुआ है एक बाँझ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर कॉर्निया में गर्म अप आगार समाधान जोड़ें ।
    3. के बाद आगर सख्त (आमतौर पर के बारे में 30-45 s) को ध्यान से ६० mm प्लेट (चित्रा 3E) में आगर के साथ कॉर्निया फ्लिप । एक ढक्कन के साथ कवर ।
  6. ऊष्मायन
    1. थाली में 4 मिलीलीटर SSFM जोड़ें, 5% CO2 में ३७ ° c में एक एयर तरल इंटरफेस में अंग सीमा पर कॉर्निया बनाए रखने । 24 घंटे और उसके बाद हर दूसरे दिन के बाद मीडिया ताज़ा करें ।
      नोट: यदि घाव में एक अभिकर्मक प्रदर्शन, अभिकर्मक के बाद जब तक एंटीबायोटिक दवाओं छोड़ ।
    2. नमी बनाए रखने के लिए डिश में कंडीशन्ड मीडिया से SSFM की 1 बूंद जोड़कर corneal सतह को एक बार रोज गीला करें । इस के लिए, पकवान मशीन से बाहर ले, यह हुड के नीचे जगह है, पकवान ढक्कन हटाने, पकवान से मीडिया के साथ सतह गीला एक बाँझ पिपेट का उपयोग कर, फिर से कवर और यह मशीन पर वापस डाल दिया ।
    3. जीन पछाड़ना के लिए, जीन लक्ष्यीकरण या नियंत्रण सिरना है कि आपूर्तिकर्ता के निर्देशों के अनुसार एक लिपिड मध्यस्थता वाहक के लिए जटिल है के साथ घाव का इलाज (नीचे देखें) ।
    4. मिश्रण 5 µ एल (५० pmol) में सिरना के ५० µ l में कम सीरम न्यूनतम आवश्यक मीडिया (जैसे, Opti-मेम). कम सीरम मीडिया के ५० µ एल में अभिकर्मक रिएजेंट के 2 µ एल मिश्रण । इस 5 मिनट के लिए बैठते है और फिर उंहें मिश्रण करते हैं ।
    5. सिरना मिश्रण करने के लिए कम-सीरम न्यूनतम मीडिया के २०० µ l जोड़ें ।
    6. पिपेट घाव पर dropwise और 3 एच के लिए मशीन ।
    7. डिश में मीडिया के साथ corneal सरफेस से सिरना को बाहर धोएं । SSFM के लिए मशीन मीडिया बदलें + एंटीबायोटिक्स ( सामग्री की तालिकादेखें) । पहले उल्लेख के रूप में जारी रखें (कदम 1.6.1-1.6.2) ।

2. प्रोटोकॉल: आयल सेक्शन एण्ड Immunostaining

  1. ऊतक तैयार
    1. एक दो सप्ताह की मशीन के बाद, अगर मात्रात्मक वास्तविक समय पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया (qRT-पीसीआर) विश्लेषण के लिए ऊतक के कुछ का उपयोग कर, फिक्सिंग से पहले, घाव के माध्यम से आधे में कॉर्निया काट । इस आधा या केवल ¼ प्लेस (या तो पर्याप्त ऊतक है) शाही सेना में स्थिर करने की रक्षा के एजेंट ।
    2. एक मानक अलगाव किट का उपयोग करना, आरएनए को अलग और qRT-पीसीआर प्रदर्शन.
      नोट: वैकल्पिक रूप से, घायल भाग केवल अलग और जीन अभिव्यक्ति के लिए परीक्षण किया जा सकता है ।
    3. कॉर्निया के दूसरे आधे ऊतक विकृति कैसेट में प्लेस और निर्धारण (10% formalin) में 2-4 दिनों के लिए कमरे के तापमान (आरटी) में जलमग्न ।
    4. आयल मानक तकनीकों का उपयोग कर घायल कॉर्निया के इस आधे एंबेड ।
      नोट: यह सुनिश्चित करने के लिए कि ऊतक खोदी गई कॉर्निया के एक पार की धारा का उत्पादन करेगा घायल कॉर्निया ओरिएंट ।
  2. Immunostaining प्रयोग ३, ३ '-diaminobenzidine (ढाब)
    1. Day 1
      1. किसी पेंसिल के उपयोग से स्लाइड लेबल । De-paraffinize एजेंट समाशोधन के साथ एक जार में स्लाइड रखकर ऊतक (2 परिवर्तन, 10 मिनट प्रत्येक) ।
      2. कम सांद्रता में इथेनॉल में स्लाइड स्थानांतरित करके ऊतक rehydrat (१००%, १००%, ७०%, ५०%, डीएच2हे, डीएच20, प्रत्येक परिवर्तन के लिए 5 मिनट).
      3. antigen पुनर्प्राप्ति microwaving द्वारा साइट्रेट बफ़र के साथ एक प्लास्टिक जार में स्लाइड (10 mM, pH ६.४) 5 मिनट के लिए निष्पादित करें । पहला चक्र ५०% बिजली पर 5 मिनट । साइट्रेट बफर और दोहराने के साथ जार फिर से भरना । 10 मिनट के लिए शांत हो जाओ ।
      4. पंजाब, 2 मिनट प्रत्येक के साथ 3x धो लो । 1% ट्राइटन एक्स के साथ Permeabilize ऊतक-१०० पंजाब में 10 मिनट के लिए आरटी. ब्लॉक वर्गों में 3% सामांय बकरी सीरम (NGS) के साथ 1 एच में आरटी पर आर्द्र कक्ष में ।
      5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ मशीन ऊतक (1:100 या आपूर्तिकर्ता के रूप में पता चलता है) 3% NGS में रातोंरात 4 डिग्री सेल्सियस (३०० µ l प्रति स्लाइड).
    2. Day 2
      1. कुल्ला PBST (पंजाब प्लस 1% 20 के बीच), 2 मिनट प्रत्येक के साथ 3x स्लाइड । अंतर्जात peroxidase को ब्लॉक करने के लिए 10 मिनट के लिए 3% H2O2 में स्लाइड्स रखें । PBST, 2 मिनट प्रत्येक के साथ 3x धो लो । एचआरपी माध्यमिक एंटीबॉडी (1:250) में 3% NGS के साथ 1 एच पर आरटी (३०० µ l प्रति स्लाइड) के साथ मशीन ।
      2. धो स्लाइड 3x PBST, 2 मिन प्रत्येक । ढाब किट के साथ स्लाइड समझो । जोड़ें ३०० µ एल स्लाइड 3 min. डीएच2हे 2x (त्वरित डुबकी) के साथ स्लाइड को धो लें ।
      3. Counterstain के लिए Hematoxylin के साथ 20 एस. डीएच2ओ 2x (त्वरित डुबकी) के साथ स्लाइड धो लो । 20 एस के लिए bluing एजेंट के साथ दाग 20 के लिए डीएच2हे में कुल्ला (५०%, ७०%, १००%, १००%, सभी जल्दी डिप) इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने में स्लाइड रखकर ।
      4. 10-20 मिनट के लिए हुड के नीचे एक कागज तौलिया पर सूखी स्लाइड ।
      5. माउंट बढ़ते मीडिया के 1 ड्रॉप, coverslip के साथ कवर का उपयोग कर स्लाइड । RT पर लेबल और स्टोर करें.
      6. छवि एक खुर्दबीन और ImageJ7 के साथ ढाब संकेत मात्रा के तहत स्लाइड (4 अनुभाग देखें) ।
  3. Immunostaining: प्रतिदीप्ति
    1. 1 दिन पर कदम 2.2.1 में वर्णित चरणों का पालन करें । 2 दिनपर निंन चरणों का पालन करें ।
    2. कुल्ला 2 मिनट प्रत्येक के लिए PBST में 3x स्लाइड । fluorophore के साथ मशीन वर्गों-टैग माध्यमिक एंटीबॉडी 3% NGS (1:200) में 1 के लिए आरटी पर एच ।
    3. PBST, 2 मिनट प्रत्येक में 3x धो लो । माउंट 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) बढ़ते मीडिया और एक coverslip के साथ कवर की 1 ड्रॉप का उपयोग कर स्लाइड । प्रतिदीप्ति इमेजिंग तक 4 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए हुड के तहत कागज तौलिया पर सूखी ।
  4. छवि J का उपयोग ठहराव
    1. ImageJ, जो ढाब धुंधला ठहराव के लिए आवश्यक plugins शामिल है की "फिजी" संस्करण डाउनलोड करें ।
    2. फिजी में एक छवि खोलें और छवि → रंग → रंग Deconvolutionका चयन करें ।
    3. का चयन करें "H ढाब" के रूप में दाग और फिर क्लिक करें ठीक। तीन नई छवियां दिखाई देंगी । छवि है कि केवल ढाब धुंधला शामिल का चयन करें ।
    4. केवल stromal धुंधला हो जाना, ImageJ रबड़ समारोह का उपयोग करने के लिए ढाब छवि से उपकला हटाने ।
    5. विश्लेषण → माप (या Ctrl + M) का चयन करें और मान रिकॉर्ड ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunohistochemistry प्राथमिक के लिए पूर्व vivo घाव हीलिंग प्रयोग की सफलता का विश्लेषण परख का उपयोग किया है । चित्रा 4 उपकला और नियंत्रण ऊतक में पूर्वकाल स्ट्रोमा को दर्शाया गया है (चित्रा 4a, 4B). छह घंटे घाव भरने के बाद, उपकला अनुपस्थित था (चित्रा 4c, 4d). छह दिनों की उंमीद के रूप में घाव के बाद, उपकला (चित्रा 4E, 4F) फिर से हो गया था । यह ऊतक अल्फा-चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) के लिए immunostained था, जो की अभिव्यक्ति myofibroblasts की विशेषता है । वर्णमिति ढाब सब्सट्रेट द्वारा पता लगाया के रूप में स्ट्रोमा में α-SMA immunostaining में एक नाटकीय वृद्धि हुई है । वहां भी था उपकला जेट कि EMT संक्रमण7 सुझाव हो सकता है में वृद्धि (चर्चा देखें) । उपकला और स्ट्रोमा में संगठन स्पष्ट था । कम इज़ाफ़ा पर एक घायल प्रयोग और के बजाय ढाब immunostaining के साथ दिखाया गया है (चित्रा 4g, 4H) । घाव मार्जिन के रूप में अच्छी तरह से पूर्वकाल से पीछे स्ट्रोमा सक्रिय myofibroblasts के एक ढाल के रूप में दिखाई है ।

हालांकि fibrotic मार्कर एक सप्ताह (चित्रा 4) द्वारा व्यक्त कर रहे हैं, fibrotic मार्करों के सुसंगत और विश्वसनीय विकास प्राप्त करने के लिए, एक दो सप्ताह के समय बिंदु चुना गया था. चित्रा 5 में एक एक बार नियंत्रण या जीन-लक्ष्यीकरण सिरना के समय आवेदन का उपयोग कर परख के लिए परीक्षण किया जा करने के लिए अपक्षयी उपचार को बढ़ावा देने का प्रदर्शन है । इस मामले में, लक्ष्यीकरण सिरना USP10, एक deubiquitinase के लिए था । रोग myofibroblasts का प्रदर्शन किया αv-integrins के संचय के माध्यम से आसंजन में वृद्धि की फोकल आसंजन21। हमारे पिछले अध्ययनों से पता चला है कि αvβ1 और αvβ5 corneal stromal हीलिंग7में integrins fibrotic महत्वपूर्ण हैं । कोशिका के बाहर Integrins बाँध ECM और साथ में वे आंतरिक रूप से कर रहे हैं । आंतरिक integrin ubiquitinated है और lysosome या ubiquitin टैग में क्षरण के लिए भेजा एक deubiquitinase (डब) द्वारा हटा दिया जाता है और integrin सेल सतह के लिए पुनर्नवीनीकरण है । हमें पता चला कि डब के जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि (USP10) integrin उपइकाईयों β1 और β5 के αv/β1/β5, सेल सतह पर, बाद TGFβ सक्रियण और प्रेरण के साथ के एक परिणामी संचय के लिए अग्रणी से ubiquitin हटाने की दर में वृद्धि fibrotic marks7. corneal अंग संस्कृति में USP10 के पछाड़ना ने fibrotic मार्करों की शक्ल को रोका7. इन परिणामों का एक उदाहरण चित्रा 5में दिखाया गया है । ऊपर के रूप में, α-SMA myofibroblasts के लिए एक मार्कर के रूप में उपयोग किया जाता है । scarring का एक और संकेत है Fibronectin-ीडा (एफ एन-ीडा), एफ एन के एक ब्याह संस्करण है कि एक RGD, αv integrin बंधन डोमेन22,23,24शामिल हैं । यह भी सेलुलर एफ एन (सी एफ एन) का कार्यकाल है । यह एफ एन के बाद से एक प्रमुख fibrotic मार्कर के रूप में कार्य करता है-ीडा प्लाज्मा परिसंचारी में नहीं है, लेकिन बजाय केवल व्यक्त की है और fibrotic शर्तों25के तहत कोशिकाओं द्वारा स्रावित । α-SMA के लिए चित्रा 5-5C immunostaining में दिखाया गया है । जख्मी (आंकड़ा 5) की तुलना में, घायल प्लस नियंत्रण सिरना (चित्रा 5B) α-SMA प्रोटीन अभिव्यक्ति में एक नाटकीय वृद्धि हुई, जबकि USP10 सिरना के अलावा7 नाटकीय रूप से कम अभिव्यक्ति में स्ट्रोमा और उपकला. इसी तरह, जख्मी (चित्रा 5d) की तुलना में, जख्मी प्लस कंट्रोल सिरना (फिगर 5E) USP10 सिरना (फिगर 5F) के साथ इलाज की तुलना में fibronectin-ीडा प्रोटीन अभिव्यक्ति में नाटकीय वृद्धि का प्रदर्शन किया । लक्ष्य प्रोटीन के लिए Immunohistology (इस मामले में, USP10) सफल पछाड़ना7प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । इसके अलावा, प्रदर्शन qRT-पीसीआर ऊतक में जीन पछाड़ना या अंय fibrotic मार्करों के लिए भी परख7आश्वासन दे सकता है । ImageJ स्ट्रोमा केवल या कुल संकेत (आंकड़ा) में संकेत यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है । प्रत्येक शर्त का परीक्षण किया जा रहा है के लिए ंयूनतम 3 कॉर्निया immunostaining यों तो हम यहां दिखाया है और पहले7प्रकाशित के रूप में सांख्यिकीय महत्व उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए । अंय प्रोटीन है कि नियमित रूप से fibrotic मार्कर के लिए उपयोग किया गया है कोलेजन III अभिव्यक्ति और integrin अभिव्यक्ति1,26में वृद्धि कर रहे हैं ।

चित्रा 6में, पूर्व vivo कॉर्निया संस्कृति का उपयोग एक विषविज्ञान परख के रूप में प्रदर्शन किया है । इस प्रयोग में, कॉर्निया या तो जख्मी (चित्रा 6A), घायल (फिगर घमण्ड), या घायल और इलाज के साथ 10 µ एम Spautin-127है, जो सेल संस्कृति मीडिया में जोड़ा गया था समय की अवधि बढ़ाने के लिए बाहर धोने से पहले छोड़ दिया गया ( चित्रा 6C-6F) । Spautin-1 एक दवा है कि गैर विशेष रूप से27USP10 लक्ष्य है । USP10 सिरना के साथ हमारी सफलता की वजह से, Spautin उपचार scarring को रोकने में प्रभावशीलता के लिए परीक्षण किया गया था । सिरना के विपरीत, इस एकाग्रता में Spautin ऊतक के लिए विषाक्त था । संस्कृति में Spautin-1 के साथ समय में वृद्धि फिर से रोका epithelialization और गुणात्मक कोशिका मृत्यु, अव्यवस्थित मैट्रिक्स और stromal रिक्तिकाएं सुझाव है कि Spautin-1 उपचार परख पर चिकित्सा को बढ़ावा नहीं देता है के परिणामस्वरूप । मानक ऊतकवैज्ञानिक परख कोशिका प्रसार या apoptosis यों तो नियोजित किया जा सकता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : क्रॉस कॉर्निया के एक विस्तारित दृश्य के साथ एक मानव आंख की धारा । रहनुमाओं और मुर्गियों में, histologically पांच अलग परतों हैं: उपकला, बोमन की झिल्ली, स्ट्रोमा, सीमेंट की झिल्ली, और endothelium28,29. अन्य सभी स्तनधारियों में बोमन की झिल्ली histologically दिखाई नहीं दे रही है. संचरण इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म स्तर पर, एक तहखाने झिल्ली एक बोमन की झिल्ली के साथ उन सहित सभी कॉर्निया में corneal उपकला और स्ट्रोमा अलग मनाया जाता है । एक बरकरार है बोमन झिल्ली या तहखाने स्ट्रोमा से उपकला अलग झिल्ली सभी स्तनधारियों में scarring को रोकने के लिए एक आवश्यक है । AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm) से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित छवि । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : सेलुलर घटनाओं है कि corneal scarring के लिए नेतृत्व के आरेख । इस आरेख में घाव भरने के बाद पूर्वकाल कॉर्निया में प्रकट होने वाली बुनियादी घटनाओं को दर्शाया गया है । (क) उपकला, तहखाने झिल्ली, स्ट्रोमा, और quiescent कोशिकाओं स्ट्रोमा, यानी, keratocytes में एंबेडेड का चित्रण । (ख) लाल त्रिकोण एक घाव है, जो यांत्रिक, एक अल्सर, वायरस, या लगातार संक्रमण हो सकता है दर्शाया गया है । (ग) घाव के बाद, जिसमें बोमन की या तहखाने की झिल्ली का उल्लंघन होता है, घाव के आसपास की कोशिकाएँ apoptose हैं. (डी और ई) कोशिकाओं की एक बाढ़ निवासी keratocytes या अस्थि मज्जा से घाव फिर से आबाद-fibroblasts और सक्रिय fibroblasts में या myofibroblasts में सीधे संक्रमण व्युत्पंन । (च) ये अनुयाई रोग myofibroblasts fibrotic धुंध और निशान गठन को बढ़ावा देता है कि अव्यवस्थित corneal मैट्रिक्स के TGFβ सक्रियण और स्राव के एक autocrine पाश बनाएँ । एक regenerativeी चंगा घाव में, myofibroblasts दिखाई देते हैं, लेकिन चंगा ऊतक में apoptosed है6,29,30. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : अंग संस्कृति के लिए कॉर्निया प्राप्त करने और प्रसंस्करण । (क) शिपिंग के दौरान कॉर्निया की रक्षा के लिए सुअर की आंखें पलकों से प्राप्त होती हैं । (ख) ऊतक के बाद दुनिया की छवि को हटा दिया है । (ग) एक 6 मिमी trephine की छवि । (घ) एक trephine के साथ केंद्रीय कॉर्निया के घाव । (ङ) ग्लोब से हटाने के बाद घुड़सवारी कॉर्निया की छवि. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : घाव भरने के बाद Corneal ऊतक । जख्मी (नियंत्रण) या घायल कॉर्निया का Immunohistological विश्लेषण । सुअर कॉर्निया या तो जख्म (नियंत्रण) या घायल छोड़ दिया गया । ऊतक वर्गों myofibroblasts की पहचान करने के लिए अल्फा चिकनी मांसपेशी actin (α-SMA) के लिए एंटीबॉडी के साथ immunostained थे. (A और B) नियंत्रण, जख्म । (ग और घ) जख्मी और 6 ज पद पर तय जख्म । उपकला हटा दिया जाता है (तीर). (ई और एफ) घायल और 6 दिन के बाद घायल पर तय की । स्ट्रोमा भर गया है और उपकला (तीर सिर) हो गया है । प्रतिनिधि आपन myofibroblasts तारक (*) से चिह्नित हैं. (छ, ज) α-sma immunostaining के कम आवर्धन छवियों घाव भरने के बाद 2 सप्ताह: α-sma (लाल), DAPI (नीला) । छवियां एक सीसीडी कैमरे के साथ एक ईमानदार प्रतिदीप्ति/brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार = १०० µm (A, C, E); ५० µm (B, D, F); २०० µm (छ, ज) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 . परीक्षण अपक्षयी हीलिंग एजेंटों । सुअर कॉर्निया या तो थे (ए और डी) जख्मी (नियंत्रण), (बी और ई) घायल और नियंत्रण सिरना, या (सी और एफके साथ इलाज) घायल और USP10 सिरना के साथ इलाज किया । Immunostaining (A-C) α-SMA या (D-F) Fibronectin-ीडा. USP10 सिरना के साथ उपचार के बाद, α-SMA २.२ ± ०.६ गुना द्वारा कम किया गया था * * * पी < ०.००१ और एफ एन-ीडा ३.३ ± १.२ गुना * * p < ०.०१. छवियां एक सीसीडी कैमरे के साथ एक ईमानदार प्रतिदीप्ति/brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार = ५० µm. (G) Corneal stromal दाग के रूप में quantified द्वारा ImageJ. सांख्यिकीय महत्व Bonferroni के परीक्षण के साथ एक तरह से ANOVA द्वारा गणना की गई थी । चित्रा गिलेस्पी एट अल.7से अनुमति के साथ अनुकूलित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6 : परीक्षण एजेंटों reepithelialization पर प्रभाव के लिए-विषविज्ञान अध्ययन । α-स्म के लिए Immunostaining । सुअर कॉर्निया थे (एक) जख्मी, और (ख) जख्मी । (सी-एफ) कॉर्निया घायल हो गए और 10 µ एम Spautin-1 के साथ मशीन । अवरोध करनेवाला बाहर धोया गया था और (C) 2 दिनों के बाद मीडिया द्वारा प्रतिस्थापित, (घ) 4 दिन, (E) 6 दिन, (च) 14 दिन । गर्मी की अवधि के दौरान सभी मीडिया परिवर्तन संकेत के रूप में Spautin शामिल थे । सभी कॉर्निया तय किए गए थे और संस्कृति में 2 सप्ताह के बाद आयल में एंबेडेड । छवियां एक सीसीडी कैमरे के साथ एक ईमानदार प्रतिदीप्ति/brightfield माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कब्जा कर लिया गया । स्केल बार = ५० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस प्रोटोकॉल एक प्राकृतिक स्तरीकृत 3 डी वातावरण में घाव भरने के अध्ययन के लिए एक मॉडल का वर्णन । कोशिका संस्कृति और vivo में अध्ययन के बीच एक मध्यवर्ती के रूप में अंग संस्कृति का उपयोग काफी लागत कम कर देता है और साथ ही जीवित पशुओं पर प्रक्रियाओं को कम करने । अंय 3 डी मॉडल स्व synthesizing कोलेजन प्राथमिक मानव corneal fibroblasts2 या इन एक ही पशु से बनाया जैल में एंबेडेड कोशिकाओं से निर्मित कोलेजन जैल सहित क्षेत्र को महान लाभ की गई है31। अंग संस्कृति मॉडल प्रणाली ख्यात चिकित्सा एजेंटों के परीक्षण के लिए विशेष रूप से उपयोगी है के बाद से घाव स्थानीयकृत है और इस प्रकार वहां एक ही कॉर्निया में घायल और गैर घाव ऊतक के बीच एक स्पष्ट मार्जिन (चित्रा 4) है । इसके अलावा, एक यांत्रिक trephine घाव स्ट्रोमा, जो घाव (चित्रा 5) में siRNAs के प्रशासन के लिए उत्कृष्ट है के लिए सीधी पहुँच की अनुमति देता है । हालांकि यह यहां नहीं दिखाया गया है, अंग संस्कृति में corneal ऊतक में वायरल transduction भी३२,३३,३४का प्रदर्शन किया गया है । इस परख के एक और परिवर्तन के लिए एक रिपोर्टर के साथ संक्रमित कॉर्निया के लिए ब्याज और छवि वास्तविक समय में जीन अभिव्यक्ति के घायल होने के बाद का निर्माण होगा । vivo अध्ययनों में अनुवाद के संदर्भ में, यह एक ही प्रक्रिया खरगोशों३५ में पूरा किया जा सकता है और इस प्रकार मानव, सुअर, या खरगोश कॉर्निया पर अंग संस्कृति vivo परिणामों में तुलना की जा सकती है । हमारे अनुभव में, हम सिरना उपचार के साथ अंग संस्कृति मॉडल का उपयोग कर प्राप्त डेटा vivo (अप्रकाशित डेटा) में इसी तरह के निष्कर्षों में अनुवाद किया है । के बाद से अंग संस्कृति कॉर्निया एक कार्यात्मक अंग vasculature, आंसू की कमी है, और जलीय हास्य, प्रत्येक अंवेषक का आकलन करना चाहिए अगर यह उनकी पढ़ाई के लिए एक उपयोगी मॉडल होगा । प्रतिरक्षा कोशिकाओं के निवासी सक्रियण प्रदर्शन किया गया है, लेकिन सही vivo अध्ययन में समानांतर1अभी तक स्पष्ट नहीं है ।

प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम के लिए बहुत गहरा घाव से कॉर्निया घुसना नहीं है । यह पूर्वकाल चैंबर द्रव इस मामले में रिसाव होगा के रूप में स्पष्ट हो जाएगा । यदि ऐसा होता है, तो ग्लोब को छोड़ दिया जाना चाहिए । एक भी यांत्रिक घाव का उत्पादन करने के लिए, एक forcep के साथ trephined क्षेत्र के भीतर demarcated ऊतक के होंठ पकड़ और फिर corneal सतह के समानांतर सर्जिकल ब्लेड कदम trephine घाव की सीमाओं के भीतर ऊतक काट । corneal सतह बाहर शुष्क नहीं होना चाहिए इस प्रकार हम अनुशंसा करते हैं कि घाव बनाने और बाहर दुनिया से कॉर्निया काटने के बाद, जब तक आगर मिश्रण सही तापमान पर है, पंजाब में कॉर्निया चेहरा नीचे जगह है । सुनिश्चित कर लें कि आगर भी गर्म नहीं है endothelial नुकसान से बचना होगा ।

इस मॉडल की एक सीमा है कि एक trephine का उपयोग करने के लिए एक घाव का उत्पादन असमान है और एक समान कॉर्निया से कॉर्निया के लिए लेजर प्रेरित घावों३६की तुलना में reproduced नहीं किया जा सकता है । हालांकि, स्वाभाविक रूप से होने वाली घावों गहराई में सभी समकक्ष नहीं है और डेटा का एक बड़ा शरीर सुझाव है कि तहखाने झिल्ली में किसी भी उल्लंघन myofibroblast विकास और धुंध स्ट्रोमा में उत्पंन करता है, जबकि तहखाने झिल्ली के उत्थान के लिए सुराग कम scarring३७,३८,३९। इस सुअर corneal अंग संस्कृति मॉडल एक गंभीर घाव जिसमें तहखाने झिल्ली trephine के क्षेत्र के भीतर हटा दिया जाता है कार्यरत हैं । corneal स्ट्रोमा में myofibroblasts और fibrotic मार्करों का विकास लगातार किया गया है और इस मॉडल प्रणाली का उपयोग कर reproducibility हासिल किया । कुछ उपकला धुंधला आमतौर पर स्पष्ट है कि जख्मी और फिर से विकसित उपकला में काला है. यह अंय corneal अंग संस्कृति रिपोर्ट४० में प्रदर्शन किया गया है, लेकिन vivo माउस और खरगोश अध्ययन४१,४२ में से सबसे कॉर्निया में अनुपस्थित है । हालांकि, एक अध्ययन में एक vivo कुत्ते मॉडल में प्रदर्शन मजबूत उपकला α-SMA४३घायल होने के बाद उपकला में धुंधला. सिरना है कि हमारे अध्ययन में पुनर्अपक्षयी चिकित्सा को बढ़ावा भी काफी इस उपकला immunostaining कम, सुझाव है कि उपकला EMT के दौर से गुजर सकता है (fibrotic scarring) जब यह अंग संस्कृति में वृद्धि. इसके अलावा, एक घायल कॉर्निया के दाग प्रोटोकॉल में एक प्राथमिक एंटीबॉडी की चूक7 का सुझाव है कि immunostaining विशिष्ट है धुंधला की कुल अनुपस्थिति में हुई । जमे हुए वर्गों (नहीं दिखाया गया है) इस संबंध में आयल वर्गों के समान थे । हालांकि, थोड़ा सा लेकिन चर पृष्ठभूमि उपकला में धुंधलान, हमारी प्रयोगशाला केवल stromal धुंधला quantified है, जो कोई पृष्ठभूमि ऊतकवैज्ञानिक7मुद्दों है प्रतीत होता है.

यदि मानव कॉर्निया घायल, प्रत्यारोपण के बजाय पूर्ण ग्लोब के लिए इस्तेमाल नहीं कॉर्निया प्राप्त करने और अधिक लागत प्रभावी४०हो सकता है । इस मामले में, कॉर्निया ग्लोब द्वारा afforded दबाव की सहायता के बिना घायल हो जाएगा । अतिरिक्त घायल रणनीतियों corneal जलता है, जो बड़े पैमाने पर vivo में इस्तेमाल किया गया है एक निशान४२उत्पादन शामिल हो सकते हैं ।

सारांश में, एक 3 डी ऊतक घाव हीलिंग परख के लिए इस प्रणाली के लाभ अपने reproducibility और केवल मानक उपकरणों की जरूरत के साथ लागत बचत है, यह देख और ऊतक उपचार पर एजेंटों के प्रभाव को बढ़ाता है के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन बना रही है ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

यह काम NIH द्वारा समर्थित किया गया था-नेि R01 EY024942, अंधापन को रोकने के लिए अनुसंधान, राज्य चिकित्सा विश्वविद्यालय अप्रतिबंधित अनुसंधान कोष, और लायंस जिला 20-Y. सूक्ष्म और आयल वर्गों के छवि विश्लेषण माइक्रोस्कोपी कोर पर प्रदर्शन किया गया और माउंट सिनाई स्थित Icahn स्कूल ऑफ मेडिसिन में ऊतकवैज्ञानिक स्लाइड तैयारी का प्रदर्शन किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

चिकित्सा अंक १४४ कॉर्निया scarring फाइब्रोसिस Myofibroblast पूर्व vivo अंग संस्कृति
पूर्व Vivo Corneal अंग संस्कृति मॉडल के लिए घाव भरने की पढ़ाई
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter