Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Um protocolo para uma ex modelo de cultura da córnea órgão vivo, útil para estudos de cicatrização de feridas é descrita. Este sistema de modelo pode ser usado para avaliar os efeitos de agentes para promover a cicatrização regenerativa ou toxicidade de drogas em ambiente 3D multicelular organizada.

Abstract

A córnea tem sido amplamente utilizada como um sistema modelo para estudar a cicatrização de feridas. A capacidade de gerar e utilizar células primárias de mamíferos em duas dimensões (2D) e a três dimensões (3D) cultura gerou uma riqueza de informações não só sobre Biologia da córnea, mas também sobre a ferida cura, Miofibroblasto, biologia e cicatrizes em geral . O objetivo do protocolo é um sistema de ensaio para quantificar o desenvolvimento Miofibroblasto, que caracteriza a cicatriz. Vamos demonstrar um órgão corneal cultura ex vivo modelo usando olhos de porco. Neste anterior fotorrefrativa ferida, córneas ainda na globo estão feridas com uma lâmina circular chamada uma trefina. Um plugue de aproximadamente 1/3 da córnea anterior é removido, incluindo o epitélio, a membrana basal e a parte anterior do estroma. Após ferimento, córneas são cortadas do globe, montadas sobre uma base de colagénio/agar e cultivadas por duas semanas, complementado-soro livre médio com estabilizado vitamina C para aumentar a proliferação celular e secreção de matriz extracelular pelos fibroblastos residentes. Ativação de miofibroblastos no estroma anterior é evidente na córnea cicatrizada. Este modelo pode ser usado para o ensaio de fechamento da ferida, o desenvolvimento de miofibroblastos e marcadores fibróticas e para estudos de toxicologia. Além disso, os efeitos de inibidores de pequenas moléculas, bem como a transfeccao siRNA lipídica mediada por knockdown do gene podem ser testados neste sistema.

Introduction

Cicatrizes na córnea resultantes de infecção, trauma ou lesão podem levar a debilitante opacidades e perda de visão permanente. Assim, há uma necessidade crítica para identificar caminhos que podem ser direcionados para a intervenção terapêutica. Opções atuais do tratamento são limitadas e consistem principalmente de transplantes da córnea, que não são acessíveis aos pacientes em todo o mundo. Cultura de células 3D estudos1,2e ambos humanos (Figura 1) e córneas animais podem ser utilizadas para 2D. Córneas de cadáver humano não são adequadas para transplante podem ser obtidas em bancos de olhos ou bancos de tecidos centralizado (nacional doença pesquisa Interchange (NDRI)), e olhos de animais podem ser obtidos de um matadouro. Células epiteliais da córnea primárias, fibroblastos do estroma e, mais recentemente, as células endoteliais, podem ser isoladas e cultivadas destes tecidos para cicatrização de feridas e toxicologia estuda3,4,5. Além da importância de compreender a base molecular da cegueira doença ocular, a acessibilidade do tecido e a capacidade de cultura primária de células fez a córnea um sistema importante modelo para estudo. A córnea é ideal para testar os efeitos dos agentes em cicatrizes como a córnea normal é transparente e certos tipos de feridas criam opacidades ou cicatrizes fibróticas (revistas em6). Várias em vivo modelos cura de ferida da córnea também tem sido utilizados extensivamente para cicatrizes de estudos1. Menos utilizado tem sido o ex vivo da córnea ferida cura modelo7,,8 é descrever em detalhe aqui. O objetivo desse método é quantificar resultados cicatricial caracterizados por fabricantes fibróticos em um 3D multicelulares corneal ex sistema de modelo vivo.

Epiteliais da córnea, ferindo que não infringe a membrana basal epitelial normalmente fecha dentro de 24-72 h9. Logo após o ferimento, as células na borda do epitélio começam espalhando e migrando para a superfície epitelial livre, para restabelecer a função da barreira epitelial. Esta atividade sequencialmente é seguida pela ativação da proliferação da córnea basocelular primeiro e, numa fase posterior, de células precursoras, localizado na zona exterior estroma para alcançar a recuperação de células epiteliais em massa10,11. Estas feridas cicatrizam muitas vezes sem deixar cicatrizes. No entanto, uma ferida que penetra a membrana basal do estroma geralmente resulta em cicatriz formação1. Após ferimento do estroma da córnea, o estroma é preenchido com células de várias origens, incluindo células do estroma residentes diferenciadas, bem como derivados da medula óssea Fi12,13,14. Cicatrizes fibróticas é caracterizada pela persistência de miofibroblastos em uma cura ferida. Estes myofibroblasts patológicos demonstram maior adesão através da acumulação das integrinas em adesões focais, fibras de estresse de actina (α-SMA) músculo contrátil de α-liso e ativação local da matriz extracelular (ECM)-isolado latente-transformar o fator de crescimento-beta (TGFβ). A diferenciação das células epiteliais-derivado, conhecido como epitélio de transição mesenquimal (EMT), também pode contribuir para a formação de6da cicatriz.

Há um equilíbrio delicado entre a diferenciação celular e apoptose após ferimento. Por causa da violação na membrana do porão, crescimento fatores tais como fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e TGFβ de lágrimas e o epitélio banham o estroma, induzindo a diferenciação de Miofibroblasto, um loop de autócrina sustentado de ativação TGFβ e o secreção de desorganizada fibrótico ECM15,16. A persistência de miofibroblastos na ferida curada promove haze e cicatrizes na córnea (Figura 2). No entanto, em regeneratively curado ferida embora myofibroblasts desenvolver, eles apoptose e, portanto, estão ausentes ou significativamente reduzida em número no tecido curado (revisto em referência6,10). Assim, a pesquisa em cicatrizes fibróticas centrou pelo menos em parte no direcionamento de moléculas que impedem o desenvolvimento excessivo de Miofibroblasto ou Miofibroblasto persistência17,18. Porque a persistência de Miofibroblasto caracteriza doença cicatriz e fibrótica em todos os tecidos19, a córnea pode ser útil como um sistema modelo para estudar os mecanismos celulares gerais da fibrose.

Em nosso sistema de modelo, a córnea é ferida com uma lâmina cilíndrica chamada uma trefina enquanto ainda na globo. Humano e as córneas de porco podem ser feridas com qualquer um 6 ou 7 mm trefina; para córneas de coelho um trépano de 6mm é preferencial. A córnea de porco é semelhante em tamanho da córnea humana. Porque eles são custo-eficaz e prontamente disponível em grandes números, córneas de porco são rotineiramente utilizadas para cultura de órgãos. Além disso, os anticorpos e siRNAs feita reagir com humanos têm consistentemente cross-reacted com porco7. Após ferimento, córneas são cortadas do globo com o limbo intactas e montado sobre um base de agar/colágeno. As córneas são cultivadas em meios de comunicação isento de soro mais estabilizaram vitamina C para simular a proliferação de fibroblastos e deposição de ECM20. A adição de soro, nem fatores de crescimento são necessários para induzir a formação de Miofibroblasto7. As córneas são rotineiramente fixadas e processadas para histologia após duas semanas de cultura. Para knockdown do gene, ou para testar os efeitos de um agente na cicatrização de feridas, a ferida pode ser tratada com siRNA na ferida depois ferindo7 ou um agente solúvel pode ser adicionado para a mídia, respectivamente,8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. o órgão cultura

  1. Preparações
    1. Prepare a solução de ágar como segue. Em um pequeno frasco, prepare-se 1% de ágar e colágeno bovino de 1 mg/mL em DMEM-F12 até 20 mL. Trazer para ferver em uma chapa quente. Colocar a solução em um tubo cónico de 50 mL. Colocar o tubo em um banho de água em uma chapa quente para manter a solução de solidificação.
    2. Prepare a mídia de soro livre completadas (SSFM) conforme a composição fornecida na Tabela de materiais.
      Nota: A quantidade necessária de SSFM estar preparado depende do número de córneas para serem processados. Geralmente 30 mL é suficiente meios para 4 córneas.
  2. Dissecação
    Nota: Execute esta etapa em uma capa de dissecação ou capuz químico. Os olhos são fornecidos com tampas ainda presa em sacos individuais para proteger os globos.
    1. Remova globos de tampas com uma lâmina de borda reta cirúrgica em uma tábua de etanol-limpo. Remova o excesso de tecido gorduroso do olho usando uma lâmina ou uma pequena tesoura (Figura 3A, 3B).
    2. Depois de retirar a tampa, o globo, segure o globo posteriormente com fórceps e mergulhe imediatamente o olho em tampão fosfato salino (PBS). Mergulhe-o rapidamente 3x em iodo 10% (em um copo de 100 mL). Mergulhe rapidamente 2x em PBS (~ 100 mL numa proveta, mudança frequentemente PBS).
    3. Usando um pano limpo ou tecido, embrulhe o olho circunferencialmente com pressão suficiente para ter uma superfície corneal esticada para cortar com a trefina.
      Nota: tenha cuidado para evitar a toalha ou tecido de entrar em contato com a córnea.
  3. Ferindo
    1. Use um trépano de 6mm para ferir o centro da córnea. Penetra o epitélio e o estroma anterior sem fazer uma ferida de espessura total através da córnea inteira.
      Nota: Se o endotélio é penetrado, uma perda de pressão e vazamento de fluido será vista. Neste caso, o olho deve ser Descartado.
    2. Colocar o trépano no centro da córnea, girá-la 180° no sentido horário e anti-horário 5 x (cada vez que a direção é alterada ele conta como uma vez), aplicando uma ligeira pressão para aprofundar a ferida.
      Nota: A ferida deve agora ser profunda o suficiente para permitir que um retalho de tecido ser levantado usando um par de pinças. Se isso não for a caso repita a etapa 1.3.2.
    3. Levante a aba das bordas. Ao mesmo tempo, com a outra mão ou com uma segunda pessoa, use uma lâmina, corte paralelo ao Globo de cortar o tecido, como a pinça continua a levantar a córnea anterior dentro da margem da ferida. Na conclusão desta etapa, deverá haver uma ferida circular localizada no centro da córnea (ver Figura 3 C, 3D).
  4. Cortando e removendo a córnea do globo
    1. Segurando o olho com o tecido, faça uma pequena incisão 1mm longe da borda da córnea com uma lâmina para que o limbo é incluído na cultura do órgão.
    2. Usando o pequeno, tesoura afiada acessar a incisão criada na etapa anterior para cortar ao redor do globo, mantendo uma margem de milímetros em toda a córnea para manter intacto o limbo.
    3. Coloque a córnea em um prato de 60 mm com 1 mL de PBS, ferida de lado para baixo até a montagem.
  5. Montagem
    1. Certifique-se que o ágar chegou-se a uma temperatura morna (cerca de 25 ° C).
    2. Com dois pares de pinças, crie uma taça, segurando os dois lados da córnea com o lado endotelial. Adicione a solução de ágar aqueceu em córnea usando uma pipeta de transferência estéril até que esteja completo.
    3. Depois que o ágar endurece (geralmente aproximadamente 30-45 s) flip cuidadosamente a córnea com o ágar-ágar em placa de 60 mm (Figura 3E). Cubra com uma tampa.
  6. Incubação
    1. Adicionar 4 mL de SSFM à placa, mantendo as córneas em uma interface ar-líquido na fronteira estroma em 5% CO2 a 37 ° C. Atualize a mídia após 24 h e depois disso todos os dias.
      Nota: Se executar uma transfecção na ferida, omita os antibióticos até depois do transfection.
    2. Molhe a superfície da córnea uma vez ao dia, adicionando 1 gota de SSFM da mídia condicionadas no prato para manter a umidade. Para isso, leve o prato fora da incubadora, colocá-lo sob o capô, retire a tampa do prato, molhe a superfície com mídia de prato usando uma pipeta estéril, cubra novamente e colocá-lo de volta na incubadora.
    3. Para o nocaute do gene, tratar a ferida com gene-alvo ou controle siRNA que é complexado a um portador de lipídios-mediada conforme instruções do fornecedor (veja abaixo).
    4. Mistura de 5 µ l (50 pmol) de siRNA em 50 µ l de soro e reduzida mínima essencial mídia (EG., Opti-MEM). Misture 2 µ l de reagente de transfeccao em 50 µ l de soro reduzido mídia. Deixe este sentar-se por 5 min e em seguida, misturá-los.
    5. Adicione 200 µ l de mídia mínima reduzido-soro para a mistura de reagente/siRNA.
    6. Pipetar gota a gota sobre o ferimento e incubar durante 3 h.
    7. Lave siRNA da superfície corneal com mídia no prato. Altere a mídia de incubação para SSFM + antibióticos (consulte a Tabela de materiais). Continue a incubação como mencionado anteriormente (passos 1.6.1-1.6.2).

2. histologia: Cortes de parafina e imunocoloração

  1. Preparação do tecido
    1. Após uma incubação de duas semanas, se usar algum do tecido para quantitativo em tempo real do polymerase reação em cadeia (qRT-PCR) análise, antes da fixação, cortada ao meio através da ferida, a córnea. Coloque esta metade ou apenas ¼ (também é de tecido suficiente) para estabilizar o reagente RNA-proteger.
    2. Usando um kit de isolamento padrão, isolar o RNA e executar qRT-PCR.
      Nota: Alternativamente, a parte ferida só pode ser isolada e testada para a expressão do gene.
    3. Coloque a outra metade da córnea em fitas de patologia do tecido e mergulhe no fixador (formol a 10%) durante 2 a 4 dias à temperatura ambiente (RT).
    4. Parafina incorporar esta metade da córnea ferida usando as técnicas padrão.
      Nota: Oriente a córnea ferida para garantir que o seccionamento de tecido irá produzir um corte transversal da córnea.
  2. Immunostaining usando 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. Dia 1
      1. Rótulo de slides corretamente usando um lápis. De paraffinize do tecido, colocando slides em um frasco com agente (2 trocas, 10 min cada) de limpeza.
      2. Re-hidratar o tecido pela transferência de slides para etanol em diminuir as concentrações (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5min para cada alteração).
      3. Execute a recuperação do antígeno por microondas dos slides em um frasco de plástico com tampão citrato (10 mM, pH 6,4) por 5 min. Primeiro ciclo 5 min à 50% de potência. Encha a jarra com tampão citrato e repita. Esfriar por 10 min.
      4. Lave 3x com PBS, 2 min cada. Permeabilize tecido com 1% Triton X-100 em PBS 10 min no bloco RT. seções com 3% de soro de cabra normal (NGS) por 1h no RT em câmara úmida.
      5. Incubar o tecido com anticorpo primário (1: 100 ou como sugere o fornecedor) em 3% NGS durante a noite a 4 ° C (300 µ l por slide).
    2. Dia 2
      1. Enxágue os slides 3x com PBST (PBS, acrescido de 1% Tween 20), 2 min cada. Coloque slides em 3% H2O2 por 10 min bloquear a peroxidase endógena. Lave 3x com PBST, 2 min cada. Incubar as seções com anticorpo secundário HRP (1: 250) em 3% NGS por 1h no RT (300 µ l por slide).
      2. Lave slides 3 x PBST, 2 min cada. Trate de slides com o kit DAB. Adicionar 300 µ l/slide de 3 min. lavagem desliza com dH2O 2 x (mergulhos rápidos).
      3. Counterstain com hematoxilina por 20 s. lavagem do slide com dH2O 2 x (mergulhos rápidos). Mancha com agente de anil para 20 s. enxágue em dH2O por 20 s. desidratando tecido colocando slides em concentrações crescentes de etanol (50%, 70%, 100%, 100%, todos os mergulhos rápidos).
      4. Seque os slides em uma toalha de papel sob o capô para 10-20 min.
      5. Montagem de slides usando 1 gota de montagem mídia, cobrir com lamínula. Rotular e armazenar em RT
      6. Imagem dos slides sob um microscópio e quantificar o sinal DAB com ImageJ7 (ver secção 4).
  3. Immunostaining: fluorescência
    1. No dia 1 siga os passos descritos na etapa 2.2.1. Execute as seguintes etapas no dia 2.
    2. Enxágue os slides 3 x em PBST por 2 min cada. Incubar as seções com anticorpo secundário fluoróforo-tag em 3% NGS (1: 200) por 1h no RT
    3. Lave 3 x em PBST, 2 min cada. Montagem de slides usando 1 gota de 4 ′, mídia de montagem 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) e cobrir com uma lamela. Seca na toalha de papel sob a capa de 30 min. loja no escuro a 4 ° C até imagens de fluorescência.
  4. Quantificação usando Image J
    1. Baixe a versão de "Fiji" do ImageJ, que inclui os plugins necessários para DAB, quantificação de coloração.
    2. Abrir uma imagem em Fiji e selecione imagem → → de cor cor deconvolução.
    3. Selecione "DAB-H" como a mancha e, em seguida, clique Okey. Três novas imagens aparecerão. Selecione a imagem que contém a única mancha de DAB.
    4. Para quantificar stromal coloração somente, use a função de borracha ImageJ para remover o epitélio da imagem DAB.
    5. Selecione analisar → medida (ou Ctrl + M) e registre o valor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Imuno-histoquímica é o ensaio principal utilizado para analisar o sucesso do ex vivo ferida cura experimento. A Figura 4 mostra o epitélio e o estroma anterior no tecido de controle (Figura 4A, 4B). Seis horas após o ferimento, o epitélio estava ausente (Figura 4, 4-D). Seis dias após o ferimento como esperado, o epitélio tinha crescido (Figura 4E, 4F). Este tecido foi immunostained para actina de músculo liso-alfa (α-SMA), a expressão de que caracteriza myofibroblasts. Há um aumento dramático em immunostaining α-SMA no estroma detectadas por colorimétrico substrato DAB. Houve também um aumento na reatividade epitelial que pode sugerir EMT transição7 (veja a discussão). Desorganização no epitélio e estroma era evidente. Um experimento ferindo na ampliação baixa e com immunostaining fluorescente em vez de DAB é mostrado (Figura 4, 4h). A margem da ferida é visível, bem como um gradiente de miofibroblastos ativos de anterior para posterior estroma.

Embora fibróticos marcadores são expressos por uma semana (Figura 4), para obter o desenvolvimento consistente e confiável de marcadores fibróticos, um ponto de tempo de duas semanas foi escolhido. Na Figura 5 , é demonstrado um ensaio usando uma única aplicação de controle ou siRNA gene-alvo a ser testado para promover a cicatrização regenerativa. Neste caso, o direcionamento siRNA foi para USP10, um deubiquitinase. Miofibroblastos patológicos demonstraram maior adesão através da acumulação de αv-integrinas em aderências focais21. Nossos estudos anteriores mostraram que a αvβ1 e αvβ5 são integrinas fibróticas importantes na cura do estroma corneano7. Integrinas vincular ECM fora da célula, e juntos eles são internalizados. A integrina interiorizada é ubiquitinated e enviado para a degradação da lisossoma ou a tag de ubiquitina é removida por um deubiquitinase (DUB) e a integrina é reciclada à superfície da célula. Descobrimos que um aumento na expressão do gene do DUB (USP10) aumentou a taxa de remoção de ubiquitina da integrina subunidades β1 e β5 levando a um acúmulo resultante de αv/β1/β5, na superfície das células, com subsequente ativação TGFβ e indução de marcadores fibrótico7. Nocaute de USP10 na cultura da córnea órgão impedido o aparecimento de marcadores fibrótico7. Um exemplo destes resultados é mostrado na Figura 5. Como acima, α-SMA é utilizada como um marcador para miofibroblastos. Outro indicador de cicatrizes é EDA-fibronectina (FN-EDA), uma variante da tala do FN que contém um RGD, αv integrina vinculação domínio22,23,24. É também denominado celular FN (c-FN). Ele serve como um marcador fibrótico chave desde FN-EDA não está no plasma de circulação mas em vez disso é apenas expressa e secretada pelas células sob condições fibrótico25. Na Figura 5A-5C imunocoloração para α-SMA é mostrada. Comparado a intacta (Figura 5A), ferindo mais controle siRNA (Figura 5B) mostrou um aumento dramático na expressão de proteínas α-SMA, Considerando que a adição de USP10 siRNA7 drasticamente reduzida expressão no estroma e epitélio. Da mesma forma, em comparação com intacta (Figura 5), ferindo mais controle siRNA (Figura 5E) demonstrou um aumento dramático na expressão de proteínas de fibronectina-EDA comparado ao tratamento com siRNA USP10 (Figura 5F). Immunohistology para a proteína do alvo (no caso, USP10) foi usado para demonstrar o sucesso "knockdown"7. Além disso, realizar qRT-PCR pode assegurar knockdown do gene no tecido, ou também a ensaiar para outros marcadores fibrótico7. ImageJ pode ser usado para quantificar o sinal no estroma apenas ou sinal total (Figura 5). Pelo menos 3 córneas para cada condição que está sendo testado devem ser usadas para quantificar imunocoloração para gerar a significância estatística, como temos mostrado aqui e anteriormente publicado7. Outras proteínas que têm sido rotineiramente utilizadas para marcadores fibróticos são expressão de III de colágeno e aumento da expressão de integrinas1,26.

Na Figura 6, o uso de ex vivo cultura de córnea é demonstrado como um ensaio de toxicologia. Neste experimento, as córneas foram também esquerda incólume (figura 6A), feridos (Figura 6B), ou feridos e tratados com 10 µM Spautin-127, que foi adicionado para o meio de cultura celular para aumentar os períodos de tempo antes de lavar para fora ( Figura 6-6F). Spautin-1 é uma droga que tem como alvo não especìfica USP1027. Por causa de nosso sucesso com siRNA USP10, tratamento Spautin foi testado para a eficácia na prevenção de cicatrizes. Ao contrário do siRNA, Spautin nessa concentração era tóxico ao tecido. Aumentando o tempo com Spautin-1 na cultura impedido re-epitelização e resultou na morte celular qualitativa, matriz desorganizada e vacúolos do estroma, sugerindo que Spautin-1 não promover a cura na concentração antes do doseamento. Padrão histológicos ensaios podem ser empregados para quantificar a proliferação celular ou apoptose.

Figure 1
Figura 1 : Seção transversal de um olho humano com uma visão expandida da córnea. Em primatas e galinhas, histologicamente há cinco camadas distintas: epitélio, Bowman membrana, estroma, da Decement membrana e endotélio28,29. Em todos os outros mamíferos, membrana de Bowman não é visível histologicamente. Em nível microscópico de elétron da transmissão, observa-se uma membrana basal separa o epitélio corneano e o estroma em córneas todos, incluindo aqueles com membrana de um arqueiro. Membrana ou membrana basal separa o epitélio do estroma um Bowman intacto é necessário para evitar cicatrizes em todos os mamíferos. Imagem reimpresso com permissão da AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2 : Diagrama dos eventos celulares que conduzir a scarring corneal. Este diagrama mostra os eventos básicos que se desenrolam na córnea anterior após ferimento. (A) representação da membrana basal do epitélio, estroma e as células quiescentes incorporadas no estroma, ou seja, keratocytes. (B) o triângulo vermelho retrata uma ferida, que pode ser mecânica, úlcera, vírus ou infecção persistente. (C) após ferimento, em que o Bowman ou membrana basal é quebrada, as células ao redor da ferida de apoptose. (D e E) um afluxo de células repovoar a ferida de keratocytes residente ou fibroblastos derivados da medula óssea e transição em fibroblastos ativados ou diretamente em miofibroblastos. Miofibroblastos patológicos (F), estes aderentes criam um loop de autócrina de ativação TGFβ e secreção de matriz fibrótico desorganizada que promove a formação de haze e cicatriz corneal. Em uma ferida regeneratively curada, miofibroblastos aparecem mas tem apoptosed no tecido curado6,29,30. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3 : Recebendo e processando as córneas para cultura de órgãos. (A) porco olhos são recebidos com tampas para proteger a córnea durante o transporte. (B) imagem do globo depois de tecido é removido. (C) a imagem de uma trefina de 6 mm. (D) Wounding da córnea central com uma trefina. (E) imagem da córnea montada após a remoção do globe. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4 : Tecido corneal após ferimento. Reagidos análise de intacta (controle) ou córneas feridas. As córneas de porco foram deixadas intacta (controle) ou feridas. Cortes de tecido eram immunostained com anticorpos actina de músculo liso-alfa (α-SMA) para identificar myofibroblasts. (A e B) controle, incólume. (C e D) Wounded e fixada em 6 h pós-ferindo. Epitélio é removida (seta). (E e F) Wounded e fixada em 6 dias após ferimento. Estroma tem preenchidos e o epitélio tem crescido (cabeça de seta). Representativa de miofibroblastos registrados são assinalados com asteriscos (*). (G, H) 2 semanas após o ferimento de baixa ampliação de imagens de imunocoloração α-SMA: α-SMA (vermelho), DAPI (azul). Imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência/brightfield ereto com uma câmera CCD. Barra de escala = 100 µm (A, C, E); 50 µm (B, D, F); 200 µm (G, H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5 . Teste de agentes de curativas regenerativos. As córneas de porco ou eram (A e D) incólume (controle), (B e E) feridos e tratadocom com controle siRNA, ou (C F) ferido e tratados com siRNA USP10. Immunostaining para (-C) α-SMA ou (D-F) fibronectina-EDA. Após o tratamento com siRNA USP10, α-SMA foi reduzido em 2,2 ± 0,6 dobra * * * p < 0,001 e FN-EDA 3,3 ± 1.2 dobra * * p < 0,01. Imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência/brightfield ereto com uma câmera CCD. Barra de escala = 50 µm. (G) da córnea do estroma coloração conforme quantificada pelo ImageJ. Significância estatística foi calculada pelo ANOVA One-Way com teste de Bonferroni. A figura foi adaptada com permissão de Gillespie et al.7. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6 : Teste de agentes para efeitos na reepitelização - estudos de toxicologia. Immunostaining para α-SMA. As córneas de porco eram incólume do (A) e (B) ferido. (C-F) Córnea foram feridos e incubadas com 10 µM Spautin-1. O inibidor foi lavado para fora e substituído pelos meios de comunicação (C) depois de 2 dias, (D), 4 dias, (E), 6 dias, (F), 14 dias. Todas as alterações de mídia durante o período de incubação incluíam Spautin conforme indicado. Todas as córneas foram fixas e incorporadas em parafina depois de 2 semanas na cultura. Imagens foram capturadas usando um microscópio de fluorescência/brightfield ereto com uma câmera CCD. Barra de escala = 50 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Este protocolo descreve um modelo para o estudo de cicatrização de feridas, em um ambiente 3D estratificado natural. Uso da cultura de órgãos como um intermediário entre a cultura de células e de estudos in vivo reduz significativamente os custos, bem como reduzir os procedimentos em animais vivos. Outros modelos 3D tem sido de grande benefício para o campo, incluindo Self sintetizando o gel de colágeno, feita a partir de fibroblastos da córnea humana primária2 ou estas mesmas células incorporados em géis feitos de derivados de animais colagénios31. O sistema de modelo de cultura do órgão é particularmente útil para testar o putativos agentes de curativas, desde que a ferida está localizada e, portanto, há uma margem clara entre o tecido não feridos e ferido na mesma córnea (Figura 4). Além disso, uma ferida de trefina mecânica permite acesso directo para o estroma, que é excelente para administração de siRNAs na ferida (Figura 5). Apesar de que não é mostrado aqui, transdução viral no tecido corneal na cultura do órgão também tem sido demonstrada32,33,34. Outra permutação deste ensaio seria para infectar as córneas com uma construção de repórter interesse e imagem da expressão do gene em tempo real após ferimento. Em termos de tradução para estudos in vivo, este mesmo procedimento pode ser realizado em coelhos35 e, portanto, cultura de órgãos humanos, porco, ou córneas de coelho podem ser comparadas a resultados in vivo. Em nossa experiência, os dados que obtivemos usando o modelo de cultura de órgão com siRNA tratamento tem traduzido em semelhantes achados na vivo (dados não publicados). Desde que as córneas de cultura órgão faltam uma vasculatura estroma funcional, lágrimas e humor aquoso, cada investigador deve avaliar se este será um modelo útil para seus estudos. Demonstrou-se residente ativação de células do sistema imunológico, mas o paralelo exato para estudos in vivo não é ainda claro1.

Um passo chave no protocolo não é penetrar na córnea por ferir profundamente. Este será óbvio como o fluido da câmara anterior irá vazar neste caso. Se isso ocorrer, o globo deve ser Descartado. Para produzir uma ferida mesmo mecânica, agarre o lábio do tecido demarcado dentro da área trephined com uma pinça e em seguida, mova a lâmina paralela à superfície da córnea para cortar o tecido dentro dos limites da trefina ferida. A superfície da córnea não deve secar assim nós recomendam que, depois de ter a ferida e cortando a córnea do globo, coloque a córnea voltada para baixo em PBS, até obter uma mistura de ágar na temperatura correta. Certificando-se que o ágar não é muito quente vai evitar dano endotelial.

Uma limitação deste modelo é que o uso de um trépano para produzir uma ferida é irregular e não pode ser reproduzido de forma idêntica de córnea de córnea em comparação com feridas induzida por laser36. No entanto, naturalmente ocorrem feridas não são todos equivalentes em profundidade e uma grande massa de dados sugerem que qualquer violação na membrana do porão gera desenvolvimento Miofibroblasto e haze no estroma, Considerando que a regeneração da membrana porão leva a diminuiu a cicatrização37,38,39. Este modelo de cultura porco corneal órgão emprega uma ferida grave em que a membrana basal é removida dentro da área da trefina. Desenvolvimento de miofibroblastos e fibróticos marcadores no estroma corneal tem sido consistentemente e reprodutibilidade alcançado usando esse modelo de sistema. Algumas manchas epitelial é geralmente evidente que escurece no epitélio ferido e crescido. Isto foi demonstrado em outros órgãos da córnea cultura relatórios40 mas é ausente na maioria das córneas de rato na vivo e estudos41,42de coelho. No entanto, um estudo realizado em um modelo canino em vivo demonstrou forte epitelial α-SMA coloração no epitélio após ferindo43. O siRNA que promoveu cura regenerativo em nossos estudos também significativamente reduzido este immunostaining epitelial, sugerindo que o epitélio pode estar sendo EMT (cicatrizes fibróticas) quando ele regrows na cultura de órgãos. Além disso, a omissão de um anticorpo primário no protocolo de coloração de uma córnea ferido resultou na ausência total de coloração7 , sugerindo que o immunostaining é específico. Seções congeladas (não mostradas) eram semelhantes às secções de parafina a este respeito. No entanto, porque o fundo ligeiro mas variável de coloração no epitélio, nosso laboratório apenas quantificou a coloração do estroma, que parece não ter nenhum fundo histológico questões7.

Se ferindo córneas humanas, obtenção de córneas não utilizadas para transplante em vez de globos completo pode ser mais rentável,40. Neste caso, a córnea vai ser ferida sem o auxílio da pressão proporcionada pelo globo. Estratégias ferindo adicionais podem incluir queimaduras da córnea, que têm sido amplamente utilizadas em vivo para produzir uma cicatriz42.

Em resumo, as vantagens deste sistema por uma ensaio de cicatrização de feridas de tecido 3D é sua poupança de reprodutibilidade e custo com equipamento padrão apenas necessidades, tornando-se um excelente recurso para observar e quantificar os efeitos dos agentes na cicatrização tecidual.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo NIH-NEI R01 EY024942, pesquisa para evitar cegueira, Upstate Medical Universidade irrestrito fundos de investigação, e Lions distrito 20-Y. microscopia e análise de imagens de cortes de parafina foram realizadas no núcleo microscopia e preparação de lâmina histológica foi realizada no biorepositórios e no núcleo de patologia da faculdade de medicina de Icahn no Monte Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

Medicina edição 144 córnea cicatriz fibrose Miofibroblasto Ex vivo cultura de órgãos
Ex Vivo modelo de cultura órgão da córnea para cicatrização de feridas estudos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter