Summary
Qui presentiamo una tecnica di iniezione intratecale diretto utilizzo 1% lidocaina cloridrato in una soluzione virale per garantire una consegna efficiente virus adeno-associato ai piccoli animali e stabilire un sistema di scoring per predire l'efficienza di trasduzione in zona centrale sistema nervoso secondo il grado della debolezza transitoria indotta da lidocaina.
Abstract
Iniezione intratecale (IT) di virus adeno-associato (AAV) ha attirato notevole interesse nella terapia genica CNS in virtù della sua sicurezza, invasività ed eccellente trasduzione efficacia nello SNC. Precedenti studi hanno dimostrato la potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da essa amministrazione. Tuttavia, sono stati segnalati alti tassi di guasto imprevedibile a causa dei limiti tecnici di amministrazione IT nei piccoli animali. Qui, abbiamo stabilito un sistema di scoring per indicare la misura del successo della puntura lombare in piccoli animali con l'aggiunta di 1% lidocaina cloridrato nella soluzione di iniezione. Più ulteriormente indichiamo che l'estensione della debolezza transitoria dopo l'iniezione può prevedere l'efficienza di trasduzione di AAV. Così, questo metodo di iniezione IT può essere utilizzato per ottimizzare le prove terapeutiche in modelli murini di malattie del SNC che affliggono vaste regioni del SNC.
Introduction
AAV possono mediare l'espressione genica a lungo termine e diffuso nella trasduzione del CNS con pochi effetti collaterali e quindi è diventato uno dei veicoli più promettenti per la terapia genica per il trattamento di malattie del SNC tra cui la sclerosi laterale amiotrofica (ALS), Huntington malattia di s (HD), morbo di Alzheimer (annuncio), malattie da accumulo lisosomiale (LSD), malattia di Gaucher (GD) e Lipofuscinosi ceroido (NCL)1. Attualmente, più di 100 AAV sierotipi sono stati isolati dagli esseri umani e animali. Tra questi, almeno 12 sono stati utilizzati in studi preclinici e clinici, tra cui i più comunemente utilizzati vettori del gene come AAV1, 2, 4, 5, 6, 8, 9, rAAVrh.8 e rAAVrh.101,2,3,4, 5,6.
Diverse malattie del SNC richiedono diverse strategie di consegna AAV a causa delle varie regioni colpite CNS e tipi di cellule. Le regioni dello SNC e la cella tipi che possono trasdurre AAV varia a seconda del sierotipo così come il metodo di consegna. Ad esempio, rAAVrh10 è stato indicato di trasdurre principalmente astrociti quando consegnato da iniezione sistemica per via endovenosa (IV), considerando che esso trasdotte sia i neuroni e cellule gliali quando consegnato dall'iniezione intratecale4,7. Inoltre, parenchima iniezione ha provocato nella trasduzione del locale alla vicinanza del sito di iniezione, mentre iniezione nel fluido cerebrospinale (CSF) attraverso intraventricolare o iniezione intratecale ha provocato diffuso trasduzione del CNS8 . Gli studi hanno anche dimostrato potenza terapeutica della terapia genica AAV-consegnato nei disordini neurodegenerative da esso amministrazione9,10,11. In malattie che colpiscono vaste aree del SNC quali ALS, iniezione intratecale nel CSF è stato indicato per coprire la maggior parte delle aree che sono afflitti dalla malattia con una dose più bassa, rispetto a un metodo di consegna sistemica4,10. Recenti studi hanno inoltre dimostrato che la puntura lombare può essere usata per iniettare AAV in modelli murini per la SLA, che evita potenziali infortuni connessi con laminectomy e intrathecal cateterizzazione4.
Puntura lombare diretta sperimentale fu usata per trasportare gli agenti, soprattutto anestetici, al midollo spinale per analgesia e anestesia in 188512,13. In questo rapporto, illustriamo la puntura lombare metodo di iniezione di IT in topi adulti con l'ausilio di cloridrato di 1% della lidocaina, un anestetico locale di ammide derivata, della soluzione di iniezione per valutare e monitorare la qualità di iniezione. Iniezioni di successo furono segnate da paralisi transitoria indotta da lidocaina, mentre le iniezioni non riuscite non hanno mostrato questo comportamento. Abbiamo classificato il livello di debolezza transitoria come uno dei cinque gradi per contribuire a predire l'efficacia dell'iniezione. Infine, indichiamo che il livello di trasduzione rAAVrh10 può essere previsto per il grado di paralisi. Pertanto, questo metodo di consegna intrathecal AAV può essere utilizzato per migliorare la consegna del gene AAV-mediata per la terapia sperimentale delle malattie del SNC.
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Protocol
Topi FVB/NJ sono stati allevati nella struttura animali di laboratorio chiave di Hebei neurologia. Tutti gli esperimenti del mouse sono stati approvati dal secondo ospedale di Hebei Medical University comitato etico ed effettuati secondo le norme di gestione degli animali di laboratorio promulgata dal Ministero della scienza e della tecnologia della Repubblica popolare di Cina.
1. preparazione della soluzione di riserva di 20% lidocaina cloridrato
- Pesano 2 g di cloridrato di lidocaina. Aggiungere delicatamente 5 – 6 mL di acqua sterile e vortex. Aumentare il volume per un totale di 10 mL con acqua sterile.
- 1.2 filtrare la soluzione attraverso filtri da 0,2 micron. Aliquota della soluzione di riserva, 1ml per microcentrifuga da 1,5 mL tubo e sigillarla con una pellicola sigillante. Conservare a 4 ° C.
2. Intrathecal AAV recapito diretto in topi svegli
- Pulire l'area di lavoro con garza sterile con etanolo al 70% e preparare i rifornimenti necessari, come indicato nella tabella 1.
- Preparare 100 µ l di AAVrh.10/1% lidocaina cloridrato complesso aggiungendo 95 µ l della soluzione di riserva di rAAVrh10 (5 x 1012 genoma copie/mL) in una microcentrifuga sterile a 200 µ l e aggiungere 5 µ l di soluzione madre di 20% lidocaina cloridrato. Miscelare bene pipettando su e giù. Quindi, conservare la soluzione di virus su ghiaccio (4 ° C).
Nota: verrà utilizzato 8 µ l per mouse4 . -
Preparazione della siringa con la soluzione AAV per iniezione
- Assemblare un 25 µ l Hamilton siringa con un ago 27G e allineare la punta smussata dell'ago con la scala volumetrica sulla siringa.
- Aspirare delicatamente 8 µ l con 4 x 1010 copie del genoma della soluzione virus nella siringa. Assicurarsi di rimuovere le bolle d'aria.
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Preparando il mouse
Nota: topi FVB/NJ maschio o femminili (30 – 70 giorni) sono stati usati in questo studio. Iniezione di IT è stato operato nella cappa.- Sterilizzare la zona di lavoro in un cappuccio con etanolo al 70%. Mettere il mouse sveglio (maschi o femminile, 30 – 70 giorni di età, 13 – 20 g di peso) su un bedpiece in posizione prona nella cappa. Coprire la parte superiore del corpo con garza sterile per calmare il mouse ed evitare di essere morso.
- Difficoltà l'animale afferrandolo saldamente e in modo appropriato sulla sua cintura pelvica con un pollice su un lato e l'indice, medio dito su altro lato. Mantenere la pelle tra bilaterali nelle cinture pelviche tese con il pollice e l'indice. Tenere premuto delicatamente sulla parte superiore del corpo dell'animale con il palmo della mano.
- Radere il pelo sul dorso tra il cingolo pelvico bilaterale, quindi sterilizzare la superficie della pelle con un etanolo di macchia e il 70% basato su ioduro.
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Di iniezione intratecale12
- Sentite lo spazio intervertebrale lungo la linea mediana tra il cingolo pelvico bilaterale con un pollice o l'indice di altra mano e premere un rientro con un'unghia per indicare lo spazio intervertebrale L5-L6 (individuare il sito di iniezione).
- Ruotare la base della coda leggermente e delicatamente per indicare la linea mediana della colonna vertebrale. Regolare la smussatura dell'ago verso la testa dell'animale prima dell'iniezione (menzionato al punto 2.3.1).
- Assicurarsi che gli animali sono fissati saldamente e allineare l'ago lungo la linea mediana della colonna vertebrale.
- Inserire l'ago delicatamente e verticalmente (o inclinare leggermente il 70 – 80°) nell'intersezione di rientro e tenere la siringa in un piano sagittale centrale. Ridurre l'angolo di circa 30° lentamente quando si connette l'osso, poi scivolare l'ago nello spazio intervertebrale.
Nota: Un flick evidente coda improvvisa è un segno di successo entrata nello spazio intradural. Una volta che l'ago entra nello spazio intervertebrale, la punta dell'ago si sentirà saldamente fissata. L'ago 27 G utilizzato in questo studio è adatto per la fornitura IT in topi ma non ratti. - Iniettare la soluzione di vettore (indicata nel passaggio 2.2). Avvia il timer e iniettare 8 µ l della soluzione vettoriale ad una velocità di 1 µ l/4 s. Mantieni l'ago circa 1 minuto dopo aver terminato consegna. Ritirare l'ago con una delicata rotazione per evitare perdite.
- Punteggio ottenuto la debolezza transitoria del mouse arti immediatamente dopo il parto per valutare la qualità di iniezione4.
Nota: Lo standard è la seguente4. Punteggio 0: nessuna debolezza; Punteggio 1: minore debolezza degli arti posteriori senza anomalia di andatura; Punteggio 2: moderi la debolezza degli arti posteriori con anomalia di andatura ovvio; Punteggio 3: completare la paralisi degli arti posteriori; Punteggio 4: completa paralisi degli arti posteriori, mancanza di respiro e moderata debolezza degli arti anteriori; e punteggio 5: completa paralisi di tutti e quattro gli arti e la evidente mancanza di respiro. - Spostare il mouse indietro per la gabbia per il recupero da paralisi.
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Pulizia
- Lavare la siringa con 1 mL di acqua sterile. Ordinare le forniture di laboratorio e raccogliere tutti i materiali riutilizzabili per la sterilizzazione in autoclave. Pulire il banco con etanolo al 70%.
3. preparazione per la macchiatura di Immunohistochemical
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Collezione tessuti
- Anestetizzare profondamente topi ad post-iniezione 21 giorni con 3% cloralio idrato (0,1 mL/10g) tramite l'iniezione intraperitoneale.
- Irrorare via con 20 mL di PBS ghiacciata di 0,01 M (NaCl 147 mM; NaH2PO4 1,9 mM; K2HPO4 8,1 mM, pH 7.4) in primo luogo, poi ghiacciata paraformaldeide al 4% (in PBS 0,01 M) con pompa (10 mL/min per 1 min, poi 5 mL/min per 9 min).
Attenzione: Paraformaldeide è cancerogeno e tossico. Gestire solo nella cappa con i guanti.
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Dissezione del midollo spinale e del cervello
- Difficoltà le zampe e la testa di ogni animale in posizione prona su un coperchio di scatola di schiuma con aghi di siringhe, poi striscia e togliere la pelle dalla testa all'osso sacro con le forbici.
- Clip del cranio tra occhi, tagliato lungo l'itinerario centrale del cranio e della linea orizzontale al cervelletto, poi apre il cranio per ogni lato.
- Sollevare l'osso occipital con pinzette e aprire il canale spinale bilateralmente con le forbici oftalmiche. Tagliare le costole su entrambi i lati e togliere delicatamente la metà superiore delle vertebre.
- Sollevare il cervello con le pinzette curve e recidere i nervi della base del cranio, quindi sezionare l'intero cervello e midollo spinale con attenzione. Post-fissare i tessuti in paraformaldeide al 4% per 24 h.
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Preparazione delle fette del tessuto
- Cryoprotect il cervello e midollo spinale cervicale e lombare in soluzione di saccarosio al 30% durante la notte a 4 ° C. Incorpora il tessuto in temperatura di taglio ottimale (OCT) composto e congelare velocemente con azoto liquido.
- Tagliare il tessuto 25 µm utilizzando un criostato e memorizzare le sezioni congelate in PBS 0,01 M a 4 ° C per l'uso.
4. Immunohistochemistry
- Pretrattare digalleggiante sezioni 1% H2O2 per 10 min, poi lavate in PBS per 10 min. Incubare in una soluzione di blocco contenente siero di 5% e 0,3% detergente non ionico in PBS per 1 h.
- Incubare le fette con gli anticorpi primari corrispondenti durante la notte a 4 ° C. Lavare le sezioni in PBST (0,2% Tween 20 in PBS) per 30 min (3 volte per 10 min. ciascuno).
- Incubare le fette con anticorpo di biotina-secondaria corrispondente a temperatura ambiente per 1 h. lavare in PBST per 30 min (3 volte per 10 min. ciascuno).
- Incubare le sezioni con affinità biotina perossidasi complessi per 40 min e macchia con agente achromogenic. Montare i profili sui vetrini e asciugare bene.
- Immergere i vetrini in etanolo anidro per 5 min e xilene per 10 min, quindi sigillare i vetrini con un mezzo di montaggio. Infine, immagine i vetrini con un microscopio equipaggiato con un charge coupled device (CCD) x 100, x 200 e 400 ingrandimenti di x.
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Representative Results
Topi hanno mostrato diversi gradi di debolezza transitoria subito dopo l'iniezione di soluzione AAV in 1% lidocaina cloridrato a causa di varie qualità di iniezione intratecale. Secondo il sistema Punteggio semi-quantitativa di 5-grado abbiamo stabilito, abbiamo testato i modelli di trasduzione di AAV in topi con diversi gradi di debolezza agli arti indotta da lidocaina (Punteggio 0, n = 2; Punteggio 1, n = 1; Punteggio 4, n = 4; Punteggio 5, n = 3). EGFP immunostaining dei midolli spinali hanno mostrato nessun o poco trasduzione nel midollo spinale lombare di topi segnare 0, leggermente migliorata trasduzione in topi segnando 1 e trasduzioni forte e diffusi nei topi segnando 4 o 5 (Figura 1A). Abbiamo quantificato la GFP intensità di quei topi visualizzati da vari gradi di debolezza transitoria (Figura 1B) di colorazione e ha concluso che la severità della debolezza dopo iniezione strettamente correlati con il limite del midollo spinale trasduzione.
Abbiamo ulteriormente esplorato il profilo dettagliato trasduzione del rAAVrh10 nel SNC intero e ho notato che la lunghezza completa del midollo spinale e vaste aree del cervello sono stati ben transduced in topi ben iniettati che avuto un punteggio di 4 o 5. Nel cervello, robusto EGFP segnali sono stati rilevati nel bulbo olfattivo (Figura 2A), la corteccia prefrontale dorsolaterale (Figura 2B), circonvoluzione dentata e zona CA3 dell'ippocampo (figure 2 e 2D), cerebellare corteccia (Figura 2E) e aree marginali del tronco cerebrale compreso nucleo facciale (Figura 2,F), del plesso coroidico e cellule epiteliali ependimali (Figura 2G). Tuttavia, meno cellule di EGFP-positivi sono state rilevate in regioni profonde del cervello. Nel midollo spinale e corna ventrali e dorsali, assoni motori degli effluenti ventrali e dorsali assoni sensoriali benestanti erano fortemente GFP-positive. Motoneuroni nei corni anteriori erano fortemente transduced in diversi livelli del midollo spinale (figure 2 H-2J). Inoltre, sono stati rilevati neuroni GFP-positivi nella corteccia tra cui cellule piramidali (figure 3A e 3B). Vari tipi di cellule glial compreso microglia, astrociti e oligodendrociti, inoltre sono stati trovati per essere EGFP-positivo (figure 3 C-3E).
Figura 1 : Misura di debolezza indotta da lidocaina predice efficienza di trasduzione. AAV con lidocaina 1% o PBS (controllo) è stato iniettato di iniezione diretta di IT. Topi sono stati sacrificati ed esaminati per l'espressione della GFP mediante immunoistochimica 3 settimane più tardi (Punteggio 0, n = 2; Punteggio 1, n = 1; Punteggio 4, n = 4; Punteggio 5, n = 3). (A) GFP macchiatura di cervicale (CSC) e sezioni di midollo spinale lombare (LSC) è mostrata. (B) GFP intensità sia LSC e CSC di colorazione direttamente è stata correlata con il grado della debolezza transitoria. Ogni marchio rappresenta valori (media ± DS) da un mouse. Questa figura è stata adattata da una precedente pubblicazione4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Diffusa trasduzione di rAAVrh10 nel cervello e nel midollo spinale. Bulbo olfattivo (A); (B) corteccia; (C) circonvoluzione dentata4; e (D) CA3 dell'ippocampo; (E) corteccia cerebellare; (F) nucleo facciale; Ventricolo laterale (G); (H) corno anteriore cervicale4; (io) corno anteriore toracica4; e (J) lombare corno anteriore4. Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Trasduzione di vari tipi di cellule nel cervello dopo l'iniezione intratecale diretto rAAVrh10. (A) cellule piramidali; (B) neurone multipolare; (C) delle cellule microgliali; Astrociti (D); e del oligodendrocyte (E). Scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Tecnicamente, ci sono diversi passaggi critici durante l'iniezione di IT in topi svegli. In primo luogo, adeguato controllo gesto e studio dei topi in tutta l'intera operazione è un prerequisito per il recapito corretto. In secondo luogo, il punto più difficile è sentimento lo spazio intervertebrale con la punta dell'ago, come è necessario non inserire troppo profondamente senza resistenza o inserire forzatamente sotto forte resistenza nel caso di ferire gli animali o piegare la punta dell'ago. In terzo luogo, anche se la paralisi transitoria a causa di lidocaina fornisce un indicatore obiettivo per esso qualità iniezione, più pratica è necessario per ottenere risultati coerenti e di successo.
In questo rapporto, abbiamo sviluppato un metodo di iniezione intratecale diretto in topi svegli per la consegna di AAV, in cui lidocaina serve come indicatore per la misura del successo di iniezione IT e come preannunciatore per l'efficienza della terapia genica. Puntura lombare diretta sperimentale fu usata per trasportare gli agenti, soprattutto anestetici, al midollo spinale per analgesia e anestesia, ed è stato altamente raccomandato nella terapia genica per le malattie del SNC. Vista la difficoltà di iniezione IT in piccoli animali come topi, abbiamo combinato le due applicazioni di puntura lombare diretta e ha scelto di anestetici locali (lidocaina, che è stato utilizzato ampiamente nelle cliniche come un indicatore obiettivo di qualità di iniezione valutando paralisi transitoria e ripristinabile). Inoltre, abbiamo definito uno standard per predire l'efficienza del recapito di AAV attraverso livelli di paralisi e confermato che si tratta di immunostaining. Abbiamo dimostrato che gli animali ben iniettati hanno avuti livelli elevati di trasduzione rAAVrh10-EGFP nel SNC in topi adulti.
Rispetto al precedente metodo di consegna intrathecal che coinvolgono l'anestesia profonda della cateterizzazione intrathecal e dell'animale con laminectomia14,15, nostro attuale metodo presenta diversi vantaggi. In primo luogo, la procedura semplice puntura lombare può essere completata in pochi minuti per ciascun animale, considerando che la procedura precedente prende ~ 1 h per animale. In secondo luogo, il metodo corrente non impiegare l'anestesia e la chirurgia e pertanto riduce il rischio di lesioni4. In terzo luogo, tramite l'aggiunta di 1% lidocaina cloridrato per la soluzione AAV, abbiamo istituito un sistema di Punteggio di cinque punti al rango paralisi transitoria dopo l'iniezione e ha dimostrato che il grado della debolezza indotto da lidocaina può essere utilizzato per prevedere l'entità del CNS trasduzione di ogni iniezione. I nostri dati hanno dimostrato che gli animali ben iniettati hanno alti livelli di trasduzione rAAVrh10-EGFP nello SNC di topi adulti. La trasduzione è anche diffusa in simile misura del metodo precedente che coinvolge il laminectomy e intratecale di cateterizzazione. Confrontato con IT esistenti metodi puntura in topi svegli, forniamo un indicatore obiettivo di qualità di iniezione mediante lidocaina ed evitare la cecità a iniezione non riuscita e conseguente interferenza nell'efficacia terapeutica.
Presi insieme, la consegna intrathecal corrente contenente l'1% lidocaina è un metodo di promessa in terapie sperimentali per malattie del SNC fornendo geni o farmaci in topi. Inoltre, è un approccio pratico e conveniente di metterla in pratica l'iniezione in piccoli animali come topi.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata finanziata da una sovvenzione da HEBEI Provinciale Dipartimento delle risorse umane e della previdenza sociale (CY201605) e una sovvenzione dalla Fondazione di Hebei Provincia di scienze naturali (H2017206101), e siamo molto grati al Dr. per Guangping Gao, che hanno fornito l'AAV per Questo studio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FVB/NJ mice | Charles River Laboratories China | ||
| Lidocaine hydrochloride monohydrate | HEOWNS | 73-78-9 | |
| AAV | Viral Vector Core of the Gene Therapy Center at University of Massachusetts Medical School | ||
| 25 µL Hamilton syringe/27-30 G needle | GASTIGHT | 1702 | |
| O.C.T compond | SAKURA | 4583 | |
| H 2O 2 | SHUI HUAN PAI | 170401 | |
| Goat serum | Solarbio | S9070 | |
| Triton X-100 | LIFE SCIENCES | T8200 | |
| Rabbit anti-GFP | Life tech | G10362 | 1:333 dilution |
| The second antibody (goat-anti rabbit) | Jackson Immuno Research | 111-005-144 | 1:1,000 dilution |
| VECTASTAIN ABC REAGENT | Vector Lab | PK-6100 | |
| ImmPACT DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Lab | SK-4105 | |
| Mounting medium for fluorescence with DAPI | Vectorshield | H-1200 | |
| NaCl | Yong Da Chemical | ||
| NaH2PO4·2H2O | Yong Da Chemical | ||
| Na2HPO4·12H2O | Yong Da Chemical | ||
| Paraformaldehyde | Yong Da Chemical | 307699 | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOGLAS | 17083 | 25 mm x 75 mm |
| SUPER-SLIP MICRO-GLAS | Electro Microscopy Siences | 72236-60 | 24 mm x 60 mm |
| 15 mL Centrifuge tube | CORNING | 430790 | |
| 96 well cell culture cluster | Coster | 3599 | |
| 24 well cell culture cluster | Coster | 3524 | |
| 70% Ethanol | WEN ZHI | ||
| Gauze | Wei AN | 05171112 | 8 cm x 10 cm x 12 cm |
| 1 mL syringe | Hong Da | ||
| Microtubes | Plasmed | ||
| Micropipet | eppendorf | ||
| Peppet tips | Rainin | ||
| Centirifuge | eppendorf | 5427R | |
| Regerator | Haier | BCD-539WT | |
| Filter | MILLEX GP | R4PA42342 | |
| Pump | LongerPump | BT-100-2J/YZ1515X | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Freezing-microtome | Leica | CM1520 |
References
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