Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Ex Vivo sårheling hornhinde orgel kultur Model for undersøgelser

Published: February 15, 2019 doi: 10.3791/58562
Automatic Translation
*1, *2, 1
1Department of Ophthalmology, SUNY Upstate Medical University, 2Department of Dermatology, Columbia University Medical Center
* These authors contributed equally

Summary

En protokol til en ex vivo hornhinde orgel kultur model nyttigt for sårheling undersøgelser er beskrevet. Denne modelsystem kan bruges til at vurdere virkningerne af agenter til at fremme regenerativ heling eller lægemiddeltoksicitet i en organiseret 3D flercellede miljø.

Abstract

Hornhinden er blevet brugt flittigt som et modelsystem til at studere sårheling. Evnen til at generere og udnytte primære pattedyrsceller i to-dimensionelle (2D) og tre-dimensionelle (3D) kultur har genereret et væld af oplysninger ikke blot om hornhinde biologi, men også om sår healing, myofibroblast biologi, og ardannelse i almindelighed . Målet med protokollen er en assay system til kvantificering af myofibroblast udvikling, der kendetegner ardannelse. Vi demonstrere en hornhinde orgel kultur ex vivo model ved hjælp af gris øjne. I denne forreste keratectomy sår, såret hornhinder stadig i verden med en cirkulær blade kaldes en trephine. Et stik af ca 1/3 af den forreste hornhinden er fjernet, herunder epitel, basalmembranen og den forreste del af stroma. Efter såret, er hornhinder skåret fra hele kloden, monteret på et kollagen/agar base og kulturperler i to uger suppleret serum gratis medium med stabiliseret vitamin C at forøge celleproliferation og ekstracellulære matrix sekretion af hjemmehørende fibroblaster. Aktivering af myofibroblasts i den forreste stroma er tydelig i helede hornhinden. Denne model kan bruges til at analyse sår lukning, udvikling af myofibroblasts og fibrotisk markører og til toksikologiske undersøgelser. Derudover kan virkningerne af lille molekyle hæmmere samt lipid-medieret siRNA Transfektion for gen knockdown testes i dette system.

Introduction

Ardannelse i hornhinden som følge af skade, traume eller infektion kan føre til invaliderende opaciteter og permanent synstab. Der er således et kritisk behov for at identificere veje, der kan målrettes for terapeutisk intervention. Nuværende behandlingsmuligheder er begrænset og består primært af cornea transplantationscentre, som ikke er tilgængelige for patienter i hele verden. Både menneskelige (figur 1) og animalske hornhinder kan udnyttes til 2D og 3D cellekultur studier1,2. Menneskelige Kadaver hornhinder ikke egnet til transplantation kan fås fra øjet banker eller centraliseret vævsbanker (nationale sygdom forskning Interchange (NDRI)), og dyrs øjne kan fås fra et slagteri. Primære hornhinde epitelceller, stromale fibroblaster og mere for nylig, endotelceller, kan isoleres og kulturperler fra disse væv for sårheling og toksikologiske undersøgelser3,4,5. Ud over betydningen af forståelse af det molekylære grundlag af blændende øjensygdom, gjort adgangen til væv og evnen til at kultur primærelementer hornhinden en vigtig modelsystem for undersøgelse. Hornhinden er ideel til at teste virkningerne af agenter på ardannelse som normale hornhinden er gennemsigtig og visse typer af sår oprette opaciteter eller fibrotisk ar (gennemgik i6). Flere i vivo hornhinde sår healing modeller har også udnyttet flittigt for ardannelse undersøgelser1. Mindre udnyttede har været i ex vivo hornhinde sår healing model7,8 der er beskriver i detaljer her. Målet med denne metode er at kvantificere ardannelse resultater karakteriseret ved fibrotisk beslutningstagere i en 3D flercellede hornhinde ex vivo modelsystem.

Hornhindens epitel sårede, der ikke overstiger den epitel basalmembranen normalt lukker inden for 24-72 h9. Snart efter sårede starte celler på kanten af epitel spredning og overflytning i epitelial gratis overfladen, for at genoprette epitel barriere funktion. Denne aktivitet er sekventielt efterfulgt af aktivering af cornea basalcelle spredning først, og i en senere fase, forløber celler beliggende på ydre limbal zone at opnå tilbagebetaling af epitelcelle masse10,11. Disse sår helbrede ofte uden ardannelse. Dog resulterer et sår, der trænger ind basalmembranen i stroma ofte i ar dannelse1. Efter hornhindens stroma sårede, er stroma befolket med celler af flere oprindelse herunder differentierede bosiddende stromale celler samt knoglemarv-afledte fibrocytes12,13,14. Fibrotisk ardannelse er karakteriseret af persistens af myofibroblasts i en helbredende såret. Disse patologiske myofibroblasts vise øget friktion gennem akkumulering af integriner i fokale sammenvoksninger, kontraktile α-glat-muskel aktin (α-SMA) stress fibre og lokal aktivering af ekstracellulære matrix (ECM)-afsondret latent-omdanne vækst faktor-beta (TGFβ). Differentiering af epitel-afledte celler, kendt som epitelial mesenchymale overgangen (EMT), kan også bidrage til at ar dannelse6.

Der er en hårfin balance mellem Celledifferentiering og apoptose efter såret. På grund af brud i basalmembranen, vækst faktorer såsom Trombocyt-afledt vækst faktor (PDGF) og TGFβ fra tårer og epitel bade stroma, inducerende myofibroblast differentiering, en vedvarende autocrine løkke i TGFβ aktivisering, og den sekretion af uorganiseret fibrotisk ECM15,16. Persistens af myofibroblasts i det helede sår fremmer haze og ardannelse i hornhinden (figur 2). Dog i regeneratively helede sår selvom myofibroblasts udvikle, de apoptose og dermed er fraværende eller væsentligt reduceret i antal i de helbredt væv (gennemgik i reference6,10). Forskning på fibrotisk ardannelse har således fokuseret i det mindste delvis på målretning molekyler, der forhindrer overdreven myofibroblast udvikling eller myofibroblast persistens17,18. Fordi myofibroblast persistens kendetegner både ardannelse og fibrotisk sygdom i alle væv19, kan hornhinden være nyttig som et modelsystem til at studere almindelige cellulære mekanismer af fibrose.

I vores modelsystem, er hornhinden såret med en cylindrisk kniv kaldet en trephine mens stadig i verden. Menneskelige og gris hornhinder kan blive såret med enten en 6 eller 7 mm trephine; for kanin hornhinder foretrækkes en 6 mm trephine. Gris hornhinden er nogenlunde samme størrelse som den menneskelige hornhinden. Fordi de er omkostningseffektive og let tilgængelige i stort tal, er svin hornhinder rutinemæssigt anvendes for orgel kultur. Derudover har antistoffer og siRNAs gjort at reagere med menneskelige konsekvent cross-reacted med gris7. Efter at have såret, hornhinder er skåret fra hele kloden med limbus intakt og monteret på en agar/kollagen base. Hornhinder er kulturperler i serumfrit media plus stabiliseret vitamin C for at simulere fibroblast spredning og ECM deposition20. Hverken tilsætning af serum eller vækstfaktorer er nødvendige for at fremkalde myofibroblast dannelse7. Hornhinder er rutinemæssigt fast og forarbejdet til histologi efter to ugers kultur. Gen knockdown eller afprøve virkningerne af en agent for sårheling, såret kan behandles med siRNA i såret efter såret7 eller en opløselig agent kan føjes til medierne, henholdsvis8.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. orgel kultur

  1. Præparater
    1. Forberede agar løsning som følger. I en lille kolbe, forberede 1% agar og 1 mg/mL bovine kollagen i DMEM-F12 op til 20 mL. Bring i kog på en varm tallerken. Sætte løsningen i en 50 mL konisk slange. Sted rør i et vandbad på en varmeplade til at holde løsningen fra solidifying.
    2. Forberede suppleres med serum-gratis medier (SSFM) pr sammensætning fremgår af Tabel af materialer.
      Bemærk: Den nødvendige mængde af SSFM til at være forberedt, afhænger af antallet af hornhinder skal behandles. Normalt er 30 mL nok medier for 4 hornhinder.
  2. Dissektion
    Bemærk: Udføre dette trin i en dissektion hætte eller en kemisk hætte. Øjnene er afsendt med låg stadig fastgjort i enkelte poser til at beskytte glober.
    1. Fjerne glober fra låg med en straight-kant kirurgiske kniv på en ethanol-rengjort skærebræt. Fjern overskydende fedtvæv fra øjet ved hjælp af enten en kniv eller en lille saks (figur 3A, 3B).
    2. Efter fjerner verden af låget, holde kloden posteriort med pincet og straks dyp øjet i fosfatbufferet saltopløsning (PBS). Hurtigt dyppe den 3 x i 10% jod (i et 100 mL baegerglas). Hurtigt dyp 2 x i PBS (~ 100 mL i et bægerglas, ændre PBS ofte).
    3. Bruge et rent håndklæde eller væv, wrap øjet circumferentially med nok pres for at få en stram hornhindens overflade til at skære med trephine.
      Bemærk: sørge for at forhindre håndklæde eller væv fra at kontakte hornhinden.
  3. Såret
    1. Bruge en 6 mm trephine til sår i midten af hornhinden. Trænge ind i epitel og anterior stroma uden at foretage en fuld-tykkelse sår gennem hele hornhinden.
      Bemærk: Hvis endotelet er trængt, ses et tab af pres og lækkende væske. I dette tilfælde skal øjet kasseres.
    2. Placere trephine i midten af hornhinden, drej det 180° med uret og mod uret 5 x (hver gang retningen ændres vil det tælle som én gang) mens lys pressionsmiddel til at uddybe sår.
      Bemærk: Såret bør nu være dybt nok til at tillade en væv flap ophæves ved hjælp af et par pincet. Hvis dette ikke er tilfældet Gentag trin 1.3.2.
    3. Løft flappen fra kanterne. På samme tid, enten med anden hånden eller med en anden person, brug en klinge, skære parallelt med kloden til at skære væk væv pincet fortsætte til løft af forreste hornhinden inden såret margen. Ved afslutningen af dette skridt bør der en cirkulær sår beliggende midt i hornhinden (Se figur 3 C, 3D).
  4. Opskæring og fjernelse af hornhinden fra hele verden
    1. Holde øje med væv, gør et lille snit 1 mm fra kanten af hornhinden med en kniv så limbus er inkluderet i kulturen, orgel.
    2. Ved hjælp af små, skarpe saks adgang snit lavet i det forudgående trin til at skære rundt om i verden, mens en millimeter margen i hele hornhinden at holde limbus intakt.
    3. Placer hornhinden i en 60 mm fad med 1 mL PBS, sår side ned indtil montering.
  5. Montering
    1. Sørg for agaren er kommet til en varm temperatur (ca. 25 ° C).
    2. Med to par pincet, skal du oprette en kop ved holder to sider af hornhinden med i endothelial side. Tilføje varmet op agar løsning i hornhinden ved hjælp af en steril overførsel pipette, indtil den er fuld.
    3. Efter agaren hærder (normalt omkring 30-45 s) omhyggeligt flip hornhinden med agaren i 60 mm plade (figur 3). Dæk med et låg.
  6. Inkubation
    1. Tilsættes 4 mL af SSFM på pladen, opretholde hornhinder på en luft-flydende interface ved den limbal grænse i 5% CO2 ved 37 ° C. Opdatere media efter 24 timer og derefter hver anden dag.
      Bemærk: Hvis udfører en Transfektion ind i såret, Udelad antibiotika indtil efter Transfektion.
    2. Våd hornhindens overflade én gang dagligt ved at tilføje 1 dråbe af SSFM fra konditioneret medierne i fadet til at opretholde fugt. For dette, tage parabol ud af rugemaskinen, placere den under kølerhjelmen, fjerne parabol låg, våd overflade med medier fra fad med en steril pipette, dække igen og sætte det tilbage i inkubatoren.
    3. Gen knockdown, behandle såret med gen-targeting eller styre siRNA, der er kompleksbundet til et lipid-medieret luftfartsselskabet ifølge leverandørens anvisninger (se nedenfor).
    4. Mix 5 µL (50 pmol) af siRNA i 50 µL af nedsat serum minimum essential medier (fx., Opti-MEM). Bland 2 µL af Transfektion reagens i 50 µL af nedsat serum medier. Lad denne sidde i 5 min. og derefter blande dem.
    5. Tilføje 200 µL af nedsat serum minimum medier til reagens/siRNA blanding.
    6. Afpipetteres dråbevis på såret og Inkuber i 3 h.
    7. Udviske siRNA fra hornhindens overflade med medier i fadet. Ændre inkubation medier til SSFM + antibiotika (Se Tabel af materialer). Fortsætte inkubation som nævnt tidligere (trin 1.6.1-1.6.2).

2. histologi: Paraffinsnit og immunfarvning

  1. Forberede væv
    1. Efter en to-ugers inkubation, hvis bruger nogle af væv for kvantitative realtid polymerase kæde reaktion (qRT-PCR) analyse, før fastsættelse, halveret hornhinden gennem såret. Placer denne halv eller kun ¼ (enten er nok væv) til stabiliserende RNA-beskytte reagens.
    2. Brug en standard isolering kit, isolere RNA og udføre qRT-PCR.
      Bemærk: Alternativt, den sårede del kun kan være isoleret og testet for genekspression.
    3. Placer den anden halvdel af hornhinden i væv patologi kassetter og nedsænkes i fiksativ (10% formalin) for 2-4 dage ved stuetemperatur (RT).
    4. Paraffin embed dette halvdelen af sårede hornhinden ved hjælp af standardteknikker.
      Bemærk: Orientere den sårede hornhinden for at sikre, at væv skæring vil producere et tværsnit af hornhinden.
  2. Immunfarvning ved hjælp af 3, 3'-diaminobenzidine (DAB)
    1. Dag 1
      1. Label glider korrekt ved hjælp af en blyant. De paraffinize væv ved at placere dias i en krukke med clearing agent (2 ændringer, 10 min).
      2. Rehydrere væv ved at overføre diasene til ethanol ved faldende koncentrationer (100%, 100%, 70%, 50%, dH2O, dH20, 5 min til hver ændring).
      3. Udføre antigen hentning af mikrobølgeovn dias i en plastik krukke med citratbuffer (10 mM, pH 6.4) i 5 min. Første cyklus 5 min på 50% strøm. Refill krukke med citratbuffer og Gentag. Køle ned til 10 min.
      4. Vask 3 x med PBS, 2 min. Permeabilize væv med 1% Triton X-100 i PBS 10 min. ved RT. blok sektioner med 3% normal ged serum (NGS) til 1 h i RT i fugtigt kammer.
      5. Inkuber væv med primær antistof (1: 100 eller som leverandøren antyder) i 3% NGS natten over ved 4 ° C (300 µL pr. dias).
    2. Dag 2
      1. Skyl dias 3 x med PBST (PBS plus 1% Tween 20), 2 min. Placer dias i 3% H2O2 til 10 min til at blokere endogent peroxidase. Vask 3 x med PBST, 2 min. Inkuber sektioner med HRP sekundær antistof (1:250) i 3% NGS for 1 h i RT (300 µL pr. dias).
      2. Vaske dias 3 x PBST, 2 min. Behandle dias med DAB kit. Tilføje 300 µL/dias i 3 min. Skyl dias med dH2O 2 x (hurtig dips).
      3. Counterstain med hæmatoxylin for 20 s. vask dias med dH2O 2 x (hurtig dips). Pletten med blånelse agent for 20 s. skylles i dH2O for 20 s. Dehydrate væv ved at placere glider ind i stigende koncentrationer ethanol (50%, 70%, 100%, 100%, alle hurtig dips).
      4. Tør dias på et stykke køkkenrulle under kølerhjelmen for 10-20 min.
      5. Montere dias ved hjælp af 1 dråbe montering medier, dække med coverslip. Etiket og butik på RT.
      6. Billede dias under et mikroskop og kvantificere DAB signal med ImageJ7 (Se afsnit 4).
  3. Immunfarvning: fluorescens
    1. Følg trin, der beskrives i trin 2.2.1 på dag 1 . Udfør følgende trin på dag 2.
    2. Skyl dias 3 x i PBST for 2 min. Inkuber sektioner med fluorophore-tagged sekundær antistof i 3% NGS (1:200) i 1 time på RT.
    3. Vask 3 x i PBST, 2 min. Montere dias ved hjælp af 1 dråbe 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) montering medier og dække med en coverslip. Tørre på køkkenrulle under kølerhjelmen i 30 min. butik i mørke ved 4 ° C indtil fluorescens billeddannelse.
  4. Kvantificering ved hjælp af billede Jørgensen
    1. Download "Fiji" version af ImageJ, som indeholder de nødvendige plugins til DAB farvning kvantificering.
    2. Åbne et billede i Fiji og vælg Image → farve → farve Deconvolution.
    3. Vælg "H DAB" som pletten og klik derefter på OK. Tre nye billeder vises. Vælg det billede, der indeholder kun DAB farvning.
    4. For at kvantificere stromale farvning kun, skal du bruge funktionen ImageJ Viskelæder til at fjerne epitel fra DAB billede.
    5. Vælg analysere → foranstaltning (eller Ctrl + M) og optage værdien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Immunhistokemi er den primære assay udnyttet til at analysere succesen af ex vivo sår healing eksperiment. Figur 4 viser epitel og anterior stroma i kontrol væv (figur 4A, 4B). Seks timer efter sårede, var epitel fraværende (figur 4 c, 4 D). Seks dage efter såret som forventet, havde epitel regrown (figur 4E, 4F). Dette væv var immunostained for alpha-glat muskel aktin (α-SMA), udtryk som præger myofibroblasts. Der er en dramatisk stigning i α-SMA immunfarvning i grønkornets stroma, som registreres af kolorimetriske DAB substrat. Der var også en stigning i epitelial reaktivitet, som kan tyde EMT overgang7 (Se diskussionen). Uorganiseret i epitel og stroma var tydeligt. En såret eksperiment ved lavere forstørrelse og med fluorescerende immunfarvning i stedet for DAB er vist (figur 4 g, 4 H). Såret margen er synlige samt en graduering af aktive myofibroblasts fra den forreste til bageste stroma.

Selvom fibrotisk markører er udtrykt ved en uge (figur 4), for at få sammenhængende og pålidelig udvikling af fibrotisk markører, blev en to-ugers tidspunkt valgt. I figur 5 fremgår en analyse ved hjælp af en engangs anvendelse af kontrol eller gen-targeting siRNA skal testes for fremme af regenerative healing. I dette tilfælde var den målretning siRNA for USP10, en deubiquitinase. Patologisk myofibroblasts påvist øget friktion gennem akkumulering af αv-integriner i fokale sammenvoksninger21. Vores tidligere undersøgelser viste, at αvβ1 og αvβ5 er vigtige fibrotisk integriner i hornhindens stroma helbredende7. Integriner binde ECM uden for cellen og sammen de er internaliseret. Den internaliseret integrin er ubiquitinated og sendt til nedbrydning i lysosomet eller ubiquitin tag er fjernet af en deubiquitinase (DUB) og integrin er genanvendt til cellens overflade. Vi opdagede, at en forøgelse af genekspression af DUB (USP10) steg antallet af ubiquitin fjernelse fra integrin underenheder B1 og β5 fører til en deraf følgende ophobning af αv/B1/β5 på celleoverfladen, med efterfølgende TGFβ aktivering og induktion af fibrotisk markører7. Knockdown af USP10 i cornea orgel kultur forhindret fremkomsten af fibrotisk markører7. Et eksempel på disse resultater er vist i figur 5. Som udnyttes ovenfor, α-SMA som markør for myofibroblasts. En anden indikator for ardannelse er fibronektin-EDA (FN-EDA), en splejsning variant af FN, der indeholder en M.H.T., αv integrin bindende domæne22,23,24. Det kaldes også cellulære FN (c-FN). Det tjener som centrale fibrotisk markør, da FN-EDA i cirkulerende plasma, men i stedet ikke er kun udtrykt og udskilles af celler under fibrotisk betingelser25. I figur 5A- er5 C immunfarvning for α-SMA vist. I forhold til unwounded (figur 5A), sårede plus control siRNA (figur 5B) viste en dramatisk stigning i α-SMA protein udtryk, der henviser til, at tilsætning af USP10 siRNA7 dramatisk reduceret udtryk i stroma og epitel. På samme måde demonstreret i forhold til unwounded (fig. 5 d), sårede plus control siRNA (figur 5E) en dramatisk stigning i fibronektin-EDA protein udtryk i forhold til behandling med USP10 siRNA (figur 5F). Immunohistology for target proteinet (i dette tilfælde, USP10) blev brugt til at påvise succes knockdown7. Derudover kan udfører qRT-PCR forsikre gen knockdown i vævet eller også til assay for andre fibrotisk markører7. ImageJ kan bruges til at kvantificere signal i stroma kun eller samlede signal (figur 5 g). Mindst 3 hornhinder for hver betingelse testes bør anvendes til at kvantificere immunfarvning for at generere Statistisk signifikans, som vi har vist her og tidligere udgivet7. Andre proteiner, der har været rutinemæssigt udnyttede fibrotisk markører er kollagen III udtryk og en stigning i integrin udtryk1,26.

I figur 6, er brug af ex vivo hornhinden kultur demonstreret som en toksikologi assay. I dette eksperiment, hornhinder var enten venstre unwounded (figur 6A), sårede (figur 6B), eller såret og behandles med 10 µM Spautin-127, som blev tilføjet til celle kultur medier for at øge perioder før vask ud ( Figur 6 c-6F). Spautin-1 er et stof, der ikke specifikt er rettet mod USP1027. På grund af vores succes med USP10 siRNA, blev Spautin behandling testet for effektivitet i forebyggelsen af ardannelse. I modsætning til siRNA var Spautin ved denne koncentration giftige for væv. Øget tid med Spautin-1 i kultur forhindret re epithelialization og resulterede i kvalitative celledød, uorganiseret matrix og stromale vacuoles tyder på, at Spautin-1 ikke fremmer heling ved den koncentration, der analyseres. Standard histologiske assays kan anvendes til at kvantificere celledelingen eller apoptose.

Figure 1
Figur 1 : Tværsnit af et menneskeligt øje med en udvidet visning af hornhinden. I primater og kyllinger, histologisk er der fem forskellige lag: epitel, Bowmans membran, stroma, Decements membran og endotelet28,29. I alle andre pattedyr er Bowmans membran ikke synlige histologisk. På transmissions elektron mikroskopisk plan observeres en basalmembran adskiller hornhindens epitel og stroma i alle hornhinder, herunder dem med en Bowman membran. En intakt Bowman membran eller basalmembranen adskille epitel fra stroma er nødvendigt at forhindre ardannelse i alle pattedyr. Billede genoptrykt med tilladelse fra AllAboutVision.com (http://www.allaboutvision.com/resources/cornea.htm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Diagram over de cellulære begivenheder, der fører til hornhinden ardannelse. Dette diagram viser de grundlæggende begivenheder, der udfolder sig i den forreste hornhinden efter såret. (A) skildring af epitel, basalmembranen, stroma og inaktiv cellerne indlejret i stroma, dvs., keratocytes. ()B) den røde trekant skildrer et sår, som kan være mekanisk, et mavesår, virus eller vedvarende infektion. (C) efter sårede, i som Bowman eller basalmembranen overtrædes, cellerne omkring såret apoptose. (D og E) en tilstrømning af celler repopulate sår fra hjemmehørende keratocytes eller knoglemarv-afledte fibroblaster og overgangen til aktiveret fibroblaster eller direkte til myofibroblasts. (F) disse tilhænger patologiske myofibroblasts oprette en autocrine loop af TGFβ aktivering og sekretion af uorganiseret fibrotisk matrix, der fremmer hornhinde haze og ar dannelse. I et regeneratively helede sår, myofibroblasts vises, men har apoptosed i helede væv6,29,30. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Modtagelse og behandling af hornhinder for orgel kultur. (A) gris øjne modtages med låg til at beskytte hornhinden under forsendelse. (B) billede af kloden efter væv er fjernet. (C) Image af en 6 mm trephine. (D) Wounding af centrale hornhinden med en trephine. (E) billede monteret hornhinden efter fjernelse fra hele kloden. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Hornhindevæv efter sårede. Immunohistological analyse af unwounded (kontrol) eller sårede hornhinder. Gris hornhinder blev enten efterladt unwounded (kontrol) eller såret. Væv sektioner var immunostained med antistof til alpha-glat muskel aktin (α-SMA) til at identificere myofibroblasts. (A og B) kontrol, unwounded. (C og D) såredes og fastsat til 6 h post såret. Epitel er fjernet (pil). (E og F) såredes og fastsat til 6 dage efter såret. Stroma har udfyldt og epitel har regrown (pil hovedet). Repræsentative aktiveret myofibroblasts er markeret med stjerner (*). (G, H) Lav forstørrelse billeder af α-SMA immunfarvning 2 uger efter såret: α-SMA (rød), DAPI (blå). Billeder blev fanget ved hjælp af en opretstående fluorescens/brightfield mikroskop med en CCD kamera. Skalalinjen = 100 µm (A, C, E); 50 µm (B, D, F); 200 µm (G, H). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Test regenerativ helbredende agenter. Gris hornhinder var enten (A og D) unwounded (kontrol), (B og E) såret og behandles med kontrol siRNA, eller (C og F) såret og behandles med USP10 siRNA. Immunfarvning for (A-C) α-SMA eller (D-F) fibronektin-EDA. Efter behandling med USP10 siRNA, α-SMA blev reduceret med 2,2 ± 0,6 gange *** p < 0,001 og FN-EDA 3,3 ± 1,2 fold ** p < 0,01. Billeder blev fanget ved hjælp af en opretstående fluorescens/brightfield mikroskop med en CCD kamera. Skalalinjen = 50 µm. (G) hornhindens stroma farvning som kvantificeres ved ImageJ. Statistisk signifikans blev beregnet ved en-vejs ANOVA med Bonferroni's test. Figur er blevet tilpasset med tilladelse fra Gillespie et al.7. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Test agenter for effekter på reepithelialization - toksikologiske undersøgelser. Immunfarvning for α-SMA. Gris hornhinder var (A) unwounded og (B) såret. (C-F) Hornhinden blev såret og inkuberes med 10 µM Spautin-1. Hæmmer blev vasket ud og erstattet af medierne efter (C) 2 dage, (D) 4 dage, (E) 6 dage, (F) 14 dage. Alle medieændringer under inkubationstiden inkluderet Spautin som angivet. Alle hornhinder var fast og indlejret i paraffin efter 2 uger i kultur. Billeder blev fanget ved hjælp af en opretstående fluorescens/brightfield mikroskop med en CCD kamera. Skalalinjen = 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol beskriver en model for at studere sårheling i en stratificeret 3D natur. Brug af orgel kultur som en mellemting mellem cellekultur og in vivo-undersøgelser reducerer omkostninger samt reducere procedurer på levende dyr. Andre 3D modeller har været til stor gavn for feltet herunder selv syntetisere kollagen geler fremstillet af primære menneskelige hornhinde fibroblaster2 eller disse samme celler der er indlejret i geler fremstillet af dyr-afledte collagens31. Orgel kultur modelsystem er særligt nyttige til at teste formodede helbredende agenter, da såret er lokaliseret og der er således en tydelig margen mellem såret og ikke-såret væv i den samme hornhinden (figur 4). Desuden giver et mekanisk trephine sår direkte adgang til stroma, som er fremragende til administration af siRNAs ind i såret (figur 5). Selvom det ikke er vist her, har viral transduktion i hornhindevæv i orgel kultur også været påvist32,33,34. En anden permutation af denne analyse ville være at inficere hornhinder med en reporter konstruktion af interesse og billede genekspression i realtid efter såret. Med hensyn til oversættelse af in vivo-undersøgelser, denne samme procedure kan ske i kaniner35 og dermed orgel kultur på menneskelige, gris eller kanin hornhinder kan sammenlignes med in vivo resultater. Vores erfaring, har de data, vi opnået med orgel kultur model med siRNA behandling oversat til lignende resultater i vivo (ikke-offentliggjorte data). Da orgel kultur hornhinder mangler en funktionel limbal Vaskulaturen, tårer og vandig humor, skal hver investigator vurdere hvis dette vil være en nyttig model for deres studier. Hjemmehørende aktivering af immunceller er blevet påvist, men den nøjagtige parallel til in vivo-undersøgelser er endnu ikke klart1.

Et vigtigt skridt i protokollen er ikke at trænge hornhinden ved såret for dybt. Det vil være indlysende, da den forreste kammer væske vil sive i dette tilfælde. Hvis dette sker, skal kloden kasseres. For at producere et endda mekanisk sår, greb læbe af afgrænsede væv inden for det trephined område med en forcep og derefter flytte den kirurgiske kniv parallel med hornhindens overflade til at skære væv væk inden for grænserne af de trephine sår. Hornhindens overflade bør ikke tørre ud, hvilket vi anbefaler, at efter at såret og skære ud hornhinden fra hele kloden, placere hornhinden ansigtet ned i PBS, indtil agar blandingen er på den korrekte temperatur. Og sørg for, at agaren ikke er for varmt vil undgå endotel skader.

En begrænsning af denne model er at brugen af en trephine til at producere en såret er ujævn og kan ikke gengives ens fra hornhinden at hornhinden i forhold til laser-induceret sår36. Dog naturligt forekommende sår er ikke alle tilsvarende i dybde og et stort antal data tyder på, at ethvert brud i basalmembranen genererer myofibroblast udvikling og haze i stroma, mens regenerering af basalmembranen fører til reduceret ardannelse37,38,39. Denne gris hornhinde orgel kultur model beskæftiger en alvorlig såret som basalmembranen er fjernet inden for trephine. Udvikling af myofibroblasts og fibrotisk markører i hornhindens stroma har været konsekvent og reproducerbarhed opnået med denne modelsystem. Nogle epitelial farvning er normalt tydeligt der bliver mørkere i såret og regrown epitel. Det er blevet påvist i andre hornhinde orgel kultur rapporter40 men er fraværende i de fleste hornhinder fra i vivo mus og kanin undersøgelser41,42. Dog, en undersøgelse foretaget i en in vivo canine model demonstreret stærk epitelial α-SMA farvning i epitel efter sårede43. Den siRNA, der fremmes regenerativ healing i vores undersøgelser også betydeligt reduceret denne epitelial immunfarvning, tyder på, at epitel kan være under EMT (fibrotisk ardannelse) Hvornår det regrows i orgel kultur. Derudover resulterede udeladelse af en primær antistof i farvning protokollen for en såret hornhinden i den totale mangel på farvning7 tyder på, at immunfarvning er specifikke. Frosne sektioner (ikke vist) var ligner paraffin afsnit i denne henseende. Men fordi den lille men variable baggrund farvning i epitel, vores lab har kun kvantificeret stromale farvning, som synes at have nogen baggrund histologiske spørgsmål7.

Hvis såret menneskelige hornhinder, kan at opnå hornhinder ikke anvendes til transplantation i stedet for fuld glober være mere omkostningseffektiv40. I dette tilfælde vil hornhinden blive såret uden hjælp af presset af kloden. Yderligere såret strategier kan omfatte hornhinde burns, som har været flittigt udnyttet in vivo til at producere en scar42.

Sammenfattende er fordele ved dette system for et 3D væv sårheling assay sin reproducerbarhed og omkostninger besparelser med kun standard udstyr behov, hvilket gør det en fremragende ressource til at observere og kvantificere virkninger af agenter på væv healing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af NIH-NEI R01 EY024942, forskning for at forebygge blindhed, Upstate medicinske universitet ubegrænset forskningsmidler, og Lions distrikt 20-Y. mikroskopi og billedanalyse af paraffinsnit blev udført kernen mikroskopi og histologiske dias forberedelse blev udført på Biorepository og patologi CORE på Icahn School of Medicine på Mount Sinai.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Gibco 10-010-023
Pen Strep  MP Biomedicals 91670049
Bovine Collagen Solution Advance Biomatrix 5005
Pig eyes with lids attached  Pel-freeze, Arkansas N/A
6.0 mm trephine  Katena K28014
Surgical Blade  Personna 0.009
Small scissor Fisher 895110
Forceps Fisher 08953-F
Kim Wipes  Kimberly-Clark™ 34120 06-666
60 mm cell culture dishes  Falcon 08-772B
Supplemented Serum- Free media (SSFM) Add all of the following components to DMEM/F-12:  ITS, RPMI, Glutathione, L-Glutamine, MEM Non essential amino acids, MEM Sodium Pyruvate, ABAM, Gentamicin, Vitamin C. 
DMEM/F-12 Gibco 11330
ITS Liquid Media Supplement  Sigma I3146 100X
RPMI 1640 Vitamins Solution  Sigma R7256 100x
Glutathione Sigma G6013 Use at 1 µg/mL. Freeze aliquots; do not reuse after thawing.
1% L-glutamine solution  Gibco 25030-081 100x
MEM Non-essential amino acids solution  Gibco 11140 100x
MEM Sodium pyruvate solution  Gibco 11360 1 M Stocks (1,000x) and freeze in single use aliquits.  Use from freezer each time media is made.
ABAM  Sigma A7292 100x
Gentamicin  Sigma 30-005-CR 200x
Vitamin C  Wako 070-0483 2-0-aD Glucopyranosyl-Ascorbic Acid. 1 mM stocks (1000x)
10% Iodine  Fisher Chemical SI86-1
Tissue Path Cassettes  Fisher 22-272416
Normal Goat Serum (NGS) Jackson Immuno Research 005-000-121 We use 3% NGS
Mounting Media  Thermo Scientific TA-030-FM
Safe Clear  Fisher 314-629
Ethyl Alcohol Ultra Pure 200CSGP 200 Proof, diluted at 100%, 70%, 50%) 
Sodium citrate  Fisher BP327 10 mM, pH 6.4
Hematoxylin EMD Millipore M10742500
Bluing agent  Ricca Chemical Company 220-106
1% Triton X-100 Fisher 9002-93-1 Diluted in PBS
0.1% Tween 20  Fisher BP337 Diluted in PBS
3% Hydrogen Peroxide  Fisher H324
DAB Kit  Vector Laboratories SK-4100
Agar  Fisher  BP1423-500 Agar solution: prepare 1% agar and 1 mg/mL bovine collagen in DMEM-F12 up to 20 mL
Parafilm Bermis 13-374-12
Moist Chamber Use any chamber, cover it with wet Wipe Tissue and then put a layer of Parafilm over it.
Lipofectamine 2000
Qiagen RNAprotect Cell Reagent Qiagen  76104
Ambion PureLink RNA Mini Kit Thermo Scientific 12183018A
Anti-Fibronectin-EDA Antibody Sigma F6140 1:200 Diluted in  3% normal goat serum
Anti-alpha smooth muscle actin Antibody Sigma A2547 or C6198 (cy3 conjugated) 1:200 Diluted in 3% normal goat serum
Permafluor  Thermo Scientific TA-030-FM
DAPI  Invitrogen P36931
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, HRP  Invitrogen 62-6520 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for a-SMA, DAB staining)
Gt anti -MS IgM (H+L) Secondary Antibody, HRP  Thermo Scientific PA1-85999 1:100 diluted in 3% normal goat serum (for FN-EDA, DAB staining)
Gt anti -MS IgG (H+L) Secondary Antibody, Cy3  Jackson Immuno Research 115-165-146 1:200 Diluted in  3% normal goat serum (for a-SMA, Fluorescence staining)
 Zeiss Axioplan2  Zeiss Microscope
SPOT-2 Diagnostic Instruments, Sterling Heights, Michigan CCD camera

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stepp, M. A., et al. Wounding the cornea to learn how it heals. Experimental Eye Research. 121C, 178-193 (2014).
  2. Karamichos, D., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Transforming growth factor-beta3 regulates assembly of a non-fibrotic matrix in a 3D corneal model. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 5 (8), e228-e238 (2011).
  3. Ronkko, S., Vellonen, K. S., Jarvinen, K., Toropainen, E., Urtti, A. Human corneal cell culture models for drug toxicity studies. Drug Delivery and Translational Research. 6 (6), 660-675 (2016).
  4. Bernstein, A. M., Twining, S. S., Warejcka, D. J., Tall, E., Masur, S. K. Urokinase receptor cleavage: a crucial step in fibroblast-to-myofibroblast differentiation. Molecular Biology of the Cell. 18 (7), 2716-2727 (2007).
  5. Zhu, Y. T., et al. Knockdown of both p120 catenin and Kaiso promotes expansion of human corneal endothelial monolayers via RhoA-ROCK-noncanonical BMP-NFkappaB pathway. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (3), 1509-1518 (2014).
  6. Shu, D. Y., Lovicu, F. J. Myofibroblast transdifferentiation: The dark force in ocular wound healing and fibrosis. Progress in Retinal and Eye Research. 60, 44-65 (2017).
  7. Gillespie, S. R., Tedesco, L. J., Wang, L., Bernstein, A. M. The deubiquitylase USP10 regulates integrin beta1 and beta5 and fibrotic wound healing. Journal of Cell Science. 130 (20), 3481-3495 (2017).
  8. Yang, Y., et al. TRPV1 potentiates TGFbeta-induction of corneal myofibroblast development through an oxidative stress-mediated p38-SMAD2 signaling loop. PLoS One. 8 (10), e77300 (2013).
  9. Sta Iglesia, D. D., Stepp, M. A. Disruption of the basement membrane after corneal debridement. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (5), 1045-1053 (2000).
  10. Ljubimov, A. V., Saghizadeh, M. Progress in corneal wound healing. Progress in Retinal and Eye Research. 49, 17-45 (2015).
  11. Echevarria, T. J., Di Girolamo, N. Tissue-regenerating, vision-restoring corneal epithelial stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 7 (2), 256-268 (2011).
  12. Wilson, S. E., Mohan, R. R., Hong, J. W., Lee, J. S., Choi, R. The wound healing response after laser in situ keratomileusis and photorefractive keratectomy: elusive control of biological variability and effect on custom laser vision correction. Archives of Ophthalmology. 119 (6), 889-896 (2001).
  13. Zieske, J. D., Guimaraes, S. R., Hutcheon, A. E. Kinetics of keratocyte proliferation in response to epithelial debridement. Experimental Eye Research. 72 (1), 33-39 (2001).
  14. Lassance, L., Marino, G. K., Medeiros, C. S., Thangavadivel, S., Wilson, S. E. Fibrocyte migration, differentiation and apoptosis during the corneal wound healing response to injury. Experimental Eye Research. 170, 177-187 (2018).
  15. Jester, J. V., Ho-Chang, J. Modulation of cultured corneal keratocyte phenotype by growth factors/cytokines control in vitro contractility and extracellular matrix contraction. Experimental Eye Research. 77 (5), 581-592 (2003).
  16. Gallego-Munoz, P., et al. Effects of TGFbeta1, PDGF-BB, and bFGF, on human corneal fibroblasts proliferation and differentiation during stromal repair. Cytokine. 96, 94-101 (2017).
  17. Hinz, B., Gabbiani, G. Fibrosis: recent advances in myofibroblast biology and new therapeutic perspectives. F1000 Biology Reports. 2, 78 (2010).
  18. Lagares, D., et al. Targeted apoptosis of myofibroblasts with the BH3 mimetic ABT-263 reverses established fibrosis. Science Translational Medicine. 9 (420), (2017).
  19. Hinz, B. Formation and function of the myofibroblast during tissue repair. Journal of Investigative Dermatology. 127 (3), 526-537 (2007).
  20. Karamichos, D., Guo, X. Q., Hutcheon, A. E., Zieske, J. D. Human corneal fibrosis: an in vitro model. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (3), 1382-1388 (2010).
  21. Henderson, N. C., et al. Targeting of alphav integrin identifies a core molecular pathway that regulates fibrosis in several organs. Nature Medicine. 19 (12), 1617-1624 (2013).
  22. Muro, A. F., et al. An essential role for fibronectin extra type III domain A in pulmonary fibrosis. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 177 (6), 638-645 (2008).
  23. Shinde, A. V., et al. The alpha4beta1 integrin and the EDA domain of fibronectin regulate a profibrotic phenotype in dermal fibroblasts. Matrix Biology. 41, 26-35 (2014).
  24. White, E. S., Muro, A. F. Fibronectin splice variants: understanding their multiple roles in health and disease using engineered mouse models. IUBMB Life. 63 (7), 538-546 (2011).
  25. Walraven, M., Hinz, B. Therapeutic approaches to control tissue repair and fibrosis: Extracellular matrix as a game changer. Matrix Biology. , (2018).
  26. Rosenbloom, J., Ren, S., Macarak, E. New frontiers in fibrotic disease therapies: The focus of the Joan and Joel Rosenbloom Center for Fibrotic Diseases at Thomas Jefferson University. Matrix Biology. 51, 14-25 (2016).
  27. Liu, J., et al. Beclin1 controls the levels of p53 by regulating the deubiquitination activity of USP10 and USP13. Cell. 147 (1), 223-234 (2011).
  28. Ritchey, E. R., Code, K., Zelinka, C. P., Scott, M. A., Fischer, A. J. The chicken cornea as a model of wound healing and neuronal re-innervation. Molecular Vision. 17, 2440-2454 (2011).
  29. DelMonte, D. W., Kim, T. Anatomy and physiology of the cornea. Journal of Cataract & Refractive Surgery. 37 (3), 588-598 (2011).
  30. Wilson, S. E., et al. Epithelial injury induces keratocyte apoptosis: hypothesized role for the interleukin-1 system in the modulation of corneal tissue organization and wound healing. Experimental Eye Research. 62 (4), 325-327 (1996).
  31. Miron-Mendoza, M., Graham, E., Kivanany, P., Quiring, J., Petroll, W. M. The Role of Thrombin and Cell Contractility in Regulating Clustering and Collective Migration of Corneal Fibroblasts in Different ECM Environments. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (3), 2079-2090 (2015).
  32. Saghizadeh, M., et al. Adenovirus-driven overexpression of proteinases in organ-cultured normal human corneas leads to diabetic-like changes. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 262-272 (2010).
  33. Saghizadeh, M., Kramerov, A. A., Yu, F. S., Castro, M. G., Ljubimov, A. V. Normalization of wound healing and diabetic markers in organ cultured human diabetic corneas by adenoviral delivery of c-Met gene. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 51 (4), 1970-1980 (2010).
  34. Kramerov, A. A., Saghizadeh, M., Ljubimov, A. V. Adenoviral Gene Therapy for Diabetic Keratopathy: Effects on Wound Healing and Stem Cell Marker Expression in Human Organ-cultured Corneas and Limbal Epithelial Cells. Journal of Visualized Experiments. (110), e54058 (2016).
  35. Cho, S. Y., Kim, M. S., Oh, S. J., Chung, S. K. Comparison of synthetic glues and 10-0 nylon in rabbit lamellar keratoplasty. Cornea. 32 (9), 1265-1268 (2013).
  36. Sharma, A., Mehan, M. M., Sinha, S., Cowden, J. W., Mohan, R. R. Trichostatin a inhibits corneal haze in vitro and in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 50 (6), 2695-2701 (2009).
  37. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Torricelli, A. A., Santhanam, A., Wilson, S. E. Corneal Molecular and Cellular Biology for the Refractive Surgeon: The Critical Role of the Epithelial Basement Membrane. Journal of Refractive Surgery. 32 (2), 118-125 (2016).
  38. Marino, G. K., Santhiago, M. R., Santhanam, A., Torricelli, A. A. M., Wilson, S. E. Regeneration of Defective Epithelial Basement Membrane and Restoration of Corneal Transparency After Photorefractive Keratectomy. Journal of Refractive Surgery. 33 (5), 337-346 (2017).
  39. Marino, G. K., et al. Epithelial basement membrane injury and regeneration modulates corneal fibrosis after pseudomonas corneal ulcers in rabbits. Experimental Eye Research. 161, 101-105 (2017).
  40. Janin-Manificat, H., et al. Development of ex vivo organ culture models to mimic human corneal scarring. Molecular Vision. 18, 2896-2908 (2012).
  41. Mohan, R. R., et al. Apoptosis, necrosis, proliferation, and myofibroblast generation in the stroma following LASIK and PRK. Experimental Eye Research. 76 (1), 71-87 (2003).
  42. Anumanthan, G., et al. KCa3.1 ion channel: A novel therapeutic target for corneal fibrosis. PLoS One. 13 (3), e0192145 (2018).
  43. Chandler, H. L., Colitz, C. M., Lu, P., Saville, W. J., Kusewitt, D. F. The role of the slug transcription factor in cell migration during corneal re-epithelialization in the dog. Experimental Eye Research. 84 (3), 400-411 (2007).

Tags

Medicin spørgsmål 144 hornhinden ardannelse fibrose Myofibroblast Ex vivo orgel kultur
Ex Vivo sårheling hornhinde orgel kultur Model for undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Castro, N., Gillespie, S. R.,… More

Castro, N., Gillespie, S. R., Bernstein, A. M. Ex Vivo Corneal Organ Culture Model for Wound Healing Studies. J. Vis. Exp. (144), e58562, doi:10.3791/58562 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter