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Medicine

Ex Vivo modelo de cultura órgano córneo para la curación de heridas estudios

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

Un protocolo para un ex vivo modelo de cultura órgano córneo es útil para estudios de cicatrización se describe. Este sistema modelo puede utilizarse para evaluar los efectos de agentes para promover la curación regenerativa o toxicidad de la droga en un ambiente organizado de multicelular 3D.

Abstract

La córnea se ha utilizado extensivamente como modelo para el estudio de la cicatrización de heridas. La capacidad de generar y utilizar las células primarias de mamíferas en dos dimensiones (2D) y tres dimensiones cultura de (3D) ha generado una riqueza de información sobre biología corneal sobre la herida cura, biología de miofibroblastos y cicatrices en general . El objetivo del protocolo es un sistema de análisis para cuantificar el desarrollo de miofibroblastos, que caracteriza a marcar con una cicatriz. Demostramos un órgano córneo cultura vivo ex modelo con ojos de cerdo. En este anterior keratectomy herida, córneas todavía en el mundo son heridas con una cuchilla circular que se llama un trépano. Se quita un tapón de aproximadamente 1/3 de la córnea anterior incluyendo el epitelio, la membrana del sótano y la parte anterior del estroma. Después de herir, córneas son corta del mundo, montadas sobre una base de colágeno/agar y cultivadas durante dos semanas en medio libre de suero complementado con estabilizado vitamina C para aumentar la proliferación celular y la secreción de matriz extracelular por los fibroblastos residentes. Activación de miofibroblastos en el tejido conectador anterior es evidente en la córnea curada. Este modelo puede utilizarse para análisis de encierro de la herida, el desarrollo de miofibroblastos y marcadores fibróticos y para estudios de Toxicología. Además, los efectos de los inhibidores de molécula pequeña como transfección mediada por lípidos siRNA por caída de gene se pueden probar en este sistema.

Introduction

Marcar con una cicatriz en la córnea debidos a lesión, trauma o infección puede conducir a debilitante opacidad y pérdida de visión permanente. Así, hay una necesidad crítica para identificar los caminos que pueden ser objeto de intervención terapéutica. Opciones actuales de tratamiento son limitadas y consisten principalmente en trasplantes córneas, que no son accesibles a los pacientes en todo el mundo. Humanos (figura 1) y córneas animales pueden ser utilizadas para 2D y estudios de cultivo celular 3D1,2. No apto para trasplante de córneas de cadáver humano pueden obtenerse de bancos de ojos o de bancos de tejidos centralizada (nacional enfermedad investigación intercambio (NDRI)), y los ojos animales pueden obtenerse en un matadero. Las células epiteliales corneales primarias, fibroblastos estromales y más recientemente, las células endoteliales, pueden aisladas y cultivadas de estos tejidos para la cicatrización de Toxicología estudios y3,4,5. Además de la importancia de comprender la base molecular de ceguera ojo, la accesibilidad del tejido y la capacidad de las células primarias de cultura ha hecho la córnea un sistema modelo importante para el estudio. La córnea es ideal para probar los efectos de los agentes en la cicatrización de la córnea normal es transparente y ciertos tipos de heridas crean opacidades o cicatrices fibróticas (revisadas en6). Varios en vivo herida corneal cicatrización modelos también se han utilizado extensivamente para estudios1marcar con una cicatriz. Menos utilizado ha sido el ex vivo cornea herida curativo modelo7,8 que se describen en detalle aquí. El objetivo de este método es cuantificar resultados de cicatrización caracterizados por los fabricantes fibróticos en un 3D multicelulares córnea ex sistema de modelo vivo.

Heridas epiteliales corneales que no romper la membrana basal epitelial normalmente se cierra en 24-72 h9. Pronto después de la herida, las células en el borde del epitelio comienzan separarse y migrar a la superficie epitelial libre, para restablecer la función barrera epitelial. Esta actividad es seguida secuencialmente por la activación de la proliferación celular basal corneal primero y, en una etapa posterior, de células precursoras, ubicado en la zona limbal externa para lograr la recuperación de la célula epitelial masiva10,11. A menudo estas heridas sanan sin dejar cicatrices. Sin embargo, una herida que penetra la membrana del sótano en el estroma, a menudo resulta en la formación de cicatriz1. Después de herir stromal córnea, el estroma se rellena con las células de múltiples orígenes como distinguidas residente células stromal y fibrocitos médula ósea12,13,14. Marcar con una cicatriz fibrótica se caracteriza por la persistencia de myofibroblasts en una herida curativa. Estos miofibroblastos patológicos demuestran mayor adherencia a través de la acumulación de las integrinas en adherencias focales, fibras de tensión contráctil del músculo liso de la α actina (α-SMA) y la activación local de la matriz extracelular (ECM)-secuestrado latente de la transformación del factor de crecimiento beta (TGFβ). La diferenciación de las células epiteliales derivadas, conocido como epitelio de transición mesenquimal (EMT), también puede contribuir a la formación6la cicatriz.

Hay un delicado equilibrio entre la diferenciación celular y apoptosis después de herir. Debido a la brecha en la membrana basal, factores de crecimiento como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) y TGFβ de lágrimas y el epitelio bañan del estroma, induce diferenciación de miofibroblastos, un bucle autocrino sostenida de la activación de TGFβ y la secreción de desorganizado fibrótica ECM15,16. La persistencia de los miofibroblastos en la herida curada promueve haze y marcar con una cicatriz en la córnea (figura 2). Sin embargo, en re-generativa curado la herida aunque desarrollar myofibroblasts, apoptose y así son ausentes o significativamente reducidas en número en el tejido curado (revisado en la referencia6,10). Así, investigación sobre cicatrización fibrótica ha enfocado al menos en parte dirigidos a moléculas que impiden el desarrollo excesivo de miofibroblastos o miofibroblastos persistencia17,18. Debido a persistencia de miofibroblastos caracteriza enfermedad cicatrización y fibrótica en todos los tejidos19, la córnea puede ser útil como un sistema modelo para estudiar los mecanismos celulares generales de fibrosis.

En nuestro sistema modelo, la córnea es herida con una cuchilla cilíndrica llamada trépano mientras que todavía en el mundo. Humano y córneas de cerdo pueden ser heridas con cualquiera de los dos un 6 o 7 mm trépano; para córneas de conejo un trépano de 6 mm se prefiere. La córnea de cerdo es similar en tamaño a la córnea humana. Porque son rentables y fácilmente disponibles en números grandes, córneas de cerdo se utilizan habitualmente para el cultivo. Además, constantemente han inducían anticuerpos y siRNAs hicieron reaccionar con humanos con cerdo7. Después de herir, córneas se cortan del globo con el limbo intactas y montado en una base de agar/colágeno. Las córneas son cultivadas en medios libres de suero además de estabilizaron de vitamina C para simular la proliferación del fibroblasto y la deposición de ECM20. La adición de suero ni factores de crecimiento son necesarias para inducir la formación de miofibroblastos7. Córneas son rutinariamente fijadas y procesadas para histología después de dos semanas de la cultura. Por caída de gene, o para probar los efectos de un agente en la cicatrización de la herida, la herida puede ser tratada con siRNA en la herida después de herir a7 o un agente soluble puede añadirse a los medios de comunicación, respectivamente8.

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Protocol

1. cultivo

  1. Preparaciones
    1. Preparar la solución de agar como sigue. En un matraz pequeño, preparar agar al 1% y 1 mg/mL de colágeno bovino en DMEM-F12 hasta 20 mL. Lleve a ebullición sobre una placa caliente. Poner la solución en un tubo cónico de 50 mL. Coloque el tubo en un baño de agua en un plato caliente para impedir la solidificación de la solución.
    2. Preparar medios libres de suero suplementados (SSFM) según la composición en la Tabla de materiales.
      Nota: La cantidad necesaria del SSFM estar preparado depende de la cantidad de córneas para ser procesados. Generalmente 30 mL es suficiente medios para 4 córneas.
  2. Disección
    Nota: Realizar este paso en una campana de disección o una campana química. Los ojos vienen con tapas fijadas en bolsitas individuales para proteger a los globos.
    1. Quite los globos de las tapas con una borde recto Cuchilla quirúrgica en un tajo de limpiado de etanol. Retire el exceso de tejido graso del ojo usando una cuchilla o unas tijeras pequeñas (Figura 3A, 3B).
    2. Después de remover el mundo de la tapa, sostenga el globo posteriorly con pinzas y sumergir inmediatamente el ojo con solución salina con tampón fosfato (PBS). Rápidamente la inmersión x 3 en 10% de yodo (en un vaso de precipitados de 100 mL). Rápidamente sumergir x 2 en PBS (~ 100 mL en un vaso de precipitados, cambio PBS con frecuencia).
    3. Usando una toalla limpia o un paño, envuelva el ojo circunferencial con suficiente presión como para tener una superficie corneal tensada con el trépano.
      Nota: tenga cuidado para evitar que la toalla o tejido entre en contacto con la córnea.
  3. Hiriendo a
    1. Utilizar un trépano de 6 mm para el centro de la córnea de la herida. Penetrar en el epitelio y el estroma anterior sin hacer una herida de espesor total a través de la córnea entera.
      Nota: Si el endotelio es penetrado, se verá una pérdida de presión y fugas de líquido. En este caso el ojo debe ser desechado.
    2. El trépano en el centro de la córnea, gírelo 180° en sentido horario y antihorario 5 x (cada vez que se cambia la dirección contará como una sola vez) mientras se aplica una ligera presión para profundizar en la herida.
      Nota: La herida debe quedar lo suficientemente profunda para permitir que un colgajo de tejido ser levantado con un par de pinzas. Si esto no es del caso repetir el punto 1.3.2.
    3. Levante la aleta de los bordes. Al mismo tiempo, con la otra mano o con otra persona, utilice una cuchilla de corte paralelo al mundo para cortar el tejido mientras el fórceps levantar la córnea anterior dentro del margen de la herida. En la conclusión de este paso debe ser una herida circular situada en el centro de la córnea (ver Figura 3C, 3D).
  4. Corte y eliminación de la córnea del globo
    1. Sostiene el ojo con el tejido, hacer una pequeña incisión de 1 mm del borde de la córnea con una cuchilla para que el limbo está incluido en la cultura de órgano.
    2. Mediante pequeñas, unas tijeras afiladas acceda la incisión creada en el paso anterior para cortar alrededor del globo, dejando un margen de milímetro a lo largo de la córnea para mantener intacto el limbus.
    3. Coloque la córnea en un plato de 60 mm con 1 mL de PBS, lado de la herida hacia abajo hasta el montaje.
  5. Montaje
    1. Asegúrese de que el agar ha llegado a una temperatura cálida (25 ° C aproximadamente).
    2. Con dos pares de pinzas, sosteniendo dos lados de la córnea con el lado endotelial para crear una taza. Añadir la solución de agar calentado en la córnea con una pipeta de transferencia estéril hasta que esté lleno.
    3. Después de que el agar se endurece (generalmente cerca de 30-45 s) con cuidado voltear la córnea con el agar en placa de 60 mm (figura 3E). Cubrir con una tapa.
  6. Incubación
    1. Añadir 4 mL de SSFM a la placa, mantener las córneas en una interfase aire-líquido en la frontera limbal en 5% CO2 a 37 ° C. Actualizar los medios de comunicación después de 24 h y posteriormente cada tercer día.
      Nota: Si realizando una transfección en la herida, omitir los antibióticos hasta después de la transfección.
    2. Humedezca la superficie corneal una vez al día agregando 1 gota de SSFM desde los medios condicionados en el plato para mantener la humedad. Para esto, tome el plato fuera de la incubadora, coloque debajo de la campana, retire la tapa del plato, humedezca la superficie con medios de comunicación de plato con una pipeta estéril, cubrir otra vez y lo pones de nuevo en la incubadora.
    3. Para la precipitación del gene, tratar la herida con gene targeting o control siRNA que es complejado a un portador lípido-mediada según las instrucciones del proveedor (véase abajo).
    4. Mezcla 5 μl (50 pmol) de siRNA en 50 μl de suero reducido mínimo esencial los medios de comunicación (por ej., Opti-MEM). Mezcle 2 μl de reactivo de transfección en 50 μl de suero reducido los medios de comunicación. Que este siente por 5 min y luego mezclarlas.
    5. Añadir 200 μL de suero reducido mínimo medios de comunicación a la mezcla de reactivo/siRNA.
    6. Pipetear con gota a gota sobre la herida e incubar durante 3 h.
    7. Lavar siRNA de la superficie corneal con medios de comunicación en el plato. Cambiar el medio de incubación SSFM + antibióticos (véase la Tabla de materiales). Continuar la incubación como se ha mencionado anteriormente (medidas 1.6.1-1.6.2).

2. histología: Secciones de la parafina y el Immunostaining

  1. Preparación del tejido
    1. Después de una incubación de dos semanas, si se utiliza parte del tejido para cuantitativa de polimerasa reacción en cadena (qRT-PCR) análisis en tiempo real, antes de la fijación, cortar la córnea en medio a través de la herida. Coloque la mitad o sólo ¼ (tampoco es suficiente tejido) en estabilización de RNA-proteger reactivo.
    2. Usando un kit de aislamiento estándar, aislar RNA y realizar qRT-PCR.
      Nota: Alternativamente, la parte herida sólo puede ser aislada y probada para la expresión génica.
    3. Coloque la otra mitad de la córnea en cassettes de patología de tejido y sumergir en fijador (formol al 10%) durante 2-4 días a temperatura ambiente (RT).
    4. Parafina esto incorporar la mitad de la córnea herida utilizando técnicas estándar.
      Nota: Oriente la córnea herida para asegurar que el seccionamiento de tejido va a producir un corte transversal de la córnea.
  2. Immunostaining usando 3, 3'-diaminobenzidina (DAB)
    1. Día 1
      1. Etiqueta desliza correctamente utilizando un lápiz. La paraffinize el tejido mediante la colocación de diapositivas en un tarro con clearing agent (2 cambios, 10 minutos cada uno).
      2. Rehidratar el tejido mediante la transferencia de los portaobjetos en etanol en disminución de las concentraciones (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 minutos para cada cambio).
      3. Realizar recuperación de antígeno por microondas los portaobjetos en un recipiente de plástico con tampón de citrato (10 mM, pH 6.4) durante 5 minutos. Primer ciclo 5 minutos al 50% de potencia. Llenar la jarra con tampón citrato y repita. Enfriar durante 10 minutos.
      4. Lavar 3 veces con PBS, 2 minutos cada uno. Permeabilizar el tejido con el 1% Tritón X-100 en PBS 10 min a RT. bloque secciones con 3% de suero de cabra normal (NGS) por 1 h a temperatura ambiente en cámara húmeda.
      5. Incubar con el anticuerpo primario del tejido (1: 100 o como lo indica el proveedor) en 3% NGS durante la noche a 4 ° C (300 μL).
    2. Día 2
      1. Enjuague las diapositivas 3 x con SAFT (PBS más el 1% Tween 20), 2 minutos cada uno. Coloque los portaobjetos en el 3% H2O2 durante 10 min bloquear peroxidasa endógena. Lavar 3 x con SAFT, 2 minutos cada uno. Incubar las secciones con anticuerpo secundario HRP (1: 250) en 3% NGS por 1 h a temperatura ambiente (300 μL).
      2. Lavar los portaobjetos 3 x PBST, 2 minutos cada uno. Tratar el portaobjetos con el kit DAB. Añadir 300 μL/diapositiva 3 min lavado diapositivas con dH2O 2 x (dips rápidos).
      3. Contratinción con hematoxilina de 20 s. lavado el carro con dH2O 2 x (dips rápidos). Mancha con agente azulado para enjuague s. 20 dH2O 20 s. tejido de deshidratar colocando las diapositivas en aumentar las concentraciones de etanol (50%, 70%, 100%, 100%, todos dips rápidos).
      4. Seque el portaobjetos sobre una toalla de papel debajo de la campana durante 10-20 min.
      5. Montar el portaobjetos con 1 gota de montaje media, cubierta con cubreobjetos. Etiquetar y almacenar a TA.
      6. Los portaobjetos en un microscopio de la imagen y cuantificar la señal DAB con ImageJ7 (ver sección 4).
  3. Inmunotinción: fluorescencia
    1. El día 1 siga los pasos descritos en el paso 2.2.1. Realice los pasos siguientes en el día 2.
    2. Enjuague las diapositivas 3 x en SAFT durante 2 minutos. Incubar las secciones con el anticuerpo secundario etiquetado fluoróforo en 3% NGS (1: 200) por 1 h a TA.
    3. Lavar 3 x en SAFT, 2 minutos cada uno. Montar el portaobjetos con 1 gota de 4′, medios de montaje 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y cubra con un cubreobjetos. Seco en la toalla de papel debajo de la cubierta para la tienda de 30 min en la oscuridad a 4 ° C hasta la proyección de imagen de fluorescencia.
  4. Cuantificación utilizando Image J
    1. Descargar la versión de "Fiji" de ImageJ, que incluye los plugins necesarios para DAB la cuantificación de la coloración.
    2. Abrir una imagen en Fiji y seleccione imagen → colores → deconvolución de Color.
    3. Seleccione "H DAB" como la mancha y a continuación, haga clic en Aceptar. Aparecen tres nuevas imágenes. Seleccione la imagen que contiene sólo DAB tinción.
    4. Para cuantificar stromal coloración solamente, utilice la función de borrador ImageJ para eliminar el epitelio de la imagen DAB.
    5. Seleccione analizar → medida (o Ctrl + M) y el valor.

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Representative Results

Inmunohistoquímica es el principal análisis utilizado para analizar el éxito de la ex vivo herida curativo experimento. Figura 4 muestra el epitelio y el estroma anterior en tejido de control (Figura 4A, 4B). Seis horas después de herir, el epitelio estaba ausente (figura 4, 4D). Seis días después de la herida como se esperaba, el epitelio había vuelto a crecer (figura 4E, 4F). Este tejido fue immunostained para la actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA), la expresión que caracteriza a miofibroblastos. Hay un aumento dramático en immunostaining de α-SMA en el estroma como detectados por colorimétrico sustrato DAB. También hubo un aumento en la reactividad epitelial que puede sugerir EMT transición7 (véase la discusión). Desorganización en el epitelio y el estroma era evidente. Un experimento hirió a menor aumento y con inmunotinción fluorescente en lugar de DAB se muestra (figura 4, 4 H). El margen de la herida es visible así como un gradiente de miofibroblastos activos de anterior a posterior tejido conectador.

Aunque marcadores fibróticos se expresan por una semana (figura 4), para lograr un desarrollo consistente y confiable de marcadores fibróticos, fue elegido un punto de tiempo de dos semanas. En la figura 5 demuestra un análisis mediante una aplicación única de control o siRNA gene targeting a probarse para promover la curación regenerativa. En este caso, el siRNA dirigidos a fue para USP10, un deubiquitinase. Myofibroblasts patológica demostró una adhesión aumentada mediante la acumulación de αv-integrinas en adherencias focales21. Nuestros estudios anteriores demostraron que αvβ1 y αvβ5 son integrinas fibróticas importantes en curación stromal córnea7. Las integrinas unen ECM fuera de la célula y juntos se internalizan. La integrina internalizada es ubiquitinated y enviado para su degradación en el lisosoma o la etiqueta ubiquitina se retira por un deubiquitinase (DUB) y la integrina es reciclada a la superficie de la célula. Hemos descubierto que un aumento en la expresión génica de la copia (USP10) incrementó la tasa de eliminación de ubiquitina de la subunidades de integrinas β1 y β5 conduce a una acumulación resultante de αv/β1/β5, en la superficie celular, con posterior activación de TGFβ y la inducción de marcadores fibrótica7. Caída de USP10 en cultura de órgano córneo previene la aparición de marcadores fibrótica7. En la figura 5se muestra un ejemplo de estos resultados. Como arriba, α-SMA es utilizada como un marcador de miofibroblastos. Otro indicador de cicatrización es fibronectina-EDA (FN-EDA), una variante del empalme del FN que contiene una RGD, αv integrina vinculante dominio22,23,24. También se le llama celular FN (c-FN). Sirve como un marcador clave fibrótico ya que FN-EDA no es en la circulación de plasma pero en cambio sólo expresada y secretada por las células bajo condiciones fibróticas25. En la figura 5A-5C immunostaining para α-SMA se muestra. Comparado con unwounded (figura 5A), hiriendo además siRNA control (figura 5B) demostró un aumento dramático en la expresión de la proteína α-SMA, mientras que además de USP10 siRNA7 dramáticamente redujeron la expresión en el tejido conectador y epitelio. Asimismo, comparado con unwounded (figura 5), hiriendo además siRNA control (figura 5E) demostró un aumento dramático en la expresión de la proteína fibronectina-EDA en comparación con el tratamiento con USP10 siRNA (figura 5F). Immunohistology para la proteína diana (en este caso, USP10) fue utilizado para demostrar éxito caída7. Además, la realización de qRT-PCR puede asegurar knockdown de genes en el tejido o análisis de otros marcadores fibrótica7. ImageJ puede utilizarse para cuantificar la señal en el tejido conectador sólo o total (figura 5). Córneas al menos 3 para cada condición ensayada deben utilizarse para cuantificar immunostaining para generar significación estadística como hemos demostrado aquí y publicado previamente7. Otras proteínas que se han utilizado habitualmente para marcadores fibróticos son expresión de colágeno III y un aumento en la expresión de integrina1,26.

En la figura 6, se demuestra el uso de ex vivo cultura de córnea como un análisis de Toxicología. En este experimento, las córneas eran izquierda permaneceran (figura 6A), herido (Figura 6B), o herido y tratadas con 10 μm 1 Spautin27, que fue agregado a los medios de cultivo celular para aumentar los períodos de tiempo antes de lavado hacia fuera ( Figura 6-6F). Spautin-1 es una droga que apunta no específicamente USP1027. Debido a nuestro éxito con USP10 siRNA, Spautin tratamiento fue probado para la efectividad en la prevención de marcar con una cicatriz. A diferencia de lo siRNA, Spautin en esta concentración era tóxico para el tejido. Aumentar el tiempo con Spautin-1 en la cultura prevenir re-epithelialization y dio lugar a muerte celular cualitativo, matriz desorganizada y vacuolas stromal sugiriendo que Spautin-1 no promueve la curación en la concentración de ensayarse. Análisis histológicos estándar pueden ser empleados para cuantificar la proliferación celular o apoptosis.

Figure 1
Figura 1 : Sección transversal de un ojo humano con una visión ampliada de la córnea. En primates y pollos, histológicamente hay cinco distintas capas: epitelio, de Bowman membrana, tejido conectador, de Decement y endotelio28,29. En el resto de los mamíferos, membrana de Bowman no está visible histológico. Nivel transmisión electrón microscópico, se observa una membrana basal separa el epitelio corneal y estroma en córneas todos los con la membrana de Bowman incluidos. Membrana un Bowman intacta o la membrana basal separa el epitelio del estroma es necesaria para evitar la cicatrización en todos los mamíferos. Imagen reimpreso con permiso de AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Diagrama de los eventos celulares que conducen a la cicatrización de la córnea. Este diagrama representa los acontecimientos básicos que se desarrollan en la córnea anterior después de herir. (A) representación del epitelio, membrana basal, estroma y las células quiescentes encajadas el estroma, es decir, queratocitos. ()B) el triángulo rojo representa una herida, que puede ser mecánica, úlcera, virus o infección persistente. (C) después de herir, en que es violada de Bowman o membrana basal, las células alrededor de la herida apoptose. (D y E) la afluencia de células repoblar la herida de keratocytes residente o fibroblastos derivadas de la médula ósea y de transición en fibroblastos activados o directamente en miofibroblastos. Myofibroblasts patológicas (F) estas adherente crea un bucle autocrino de la activación de TGFβ y la secreción de matriz fibrótica desorganizada que promueve la formación de opacidades y cicatrices corneal. En una herida curada re-generativa, miofibroblastos aparecen pero tienen apoptosed en el tejido curado6,29,30. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3 : Recepción y procesamiento de corneas para cultivo. (A) cerdo ojos reciben con tapas para proteger la córnea durante el transporte. (B) imagen del mundo después de que se extirpa el tejido. (C) imagen de un trépano de 6 mm. Herir (D) de la córnea central con un trépano. (E) imagen de la córnea montada después del retiro del globo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Tejido de la córnea después de herir a. Análisis Immunohistological de unwounded (control) o córneas heridas. Córneas de cerdo fueron dejadas unwounded (control) o heridas. Las secciones de tejido immunostained con anticuerpos de la actinia alfa-lisa del músculo (α-SMA) para identificar miofibroblastos. (A y B) Control, permaneceran. (C y D) heridos y fijo en 6 h poste-herir. Epitelio es quitado (flecha). (E y F) heridos y fijo en 6 días la herida. Estroma se suplieron y el epitelio ha vuelto a crecer (cabeza de flecha). Representante de miofibroblastos activados son denotados con asteriscos (*). (G, H) Imágenes de aumento de α-SMA immunostaining de baja 2 semanas después de la herida: α-SMA (rojo), DAPI (azul). Imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia/brightfield vertical con una cámara CCD. Barra de escala = 100 μm (A, C, E); 50 μm (B, D, F); 200 μm (G, H). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Pruebas de agentes curativos regeneradores. Córneas de cerdo eran (A y D) permaneceran (control), (B y E) heridos y trataron con siRNA control, o (C y F) heridos y trataron con siRNA USP10. Immunostaining para (A-C) α-SMA o (D-F) fibronectina-EDA. Después del tratamiento con USP10 siRNA, α-SMA se redujo en 2,2 ± 0.6 veces *** p < 0.001 y FN-EDA 3.3 ± 1.2 veces ** p < 0.01. Imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia/brightfield vertical con una cámara CCD. Barra de escala = 50 μm. (G) córnea stromal de tinción como cuantificados mediante ImageJ. Significancia estadística se calculó ANOVA unidireccional con la prueba de Bonferroni. Figura ha sido adaptada con permiso de Gillespie et al7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6 : Prueba de agentes para efectos de reepitelización - estudios de Toxicología. Immunostaining para α-SMA. Córneas de cerdo fueron permaneceran (A) y (B) heridos. (C-F) Córnea se hirió y se incubaron con el μm 10 Spautin-1. El inhibidor era lavado y sustituido por los medios de comunicación después de (C) 2 días, (D) 4 días, (E) 6 días, (F) 14 días. Todos los cambios de los medios de comunicación durante el período de incubación incluyen Spautin como se indica. Todas las córneas eran fijos y embebidas en parafina después de 2 semanas en la cultura. Imágenes fueron capturadas utilizando un microscopio de fluorescencia/brightfield vertical con una cámara CCD. Barra de escala = 50 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Este protocolo describe un modelo para el estudio de la cicatrización de heridas en un entorno 3D estratificado natural. Uso de cultivo como intermediario entre la cultura de célula y estudios in vivo reduce significativamente los costos, así como reducir procedimientos en animales vivos. Otros modelos 3D han sido de gran beneficio para el campo, incluyendo la síntesis de geles de colágeno de fibroblastos corneales humanas primaria2 o estas mismas células embebidas en geles de colágenos origen animal31. El sistema de modelo de cultivo de órganos es particularmente útil para las pruebas de supuestos agentes curativos ya que la herida está localizada y así hay un margen claro entre herido y no heridos el tejido en la córnea mismo (figura 4). Además, una herida de trépano mecánica permite acceso directo al estroma, que es excelente para la administración de siRNAs en la herida (figura 5). Aunque no se muestra aquí, la transducción viral en tejido corneal en cultura de órgano también ha sido demostrada32,33,34. Otra permutación de este ensayo sería infectar las córneas con una construcción de reportero de la expresión génica interés e imagen en tiempo real después de herir. En cuanto a la traducción para estudios in vivo, este mismo procedimiento puede realizarse en conejos35 y así la cultura de órganos humanos, cerdo, o córneas de conejo pueden ser comparadas con resultados en vivo. En nuestra experiencia, los datos que se obtuvieron con el modelo de cultura órgano de tratamiento siRNA se traducen similares resultados en vivo (datos no publicados). Las córneas de cultura órgano carecen de una vasculatura funcional limbal, lágrimas y humor acuoso, cada investigador debe evaluar si se trata de un modelo útil para sus estudios. Residente activación de células inmunes se ha demostrado, pero la URL exacta para estudios in vivo no está todavía claro1.

Un paso clave en el Protocolo no debe penetrar la córnea por herir demasiado profundamente. Esto será evidente como el líquido de la cámara anterior se derramará en este caso. Si esto ocurre, el globo debe ser desechado. Para producir una herida incluso mecánica, el labio del tejido demarcado dentro del área del allograft con una pinza de agarre y mueva la cuchilla quirúrgica paralela a la superficie corneal para cortar el tejido dentro de los límites de la trepanación de la herida. La superficie corneal no debe secarse así que recomendamos que después de hacer la herida y cortar la córnea del globo, colocar la cara córnea abajo en PBS hasta que la mezcla de agar está a la temperatura correcta. Asegurándose de que el agar no está demasiado caliente se evite el daño endotelial.

Una limitación de este modelo es que el uso de un trépano para producir una herida es irregular y no puede ser reproducido idénticamente de córnea a córnea comparado con heridas inducidas por láser36. Sin embargo, naturalmente las heridas que ocurren no son todos equivalentes en profundidad y un gran cuerpo de datos sugieren que cualquier brecha en la membrana del sótano genera desarrollo de miofibroblastos y haze en el estroma, mientras que la regeneración de la membrana del sótano conduce a disminuye cicatrices37,38,39. Este modelo de cultura órgano córnea de cerdo emplea una herida severa en la que se retira la membrana basal dentro de la zona del trépano. Desarrollo de miofibroblastos y marcadores fibróticos en el estroma corneal han sido constantemente y reproducibilidad alcanzada usando este sistema de modelo. Algunos tinción epitelial es generalmente evidente que oscurece en el epitelio herido y vuelto a crecer. Esto ha sido demostrado en otros órganos córnea cultura informes40 pero está ausente en la mayoría de córneas de en vivo ratón y conejo estudios41,42. Sin embargo, un estudio realizado en un modelo canino in vivo demostraron a fuerte α-SMA epitelial, manchas en el epitelio después hiriendo a43. El siRNA que promueve curación regenerativa en nuestros estudios también significativamente reducida esta inmunotinción epitelial, lo que sugiere que el epitelio puede ser sometido a EMT (cicatrización fibrótica) cuando regrows en cultura de órgano. Además, omisión de un anticuerpo primario en el protocolo de tinción de una córnea herido resultaron en la ausencia total de tinción7 lo que sugiere que el immunostaining específico. Las secciones congeladas (no mostradas) fueron similares a las secciones de parafina en este sentido. Sin embargo, porque el fondo leve pero variable, manchas en el epitelio, nuestro laboratorio ha cuantificado sólo la tinción estromal, que parece sin fondo histológico temas7.

Si heridas córneas humanas, obtener córneas no utilizadas para trasplante en lugar de globos completos puede ser más rentable40. En este caso, la córnea se va herida sin la ayuda de la presión por el mundo. Estrategias heridas adicionales pueden incluir quemaduras de córneas, que se han utilizado extensivamente en vivo para producir una cicatriz42.

En Resumen, las ventajas de este sistema para un ensayo de cicatrización de tejido 3D es su reproducibilidad y ahorro de costes con las necesidades de equipos estándar, lo que es un excelente recurso para observar y cuantificar los efectos de agentes en tejido de cicatrización.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por NEI NIH R01 EY024942, investigación para prevenir la ceguera, Upstate médica Universidad Libre fondos de investigación, y leones distrito 20-Y. microscopía y análisis de imágenes de secciones de la parafina se realizaron en el centro de microscopía y preparación de los portaobjetos histológico fue realizado en el biorepositorio y la base de la patología en la Facultad de medicina de Icahn en el Monte Sinaí.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

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References

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Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

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