Summary
Denne protokollen gir de nødvendige trinnene for å etablere og evaluere neonatal sepsis i 7 dager gamle mus.
Abstract
Neonatal sepsis forblir en globale byrden. En prekliniske modell til skjermen effektive forebyggende eller terapeutiske tiltak er nødvendig. Neonatal musen polymicrobial sepsis kan indusert ved injisere cecal slurry intraperitoneally i dag av livet 7 mus og overvåking for følgende uke. Presenteres her er de detaljerte trinnene nødvendig for gjennomføringen av denne neonatal sepsis modellen. Dette inkluderer å gjøre en homogen cecal slurry lager, fortynne den å en vekt - og søppel-justert dose, disposisjoner for overvåking plan, og en definisjon av observerte helse kategorier brukes til å definere Human endepunktene. Generering av en homogen cecal slurry lager fra gruppert givere gir administrasjonen i mange søppel over tid, reduserer variasjon mellom givere og hindrer bruk av potensielt giftig glyserol. Overvåking strategien som brukes tillater påvente av overlevelse utfallet og identifikasjon av musene som ville senere fremgang til døden, slik at en tidligere identifikasjon av Human sluttpunktet. To hovedfunksjoner for atferdsdata brukes til å definere helse score, nemlig evnen til neonatal mus å rette seg selv når den plasseres på ryggen og deres nivå av mobilitet. Disse kriteriene kan potensielt brukes til adressen Human endepunktene i andre studier av neonatal sykdom i mus, så lenge en pilotstudie er utført for å bekrefte nøyaktigheten. Avslutningsvis gir denne tilnærmingen en standardisert metode til modell nyfødte sepsis i mus, samtidig som ressurser for å vurdere dyrevelferd brukes til å definere tidlig Human endepunktene for utfordret dyr.
Introduction
Sepsis er en ledende årsak til menneskelige Nyfødte smittsomme dødsfall1. Fordi nyfødte sepsis er dårlig forstått, har liten fremgang blitt gjort begge identifisere i risikosonen nyfødte tidlig under sykdom og utviklingen av effektive behandlinger eller prophylaxes. Dette nødvendiggjør bruk av dyr modeller av sepsis for bedre å forstå prosessen og test mulig intervensjon. Videre reagere voksen gnagere forskjellig på sepsis, med statistisk betydelige forskjeller i antall bakterier å administrere for å få samme dødelig dose (LD) og forskjellene i resulterende vert respons i forhold til nyfødte2. Således, neonatal sepsis har å bli studert i nyfødte. Flere voksne sepsis modeller har blitt brukt i sepsis forskning. Disse inkluderer en intravenøs utfordring med bestemte organismer innblandet i voksen menneskelige sepsis eller cecal hemorroider og punktering (CLP). CLP er en endogen utfordring modell der cecum er kirurgisk isolert samskrevet og punctured for å tillate lekkasje av intestinal innholdet i peritoneum, til slutt fører til systemisk formidling av mikrober og deres produkter3. Men er den kirurgiske prosedyren må etablere CLP dødelig for nyfødte dyrene; en alternativ metode er derfor nødvendig å etterligne polymicrobial utfordringen med CLP å indusere neonatal sepsis. Cecal slurry modell for neonatale polymicrobial sepsis ble utviklet for å møte dette behovet, der cecal innholdet av dyr høstet, suspendert i sterilt druesukker 5% i vannet (D5W) og intraperitoneally injisert i nyfødte mus2. Dette har siden blitt et stadig mer populært modell å studere sepsis i både nyfødte og voksen dyr og har betydelig avansert mekanistisk innsikt i sykdommen sin prosessen4,5,6,7 ,8,9,10,11,12,13,14,15.
Gitt den økende bruken av denne modellen og ønske forskere direkte sammenligne resultater over publikasjoner, er det behov for de tekniske aspektene være godt beskrevet og standardisert over studier. Standardisering gjelder tre aspekter av modellen, nemlig i) utarbeidelsen av cecal slurry aksjen, ii) utarbeidelsen av utfordringen dele for injeksjon i forsøksdyr, og iii) definisjonen av Human endepunktet der dyr anses nonsurvivors utfordring eksperimenter. Spesielt refereres metoder å forberede cecal slurry aksjen ofte til den opprinnelige artikkelen introduserer modell2. En kort oppsummering av denne modellen er at cecal innholdet fra voksen mus ble høstet, suspendert i sterilt D5W til en konsentrasjon av 80 mg/mL og brukes innen 2 t å injisere forsøksdyr. Denne opprinnelige modellen brukes mus på samme alder, fra samme leverandør sted, som var plassert i sine respektive forskningsanlegg for mindre enn 2 uker før høsting cecal innholdet. Bruk av interne avlet mus, økt selv om redusere kostnadene fra faste leverandøren levering og tillate bruk av overflødig mus til et bredere spekter av kjønn og alder også vesentlig giver-til-donor variasjon. Dette motivert utviklingen av en alternativ teknikk, der cecal innholdet fra flere mus ble samlet sammen for å forberede et stort lager, som var så aliquoted og lagrede-80 ° C13. Denne alternative metoden ble tilpasset av flere grupper14,15. Men at tilpasning resulterte i noen tekniske variasjoner, både i lagringsmediet brukes (10% eller 15% glyserol eller D5W alene) og i strategien for filtrering å fjerne partikler (flertrinns filtrering gjennom en 860 µm og, deretter en 190 µm filter eller enkelte filtrations gjennom 100 µm eller 70 µm filtre)13,14,15. Injeksjon av glyserol alene kan potensielt forårsake skade, gitt at 25% - 50% glyserol injeksjoner har vært brukt som en gnager modell av nyre skader16,17,18,19, 20. For å unngå uønskede bivirkninger av glyserol, cecal slurry lager forberedelse til mus i denne studien er frosset i D5W uten glyserol, og tester av bakteriell levedyktighet fra lagring ved-80 ° C utføres. Filtrering strategien som brukes i denne studien er en passere en 70 µm filter, som ikke har vært direkte forhold til andre filtrering strategier oppført.
Dødelige vekt-justert doser av injisert cecal slurry kan variere fra anlegg til anlegg og skal titered ut til ønsket lethality for individuelle grupper. Med annerledes utfordring doser endre tilhørende utfordring volumene av nødvendighet. Men er disse metodologiske detaljene ikke rapportert før. Videre strategier for standard prosedyrer, for eksempel intraperitoneal injeksjon, er sjelden utdypet i litteraturen, men individuelle teknikker kan påvirke om nyfødte mus lekke når injisert og påvirke deres endelige resultatene.
Dyrevelferd, inkludert en definisjon av Human sluttpunkt, er et sentralt aspekt av denne modellen, og i noen modell for infeksjon og betennelse i gnagere21. I 1998 publisert den kanadiske Council på dyr omsorg (CCAC) omfattende retningslinjer for valg av Human sluttpunktet definerer Human sluttpunktet som "aktuell eller potensiell smerte, ubehag, eller ubehag bør minimert eller lindres ved å velge de tidligste endepunktet som er kompatibel med vitenskapelige målene for forskningen"22. Andre også forsiktig at Human endepunktene må opprettes basert på vitenskapelig begrunnelse i stedet for en subjektiv tolkning av dyrets staten alene21. Mens det er et vell av ressurser for klinisk, atferdsdata, og kroppen-tilstand tegn-baserte kriterier for Human sluttpunktet, selv i sammenheng med infeksjon og betennelse spesielt21,23,24, ingen av disse , inkludert CCAC retningslinjene for Human endepunktet22, nevne nyfødte mus. Dermed er objektivt og vitenskapelig berettiget Human endepunktene mye vanskeligere å etablere for nyfødte dyr, gitt både deres begrenset atferdsmessige evner og mangel på bevis fra kriterier som vekttap, som er vanlig for voksen mus. Foreløpig kriteriene for Human sluttpunktet brukes for 5-12 dag-gamle neonatal mus i cecal slurry litteraturen alle henvisning tilbake til det opprinnelige manuskriptet som introduserte modell2. I denne originalt papir, var definisjonen av Human endepunkt for nyfødte dyr basert på to kriterier; nemlig, plasseringen av en mus utenfor reiret (spredning) og mangel på melk flekker hadde blitt sett resulterer i død innen timene. En kompliserende spørsmål i tilordne en human sluttpunktet er at melk flekker bli vanskelig å se i musen stammer med mørk pels, som ofte ansatt C57BL/6J belastningen, etter den første uken av livet, mens syke dyr overvåkes inntil 14 dag livet (DOL). Videre, døde dyr kan bli funnet postchallenge når du bruker disse kriteriene (eier observasjon, upublisert); Dermed er en strengere definisjon av Human sluttpunktet nødvendig for å lindre lidelse til forsøksdyr og unngå dødelighet i situasjoner der utfallet nøyaktig forholdet tidligere.
Alle tre metodologiske aspekter av cecal slurry modellen er presentert i en standard prosedyre detaljering utarbeidelsen av cecal slurry lager, en metode for å injisere forsøksdyr som holder injeksjon volum konstant mellom doser og reduserer faren for lekkasjer og en definisjon av Human endepunkt for 7 - 12 dag-gamle mus basert på et system atferdsmessige modellering. Atferdsdata informasjon musen helse score over 240 forsøksdyr var samlet og gruppert etter siste overlevelse utfallet, demonstrere en bevis-drevet definisjon av Human endepunkt. Lidelsene til forsøksdyr reduseres ved å identifisere døende neonatal mus på det tidligst mulig tidspunktet, mens biologisk betydelig overlevelse resultater kan utledes ved å observere viktige variabler. Den visuelle representasjonen av både cecal slurry forberedelse og neonatal mus atferd vil tjene som et utmerket ressurs til en gruppe studere sepsis eller nyfødte utfordring modell dyr.
Protocol
Alle eksperimenter i denne protokollen er godkjent av University of British Columbia dyr omsorg komiteen under Protokollnummer A17-0110.
1. verktøyet sterilisering
- I en biologisk sikkerhet regjering (BSC), slå på og Forvarm varme perle sterilisatoren til 250 ° C, minst 30 min før bruk.
- Dypp verktøyene i 70% etanol.
- Senk verktøyene i forvarmet varme perle sterilisatoren minimum 1 min.
Merk: Håndtakene på verktøyene vil få varm og kan brenne hvis igjen i varme perle sterilisatoren for over 1,5 min. - Spray en matte papirhåndklær med 70% etanol steriliseres.
- Fjerne verktøyene fra varme perle sterilisatoren uten å berøre den sterilisert del av verktøyet til ikke-sterilt håndtakene på andre neddykket verktøy og plassere dem på etanol sprayet papirhåndklær.
- Vent 30 å 2 min for verktøy å kjøle seg ned før du bruker dem for disseksjon.
2. cecal slurry forberedelse
- Preweigh 15 mL sentrifuge rør (en tube for hver fem mus tilværelse euthanized).
- Euthanize cecal slurry givere i henhold til lokale dyr omsorg retningslinjer eller bruke protokollen nedenfor.
Merk: Opptil 40 C57BL/6J mus mellom 6 og 12 uker gamle ble brukt for cecal slurry forberedelse, med opptil fem mus tilværelse euthanized samtidig.- Overføre mus til euthanasia chamber og Still isoflurane anestesi maskinen til 5% oksygen perfusjon.
- Overvåke mus å observere tap av evnen til å gå og se dem inn kirurgisk flyet bedøvelse og til slutt slutte å puste.
- Fjerne en mus fra eutanasi kammer, knip labben og observere noen etappe retraksjon eller innånding. Hvis enten finnes, returner musen til euthanasia chamber; ellers fortsette.
- Terminalt euthanize musene av skarpe cervical forvridning.
- Utføre cecum disseksjon, bruker presterilized og avkjølt verktøy (se avsnitt 1) i en BSC.
- Feste bena på musen til en ekstruderte polystyren skum bord med 23 G nåler slik at musen har buken opp. Sikre og deretter spray magen med 70% etanol.
- Bruke sterilt tang og saks, skjære gjennom huden, løsne huden fra peritoneal fôr med saksen og kuttet åpne et rektangulært område fra lyske til sternum og venstre til høyre. Fjern alle pels fra peritoneum.
- Bytte til et nytt par av sterile verktøy for å skjære gjennom peritoneum, gjør en rektangulære åpningen som ble gjort for huden, bytte verktøy hvis de brukte kontakt huden.
- Identifisere cecum, som burde være running venstre høyre over kroppen. Forstyrre bindevev cecum grenene fra tarmen og kutte cecum fra tarmen. Plass cecum på en sterilisert veier papir.
Merk: Veiing papir kan steriliseres ved sprøyting med 70% etanol på begge sider og la det tørke, eller ved UV bestråling. Alternativt kan cecum være dissekert på en steril Petri plate.
- Cecal innhold ekstrudering
- I en BSC-maskin, kan du bruke sterilt verktøy for å skjære gjennom begge ender av cecum.
- Holde midten av cecum med sterilt tang og bruke flatt sterilt metall spatula å forsiktig presse cecal innholdet av kuttet ender, bruke rullende bevegelser og unngå skraping bevegelse som kunne rive epitel. Samle innholdet, og plassere dem i en preweighed 15 mL sentrifuge rør.
- Basseng cecal innholdet fra maksimalt fem mus til samme rør. Veie røret igjen når alt innholdet er lagt til.
Merk: Forventer et gjennomsnitt på 300 mg, og opp til 390 mg cecal slurry per musen, krever 1.8 til 2,4 mL D5W for rørets per mus; Derfor kan bruker mer enn fem mus i dette trinnet resultere i overfylling 15 mL sentrifuge røret. - Tørk verktøyene rent med en etanol sprayet papirhåndkle og resterilize dem ved å gjenta trinn 1.2 til 1.6.
- Cecal slurry filtrering
- Veie sentrifuge røret fylt med cecal innhold og beregne mengden D5W legge til cecal innholdet ved vekten av cecal innholdet med ønsket lager konsentrasjonen i milligram per milliliter, som i formelen nedenfor.
- Legg den nødvendige mengden av iskalde D5W til 15 mL sentrifuge røret som inneholder cecal innholdet i en BSC.
- Vortex 15 mL sentrifuge tube vertikalt og horisontalt for 30 s. Sjekk Particulate mer enn 1-3 mm i diameter, og hvis Fortsett vortexing til alle store partikler forsvunnet synlig.
- Plass en steril 70 µm celle sil i et 50 mL sentrifuge rør som er plassert på is. Pipetter 4 mL resuspended cecal slurry til celle silen og deretter til samling røret. Resuspend partikler av pipettering opp og ned 2 x-3 x. Forsiktig extrude bobler å øke filtrering hastigheten under omrøring innholdet med Pipetter spissen til det er ingen flere dråper filtreres.
Merk: Når miksing, kan det være partikler stor nok å plugge 5 mL pipette. I dette tilfellet gjenta vortexing fra trinn 2.5.3, og hvis løsningen fortsatt ikke bryte fra hverandre, bruker pipette trykke partikler mot veggen av sentrifuger røret. - Gjenta trinn 2.5.4, endre cellen siler mellom hver tube cecal slurry og bassenget alt innholdet i samme 50 mL sentrifuge samling rør holdt på is, eller i en andre 50 mL sentrifuge tube Hvis volumet på filtratet overskrider hvilket isen i isen boksen.
- Veie sentrifuge røret fylt med cecal innhold og beregne mengden D5W legge til cecal innholdet ved vekten av cecal innholdet med ønsket lager konsentrasjonen i milligram per milliliter, som i formelen nedenfor.
- Aliquot cecal gjødsel.
- Eventuelt kombinere flere 50 mL cecal slurry filtratet rør fra trinn 2.5.5 inn i en større sterile containeren (f.eks en 1000 mL lagring flaske). Deretter vortex for 15 s og sted 20 mL i en ny 50 mL sentrifuge tube.
- Vortex cecal slurry aksjen i 50 mL sentrifuge røret for 5-10 s og aliquot 500 µL i tre 2 mL kryogene ampuller som har en gummi sel, å forhindre fordampning over tid. Umiddelbart plassere master lager og aliquoted kryogene medisinglass på is.
- Gjenta trinn 2.6.1 og 2.6.2 til alle cecal slurry er aliquoted, vortexing master aksjen etter hvert tre kryogene ampuller å unngå bosetting av alle partikler og opprettholde en homogen blanding.
- Fryse cecal slurry dele på-80 ° C.
Merk: Forvente fra tre til fire lager ampuller på 500 µL fra hver voksen mus. Hvert lager hetteglass bør være grovt nok å utfordringen en søppel av åtte mus på DOL 7.
3. sepsis utfordring av 7 dager gamle neonatal mus
- Skille, identifisere og veie neonatal mus.
- I en BSC, overføre neonatal mus å en ny bur å holde mus fra dammen og redusere stress til demningen.
- Fjerne og gni del av hekkende materialet med hansker overføre bur lukten til hansker. Deretter mold hekkende materialet i en mindre reir og legg den i en ny bur uten demningen.
- Overføre neonatal mus å hekke materiale i nye buret.
- Overføre mer hekke materiale for å gjøre en andre, tomme reir i nye buret.
- Lukk og fjerne demningen buret av panseret, slik at demningen ikke er stresset av å høre noen av de nyfødte mus nød.
- For å spore individuelle neonatal mus i kullet over tid, kan du bruke en etanol-bevis markør for å merke ett til fem punkt på forsiden eller baksiden av halen, at hver 12-24 h etter behov.
- Veie hver mus som vil bli utfordret, plassere hver i sekundære nest etter veier, og gjenta dette for alle mus.
- Tilbake hele søppel dammen før forberede cecal slurry utfordringen aliquot.
- Beregne personlige vekt-justert doser cecal slurry og nødvendige fortynning med D5W ved fullfører dette trinnet for hvert kull separat, ved hjelp av beregningene nedenfor eller angitte regnearket (se Ekstra fil).
- Beregne milligram av cecal slurry (en) gis til hver musen ved å multiplisere vekten av musen i gram (b) ved ønsket utfordring dosen i milligram cecal slurry per gram av musen (c).
- Beregne personlige volumet av ufortynnet cecal slurry lager må etter musen i microliters (d) ved å dele milligram cecal slurry trengs per musen fra trinn 3.2.1 (en) ved at lager cecal slurry, 160 mg cecal slurry per milliliter D5W (e), og multipliseres med 1000 µL per milliliter til konvertere fra ml til microliters.
- Gjennomsnittlig lager volumet av cecal slurry må etter musen (g) ved å summere mengden cecal slurry lager (d) per musen i en søppel av n mus, delt på antall mus (n).
- Beregn den gjennomsnittlige fortynningsfaktoren for cecal slurry aksjemarkedet (h) ved gjennomsnittlig injeksjon volumet (100 µL) av gjennomsnittlig lager volumet av cecal slurry må etter musen (g).
- Beregne hver mus er bestemt injeksjon volum i microliters (j) ved å multiplisere hver mus er volumet av lager cecal slurry kreves (d) med den gjennomsnittlige fortynningsfaktoren (h) og deretter runde det av til nærmeste ten (tilsvarer den 10 µL intervaller av injeksjon).
- Beregne gjennomsnittlig nødvendig volumet av D5W å fortynne cecal slurry lager (k) ved å trekke de gjennomsnittlige cecal slurry lager (g) fra gjennomsnittlig injeksjon volumet (100 µL).
- Beregne den totale mengden cecal slurry lager i microliters (l) ved å multiplisere den gjennomsnittlige lager cecal slurry per musen i microliters (g) av antall mus i dette søppel (n) og multipliseres 1.4 opprette ekstra.
- Beregne den totale mengden D5W i microliters (m) nødvendig å fortynne cecal slurry lager ved å multiplisere den gjennomsnittlige nødvendige mengden D5W (k) på antall mus (n) og multipliseres 1.4 opprette ekstra.
- Beregne milligram av cecal slurry (en) gis til hver musen ved å multiplisere vekten av musen i gram (b) ved ønsket utfordring dosen i milligram cecal slurry per gram av musen (c).
- Forberede utfordring aliquot etter beregning av hvor mye lager cecal slurry kreves (l fra trinn 3.2.7). I en BSC, tine antall cecal slurry lager ampuller i romtemperatur, pipettering innholdet å blande.
- Når det er ikke mer synlig iskrystaller i tinte cecal gjødsel, overføre den beregnede mengden cecal slurry lager (l fra trinn 3.2.7) til et sterilt 1,8 mL microcentrifuge rør.
- Fortynne til nødvendig konsentrasjon ved å legge til iskalde D5W som beregnet trinn 3.2.8 (m). Lagre utfordring aliquot på is.
- Før du legger sprøyten, bland microcentrifuge røret ved å sveipe det 20 x, etterfulgt av 3 x trekke opp og utviste 300-500 µL av cecal slurry med en 500 cc 28 G ½ tommers insulinsprøyte.
- Utarbeide omtrent 150 µL av fortynnet cecal slurry i samme sprøyten.
- Sveip sprøyten å dislodge bobler fra stempelet, trekke tilbake litt på sprøyten og deretter utvise bobler.
- Dispensere til overflødig cecal slurry tilbake i microcentrifuge røret til riktig mengde cecal slurry til en mus, som var beregnet for individuelle mus i trinn 3.2.5 (j), er lastet i sprøyten.
- Intraperitoneally injisere cecal slurry, i henhold til relevante lokale dyr omsorg institusjon retningslinjer, eller bruke fremgangsmåten nedenfor.
- I en BSC, separat neonatal mus fra demningen som beskrevet i trinn 3.1.
- Scruff musen av baksiden av halsen, ved hjelp av tommelen og pekefingeren.
- Sikre musen er halen på baksiden av den og ringfinger, eller på forsiden av pinky og ring fingrene.
- For å minimere lekkasjer, tilt neonatal musen slik at den vender nedover og sett inn nålen skråkant nålen grossist, mellom skaftet og genitalia, holde nålen grunne og underhud.
- Når nålen settes 1 cm, trykk nedover og videresende for å føle nålen punktering peritoneum. Langsomt trykk ned stempelet, holde spissen av nålen så stødig som mulig, så laterale bevegelser kan skade musen er organer.
- Nøye trekke nålen 5-10 s, følge samme rute ut som avslappende langfingeren under fjerning å redusere spenningen i musen er kroppen.
- For å se etter lekkasjer, hold musa for et par sekunder etter fjerning av nålen, å gi tid for injeksjonsstedet lukkes, og observere noen lekkasje eller utstående på injeksjonsstedet, da musen ikke bør brukes i analysen.
Merk: Svulmende av huden på injeksjonsstedet indikerer en mislykket intraperitoneal injeksjon, med injectant blir subkutan. - Plasser musen på et papirhåndkle og la musen for å ta et skritt. Hvis musen er immobile for 5 s, trykk lett halen.
- Plukke opp musen og se etter noen lekkasje av cecal slurry på injeksjonsstedet. Hvis det er en lekkasje, utelate musen fra analysen og euthanize musen.
4. musen overvåking
- Overvåke musene regelmessig for å kontrollere om ankommer en human endepunkt.
- Observere musene 2t postchallenge for noen knyttet komplikasjoner.
- Overvåke mus 12t postchallenge for sepsis-relaterte sykelighet og identifikasjon av mus på en human endepunkt (se trinn 4.2-4.3 vilkår).
- Senere Overvåk hver 4-6 h for de 3 første dagene, unntatt 8t over natten, når neonatal mus er uovervåket.
- Utover 2 dager postchallenge, overvåke 1 x-2 x per dag. Hvis syk mus eller mus som helse score reduserer er observert, så øke overvåking frekvensen til hver 4-6 timer.
- Overvåking neonatal mus
- For noen prosedyre som involverer neonatal mus, overføre bedding materiale å en ny bur som beskrevet i trinn 3.1 (av samme grunner som nevnt det). Nøye sjekk for eventuelle nyfødte som blir dratt fra redet mens sykepleie. Noen mus som blir dratt ut av kullet mens sykepleie ikke bør anses å være spredt mus.
- Når du fjerner toppen av reiret, identifisere alle spredning av neonatal mus enten fra redet eller fast i hekkende materiale, men fra deres littermates, med unntak av mus dratt vekk fra kull mens sykepleie. Se Human sluttpunktet kriterier i trinn 4.5 Hvis musen er funnet spredt.
- Måle mus rettende reflekser og mobilitet.
- Et papirhåndkle, plasserer musen på ryggen og overvåke for sin evne til å rette seg maksimalt 4 s. Når plassert på ryggen, falle musen til enten venstre eller høyre side, som er når 4 s greven begynner.
Merk: For å være klassifisert i gruppen "Rettigheter", musen skal kunne få minst tre av fire pote pads på tørkepapir for 1 s. Det er fortsatt gruppert som kunne høyre seg hvis den faller over.- Hvis musen kan høyre seg, deretter vente på 8 å bestemme nivået av mobilitet.
- Kategorisere musen som "Rettigheter-mobil" Hvis den kan høyre seg og utforske omgivelsene med flere tiltak på rad.
- Kategorisere musen som "Rettigheter-apatisk" Hvis den kan høyre seg og ta noen skritt å utforske omgivelsene. Mus i denne gruppen kan falle over mens du tar et skritt, se vaklende på beina og pause mellom trinnene.
- Kategorisere musen som "Rettigheter-Nonmobile" Hvis den kan høyre seg men ikke flytte rundt mye. Det kan fremdeles falle over, og det ikke tar eventuelle trinn i 8 s, er det gruppert som rettigheter-Nonmobile.
- Hvis musen ikke kan riktig selv, deretter kategorisere sin mobilitet basert på observerte hip bevegelse.
Merk: Unngå å gjenta overvåking eller øke lengden av tid musen bruker på ryggen fordi dette kan påvirke poengsystemet og Human sluttpunktet, som en mus som ikke klarer å rette seg innen 4 s kan noen ganger gjøre det hvis gitt mer tid.- Kategorisere musen som "ikke høyre (FTR)-Mobile" Hvis det ikke til høyre seg og viser hip bevegelse som overskrider 90° vinkel fra vannrett. Noen mus kan rette seg selv hvis gitt mer enn 4 s men fortsatt bli kategorisert som FTR, med mobilitet score basert på hip bevegelse.
- Kategorisere musen som "FTR-apatisk" Hvis det ikke til høyre seg og viser hip bevegelse under 90° vinkel fra vannrett.
- Kategorisere musen som "FTR-Nonmobile" Hvis den ikke er i stand til høyre seg og har ben som riste eller vibrere men ingen hip bevegelse. Lemmer kan utvide eller trekke men gjør ikke har sideveis bevegelse. Musen er synlig syk og har nådd Human sluttpunktet.
- Et papirhåndkle, plasserer musen på ryggen og overvåke for sin evne til å rette seg maksimalt 4 s. Når plassert på ryggen, falle musen til enten venstre eller høyre side, som er når 4 s greven begynner.
- Gjenta trinn 4.3 på den andre siden av musen, innspillingen begge sider.
Merk: Se Utfyllende fil for opptak observasjoner. - Avgjøre om musen på en human endepunkt og krever euthanasia som beskrevet i tabell 1, og under.
- Kategorisere mus i forskjellige rettende og mobilitet nivåer basert på overvåking observasjoner i trinn 4.3 og 4.4. Musen er mobilitet er målt på hver side, og mobile virkemåten brukes til å bestemme om musen krever euthanasia.
- Tilordne alle mus med en rettende refleks (a) FTR-Nonmobile eller (b) FTR-Lethargic og fant atskilt fra redet på en human endepunkt.
- Overvåke tidspunkt utover 20 h postchallenge, klassifisere alle mus med en rettende refleks av "ikke å høyre" på begge sider som på en human sluttpunktet, fordi datatypen presentert forutsi med høy nøyaktighet at disse musene til slutt gi etter for sykdom, ikke og gjenopprette.
- Separat mus som skal være euthanized, som bestemmes i trinn 4.5. Hvis overvåkede musen ikke er sett på en human sluttpunktet, Legg den i det andre tomme reiret i nye buret uten demningen, og fortsette med de andre neonatal musene.
- Når hele søppel har blitt overvåket, flytte halvparten av hekkende materialet inn i buret med demningen, reformere et reir med plass i midten neonatal musene.
Merk: En feil reir kan føre til at mus til å splitte og redusere mengden av tilgjengelig omsorg som dammen kan tilby. - Overføre neonatal musene tilbake inn i buret med demningen.
- Sett søppel i reiret ved å sette det leftover hekke materialet over søppel og forsiktig klemme den rundt du lokket secure hekkende materialet på plass.
- Euthanize neonatal musene i trinn 4.6 i henhold til lokal institusjon.
5. Serine cecal gjødsel
- Utfordre musene på ønsket utfordring dose (del 3) og overvåke resultatene (del 4).
- Observere om det endelige resultatet gir den ønskede LD og hvis ikke, gjentar seksjoner 3 og 4 med et nytt kull på et høyere eller lavere utfordring dose, justere den ved 5% - 10%.
Merk: Challenge doser kan ligne på figur 1B men skal titered i hvert anlegg og stamme av mus. - Også observere om musene oppnå en human endepunktet raskere eller langsommere enn forventet kinetics i figur 1B, og gjenta 3 og 4 med et nytt kull på et høyere eller lavere utfordring dose, justere den ved 5% - 10%.
Representative Results
Cecal slurry levedyktighet lagret på-80 ° C kan bli testet over tid av serielt fortynne og plating dele cecal slurry aksjer på 5% sau blod tryptic soya agar etterfulgt av 24 timer med aerobic inkubering på 37 ° C. Etterfølgende telling av culturable colony-forming unit (CFU) innholdet i en cecal slurry forberedelse ble funnet ikke for å endre over en 6 måneders periode, og levedyktigheten var ikke påvirket av langvarig lagring ved-80 ° C (figur 2). Hver giver musen resulterte i gjennomsnitt i nok cecal slurry å utfordre tre til fire søppel (data ikke vist).
Mus utfordret DOL 7 med cecal slurry å indusere polymicrobial sepsis begynte å Human sluttpunktet innen 12 timer av utfordringen og polymicrobial sepsis ble hovedsakelig løst ved 48t postchallenge, som observert i en Kaplan-Meier overlevelse kurve kombinert fra data fra over 200 utfordret mus (figur 1A). Lethality var avhengig av utfordringen dosen gis, med en 5% endring i utfordringen dose som resulterer i en omtrent 15% forskjell i overlevelse (figur 1B). Musen kroppsvekt ble målt på hver overvåking besøk. Vekttap ble sett i alle utfordret dyr, blir nondiscriminatory mellom musene som havnet overlevende og de som ikke under innledende 24 h postchallenge (figur 1 c). Etter 24 timer begynte de fleste bevarte dyr å gjenvinne sin vekt, mens alle nonsurvivors fortsatte å miste vekt og flyttet til deres Human endepunkt. Imidlertid en liten andel av overlevende dyr som hadde beholdt sin rettende refleks fortsatte å miste vekt eller kunne få vekt, til slutten av eksperimentet selv mister så mye som 20% av sin opprinnelige kroppsvekt innen 40 timer av utfordringen. Det var en overlapping av vekttap mellom musene som havnet overlevende og de som ikke, kan endringen i vekt eller en terskel for vekttap ikke brukes som et kriterium for Human sluttpunktet samtidig opprettholde målet nøyaktig dele overlevende fra nonsurvivors.
Virkemåten til mus var overvåket som skissert i protokollen og i tabell 2. Øyeblikksbilder av helse kategoriene vises (figur 3A-C). Bildene viser forskjellige helse kategoriene av mus som ikke klarte å rette seg selv etter blir plassert på ryggen og skissere forskjellen på FTR-Mobile og FTR-apatisk, som er et viktig skille. Uimotsagt sunne mus i denne alderen Vis ikke FTR-apatisk aktivitet. Derfor er denne helse kategorien en markør av sykdom og Svar å utfordre. Syk mus vises FTR-apatisk symptomer (figur 3B) og kunne regress mot FTR-Nonmobile (Figur 3 c), der den øvre Ben forblir parallelt med bunnen beinet, med liten eller ingen hip rocking bevegelse, som er en av kriteriene for Human endepunkt. Musene kan også gjenopprette, få økt hip bevegelse og bli FTR-Mobile (figur 3A). Rettende refleks og mobilitet score var bestemt for både venstre og høyre side av hver musen, og den høyeste poengsummen ble benyttet for å avgjøre om musen hadde nådd en human endepunkt. Atferdsdata informasjon ble samlet inn over 240 dyr utfordret med en dødelig dose 60 (LD60) cecal slurry, og 144 Human endepunktene ble observert (figur 3D-F og tabell 1). Dette bevis-drevet tilnærming ble brukt til å definere og avgrense Human sluttpunktet over fire sykdom stadier, kategorisert etter forskere basert på begge atferdsdata forskjeller mellom overlevende og nonsurvivors og ved brøkdel av Human endepunktene nådd under hver tidsramme. Under tidlig eksperimenter fant konsekvent FTR-Nonmobile mus som hadde ingen hip bevegelse død innen 4-6 timer med dette å bli observert. I samlingen av presentert informasjon, ble en FTR-Nonmobile helse score brukt som kriterium for en human sluttpunktet. Fra 12-21 h postchallenge, mens FTR-Nonmobile mus var euthanized, både overlevende og nonsurviving dyr vises ligner atferdsmønster, og kan ikke skilles i noen annen måte (finne 3D). Fra 21-48 h postchallenge, fleste overlevende mus gjenvant sin rettende refleks, mens mindre enn 1% av FTR observert var i dyr som kom til å overleve eksperimentet (figur 3E). Mus som ikke klarte å rette seg selv fra begge sider ble dermed et tilleggsvilkår for Human sluttpunktet i denne perioden. Mellom 12 og 20 h postchallenge, ble 12,5% av totalt antall Human endepunktene observert, versus 80,5% mellom 20 og 48 h, og 7% etter 48 h (tabell 1). Et særtrekk mellom mus som endte opp overlevende som til slutt forverret en human endepunktet var tapet av rettende refleks, uavhengig av hip mobilitet (figur 3F). Faktisk mellom 20 og 48 h etter utfordringen, hadde totalt 121 mus mislyktes i å rette seg selv fra begge sider, med 116 av disse musene senere videre til en human sluttpunkt (som representerer en 96% nøyaktighet identifisere mus som ikke ville gjenopprette). Utover 48 timer etter utfordringen, ble 11 mus observert for å unnlate å rette seg selv fra begge sider, og 10 av disse kommet til en human sluttpunktet (en 91% nøyaktighet). Utover 20 h etter utfordringen spår antall mus som mistet rettende refleks for begge sider sluttresultatet med en nøyaktighet på mer enn 90%; Derfor er dette lagt til Human endepunktet kriteriene, identifisere nonrecovering mus tidligere og redusere musen lidelse (tabell 1).
Frekvensen at mus må overvåke endringer over tid, på grunn av ulike priser av død postchallenge, og er beskrevet i tabell 1. En mus ble ansett å være Human endepunktet når som helst hvis det hadde ikke til høyre seg og vises nonmobile hip bevegelse på begge sider, eller hvis musen ble funnet spredt fra redet, kunne høyre seg, og hadde apatisk hip bevegelse. Mus med én av disse betingelsene ikke var ventet å bli avfallet og er observert for å være FTR-Nonmobile i 4-6 h. starter 20 h etter utfordringen, ble et nytt Human sluttpunkt lagt fordi presentert informasjon viser at det store flertallet av mus som FTR fra begge ender opp succumbing til sykdom.
Videoer, tabeller og ressurser i dette manuskriptet er en effektiv opplæring ressurs for korrekt opptreden tildelingen av utfordret mus. Syv forskere ble bedt om å se trening video og lese både protokollen og tabellene før atferd 60 utfordret dyr. Identifikasjon av Human endepunktet tildelingen var nøyaktig både skille FTR-Nonmobile mus fra mus som vises andre atferd (figur 4A) og FTR mus fra mus som kunne rette seg selv innen den tillatte tidsrammen ( Figur 4B).
Figur 1 : Kaplan-Meier overlevelse kurve, cecal slurry dose titrering og vekt endre følgende cecal slurry utfordringen. (A) overlevelse utfallet av neonatale C57BL/6J mus utfordret med en intraperitoneal cecal slurry injeksjon på DOL 7. Dataene for denne illustrasjonen ble kombinert fra uavhengige eksperimenter ved hjelp av flere utfordring doser, mellom 0,7 1.3 mg cecal slurry per gram kroppsvekt ble administrert mus. (B) Neonatal mus utfordret med 0,80 til 0,95 mg cecal slurry per gram kroppsvekt fra en cecal slurry forberedelse vise en doseavhengig sammenheng mellom mengden av cecal slurry gitt og andelen av overlevelse. ()C) prosentverdien for endring i vekt sammenlignet med utfordringen vekten, med den stiplede linjen angir en 20% tap av vekt fra tid av utfordringen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Endrer ikke CFU konsentrasjon i cecal slurry lager lagret på-80 ° C over en 6 måneders periode. Effekten av cecal slurry alder på CFU konsentrasjon ble testet ved hjelp av lineær regresjon. Hvert punkt representerer én aliquot med den samme cecal slurry forberedelsen, serielt utvannet og belagt over en 6 måneders periode. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Hip mobilitet kategorier av mus som ikke klarer å rette seg selv og dyrenes atferd på ulike tider postchallenge. Mus som har blitt utfordret med sepsis, når den plasseres på ryggen, viser tegn til sykelighet som kan måles av graden av hip bevegelse. (A) A ikke høyre (FTR)-Mobile musen viser hip rocking bevegelse av deres øverste benet over 90 ° vinkel fra vannrett. (B) en FTR-apatisk musen viser hip rocking bevegelse men ikke overstige 90 ° vinkel fra vannrett når som helst under 4 s overvåking. (C) noen FTR-Nonmobile mus vil utvide sine ben, bøyd på kneet, men vil vise lite (mindre enn 10 ° vinkler) til null hofte rocking bevegelse og bena vil være parallelle med hverandre. (D) dyrenes atferd 12-21 h postchallenge viser at bare FTR-Nonmobile atferd skille overlevende fra nonsurvivors. (E) fra 21 til 48 h postchallenge, bare 4 av 592 observert FTR atferd (0,67%) tilhører overlevende, slik at den rettende refleks å forutsi endelige utfallet og brukes som en ny criterium for Human sluttpunktet. (F) utover 48 h postinfection, 6 av 131 mus (4.55%) som hadde en rettende refleks gikk på å bli en del av gruppen FTR og ble ofret ved slutten av forsøket, rettferdiggjøre vedvarende overvåking i løpet av utvinning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Pedagogiske ressurser føre nøyaktig atferdsmessige klassifisering av uavhengige forskere. Forskere trent ved å se på videoen som følger med denne protokollen kategorisert videoer av 60 neonatal mus i ulike helsemessige grupper. (A) muligheten til å skille en human endepunktet ble bestemt og gjennomsnittlig 97% av atferd var nøyaktig kategorisert som FTR-Nonmobile eller ikke, mens bare 1% av FTR-Nonmobile mus var feilidentifisert. To prosent av musene ble feilaktig identifisert som FTR-Nonmobile. (B) identifikasjon av det andre humane endepunktet criterium riktig skille mellom FTR mus eller de som har evnen til å rette seg selv i 4 s blir plassert på ryggen var riktig tilordnet i 97% av scorings, mens bare 0,96% av mus ble feilaktig tildelt som rettende seg og 2% av mus ble feilaktig tildelt som FTR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Sykdom scenen | A: høy sykelighet, dødelighet ingen | B: høy sykelighet, lav dødelighet | C: høy sykelighet, høy dødelighet | D: lav sykelighet, lav dødelighet |
| Timer innlegg utfordring | 0−12 | 12−20 | 20−48 | > 48 |
| Overvåking frekvens | 2t innlegg utfordring | hver 4−6 h | Hver 4−6 h, 8 h, uovervåket over natten | 1−2 ganger daglig, mer om nødvendig |
| Andelen totale Human endepunktene observert | 0/144 | 18/144 | 116/144 | 10/144 |
| Prosentandel av Human endepunktene observert | 0% | 12,5% | 80,5% | 7% |
| Human endepunktet kriterier | 1. FTR−Nonmobile på begge sider | 1. FTR−Nonmobile på begge sider | ||
| 2. spredt reir og er FTR−Lethargic | 2. spredt reir og er FTR−Lethargic | |||
| 3. FTR både venstre eller høyre side (med noen mobilitet score) | ||||
Tabell 1: frekvens overvåking og Human endepunktet kriterier i ulike stadier av sykdommen. Overvåking frekvens, Human endepunktene observert, prosentandelen av Human endepunktene og Human endepunktet vilkår under ulike stadier av sykdommen.
| Rettende refleks | Mobilitet | Tidsbegrensning til høyre etter blir plassert på ryggen | Tidsfristen for å måle mengden av bevegelse (mobile / apatisk / nonmobile) | Mobilitet kriteriene |
| Rettigheter | Mobile | 4 s | En ekstra 8 s | Musen tar flere trinn i en rad, opprettholde frem fart, og undersøker omgivelsene. Pup falle ikke. |
| Sløv | Musen kan ta et skritt, men vil stoppe og stoppe før du tar en annen. Pup kan falle. | |||
| Nonmobile | Musen tar ikke trinn etter rettende selv. Pup kan falle. | |||
| Ikke rett | Mobile hofter | Den samme 4 s brukes til å måle rettende refleks | Har energisk hip bevegelse med den øvre etappen roterer utover 90° fra horisontal minst en gang i 4 s. | |
| Apatisk hofter | Hip bevegelse til men ikke utover 90° fra horisontal. | |||
| Nonmobile hofter | Lemmer kan flytte ved å utvide og trekke men hoftene roterer ikke. Pup ser veldig sykelig. |
Tabell 2: tabell og kriterier for å avgjøre helse score på mus. Angitte kriterier ble brukt til å definere helse kategorigrupper til mus, og for å redusere personlige variansen i tilordne helse score.
Discussion
Postnatal neonatal mus har svært begrenset mobilitet og ikke klarer å rette seg selv etter blir plassert på ryggen, selv når uimotsagt. Av DOL 7 år mus utfordret i denne modellen, en rekke bevegelse som spenner fra rettigheter-Mobile til FTR-Mobile ble observert i uimotsagt mus, med en viktig forskjell, nemlig at en ubestridt mus i denne alderen ikke vise FTR-apatisk atferd. Bare mus utfordret med polymicrobial sepsis ble observert for å bli FTR-apatisk; Dette svaret kan derfor være en markør av sykdommens alvorlighetsgrad. Å være oppmerksomme til cut-off av en 90-graders vinkel fra vannrett for hip bevegelse gir konsistent og presis tildelingen av sløv eller mobil hip bevegelse i mus. Tidsrammen 4 s se hvis musen kan rett selv ble valgt fordi uimotsagt mus kunne konsekvent rett seg innenfor denne tidsrammen. Gjentatt måling av samme musen ble unngått, mens tiden å rette seg selv og måling av hip mobilitet var begrenset til 4 s, for å unngå overdreven slitsomt musen, som ellers kunne berøre dens evne til å skaffe mat og varme og kan påvirke sin prognosen å bli bedre. Rettende seg fra både venstre og høyre side ble observert og høyere av poengsummer ble brukt til å fastslå om musen på en human endepunkt, fordi noen mus ble funnet for å vise FTR-Nonmobile på den ene siden men har en høyere mobilitet på den andre siden og b e gjenopprette til slutt.
Poengsystemet brukes til å evaluere musen helse avhengig av anvendelsen av kategoriske konsentrasjon til hva er et spekter av bevegelse, og derfor kan være utsatt for personlige bias. Personalet var trent sammen å sikre hver person scoret musene samme; imidlertid vil det sannsynligvis være et nivå av subjektivitet fører til variasjon. Konsistensen av scoring ble vurdert ved syv forskere som ikke hadde tidligere spilt neonatal musen overvåking lære kravene i denne protokollen og video, uavhengig tilordne atferd og bestemme Human endepunktet. En 97% nøyaktighet ble observert med scoring utføres på 60 utfordret mus, antyder at personlige bias ikke spille en betydelig rolle i atferdsdata tildelingene av denne modellen. Presentert atferdsmessige overvåking protokollen er basert på observasjoner av dyr utfordret på DOL 7, men mus yngre enn 6 dager i en ubestridt sunn tilstand konsekvent rette ikke seg selv. Dermed kan beskrevet Human endepunktet kriteriene ikke brukes direkte til yngre mus. Hvis yngre mus brukes i denne eksperimentell modell eller en annerledes utfordring modell med forskjellige sykdommen kinetics brukes, må deretter passende Human endepunktet kriterier være utviklet og testet for å unngå euthanasia mus som ville ellers, til slutt, gjenopprette. Scoring system viser en robust metode for å forbedre Human endepunktet klassifisering som, med testing og bekreftelse, kan potensielt brukes til andre modeller.
Hver utarbeidelse av cecal slurry eller bruk av en ny mus belastning kreves retitration av cecal slurry dosen administrere for å oppnå en lignende dødelig dose. Hvert preparat ble standardisert av avlesning av interesse, nemlig overlevelse, enn å gi den samme bakterielle tellingen. Hver cecal slurry forberedelse levedyktig bakteriell konsentrasjon varierte litt, potensielt skyldes forskjeller i donor gram-negative bakterier eller avvik i vekten igjen i cellen silen av cecal slurry lager postfiltration. Under Serine cecal gjødsel, de to første kull ble delt i to grupper og hver halvdel av søppel ble utfordret med en av to doser slik at hver av doser vil bli testet i to. Hvis den resulterende overlevelse ikke samsvarte ønsket nivå, deretter utfordring dosen var enten økt eller redusert med 5% - 10% og forsøket gjentas. Flere kull ble brukt hensyn til kull-til-kull forskjeller som kan føre til motstand eller økt mottakelighet for sepsis over en søppel. Det var viktig å nøyaktig titer cecal slurry aksjen med hver ny forberedelser for å sikre at nye Serine cecal slurry var sammenlignes med tidligere cecal slurry forberedelser. Overflødig støy og vibrasjon, spesielt under komprimering av asfalt og bygging av en bygning i nærheten og road, ble observert for å øke stress i demninger. Dette korrelert med økt forekomst av cannibalization og påvirket dødeligheten blant den overlevelse eksperimenter, selv påvirker uimotsagt mus, som angir at det kan være unødvendige virkninger på neonatal overlevelse som også må kontrolleres for.
Tidligere metoder for cecal slurry lager forberedelse inkludert bruk av fersk cecal slurry eller utarbeidelse av frosne cecal slurry, bruker en rekke metoder, inkludert lagring i glyserol som vil uunngåelig bli overført under utfordringen. Mens bruken av fersk cecal slurry inneholder også fordelen av en bakteriell komposisjon nærmest opprinnelige cecal innholdet, er risikoen av avvik mellom individuelle donor mus på grunn av variasjoner av gram-negative bakterier. Mens dette var minimert ved hjelp cecal givere fra samme leverandør med minimal tid mellom ankomst og progresjon av eksperimentet, dette kan bli en pris prohibitive alternativ for noen laboratorier og presentert en timing logistikk utfordring i å ha alder-matchet mus tilgjengelig når begynner en cecal slurry eksperimenter i neonatal mus som var 7 dager gamle. En alternativ metode å bruke fersk cecal slurry ble benyttet, der flere voksne donorer cecal innholdet var samlet, resuspended i D5W, fryses på-80 ° C uten glyserol, og tint én aliquot om gangen for eksperimenter. Utnyttelsen av voksen donor cecal slurry å studere neonatal sepsis kan potensielt overføre arter av bakterier i cecal gjødsel som neonatal musen ikke har vært utsatt for, men det er en strategi som muliggjør studiet av sepsis i neonatal mus og har blitt brukt til å studere neonatal musen biologi i siste13,14,15. Cecal slurry var fortynnet i D5W å gi næring til bakterier, som tillot etableringen av en aktiv infeksjon når bakterier ble injisert, og ble gjort for å etterligne tilgjengeligheten av næringsstoffer i bukhulen under necrotizing enterokolitt. Glyserol ble ikke inkludert som en stabiliserende agent i iskaldt bakterier på grunn av den potensielle negative bivirkninger som kan oppstå fra glyserol injeksjon alene. Hvis glyserol hadde vært med i cecal slurry utarbeidelse, deretter den potensielle skaden at glyserol alene kan indusere ville nød å bli testet for ved å inkludere en bare glyserol (mangler cecal slurry) injeksjon i mus, som ville ha økt mus bruk. Bakterier levedyktigheten til cecal slurry aksjer ble testet etter frysing cecal slurry lager uten glyserol og ble funnet for å være konstant, med ingen endring i bakterier konsentrasjon i separate dele den samme cecal slurry forberedelser lagret på-80 ° C over en 6 måneders periode. Dette antyder at lagringen uten glyserol er mulig å gi en konsistent biologiske utfall. Bruk av en bulk forberedt frosset cecal slurry lager også tillatt for bruk av mus avlet internt, redusere kostnader og utnytte mannlig musene som ellers ville være overflødig fra oppdrett, derfor redusere musen svinn.
Identifikasjon av mislykkede utfordringer i mus var viktig å unngå å legge ekstra støy til systemet. Etter å ha gjennomgått en intraperitoneal injeksjon av cecal slurry, ble musene observert etter en kul under huden, som indikeres en mislykket injeksjon som var faktisk subkutan. Mus ble observert lekkasjer på injeksjonsstedet, både umiddelbart etter nålen fjerning og etter tillater dem å ta et skritt etter injeksjon, fordi mus ville noen ganger (sjelden) lekkasje etter flytting ben i injeksjonsstedet ved å ta et skritt. Tilstedeværelsen av en kul eller lekkasje etter injeksjon resulterte i fjerne musen fra analysen. Tross alt, kan noen av disse resultere i et annet resultat på grunn av feil mengden cecal slurry injisert som en 5% forskjell i utfordringen dose har blitt observert for å påvirke påfølgende overlevelse.
Cecal slurry utfordring eksperimenter ofte krever ulike mål dødelige doser med varierende vekt-justert doser. Grunnet dette, kan injeksjon volumer variere fra så lite som 20 µL og opp til 100 µL. Forholdsmessig eksperimentelle feil forbundet med døde nål volumet endres også sammen med injeksjon volumet, økende vanskelighetsgrad å direkte sammenligne forskjellige doser. Med enkel endring av standardisere injeksjon volumet, fjernes denne kilden avvik fra eksperimentet.
Neonatal musen er atferdsdata overvåkingssystem brukes i denne protokollen er først i sitt slag. Forskere hensikt å drive etisk forskning med nyfødte mus er ofte møtt med utfordrende mangelen på ressurser å vurdere dyrets velvære i denne alderen. Presentert intuitivt og enhetlig overvåking systemet begynner å ta denne kunnskapen hullet. Viktigere, denne bevis-drevet ikke bare øker kvaliteten på eksperimentelle data innhentet men på samme tid, reduserer også lidelsene til forsøksdyr.
Disclosures
Dr. James Wynn mottar støtte fra National Institutes of Health (NIH) / nasjonale Institutt for generelle medisinske basalfag (R01GM128452) og NIH /Eunice Kennedy Shriver nasjonale Institutt for Child Health and Human Development (NICHD) ( R01HD089939).
Acknowledgments
Spesiell takk til Claire Harrison og dyr omsorg anlegget på British Columbia Children's Hospital Research Institute (BCCHR) for deres støtte i dyr arbeidet, samt til Dr. Po-Yan Cheng for deres veiledning og innspill til dyr overvåking og velvære.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1 - 20 μL pipette tips | VWR | 732-0799 | |
| 1.8 mL Microcentrifuge tube | Costar | 3621 | |
| 100 - 1000 μL pipette tips | VWR | 732-0801 | |
| 1 - 200 μL pipette tips | VWR | 732-0800 | |
| 15 mL Centrifuge tube | FroggaBio | TB15-25 | |
| 23G1 needles | Becton Dickinson | 305145 | only the needle, not the syringe, used for pinning mouse to styrofoam |
| 28G 0.5 mL Insulin syringe | BD | 329461 | |
| 2 mL Cryogenic vial | Corning | 430488 | |
| 50 mL Centrifuge tube | Fisher scientific | 14-432-22 | |
| 5 mL pipette | Costar | 4487 | |
| 6 - 10 week old C57BL/6J adult mice | Jackson Laboratories | 664 | |
| 7 + day old C57BL/6J neonatal mice | Bred in house | n.a | |
| 70 μm Cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Defibrinated Sheep's Blood | Dalynn | HS30-500 | |
| Dextrose 5% Water (D5W) | Baxter | JB0080 | |
| Dissecting forceps | VWR | 82027-386 | |
| Dissecting Scissors, Sharp Tip | VWR | 82027-592 | |
| Dissecting Scissors, Sharp/Blunt Tip | VWR | 82027-594 | |
| Ethanol (HistoPrep 95% Denatured Ethyl Alcohol) | Fisherbrand | HC11001GL | diluted to 70% with double distilled water |
| Ethanol-proof marker; Lab marker | VWR | 52877-310 | |
| EZ Anesthesia Vaporizer | EZ Anesthesia | EZ-155 | |
| Germinator 500, Dry sterilize surgicial instrument (Hot bead sterilizer) | Braintree Scientific | GER 5287-120V | |
| Isoflurane | Fresenius Kabi | CP0406V2 | |
| Micro Spatula | Chemglass | CG-1983-12 | |
| Pipette-Aid | Drummond | 4-000-100 | |
| Rainin Classic Pipette PR-1000 | Rainin | 17008653 | |
| Rainin Classic Pipette PR-20 | Rainin | 17008650 | |
| Rainin Classic Pipette PR-200 | Rainin | 17008652 | |
| Scale | Sartorius | BL 150 S | |
| Specimen forceps | VWR | 82027-440 / 82027-442 | |
| Square 1000 mL Storage Bottle | Corning | 431433 | |
| Styrofoam board | Any | n.a | |
| Sure-Seal Mouse/Rat euthanasia chamber | Euthanex | EZ-178 | |
| Tryptic Soy Agar | Sigma-Aldrich | 22091-2.5KG | |
| VX-200 Lab Vortex Mixer | Labnet International | S0200 | |
| weigh paper | Fisherbrand | 09-898-12B |
References
- Liu, L., et al. Global, regional, and national causes of child mortality in 2000-13, with projections to inform post-2015 priorities: an updated systematic analysis. The Lancet. 385 (9966), 430-440 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Increased mortality and altered immunity in neonatal sepsis produced by generalized peritonitis. Shock. 28 (6), 675-683 (2007).
- Fink, M. P.
- Wynn, J. L., et al. Defective innate immunity predisposes murine neonates to poor sepsis outcome but is reversed by TLR agonists. Blood. 112 (5), 1750-1758 (2008).
- Cuenca, A. G., et al. Critical role for CXC ligand 10/CXC receptor 3 signaling in the murine neonatal response to sepsis. Infection and Immunity. 79 (7), 2746-2754 (2011).
- Gentile, L. F., et al. Protective immunity and defects in the neonatal and elderly immune response to sepsis. Journal of Immunology. 192 (7), 3156-3165 (2014).
- Cuenca, A. G., et al. Delayed emergency myelopoiesis following polymicrobial sepsis in neonates. Innate Immunity. 21 (4), 386-391 (2015).
- Gentile, L. F., et al. Improved emergency myelopoiesis and survival in neonatal sepsis by caspase-1/11 ablation. Immunology. 145 (2), 300-311 (2015).
- Wynn, J. L., et al. Targeting IL-17A attenuates neonatal sepsis mortality induced by IL-18. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (19), E2627-E2635 (2016).
- Fallon, E. A., et al. Program Cell Death Receptor-1-Mediated Invariant Natural Killer T-Cell Control of Peritoneal Macrophage Modulates Survival in Neonatal Sepsis. Frontiers in Immunology. 8, 1469 (2017).
- Young, W. A., et al. Improved survival after induction of sepsis by cecal slurry in PD-1 knockout murine neonates. Surgery. 161 (5), 1387-1393 (2017).
- Rincon, J. C., et al. Adjuvant pretreatment with alum protects neonatal mice in sepsis through myeloid cell activation. Clinical & Experimental Immunology. 191 (3), 268-278 (2018).
- Starr, M. E., et al. A new cecal slurry preparation protocol with improved long-term reproducibility for animal models of sepsis. PLoS ONE. 9 (12), e115705 (2014).
- Hansen, L. W., et al. Deficiency in milk fat globule-epidermal growth factor-factor 8 exacerbates organ injury and mortality in neonatal sepsis. Journal of Pediatric Surgery. 52 (9), 1520-1527 (2017).
- Fujioka, K., et al. Induction of heme oxygenase-1 attenuates the severity of sepsis in a non-surgical preterm mouse model. SHOCK. 47 (2), 242-250 (2017).
- Al Asmari, K. A., et al. Protective effect of quinacrine against glycerol-induced acute kidney injury in rats. BMC Nephrology. 18, PMC5273840 (2017).
- Geng, X., et al. Differences in gene expression profiles and signaling pathways in rhabdomyolysis-induced acute kidney injury. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 8 (11), 14087-14098 (2015).
- Kim, J. H., et al. Macrophage depletion ameliorates glycerol-induced acute kidney injury in mice. Nephron Experimental Nephrology. 128 (1-2), 21-29 (2014).
- Nara, A., et al. Evaluations of lipid peroxidation and inflammation in short-term glycerol-induced acute kidney injury in rats. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 43 (11), 1080-1086 (2016).
- Zager, R. A., Johnson, A. C. M., Lund, S., Hanson, S. Acute renal failure: determinants and characteristics of the injury-induced hyperinflammatory response. American Journal of Physiology Renal Physiology. 291 (3), F546-F556 (2006).
- Olfert, E. D., Godson, D. L. Humane Endpoints for Infectious Disease Animal Models. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 99-104 (2000).
- Canadian Council on Animal Care. Guidelines on: choosing an appropriate endpoint in experiments using animals for research, teaching and testing. , https://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Appropriate_endpoint.pdf (1998).
- Nemzek, J. A., Xiao, H. Y., Minard, A. E., Bolgos, G. L., Remick, D. G.
- Morton, D. B. A systematic approach for establishing humane endpoints. Institute for Laboratory Animal Research Journal. 41 (2), 80-86 (2000).
