Summary
该方案为建立和评估7天龄小鼠新生儿败血症提供了必要的步骤。
Abstract
新生儿败血症仍然是一个全球性的负担。需要一个临床前模型来筛选有效的预防或治疗干预措施。通过腹腔内腹腔注射 cecal 浆液到生命中7只小鼠并对其进行监测, 可诱发新生小鼠多药脓毒症。这里介绍了实施这种新生儿败血症模型所需的详细步骤。这包括制作均匀的雪松浆料库存, 将其稀释到重量和垃圾调整剂量, 监测时间表的大纲, 以及用于界定人道终点的观察健康类别的定义。从集合捐献者生成均匀的鲸浆库存, 可以随着时间的推移将其转化为许多垃圾, 从而减少捐献者之间的差异, 并防止使用潜在的毒性甘油。所使用的监测战略可以预测生存结果, 并确定小鼠, 这些结果将在以后发展到死亡, 从而能够更早地确定人道的终点。两个主要的行为特征被用来定义健康得分, 即新生小鼠在背部放置时纠正自己的能力和他们的行动能力。这些标准有可能用于解决其他小鼠新生儿疾病研究中的人道终点问题, 只要进行试点研究以确认准确性。总之, 这种方法提供了一种标准化的方法来模拟小鼠新生儿败血症, 同时提供资源来评估动物福利, 用于定义早期人道终点的受挑战动物。
Introduction
脓毒症是人类新生儿传染性死亡的主要原因1。由于对新生儿败血症的了解甚少, 因此在疾病早期对高危新生儿的鉴定和有效治疗或预防的发展方面进展甚微。这就需要使用败血症的动物模型, 以更好地了解过程并测试可能的干预措施。此外, 成年啮齿类动物对败血症的反应不同, 在获得相同致命剂量 (ld) 的细菌数量上存在统计学显著差异, 与新生儿2相比, 在由此产生的宿主反应上存在差异。因此, 新生儿败血症必须在新生儿中进行研究。几种成人败血症模型已被用于脓毒症的研究。这些措施包括与成人败血症或教会结扎和穿刺 (clp) 中涉及的特定生物体进行静脉注射挑战。clp 是一种内生挑战模型, 在这种模型中, 对肠道进行手术隔离、结扎和穿刺, 以允许肠道内容物泄漏到腹膜, 最终导致微生物及其产品的系统传播 3.然而, 建立 clp 所需的外科手术对新生动物是致命的;因此, 另一种方法是必要的, 以模拟多药挑战的 clp 诱导新生儿败血症。为满足这一需要, 开发了新生儿多药脓毒症的 ecal 浆液模型, 通过该模型, 收获动物的仙人掌含量, 在无菌葡萄糖中悬浮 5% (d5w), 并将腹腔注射到新生小鼠2体内。此后, 这已成为研究新生和成年动物败血症的日益流行的模式, 并在这种疾病的过程中具有相当先进的机械洞察 4、5、6、7 , 8,9,10,11,12, 13, 14,15.
鉴于越来越多地使用这一模式, 而且研究人员希望直接比较各出版物的结果, 有必要在各研究中很好地描述技术方面并使之标准化。标准化适用于模型的三个方面, 即: (一) cecal 浆料库存的制备, (二) 向实验动物注入的挑战的准备, 以及 (三) 人类终点的定义在挑战实验中被认为是非幸存者。具体而言, 制备冰质浆料库存的方法通常参考于介绍模型2的原始文章。该模型的简要总结是, 从成年小鼠的仙人掌内容收集, 悬浮在无菌 d5w 浓度为 80 mg/ml, 并在2小时内注射实验动物。这种原始模型使用了同一年龄的老鼠, 来自同一供应商的地点, 在收获仙人掌之前, 这些老鼠在各自的研究设施中存放不到2周。使用内部饲养的小鼠虽然减少了定期供应商交货的费用, 并允许使用范围更广的性别和年龄的多余小鼠, 但也大大增加了捐助方对捐助方的变异性。这促使了另一种技术的发展, 通过这种技术, 来自多个小鼠的 cecal 含量被汇集在一起, 准备大量的股票, 然后在-80°c13 中被报价和储存。这种替代方法被 14、15 组所采用。然而, 这种适应导致了一些技术上的变化, 无论是在使用的储存介质 (10% 或15% 甘油, 或单独 d5w) 和过滤的策略, 以去除颗粒 (多级过滤通过 860μm, 然后, 190 微米过滤器, 或个别通过100μm 或70μm 过滤器)13,14,15.单独注射甘油可能会造成伤害, 因为 25%-50% 的甘油注射已被用作肾脏损伤的啮齿动物模型 16,17,18,19, 20岁。为避免甘油的意外副作用, 本研究中的小鼠盲肠浆料制剂在 d5w 中冷冻, 不含甘油, 并对在-80°c 储存时的细菌活力进行测试。本研究中使用的过滤策略是通过一个70μm 过滤器, 这还没有直接比较其他过滤策略列出。
注射的 cecal 浆料的致命重量调整剂量可能因设施而异, 应根据单个群体的需要进行滴定。随着不同的挑战剂量, 伴随的挑战量必然会发生变化。然而, 这一方法细节以前没有报告过。此外, 在文献中很少详细阐述标准程序的策略, 如腹腔内注射, 但个别技术可能会影响新生小鼠在注射时是否泄漏并影响其最终结果。
动物福利, 包括人道终点的定义, 是这一模式的一个核心方面, 也是任何啮齿类动物感染和炎症模式 21的核心方面。1998年, 加拿大动物护理委员会 (ccac) 公布了广泛的人道终点选择指南, 将人道终点定义为 "任何实际或潜在的痛苦、苦恼或不适都应通过选择最早的终点来减少或减轻与研究的科学目标兼容的终点 "22。另一些人还告诫说, 必须根据科学的理由, 而不是仅仅根据对动物状态的主观解释21来建立人道的终点。虽然有丰富的资源用于临床、行为和身体条件信号的人性化终点标准, 即使在感染和炎症的背景下, 特别是 21,23, 24, 这些都没有, 包括 ccac 指南的人道终点22, 提到新生小鼠。因此, 客观和科学上合理的人道终点是更难建立的新生动物, 因为他们的行为能力有限, 并缺乏证据的标准, 如减肥, 这是常见的成人小 鼠。目前, 在仙人掌浆文献中, 5 ~ 12天龄新生小鼠使用的人道终点标准都参考了介绍模型2的原稿。在本文的原始研究中, 对新生动物的人文终点的定义基于两个标准;也就是说, 老鼠在鸟巢外的位置 (散射) 和缺乏牛奶斑点被认为在数小时内死亡。在分配一个人道的终点的一个复杂的问题是, 牛奶斑点变得很难看到老鼠菌株与黑暗的毛皮, 如常用的 C57BL/6J 菌株, 在生命的第一周后, 而生病的动物监测, 直到第14天的生活 (dol)。此外, 在应用这些标准时, 可以发现死亡动物的后期挑战 (自己的观察; 未公布);因此, 有必要更严格地界定人道终点, 以减轻实验动物的痛苦, 避免在更早发现结果的情况下死亡。
在一个标准的操作程序中介绍了仙人掌浆模型的所有三个方法学问题, 该方法详细介绍了 cecal 浆料库存的制备, 这是一种注射实验动物的方法, 用于保持注射量在剂量和降低泄漏的风险, 并根据行为建模系统定义7至12天龄的小鼠的人道终点。收集了240多只实验动物的小鼠健康评分的行为信息, 并按最终生存结果进行分组, 展示了一个证据驱动的人道终点定义。实验动物的痛苦通过在尽可能早的时间点识别垂死的新生小鼠而减少, 而通过观察关键变量可以推断具有生物学意义的生存结果。对任何研究脓毒症或新生儿挑战模型动物的群体来说, 对 cecal 浆液制备和新生儿小鼠行为的视觉表现都将是一个很好的资源。
Protocol
该议定书中的所有实验都已得到不列颠哥伦比亚大学动物护理委员会根据 a17-0110 号议定书进行的批准。
1. 工具灭菌
- 在生物安全柜 (bsc) 中, 打开热珠灭菌器并将其预热至 250°c, 使用前至少30分钟。
- 将工具浸入70% 乙醇中。
- 将工具浸入预热的热珠灭菌器中至少1分钟。
注: 工具的手柄将变热, 如果留在热珠消毒器中超过1.5 分钟, 可能会燃烧。 - 用70% 乙醇喷洒一大席纸巾进行消毒。
- 从热珠消毒器中取出工具, 而不将工具的灭菌部分接触到其他浸入水下工具的非无菌手柄上, 并将其放置在喷洒乙醇的纸巾上。
- 等待30秒到 2分钟, 让工具冷却, 然后再使用它们进行解剖。
2. cencal 浆料制备
- 预称15毫升离心管 (每5只老鼠为一管被安乐死)。
- 根据当地动物护理指南或使用以下协议对盲肠浆料捐献者进行安乐死。
注: 6至12周大的多达 40只 c57bl/6j 小鼠被用于 cecal 浆液制备, 每次最多5只小鼠被安乐死。- 将小鼠转移到安乐死室, 并将异氟醚麻醉机放入 5%, 并进行氧气灌注。
- 监测小鼠的移动能力丧失, 看到它们进入麻醉的手术平面, 最后停止呼吸。
- 将鼠标从安乐死室取出, 捏它的爪子, 观察任何腿部收缩或吸入。如果存在其中任何一个, 则将鼠标返回安乐死室; 如果存在, 则将鼠标返回到安乐死室。否则, 请继续。
- 最终通过尖锐的颈椎脱位对小鼠实施安乐死。
- 使用 bsc 中的预灭菌和冷却工具 (见第1节) 进行 cecum 解剖。
- 将鼠标的腿钉在挤出的聚苯乙烯泡沫板上, 使用 23 g 针, 使老鼠的腹部向上。用70% 的乙醇固定腹部, 然后喷洒。
- 使用无菌钳和剪刀, 穿过皮肤, 用剪刀从腹膜衬里放松皮肤, 并切开一个长方形区域, 从腹股沟到胸骨, 从左侧到右侧。从腹膜中取出任何毛皮。
- 切换到一对新的无菌工具, 以切割通过腹膜, 使一个矩形开放, 因为做的皮肤, 切换工具, 如果使用的接触皮肤。
- 识别塞子, 它应该在身体上从左到右运行。破裂的结缔组织, 以识别从肠道的仙人掌分支, 并切断从肠道的仙人掌。将塞康放在经过消毒的称重纸上。
注: 称重纸可以通过在两侧喷洒70% 的乙醇并使其干燥或紫外线照射来消毒。或者, 可在无菌的 petri 板上解剖胎粪。
- 盲肠含量挤出
- 在平衡计分卡中, 使用无菌工具切割出胎粪的两端。
- 用无菌钳将胎粪中央按住, 并使用扁平的无菌金属铲子轻轻将仙人掌内的内容物从切割端推出, 使用滚动运动, 避免可能撕裂上皮的刮擦运动。收集内容物并将其放入预压15毫升离心管中。
- 将最多5只老鼠的仙人掌内的物质含量池入同一根管子中。一旦添加了所有的内容, 再称重管。
注: 预计平均每只小鼠300毫克, 最高390毫克的仙人掌浆, 每只小鼠需要1.8 至2.4 毫升的 d5w 才能重新悬浮;因此, 在此步骤中使用5只以上的小鼠可能会导致15毫升离心管的过量填充。 - 用乙醇喷纸油条擦拭工具, 重复步骤 1.2-1.6 对其进行再消毒。
- 塞卡尔浆料过滤
- 称量充满冰囊内装物的离心管, 并通过将冰囊内装物的重量除以所需的每毫升库存浓度来计算到可得中的 d5w 的含量, 如下面的公式所示。
- 在 bsc 中, 在含有冰囊含量的15毫升离心管中加入所需的冰凉 d5w。
- 将15毫升的离心管垂直和水平旋转 30秒. 检查直径超过1-3 毫米的颗粒, 如果存在, 继续涡旋, 直到所有大颗粒明显消失。
- 将无菌的70μm 细胞过滤器放入放置在冰上的50毫升离心管中。将移液器重新悬浮在细胞过滤器中, 然后进入收集管。通过上下移液2x-3x 重新移出颗粒。轻轻挤压气泡以提高过滤速度, 同时用移液器尖端搅拌内容物, 直到没有更多的液滴被过滤。
注: 混合时, 可能有足够大的颗粒来堵塞5毫升移液器。在这种情况下, 重复从步骤2.5.3 的涡流, 如果溶液仍然没有破裂, 使用移液器将颗粒压在离心管壁上。 - 重复步骤 2.5.4, 在每根冰浆管之间更换细胞过滤器, 并将所有内容物集中到保存在冰上的同一50毫升离心机收集管中, 如果滤液的体积超过冰箱中的冰水平, 则放入第二台50毫升离心管中。
- 称量充满冰囊内装物的离心管, 并通过将冰囊内装物的重量除以所需的每毫升库存浓度来计算到可得中的 d5w 的含量, 如下面的公式所示。
- 将仙人掌浆液。
- 如果适用, 将多个50毫升的塞勒浆料滤液管从一步2.5.5 合并到一个更大的无菌容器 (例如, 1, 000 毫升的储存瓶) 中。然后, 涡旋 15秒, 并将20毫升放入一个新的50毫升离心管。
- 涡旋在50毫升离心管中5-10 的 cecal 浆料库存, 并将500μl 置于三个具有橡胶密封的2毫升低温瓶中, 以防止随着时间的推移蒸发。立即将主库存和上市的低温小瓶放在冰上。
- 重复步骤2.6.1 和 2.6.2, 直到所有的冰囊浆料都已被报价, 每三个低温小瓶后对主库存进行涡流处理, 以防止任何颗粒的沉淀, 并保持均匀的混合物。
- 将仙人掌冷冻。
注: 每个成年小鼠的每只小瓶价格为 500μl, 预计可容纳3至4个小瓶。每个小瓶应该大致足以挑战一个垃圾的八只老鼠在 dol 7。
3. 7天龄新生小鼠脓毒症的挑战
- 分离、识别和称重新生鼠。
- 在 bsc 中, 将新生鼠转移到一个新的笼子里, 以防止老鼠远离大坝, 并减轻对大坝的压力。
- 取下用手套擦拭部分嵌套材料, 将笼子的气味转移到手套上。然后, 将筑巢材料塑造成一个较小的鸟巢, 并将其放置在没有大坝的新笼子中。
- 将新生小鼠转移到新笼子中的筑巢材料中。
- 转移更多的筑巢材料, 使第二个空巢在新的笼子。
- 关闭并将大坝的笼子从引擎盖上取下, 这样大坝就不会因为听到任何新生老鼠的痛苦而受到压力。
- 要在一段时间内跟踪垃圾中的单个新生小鼠, 请使用防乙醇标记标记尾巴前部或背面的1到5个点, 根据需要每12-24小时重新涂抹一次。
- 称重每只会被挑战的老鼠, 称重后将每只老鼠放入次巢, 并对所有老鼠重复此操作。
- 在准备可排浆料挑战之前, 把所有的垃圾送回大坝。
- 使用下面的计算或使用提供的工作表, 分别完成每个垃圾的此步骤, 计算 cecal 浆料的个别重量调整剂量和 d5w 所需的稀释量 (请参阅补充文件)。
- 计算每只老鼠要给其施用的 cecal 浆 (a) 的毫克, 方法是将小鼠的重量 (克 (b) 乘以所需的挑战剂量 (每克小鼠 (c) 的越周液毫克。
- 通过将每只小鼠所需的冰他人浆毫克从步骤 3.2.1 (a) 除以生态囊浆料浓度 (160毫克的仙人掌浆) 来计算微公升微公升虫浆所需的每只小鼠的单个体积每毫升 d5w (e), 并乘以每毫升 1, 000μl, 从毫升转换为微升。
- 平均每只老鼠 (g) 所需的冰体浆的存量, 方法是将每只小鼠的冰体浆量 (d) 除以小鼠 ( n) 的数量。
- 通过将平均注入量 (100μl) 除以每只小鼠所需的仙人掌浆的平均库存量 (g) 来计算 cecal 浆料库存 (h) 的平均稀释系数。
- 计算每只老鼠的特定注入体积, 以微升 (j) 为单位, 方法是将每只老鼠所需的库存 cecal 浆的体积乘以平均稀释系数 (h), 然后将其舍入到最近的十 (以匹配注射注射器的10μl 增量)。
- 通过从平均注入量 (100μl) 中减去平均冰囊浆料库存 (g), 计算 d5w 的平均所需体积, 以稀释冰囊浆料库存 (k)。
- 计算微升 (l) 中的仙人掌浆的总量, 方法是将微升 (g) 中每只小鼠的平均生态浆料乘以这个垃圾中的老鼠数量, 再乘以1.4 以产生额外的。
- 计算稀释冰囊浆料库存所需的 d5w 总量 (m), 将 d5w (k) 的平均所需体积乘以老鼠 (n) 的数量, 乘以1.4 以产生额外的热量。
- 计算每只老鼠要给其施用的 cecal 浆 (a) 的毫克, 方法是将小鼠的重量 (克 (b) 乘以所需的挑战剂量 (每克小鼠 (c) 的越周液毫克。
- 在计算所需的库存教会浆数量 (l从步骤 3.2.7) 后, 准备好挑战。在 bsc 中, 在室温下解冻所需数量的仙人掌浆瓶, 将其内容物移入混合。
- 当解冻的仙人掌浆中没有更多可见的冰晶时, 将计算出的仙人掌浆库存量 (l从步骤 3.2.7) 转移到无菌 1.8 ml 微离心管。
- 通过添加在步骤 3.2.8 (m) 中计算的冰凉 d5w, 稀释到所需的浓度。将挑战的专家存放在冰上。
- 在装载注射器之前, 将微型离心管混合在一起, 将其闪烁 20x, 然后用 500 cc 28 g 半英寸的胰岛素注射器绘制并排出300-500μl 的 cecal 浆料。
- 将大约150μl 稀释的仙人掌浆放入同一注射器中。
- 轻扫注射器, 将气泡从柱塞中取出, 在注射器上稍微向后拉, 然后排出气泡。
- 将多余的仙人掌浆重新分配回微离心管, 直到在注射器中装载了一个小鼠的正确数量的 cecal 浆, 这是为步骤 3.2.5 (j) 中的单个小鼠计算的。
- 根据当地相关动物护理机构的指导原则, 或使用下面概述的步骤, 在腹腔内注射盲肠浆料。
- 在 bsc 中, 将新生鼠与大坝分开, 如步骤3.1 中所述。
- 用拇指和食指用手指擦洗鼠标的后部。
- 将鼠标的尾巴固定在中指和无名指的后部, 或在环和小指的前部。
- 为了最大限度地减少泄漏, 倾斜新生鼠标, 使其朝下, 并插入针斜面对, 在腿和生殖器之间, 保持针浅和皮下。
- 当针插入1厘米时, 向下和向前按压, 感觉针头刺穿腹膜。慢慢地按压柱塞, 保持针头尖端尽可能稳定, 因为侧向运动可能会损坏老鼠的器官。
- 小心地取出针头超过 5-10, 沿着相同的路线出出, 放松中指在去除过程中, 以减少在鼠标的身体紧张。
- 要检查是否有泄漏, 请在取出针头后按住鼠标几秒钟, 以便有时间关闭注射部位, 并观察注射部位的任何泄漏或膨胀情况, 此时不应在分析中使用鼠标。
注: 注射部位皮肤破裂表明腹腔内注射失败, 注射是皮下注射。 - 将鼠标放在纸巾上, 让鼠标迈出一步。如果鼠标不动 5秒, 则轻轻按下尾巴。
- 取起鼠标, 并检查是否有在注射部位的仙人掌浆泄漏。如果有泄漏, 请将鼠标排除在分析之外, 并对鼠标实施安乐死。
4. 鼠标监控
- 定期监测老鼠, 检查它们是否到达了一个人道的终点。
- 观察小鼠2小时后对任何注射相关并发症的挑战。
- 监测小鼠12小时后对与败血症有关的发病率和在人道终点识别小鼠的情况 (标准见步骤 4.2-4.3)。
- 随后, 在头2天每4-6 进行一次监测, 但夜间8小时除外, 当时新生老鼠无人看管。
- 超过2天的后挑战, 每天监控 1x-2 x。如果观察到健康评分下降的病鼠或小鼠, 则将监测频率增加到每4-6。
- 监测新生小鼠
- 对于涉及新生鼠的任何手术, 如步骤3.1 所述, 将床上用品转移到新的笼子中 (原因与其中提到的相同)。在护理过程中, 仔细检查从巢穴中拖出来的新生儿。任何在护理过程中被从垃圾中拖出来的老鼠都不应被视为分散的老鼠。
- 当取出鸟巢顶部时, 识别任何散落的新生鼠要么远离巢穴, 要么卡在筑巢材料中, 但远离垃圾, 但在护理过程中将幼鼠从垃圾中拖走的除外。如果发现鼠标分散, 请参考步骤4.5 中的人道终结点标准。
- 测量小鼠的正确反应和流动性。
- 在纸巾上, 将鼠标放在背上, 并监控其在最多4秒内正确的能力。当放置在其背面时, 鼠标将落在左侧或右侧, 这是当4秒计数开始。
注: 要被归类为 "权利" 组, 鼠标必须能够得到至少三个四个爪子垫上的纸巾 1 s。它仍然被归类为能够纠正自己, 如果它倒了。- 如果鼠标可以自行右转, 则等待8秒以确定其移动级别。
- 如果鼠标能够纠正自己的权利, 并通过连续多个步骤探索其环境, 则将鼠标归类为 "权利-移动"。
- 如果鼠标能够纠正自己, 并采取一些步骤来探索它的环境, 则将鼠标归类为 "右-昏昏欲睡"。这一组中的老鼠可能会在走一步的时候摔倒, 站着看起来不稳, 在两步之间停下来。
- 如果鼠标可以自行移动, 但不会经常移动, 则将鼠标归类为 "rrights-nign"。它可能仍然会掉落, 如果它在8秒内没有采取任何步骤, 它将被归类为 "权利-非移动"。
- 如果鼠标不能自行纠正, 则根据观察到的臀部运动对其移动性进行分类。
注意: 避免重复监视或增加鼠标在背上花费的时间长度, 因为这可能会影响评分系统和人道终结点, 因为如果给更多时间, 在4秒内无法自行对齐的鼠标有时会这样做。- 如果鼠标无法自行右转, 并从水平方向显示超过90°角的臀部运动, 则将鼠标归类为 "无法向右 (ftr)-mobile"。一些老鼠如果给出的时间超过 4秒, 可以纠正自己, 但仍应归类为 ftr, 其移动得分基于臀部运动。
- 如果鼠标无法自行右转, 并从水平方向显示90°以下的臀部运动, 请将鼠标归类为 "ftr-lethargic"。
- 将鼠标归类为 "ftr-nlo-nob", 如果它无法纠正自己, 并且有腿可以晃动或振动, 但没有髋关节运动。肢体可以伸展或收缩, 但没有横向运动。老鼠明显生病, 已经达到了人道的终点。
- 在纸巾上, 将鼠标放在背上, 并监控其在最多4秒内正确的能力。当放置在其背面时, 鼠标将落在左侧或右侧, 这是当4秒计数开始。
- 在鼠标另一侧重复步骤 4.3, 记录两侧。
注: 有关记录观察结果, 请参阅补充文件。 - 确定鼠标是否处于人道的终点, 并需要实施表1和下面所示的安乐死。
- 根据步骤4.3 和4.4 中提到的监测观察, 将鼠标分类到不同的纠正和移动水平。鼠标的移动性是为每一侧测量的, 移动行为被用来确定老鼠是否需要安乐死。
- 将任何具有 (a) ftr-nutc 或 (b) ftr-lethargic 的右脑的纠正反射分配给与巢穴分离的老鼠, 使其处于人道的终点。
- 在监测超过20小时的时间点时, 将双方 "不对右" 的纠正反射的任何老鼠分类为处于人道的终点, 因为所提供的数据非常准确地预测, 这些老鼠最终会死于疾病, 而不是恢复。
- 步骤4.5 中确定的要安乐死的单独小鼠。如果被监视的老鼠不被视为处于人道的终点, 将其放置在没有大坝的新笼子中的第二个空巢中, 并继续与其他新生老鼠在一起。
- 一旦对整个垃圾进行了监测, 就用大坝将一半的筑巢材料转移到笼子里, 改造一个在中间有新生老鼠空间的鸟巢。
注: 不正确形成的巢穴可能会导致老鼠散开, 并减少大坝可以提供的护理量。 - 把新生老鼠和水坝一起转移回笼子里。
- 将剩余的筑巢材料放在垃圾上, 轻轻地将其捏在盖子周围, 以确保筑巢材料就位, 从而将垃圾包裹在鸟巢中。
- 根据当地机构的要求, 对第4.6 步分离的新生小鼠进行安乐死。
5. cecal 浆料的滴定
- 以所需的挑战剂量挑战小鼠 (第3节) 并监测结果 (第4节)。
- 观察最终结果是否导致所需的 ld, 如果没有, 重复第3节和第4节与一个新的垃圾在一个更高或更低的挑战剂量, 调整 5%-10%。
注: 挑战剂量可能类似于图 1 b,但需要在每个设施和小鼠菌株中进行滴定。 - 此外, 观察小鼠是否比图 1 b中的预期动力学更快或更慢地达到了人道端点, 并以更高或更低的挑战剂量重复第3节和第4节的新垃圾, 调整 5%-10%。
Representative Results
在-80°c 储存的盲药浆活力可通过在5% 的绵羊血液色态大豆琼脂上连续稀释和电镀盲药脂质进行测试, 然后在37°c 下进行24小时有氧培养。随后对可培养的成菌体成矿单元 (cfu) 中的可培养的成矿单元 (cfu) 含量的计算发现, 在6个月的时间里没有变化, 在-80°c 下长期储存不会影响其可行性 (图 2)。平均而言, 每只供体小鼠都会产生足够的雪松浆, 以挑战3到4垃圾 (数据未显示)。
在 dol 7 与 cecal 浆液诱导多微生物败血症的小鼠挑战开始达到人道终点12小时内的挑战, 和多微生物脓毒症主要解决48小时后挑战, 观察到在卡普兰-梅耶尔生存曲线结合从来自200多只受到挑战的小鼠的数据 (图 1a)。杀伤力取决于所给出的挑战剂量, 5% 的挑战剂量变化导致生存率的大约15% 的差异 (图 1b)。每次监测访问都会测量鼠标体重。在所有受到挑战的动物中, 体重下降都是非歧视性的, 最终存活下来的老鼠和最初的24小时后挑战中没有的老鼠是非歧视性的 (图 1c)。2 4小时后, 大多数幸存的动物开始恢复体重, 而所有非幸存者则继续减肥, 并转移到人道的终点。然而, 一小部分存活下来的动物保留了纠正性的反射, 在实验结束前也继续减肥或体重不足, 甚至在挑战的 4 0 小时内减掉了多达 2 0% 的最初体重。由于最终幸存的小鼠和没有存活下来的老鼠之间的减肥有重叠, 体重的变化或减肥的门槛不能作为人道终点的标准, 同时仍然坚持准确划分幸存者的目标从非幸存者。
如协议和表 2所述, 对小鼠的行为进行了监测。将显示运行状况类别的快照 (图 3a-c)。这些照片显示了不同的健康类别的老鼠谁不纠正自己后, 被放置在他们的背上, 并概述了 ftr-mobile 和 ftr-althargic 之间的区别, 这是一个重要的区别。这个年龄的无障碍健康小鼠不表现出 FTR-Lethargic 活性;因此, 这一健康类别是疾病的标志, 也是对挑战的回应。生病的小鼠表现出 ftr-lethargic 症状 (图 3b), 并可能向 ftr-n移 (图 3B) 倒退, 其中上肢与下肢保持平行, 几乎没有到零的臀部晃动运动, 这是标准之一。人道的终点。小鼠也可能恢复, 获得增加的髋关节运动, 并成为 ftr-mobile (图 3a)。确定了每只老鼠左右侧的右切反射和移动性得分, 并利用最高分确定鼠标是否达到了人性化的终点。从240多只受到致命剂量 60 (ld60) 的动物收集了行为信息, 观察到144个人道终点 (图 3d-f和表 1)。这种证据驱动的方法被用来定义和完善四个疾病阶段的人道终点, 由实验者根据幸存者和非幸存者之间的行为差异以及所达到的人道终点的部分进行分类在每个时间段内。在早期实验中, 在观察到这种行为的4-6 内, 一直发现没有髋关节运动的 ftr-非移动小鼠死亡。在所提供信息的收集中, 采用 ftr-非移动健康评分作为人性化终点的标准。从12-21小时的挑战, 而 ftr-非移动小鼠被安乐死, 幸存的和不存活的动物显示非常相似的行为模式, 无法区分以任何其他方式 (图 3d)。从21-48 的测试, 大多数存活的小鼠恢复了正确的反射, 而观察到的 ftr 行为中只有不到1% 是在能够继续存活实验的动物身上 (图 3e)。因此, 在这段时间里, 未能从双方纠正自己的老鼠成为了人道终点的另一个标准。在12至20小时的质疑后, 观察到的人道终点总数的 12.5%, 而20至48小时之间的这一比例为 80.5, 48小时后为 7% (表 1)。最终存活下来并最终恶化到人道终点的小鼠之间的一个显著特征是失去了与髋关节移动无关的纠正反射 (图 3f)。事实上, 在挑战结束后的20至48小时间, 共有121只老鼠未能从两侧纠正自己, 其中116只老鼠最终进展到一个人道的终点 (这意味着96% 的准确性, 以确定无法恢复的小鼠)。超过48小时后的挑战, 观察到11只老鼠未能从双方的权利, 其中 10% 进展到一个人道的终点 (91% 的准确性)。超过20小时后的挑战, 老鼠的数量, 失去了对出反射的双方预测最终结果的准确性超过 90%;因此, 这已被添加到人道的终点标准, 以更早地识别未恢复的小鼠, 并减少小鼠的痛苦 (表 1)。
由于不同的死亡后质疑率, 小鼠需要监测随时间变化的频率,如表 1所示。如果老鼠在任何时候都不能纠正自己, 在两边都表现出非移动的臀部运动, 或者如果发现老鼠分散在鸟巢里, 无法纠正自己, 臀部运动就会在任何时候处于人道的终点。预计这两种情况中的任何一种情况下的老鼠都无法重新加入垃圾, 而且在4-6 内被观察到是非移动的. 在挑战发生后20小时开始, 增加了一个新的人道终点, 因为所提供的信息表明, 巨大的大多数来自双方的 ftr 最终死于疾病的老鼠。
本手稿中提供的视频、表格和资源是正确分配受挑战小鼠行为的有效教学资源。7名实验者被要求观看训练视频, 阅读协议和表格, 然后再将行为分配给60只受到挑战的动物。对人性化端点分配的识别是准确的, 既能区分 FTR-Nonmobile-非移动小鼠与显示其他行为的小鼠 (图 4a), 也能准确区分在允许的时间范围内纠正自己的小鼠 ftr 小鼠 (图 4a) (图 4b)。
图 1: 卡普兰-梅耶尔生存曲线, 仙人掌浆剂量滴定法, 和重量变化后的仙人掌浆的挑战.(a) 新生儿 c57bl-6j 小鼠在 dol 7 处接受腹腔内 cecal 浆液注射的检测结果。这一数字的数据是根据使用多种挑战剂量的独立实验综合使用的, 每克体重0.7 至1.3 毫克, 这些小鼠服用了这些药物。(b) 在一个 cecal 浆液制剂中, 每克体重需要0.80 至0.80 毫克的 cecal 浆的新生小鼠, 它们在给出的仙人掌浆数量和存活率之间存在剂量依赖性关系。(c) 体重变化与挑战体重的百分比相比, 虚线表示从挑战发生时开始体重下降20%。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 在-80°c 储存的冰体浆料库存中, cfu 浓度在6个月内不会改变.用线性回归方法测试了仙人掌浆液年龄对 cfu 浓度的影响。每个点代表同一仙人掌浆料制备的一个, 在6个月的时间里连续稀释和电镀。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 在不同的时间, 在不同的时间, 没有纠正自己和动物行为的小鼠的髋关节移动性类别.被挑战的小鼠, 一旦放在背上, 就会显示出可以用臀部运动程度来衡量的发病迹象。(a) 右 (ftr)-移动鼠标显示他们的上肢臀部摇晃运动超过90°角从水平。(b) ftr-lethargic 鼠标显示髋关节晃动运动, 但在4个监测过程中, 在任何一点上都不超过水平角度90°角。(c) 一些 ftr-非移动小鼠会伸展腿, 在膝盖上弯曲, 但很少 (小于10°角) 到零髋关节晃动运动, 腿将保持平行。(d) 动物行为12-21小时的质疑后表明, 只有 ftr-mobile 行为将幸存者与非幸存者分开。(e) 从21至48小时的挑战后, 在592个观察到的 ftr 行为中, 只有 4个 (0.67) 属于幸存者, 这使得纠正反射能够预测最终结果, 并被用作终点人道的新标准。(f) 在感染后48小时以上, 131只有纠正反射的小鼠中, 有 6只 (4.55) 继续成为 ftr 组的一部分, 并在实验结束时被牺牲, 从而证明有理由在整个恢复过程中进行持续监测。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 教学资源可由独立实验者进行准确的行为分类。通过观看本协议附带的视频进行实验的实验人员将60只新生小鼠的视频分为不同的健康组.(a) 确定了区分人道终点的能力, 平均97% 的行为被准确地归类为 ftr-非移动或非移动, 而只有1% 的 ftr-非移动小鼠被误认。2% 的老鼠被错误地识别为 ftr-nut-nsper。(b) 在97% 的蔑视中, 正确地确定了正确区分 ftr 小鼠或有能力在其背部被放置后4秒内纠正自己的小鼠的第二个人道终点标准, 而只是0.96 的小鼠被错误地指定为纠正自己, 2% 的小鼠被错误地分配为 ftr。请点击这里查看此图的较大版本.
| 疾病阶段 | a: 发病率高, 无死亡率 | b: 发病率高, 死亡率低 | c: 高发病率, 高死亡率 | d: 低发病率、低死亡率 |
| 质询后的小时数 | 0-12 | 12-20 | 20-48 | & gt;48 |
| 监控频率 | 2小时后挑战 | 每4-6小时 | 每 4-6小时, 8小时, 无人看管过夜 | 每天1-2 次, 如果需要, 更多 |
| 观察到的人道终点总数的比例 | 上午144 | 18"144 | 12/144 | 144 |
| 遵守的人道终点的百分比 | 0% | 12.5% | 80。5 | 7% |
| 人道终结点标准 | 1. ftr-两边都是非移动的 | 1. ftr-两边都是非移动的 | ||
| 2. 从巢穴散开, 是 ftr-昏昏欲睡 | 2. 从巢穴散开, 是 ftr-昏昏欲睡 | |||
| 3. 左、右两方面的 ftr (任何行动得分) | ||||
表 1: 不同疾病阶段的监测频率和人道终点标准.观察到的监测频率、人道终点、人道终点的百分比以及不同疾病阶段的人道终点标准。
| 纠正反射 | 流动性 | 被放置在后面后的时间限制 | 测量移动量的时间限制 (移动/昏昏欲睡/非移动) | 移动性评分标准 |
| 权利 | 移动 | 4秒 | 额外的8秒 | 鼠标连续采取多个步骤, 保持前进的势头, 并探索其环境。帕普不会摔倒的。 |
| 昏昏欲睡 | 鼠标可以采取一个步骤, 但在采取另一个步骤之前会停止并暂停。帕普可能会摔倒。 | |||
| 非移动设备 | 鼠标在纠正自身后不采取任何步骤。帕普可能会摔倒。 | |||
| 未能向右 | 移动臀部 | 用于测量右转反射的方法相同的4s | 有能量的髋关节运动与上肢旋转超过90°从水平至少一次在4秒内。 | |
| 昏昏欲睡的臀部 | 臀部运动可达到但不超过从水平90°。 | |||
| 非移动臀部 | 肢体可以通过伸展和收缩移动, 但臀部不会旋转。普普看起来很虚弱。 |
表 2: 监测表和确定小鼠健康评分的标准.所提供的标准用于定义小鼠的健康类别组, 并减少在分配健康分数时的个体差异。
Discussion
产后新生小鼠的活动能力非常有限, 即使在没有挑战的情况下, 也无法纠正背部。通过在这个模型中受到挑战的小鼠年龄的 dol 7, 在没有挑战的小鼠身上观察到了一系列从权利-移动到 ftr-mobile 的运动范围, 但有一个重要的区别, 那就是在这个年龄没有挑战的老鼠没有表现出 ftr-letharic 的行为。只有受到多微生物脓毒症挑战的小鼠才会被观察到成为 FTR-Lethargic;因此, 这种反应可以是疾病严重程度的标志。注意从水平方向切断90°角的髋关节运动, 可以在小鼠中一致和准确地分配昏昏欲睡或移动的髋关节运动。选择了4秒的时间框架, 看看老鼠是否能自行右转, 因为没有挑战的老鼠能够在这个时间框架内持续地纠正自己。避免了对同一只老鼠的重复测量, 而纠正自己的时间和臀部活动的测量被限制在4秒之内, 以避免过度疲劳, 否则可能影响其获得食物和温暖的能力, 并可能影响其的预后, 以获得更好的。观察到了从左侧和右侧的情况, 并使用较高的分数来确定鼠标是否处于人道的终点, 因为发现一些老鼠在一侧显示 FTR-Nonmobile-非移动, 而另一侧和 b 的移动能力较高我最终能够恢复。
用于评估鼠标健康状况的评分系统依赖于对运动范围的分类截止应用, 因此, 可能容易出现个人偏差。工作人员一起接受了培训, 以确保每个人的得分都是一样的;然而, 很可能会有一定程度的主观性导致变异。通过让7名以前没有进行过新生儿老鼠监测的研究人员了解本协议和视频中概述的要求, 然后独立分配行为并确定人性化, 对评分的一致性进行了评估端点。在60只受到挑战的小鼠身上进行评分时, 观察到97% 的准确性, 这表明个体偏见在这种模型的行为分配中没有实质性的作用。所提出的行为监测协议是基于对在 dol 7 上受到挑战的动物的观察, 但在没有挑战的健康状态下, 6天以下的老鼠不能一直纠正自己。因此, 所描述的人道终点标准不能直接应用于年轻的小鼠。如果在这个实验模型中使用年轻的小鼠, 或者如果应用了不同的抗病动力学的不同的挑战模型, 那么就必须制定和试行适当的人道终点标准, 以避免对小鼠实施安乐死, 否则最终,恢复。评分系统显示了一种改进人性化端点分类的可靠方法, 通过测试和确认, 该方法有可能应用于其他模型。
每制备得一次得下的仙人掌浆或使用新的小鼠菌株都需要重新过滤得好的仙人掌浆剂量来管理, 以达到类似的致死剂量。每一种制剂都是通过感兴趣的读数, 即生存, 而不是给出相同的细菌数量来标准化的。每个盲肠浆料制剂的活菌浓度略有不同, 可能是由于供体的共生菌的差异, 或由于在盲肠浆料库存后的细胞过滤器中的重量的差异。在 cecal 浆料的滴定过程中, 将前两片垃圾分为两组, 每一半的垃圾都受到两种剂量中的一种的挑战, 以便每一个剂量都能在两个垃圾中进行测试。如果所产生的存活率与所需水平不符, 那么挑战剂量要么增加, 要么下降 5%-10%, 实验重复。多个垃圾被用来解释垃圾与垃圾之间的差异, 这些差异可能会导致对垃圾的抗药性或增加对败血症的易感性。重要的是要准确地将仙人掌浆料库存与每一种新的制剂滴定, 以确保新的胎浆滴定量与以往的仙人掌浆料制剂相当。观察到, 特别是在沥青压实和附近建筑和道路施工过程中, 出现了过度噪音和振动的时期, 增加了大坝的应力。这与食人鱼率的增加有关, 并影响了生存实验的死亡率, 甚至影响到未受到挑战的小鼠, 这表明可能会对新生儿生存产生无关的影响, 这也需要加以控制。
以前制备仙人掌浆库存的方法包括使用新鲜的仙人掌浆或冷冻的仙人掌浆, 使用各种方法, 包括在挑战期间不可避免地转移的甘油储存。虽然使用新鲜的盲肠浆料提供了一个最接近原始盲肠含量的细菌成分的优势, 但由于同源细菌的变化, 单个供体小鼠之间存在差异的风险。虽然通过使用同一供应商的 cecal 捐助方, 从到达到实验的时间最短, 从而最大限度地减少了这一情况, 但这可能成为一些实验室的成本高昂的选择, 并在实现在7天龄的新生小鼠中进行 ecal 浆液实验时, 可获得年龄匹配的小鼠。采用了使用新鲜的雪松浆的另一种方法, 将多个成年供体的仙人掌含量汇集在一起, 重新悬浮在 d5w 中, 在-80°c 下冷冻, 不使用甘油, 并一次解冻一个外石进行实验。利用成年供体 cecal 浆液研究新生儿败血症有可能转移新生小鼠没有接触过的仙人掌浆中存在的细菌种类, 但这是一种策略, 可以研究新生小鼠的败血症和在过去的 13,14, 15被用来研究新生儿小鼠生物学。cecal 浆液在 d5w 中稀释, 为细菌提供营养, 一旦注射细菌, 就可以建立活性感染, 并在坏死过程中模拟腹腔内营养物质的供应情况小肠 结肠 炎。甘油不被包括作为稳定剂在冷冻细菌, 因为潜在的负面副作用可能会产生单独的甘油注射。如果将甘油纳入了塞勒浆液制剂, 那么仅甘油本身就可能造成的潜在损害, 就需要通过在小鼠体内只注射甘油 (缺乏仙人掌浆) 来进行测试, 这将增加小鼠的使用。在没有甘油的情况下冷冻得煤浆的菌样料后, 对其菌种的细菌活力进行了测试, 发现其细菌浓度是不变的, 在-80°c 以上储存的同一仙人掌中, 细菌浓度没有变化月份期间。这表明, 没有甘油的储存在提供一致的生物结果方面是可行的。使用大容量制备的冷冻塞勒浆还可以使用内部饲养的小鼠, 从而降低成本, 并利用本来会超过繁殖量的雄性小鼠, 从而减少小鼠的浪费。
识别小鼠失败的挑战对于避免给系统增加额外的噪音很重要。在接受腹腔注射 cecal 浆液后, 观察到小鼠在皮肤下出现隆起, 这表明注射失败, 实际上是皮下注射。在注射部位观察到老鼠是否漏水, 这既在拔针后立即, 也在允许它们在注射后采取一步后, 因为老鼠有时 (很少) 在移动注射部位的肢体后, 才会通过一步移动。注射后出现隆起或泄漏, 导致鼠标从分析中删除。毕竟, 这两种情况中的任何一种都可能导致不同的结果, 因为注射的仙人掌浆的数量不正确, 因为已经观察到5% 的挑战剂量差异, 以影响随后的生存。
ccal 泥浆挑战实验通常需要不同的目标致命剂量和不同的重量调整剂量。因此, 注射量的范围从20μl 到100μl 不等。与死针体积相关的比例实验误差也随注射体积的变化而变化, 增加了直接比较不同剂量的难度。通过对注入体积标准化的简单修改, 将这一方差来源从实验中删除。
该协议中使用的新生儿小鼠行为监测系统是同类系统中的第一个。打算对新生小鼠进行伦理研究的研究人员往往面临着评估这个年龄动物健康状况的具有挑战性的缺乏资源的问题。所介绍的直观和一致的监测系统开始解决这一知识差距。重要的是, 这种证据驱动的方法不仅提高了所获得的实验数据的质量, 同时也减少了实验动物的痛苦。
Disclosures
james wynn 博士得到国家卫生研究院 (nih)/国家普通医学研究所 (r01gm128452) 和国家儿童健康和人类发展研究所 (nichd) 的支持 ( r01hd089939)。
Acknowledgments
特别感谢 claire harrison 和不列颠哥伦比亚省儿童医院研究所动物护理设施对动物工作的支持, 并感谢郑宝贤博士在动物监测和福祉方面提供的指导和投入。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
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