Summary
כתב יד זה מתאר את הסינתזה של ננו-צינורית פחמן קיר אחד (SWCNT)-מצומדת MALAT1 antisense gapmer דנ א oligonucleotide (SWCNT-נגד-MALAT1), אשר מדגים מסירת SWCNT אמין, חזק טיפולית והשפעת anti-MALAT1 במבחנה, ויוו. שיטות להשתמש של סינתזה, שינוי, ההטיה, הזרקה של SWCNT-נגד-MALAT1 מתוארים.
Abstract
ננו-צינורית פחמן קיר אחד (SWCNT) הוא סוג חדש של ננו-חלקיק, אשר שימש כדי לספק מספר סוגי סמים לתוך תאים, כגון חלבונים, oligonucleotides, תרופות סינתטיות מולקולה קטנה. SWCNT המימדים הניתנות להתאמה אישית, שטחי אזור גדול, באפשרותך לאגוד בגמישות עם סמים דרך שינויים שונים על פני השטח שלו; לכן, זה מערכת אידיאלי להעברת סמים לתוך התאים. זמן noncoding RNAs (lncRNAs) הם מקבץ של יותר מ 200 noncoding RNA nt, אשר לא יכול להיות מתורגם לחלבון אבל יש תפקיד חשוב בתהליכים ביולוגיים, הקשורים pathophysiological. גרורות-הקשורים ריאות אדנוקרצינומה התעתיק 1 (MALAT1) הוא lncRNA שנשמרת מאוד. הוכח כי רמות MALAT1 גבוהות קשורות על פרוגנוזה גרועה סוגי סרטן שונים, לרבות מיאלומה נפוצה (מ מ). נחשפו MALAT1 מווסת את תיקון ה-DNA ומוות תא מ מ; לפיכך, MALAT1 יכול להיחשב מטרה טיפולית עבור מ מ. עם זאת, oligo antisense מסירת יעיל כדי לעכב/נוקאאוט MALAT1 ויוו היא עדיין בעיה. במחקר זה, לנו לשנות את SWCNT עם פג-2000 ו נזווג oligo anti-MALAT1 אליו לבדוק את המשלוח של מתחם זה במבחנה, תזריק את זה דרך הווריד למודל בעכבר של מ מ המופץ, להתבונן על עיכוב משמעותי של התקדמות מ מ, אשר מציינת SWCNT הזה הוא הסעה משלוח אידיאלי עבור gapmer אנטי-MALAT1 ה-DNA.
Introduction
SWCNT הוא nanomaterial חדשניים שיכולים לספק סוגים שונים של תרופות, כגון חלבונים, מולקולות קטנות, חומצות גרעין, stably וביעילות עם סבילות אידיאלי, רעילות מינימלית חוץ גופית1 וויוו2. SWCNT functionalized יש נהדר מסיסות הביו ומים, יכול לשמש הסעות עבור מולקולות קטנות יותר, והוא מסוגל לשאת להן לחדור את קרום התא3,4,5.
lncRNAs הם מקבץ של RNA (> 200 nt) זה משוקלטים מן הגנום ל mRNA אבל לא ניתן היה לתרגם את החלבונים. הוכחה גוברת הראו כי lncRNAs להשתתף ברגולציה של ביטוי גנים6 , מעורבים החניכה, התקדמות של רוב סוגי סרטן, כולל מ מ7,8,9. MALAT1 הוא תעתיק noncoding גרעיני מועשר 2 (NEAT2), מאוד שנשמרת lncRNA10. MALAT1 מזוהה בתחילה ריאות שאינם קטנים התא גרורתית סרטן (NSCLC)11, אבל יש כבר overexpressed רבים גידולים5,12,13; הוא נחשב לאחד lncRNAs ביטוי ביותר, הוא מתואם עם פרוגנוזה גרועה מ מ8,14. רמת הביטוי של MALAT1 גבוה משמעותית בחולים קורס קטלני extramedullary מ"מ לעומת אלו שאובחנו רק מ מ15.
במחקר הקודם, יש לנו אישר כי אנטי-MALAT1 oligos robustly לגרום נזק לדנ א אפופטוזיס מ מ16 באמצעות gapmer DNA antisense oligonucleotides מיקוד MALAT1 (אנטי-MALAT1) בתאים מ מ. ה-DNA gapmer המורכב antisense DNA, מקושרים על ידי 2'-הביתה-RNAs, אשר יכול לבקש MALAT1 המחשוף מאת RNase H פעילות פעם מאוגד17. יעילות משלוח ויוו antisense oligos עדיין מגבילה את השימוש הקליני.
כדי לבדוק את המשלוח אפקט של SWCNT אנטי-MALAT1 gapmer oligos, gapmer אנטי-MALAT1 ה-DNA היא מצומדת כדי DSPE-PEG2000-אמין functionalized SWCNT. SWCNT-נגד-MALAT1 מכן מוזרק לווריד מודל העכבר המופץ מ מ; עיכוב בולט הוא ציין לאחר ארבעה טיפולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המערבות בעלי חיים אושרו מראש על-ידי IACUC מרפאת קליבלנד (אכפת לי חיה המוסדית והוועדה שימוש).
1. סינתזה של Functionalized SWCNTs
- מערבבים 1 מ ג של SWCNTs, 5 מ"ג של DSPE-PEG2000-אמין ו 5 מ ל מים נטולי נוקלאז סטיריליים בקבוקון נצנוץ זכוכית (20 מ ל). לנער את זה טוב כדי להמיס כל ריאגנטים לחלוטין.
- Sonicate את המבחנה ב sonicator אמבט מים ברמת הכוח של 40 W לשעה בטמפרטורת החדר (RT, מינימום 20 x 3, להחליף את המים כל 20 דקות כדי למנוע התחממות יתר). לאחר מכן, centrifuge זה ב x 24,000 g עבור 6-אייץ ' ולאסוף את הפתרון supernatant. ניתן לאחסן פתרון פונקציונלי זה SWCNT ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודשיים.
- להוסיף 1 מ"ל של פתרון SWCNT מהשלב 1.2 למכשיר 100 kDa MWCO צנטריפוגלי מסנן, ואחריו 4 מיליליטר מים נטולי נוקלאז מעוקר. צנטריפוגה 10 דקות ב x 4,000 g ב- RT כדי להסיר תוספת DSPE-PEG2000-אמין. חזור על התוספת של 4 מ של מים, צנטריפוגה 5 x. יותר מ- 0.5 mL של שאריות SWCNT פתרון יישאר במסנן לאחר כל צנטריפוגה.
- למדוד את הריכוז של הפתרון SWCNT שאריות במסנן באמצעות ספקטרומטר של UV/VIS ב 808 nm לאחר כביסה הסופי. הריכוז הסופי הוא בדרך כלל כ 50 מ ג/ליטר (מחושבת על-פי השיטה שפותחה על ידי ואח קם18).
הערה: ודא DSPE-פג-functionalized ' SWCNTs הם מסיסים במים לאחר שלב 1.4 יציבים בפתרונות ביולוגיים שונים ללא צבירת גלויים לאחר מספר שבועות.
2. ההטיה של אנטי-MALAT1 Gapmer DNA ולצדו 2'-O RNAs ששונה כדי Functionalized SWCNT
- להוסיף 0.5 מ ג של Sulfo-LC-SPDP לתוך 450 µL של DSPE-PEG2000-אמין functionalized SWCNT. להוסיף µL 50 ל- 10 x PBS ולאחר מכן תקופת דגירה של 2 h-RT.
- כדי להסיר תוספת Sulfo-LC-SPDP, להוסיף את התגובה מ שלב 2.1 למכשיר 100 kDa MWCO צנטריפוגלי מסנן, ואחריו 4 מיליליטר מים נטולי נוקלאז. צנטריפוגה 10 דקות ב x 4,000 g -RT. חוזר התוספת של 4 מ"ל של מים, צנטריפוגה את 5 x.
- להוסיף 200 ננומטר תיול-השתנה anti-MALAT1-Cy3 gapmer DNA לתוך 1.5 מ של פתרון DTT מסחרי, תקופת דגירה של 90 דקות ב- RT. Purify את המוצר עם עמודה NAP-5, ע פ הפרוטוקול של היצרן. Elute האנטי-MALAT1-Cy3 עם µL 500 1 ללא נוקלאז סטיריליים x PBS.
הערה: ניתן לאחסן את SWCNT functionalized עם DTT נוסף, אשר ייתכן קליב דיסולפידי נוסדים במהלך האחסון של gapmer אנטי-MALAT1 thiolated ה-DNA. ניתן להסיר את DTT נוסף לפי עמודה aNAP-5 לפני ההטיה עם SWCNT. - לאסוף את הפתרון SWCNT DSPE-PEG2000-אמין sulfo-LC-SPDP-טיפול עזב את המסנן, לדלל את זה עם µL 500 של פתרון אנטי-MALAT1-Cy3. לאחר מכן, דגירה זה ב 4 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה. SWCNT-נגד-MALAT1 מצומדת שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3 שבועות. בעקבות הליך דומה SWCNT מצומדת עם oligo antisense לטרוף יכול להיות מסונתז והוא משמש SWCNT-control.
3. הזנב הזרקה לווריד של SWCNT-נגד-MALAT1
-
ליצור מודל העכבר המופץ מ מ.
- כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר של השוואה, לארגן באופן אקראי 14 במנוד ראש. CB17-Prkdcscid/J עכברים (בן 8 שבועות) משפט או פקד קבוצות (שבע בכל קבוצה) עם אותו יחס זכר/נקבה.
- לנקות את הספסל מבצע ולחטא אותו עם אלכוהול 70%.
- השתמש מנורת חימום כדי לחמם את העכבר כדי לעזור הזנב הווריד להופיע. לרסן את העכבר כראוי עם restrainer הזרקה הזנב.
- מזריקים תאים 5 x 106 MM.1S-לוק-mCherry 50 µL ל- PBS דרך הווריד של זנב ללא הרדמה. הקש ההזרקה עם ספוגית אלכוהול עבור 30 ס' סמן העכבר מוזרק ולהחזיר את כלוב נקי.
-
להתחיל את הטיפול ביום 7 אחרי הזריקה תא MM.1S.
- מזריקים µL 50 ל- PBS המכיל SWCNT-נגד-MALAT1 לווריד הזנב של העכבר. השתמש PBS המכילים SWCNT-הפקד כפקד.
- הקש ההזרקה עם ספוגית אלכוהול עבור 30 s.
- לצפות את הדימום המקומי על הזנב ואת ההתנהגות הכללית של העכבר עבור 1 דקות ולאחר מכן להחזירו כלוב נקי. להתבונן עכברים כל מוזרק שוב לפני שחזר לכלוב המדף, כדי לוודא כי הזריקות מתקבלים טוב.
-
לחזור על הזריקה כל 7 ימים עד לסיום הניסוי.
- לסיים את הניסוי כאשר הבריאות הכללית של העכבר מבזה: כשאני לא אוכלת או שותה, את המראה של כפות רגליים חיוור, דימום תת עורי, קוצר נשימה, ירד פעילות, שיתוק של הגפיים התחתונות, ו/או מסה שניתן לגעת בהם הבטן הוא ציין.
4. הערכת התקדמות המחלה
- להעריך את המצב הכללי של העכברים בכל יום אחרי הזריקה תא MM.1S-לוק-mCherry. שים לב במיוחד אם העכברים לפתח משתק של הגפיים התחתונות.
-
להעריך את הגידול באמצעות ויוו הדמיה המערכת 1 x שבוע, לפני הזריקה SWCNT-נגד-MALAT1.
- להכין טרי 15 מ"ג/מ"ל D-Luciferin עם 1 x PBS.
- עזים ומתנגד העכברים עם מכשיר אידוי איזופלוריין (3-5% עבור אינדוקציה ו 1 – 3% עבור תחזוקה, בהתאם למצב של העכברים).
- להזריק 150 מ"ג/ק"ג של D-Luciferin ב עכבר כל intraperitoneally, 5 דקות לפני הדמיה; לאחר מכן, תמונה העכברים במצב של שכיבה עם ספקטרום מערכת הדמיה.
- איסוף תמונות רציפים של העכברים כל 2 דקות, עד רוויה הפריה חוץ גופית. להתאים את מרווח הזמן לפי ספיגת/האות D-Luciferin.
- השתמש CO2 להקריב העכברים ברגע הסיום של הניסוי הוא הגיע.
-
מאז זה מודל המופץ מ מ, תהליך העכברים כדלקמן.
- שוקלים את העכבר לפני ניתוח.
- לאסוף דם היקפיים מכל הלב עבור וזמינותו ספירת דם (CBC) המבוצעת על ידי מכונה מונה תאי הדם. את ספירת תאי דם לבנים, תאי דם אדומים, כמו גם היחס של לימפוציטים, הן המדדים העיקריים.
- לבודד את הטחול, שוקל אותה. לחשב את היחס בין משקל גוף/טחול; שקול > 0.5% כמו הגדלת טחול.
- לאסוף את הרקמות של מח העצם, הטחול, לימפה, כליות, ואת הרקמה עם גרורות לעין.
- לאסוף את עמוד השדרה, אם העכבר של שיתוק של הגפיים התחתונות.
- חלץ RNA וחלבון בין דגימות מח עצם.
- לתקן את כל הרקמות הנותרים בפורמלין.
- עבור decalcification, לטבול את הדגימות עצם תמיסת EDTA 0.25 M (pH 8.0) 5 ימים לאחר 24 שעות של קיבעון.
- לטבול כל דוגמאות ב 75% אלכוהול לאחסון לטווח ארוך.
- להשוות את עוצמת האות של לוציפראז באותן נקודות זמן לשתי קבוצות. בין שתי הקבוצות, את תאריכי ההקרבה של כל עכבר ולחשב את עקומות הישרדות של שתי הקבוצות עם התוכנה.
הערה: כל ההליכים מסוכמות באיור1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כדי להדגים את השפעת עיכוב anti-MALAT1 gapmer-DNA מ מ, אנו הפיל את הביטוי של MALAT1, השתמש בה תאים H929 ו- MM.1S. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, התאים שנאספו לניתוח של יעילות דפיקה למטה, מצב אפופטוזיס בתאים transfected עם אנטי-MALAT1 gapmer או פקד ה-DNA. לרביעיית-PCR התוצאות הראו כי ה-DNA gapmer אנטי-MALAT1 הפיל את הביטוי MALAT1 בתאים H929 ו- MM.1S ביעילות (איור 2א). המצב של אפופטוזיס נקבע על ידי cytometry זרימה, אשר חשף MALAT1 ולמטה מוסדר המושרה אפופטוזיס באופן משמעותי (איור 2B).
תוצאות אלו מצביעות על כי oligos אנטי-MALAT1 לעכב מ"מ ביעילות במבחנה. עם זאת, משלוח יעילה שיטת/הסעה עבור אנטי-MALAT1 oligos ויוו צורך להתפתח, שהוא גם המכשול של oligos antisense ביישום קליני; ומכאן האינטרס שלנו ב- SWCNT. SWCNT הוא nanomaterial הרומן למשלוח סמים, אשר יכולים להתפתח hydrophilicity ו- dissolubility לאחר והתאמות; לכן, זה יכול לספק וחקלאיים בצורות שונות, כמו סמים oligonucleotide. כדי לאמת את היעילות משלוח של SWCNT ויוו, אנחנו קודם functionalized את SWCNT עם DSPE-PEG2000-אמינים, אשר ניחן ירידה לפרטים hydrophilicity ואיגוד SWCNT19. לאחר מכן, SWCNT תפקודית זו טופלה עם sulfo-LC-SPDP ליצור קבוצות sulfhydryl חינם, אשר ישמשו להתחברות oligo. כדי נזווג את oligo anti-MALAT1, את SWCNT sulfo-LC-SPDP-טיפול, שונתה 5' קצוות oligo anti-MALAT1 עם קבוצות תיול (S-S); לאתר בעליל את המשלוח, שונתה 3' קצוות oligo anti-MALAT1 עם cyanine 3 (Cy3). לאחר כל השלבים סינתזה, SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3 הושג (איור 1)12. . אז, זה נוספה המדיום התרבות של תאים H929-GFP ו- MM.1S-GFP כדי לאמת את היעילות משלוח.
כפי שמוצג באיור 2C, SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3 נמסרה ביעילות לתוך הגרעין של תאים מ מ ומדוכאים באופן משמעותי את רמת MALAT1 אנדוגני בתאים הן H929 והן MM.1S (איור 2D). כדי לבחון את רעילות והבטיחות של SWCNT בתאים נורמליים, SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3 נוספה במדיום של תאים BMEC-1 בריכוזים שונים; Lipofectamine היה הפקד הטיפול; בינוני רגיל שימש הפקד חיוניים (איור 2E). לאחר מכן, הכדאיות תא זוהה באמצעות ערכת assay תא הכדאיות על יום ראשון, יום שני ויום 3. אין הבדל משמעותי תא הכדאיות עיכוב נמצאה בין SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3 הפקד הטיפול במינונים שונים, נקודות זמן. היה הבדל לעומת רגיל בינוני (NC), המציין כי הרעילות של SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3 דומה הפקד טיפול, הכולל של רעילות מוגבל ומקובל בתאים נורמליים במינון גבוה.
בשלב הבא, דגם העכבר המופץ האדם-מ מ הוקמה כדי להעריך את השפעת הטיפול SWCNT-נגד-MALAT1 ויוו. קודם כל עכבר SCID-בז ' (של בן 8 שבועות) הוזרק עם 5 x 106 MM.1S-לוק-mCherry תאים לווריד (איור 3). סכום כולל של 14 עכברים הוזרקו תאים MM.1S; ביניהם, עכברים שבע היו מסודרים באופן אקראי לתוך קבוצת טיפול SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3, עוד שבע היו בקבוצת הביקורת. SWCNT-נגד-MALAT1 וגם SWCNT בקרת oligos היו התפרקה ב- 0.5 מ של 1 x PBS, מוזרק דרך הוורידים הזנב 7 ימים לאחר הזרקת תאי הגידול. הטיפול SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3 חזר על עצמו כל 7 ימים עד לסיום הניסוי. כדי להעריך את נטל הגידול, האות luciferin נצפתה על ידי ויוו הדמיה מערכת (IVIS) 30 דקות לאחר הזריקה luciferin 1 x שבוע לפני הזריקה SWCNT-oligo. מצאנו כי אותות luciferin של העכברים בקבוצה טיפול SWCNT-נגד-MALAT1 היו להפליא נמוך לעומת אלו של קבוצת טיפול SWCNT-בקרת לאחר 21 ימים של טיפול (מתוך 28 יום). מעמדם בריאות והישרדות שנבדקה הקליט כל יום, סיכם בעקומה קפלן-מאייר. מתוצאות אלה, הגענו למסקנה כי הטיפול SWCNT-נגד-MALAT1 באמצעות הזרקה תוך ורידי יכולה להעביר את oligos אנטי-MALAT1 תאים סרטניים ביעילות. ואז, מוגבל את נטל הגידול והרחבה לכלבים של העכברים (p = 0.04) כצפוי, אשר דומה לתוצאות במבחנה. לא מצאנו תופעות לוואי משמעותיות של הטיפול בעכברים במהלך תקופת הניסוי כולו, אשר ציין כי הזרקת SWCNT-נגד-MALAT1 הוא טיפול בטוח עבור עכברים; לכן, SWCNT היא מערכת ויוו בטוחה ואמינה משלוח עבור אנטי-MALAT1.
איור 1 : תרשים סכמטי של הסינתזה, הקליטה, ו ויוו דיסוציאציה של oligo gapmer SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3. (א) SWCNT functionalized עם DSPE-PEG2000-אמינים, לאחר מכן, מצומדת עם אנטי-MALAT1-Cy3 באמצעות הצמדה דיסולפידי מתווכת על-ידי Sulfo-LC-SPDP. אנטי SWCNT מצומדת (B)-MALAT1 היה מוזרק עם תאים MM.1S-לוק-mCherry דרך הווריד הזנב של העכבר. (ג) SWCNT מצומדת anti-MALAT1 חודר קרום פוספוליפידים bilayer דרך הכניסה או אנדוציטוזה. (ד) SWCNT-נגד-MALAT1 היה ארוז בתוך endosomes מוקדם לאחר הספיגה על ידי תאים; לאחר מכן, אנדוזום מוקדם הבשיל כדי אנדוזום מאוחר, התמזגה עם ליזוזום כדי ליצור את endolysosome. Endolysosome עוזר לשחרר anti-MALAT1 מ- SWCNT ידי לשבור את קשר דיסולפידי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : SWCNT-נגד-MALAT1 נמסרה בצורה יעילה עם רעילות מינימלית, המושרה אפופטוזיס שורות תאים מ מ. Oligo SWCNT-נגד-MALAT1 gapmer או SWCNT-בקרת oligo היו transfected מאת Lipofectamine לתוך תאים H929 ו- MM.1S, בהתאמה. ארבעים ושמונה שעות לאחר מכן, אספנו תאים עבור (A) הניתוח של הביטוי MALAT1 על ידי לרביעיית-PCR וניתוח אפופטוזיס (B) על ידי cytometry זרימה. (ג) H929-GFP ותאי MM.1S-GFP היו בתרבית במשותף עם SWCNT-נגד-MALAT1-Cy3 למשך 48 שעות; היעילות משלוח נקבע על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ (פסי בקנה מידה = 100 מיקרומטר). (ד) ofMALAT1 ברמה הביטוי אותרה על ידי לרביעיית-PCR, אשר הראו כי זה היה בהצלחה הפיל בתאים H929 ו MM.1S (* * p < 0.01, * * * p < 0.001). SWCNT (E) ואת הפקד טיפול נוספו לתוך מדיום התרבות של תאים BMEC-1 במינונים שונים. ההתפשטות נמדדה באמצעות ערכת assay תא הכדאיות. איור זה השתנה מ Hu et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : SWCNT-נגד-MALAT1 דיכאו מיאלומה גדל במודל עכבר המופץ MM.1S-תא-נבנה מ מ. תאים 5 x 106 MM.1S-לוק-mCherry (א) היו מוזרק לווריד לורידים הזנב של SCID-בז ' לקרינה עכברים (שבע בכל קבוצה); 50 μL של SWCNT-נגד-MALAT1 או SWCNT-בקרת פתרון הוזרקו כל 7 ימים דרך הווריד של הזנב מן היום ה-7 לאחר הזריקה תא MM.1S. IVIS שימש כדי לפקח על הגידול. (B) הגפיים האחוריות שיתוק ובעיות גידול הנטל שימשו נקודות קצה, הישרדות הנתונים נותחו על ידי ניתוח קפלן-מאייר. דמות זו שונתה מ Hu et al.16. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הראיות הוכיחו כי lncRNAs לקחת חלק מרכזי בויסות פיזיולוגיים רבים ושגרות pathophysiological ב סרטן, כולל7,מ מ8,9; יש להם פוטנציאל להיות ממוקד לטיפול בסרטן, אשר יכול להתממש מאת antisense oligonucleotides20,21,22. המזון והתרופות האמריקני (FDA) אישר מספר תרופות antisense oligonucleotide, כולל fomivirsen עבור רטיניטיס cytomegalovirus23, mipomersen עבור היפרכולסטרולמיה משפחתית homozygous24, nusinersen עבור ניוון שרירי עמוד השדרה25ו- eteplirsen עבור ניוון שרירים דושן26. במחקר זה, עלינו לשנות את gapmer אנטי-MALAT1 DNA עם 2'-הביתה-RNA, מצומדת זה עם SWCNT תפקודית. SWCNT נושא ומעבירה oligos אנטי-MALAT1 כמו הסעות, אשר לא רק לשפר את זיקתו של המטרה-oligo בשל הגמישות שלה וטעינה מרובים אך גם לייצב את oligos עזר למנוע השפלה נוקלאז במהלך הלידה27 .
שינוי מתאים על פני השטח של SWCNTs יכול לעזור זה מקבל dispersibility אמין בסביבות רלוונטי מבחינה פיזיולוגית, מימית ולקדם שלהם28,biodistribution29. השתמשנו DSPE-PEG2000-אמין כדי לשנות את SWCNT, אשר הוכח כדי להשתיל על SWCNT ולשפר את המסיסות מימית זה, אשר יתר על כן, הראתה יציבות מעולה ללא הצטברות מדיה ביולוגית30. Sulfo-LC-SPDP שימש crosslinker לניסוי, אשר סייע SWCNT functionalized לאגד את gapmer אנטי-MALAT1 הדנ א באמצעות הצמדה דיסולפידי ולאחר מכן להעבירם לתאי. ברגע SWCNT חדרו בתאים מ מ, הם היו נלקח על ידי בתחילת endosomes (pH ~ 6.0), אשר לאחר מכן הבשיל כדי endosomes מאוחר (pH ~ 5.0) בליווי של ערך ה-pH מופחתת31. היתרון של הקישור פג הוא לקשר יציב ב- pH > 6, אבל עד 75-95% של הסם מקושרים פג שוחרר בתוך שעתיים לאחר ה-pH הפך פחות מ 5.532,33,34. Endosomes נושא SWCNT-נגד-MALAT1 התמזגה עם lysosomes (pH ~ 4.5) כדי ליצור endolysosome ולאחר מכן את דיסולפידי אג ח היו מזורז על ידי תיול lysosomal רדוקטאז, אשר הופעל בצורה אופטימלית pH נמוך35. זאת, לאחר מכן, שוחרר חינם anti-MALAT1 gapmer DNA. על פי תוצאות הניסוי במבחנה, ויוו, SWCNT נמסר SWCNT-נגד-MALAT1 ביעילות ועזרו זה פועלים באופן דומה לפונקציה anti-MALAT1 במבחנה.
המעבר SWCNTs functionalized דרך פוספוליפיד bilayer באמצעות שתי תבניות: הכניסה36,37 ו אנדוציטוזה38,39. הליכים אלה לעזור את SWCNT לספק וחקלאיים לתוך תאים ללא מפריע הייצוב של קרום התא, ולכן מופחת הרעילות של SWCNT. הזרקנו 50 µL של SWCNT-נגד-MALAT1 (~ 40 mg/L) כל עכבר (~ 20 גרם); לפיכך, ריכוז התרופה הסופי היה 0.1 מ"ג/ק"ג, וזה הרבה יותר המינון שהשתמשנו בניסויים רעילות (2 מ ג/ליטר ו 4 מ ג/ליטר) נמוך. כמו הקודם התוצאות הראה, SWCNT יש השפעה דומה של הפקד טיפול (למשל, Lipofectamine) על צמיחת תאים ותואמים הכדאיות על המינונים. הפקד הטיפול הוא ריאגנט נפוצות עבור תאים תקנים, הוא האמין חייב של רעילות מוגבל ומקובל תאים; לפיכך, אנו מאמינים ש-SWCNT יש רק עם רעילות מינימלית עבור תאים נורמליים.
כמו הסעות עבור antisense oligonucleotides, חילוף החומרים הוא שיקול חשוב נוסף לשלומם של SWCNT. זה הוכח, כי functionalized SWCNT מופרש בעיקר דרך הכליות, ללא רעילות glomerular, צינורי40. לא מצאנו כליה תופעות הקשורות בתפקוד, כגון oliguria, anuria, בצקת, המראה שינויים הכליה, וכו ', בעכברים המקובל הזריקה SWCNT. לפיכך, SWCNTs יש ללא תופעות רעילות עקב הצטברות חריגה בכל עכבר עם פונקציה כליות רגילה.
אנו הראשונים נזווג תחושה אנטי oligonucleotides מיקוד lncRNA עם functionalized SWCNT, להשתמש בו לטיפול מ מ. SWCNT הוא סוג של הרומן nanomaterial, שבו יש כיראליות עקבית, קוטר אופציונלי ובהפצה אורך. לאחר טיפול functionalization, SWCNTs לפתח את מסיסות המים הביו ולהיות הסעה ביולוגי אידיאלי להעביר מטענים רבים דרך קרום התא, ובכך הגדלת הפצת סמים ושיפור אפקט הטיפול. בנוסף, SWCNT עשויה לייצב תחושה אנטי oligonucleotide מולקולות של נוקלאז עיכול1. התוצאות מציגות, נמסר MALAT1 לתוך תאים מ מ ביעילות SWCNT-נגד-MALAT1 functionalized, עכבות מ מ גידול דרמטי שורות תאים במבחנה, במודל של עכברים המופץ ויוו. עד כה, לא נתבונן כל רעילות עקב טיפול SWCNT בניסויים אלה. מחקר זה מדגים כי SWCNT הוא רכב משלוח בטוח ויעיל עבור תרופות antisense oligonucleotide ויש פוטנציאל לשמש כנשא עבור מולקולות טיפוליות בחולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
המחברים תודה את המכון לחקר לרנר פרוטיאומיה מבנית, גנומית, ואת ההדמיה ליבות לסיוע שלהם ותמיכה. מימון: עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי NIH/NCI מענק R00 CA172292 (J.J.Z.) ואת ראשונית (ל J.J.Z.) ואת קלינית Translational המדע שיתופית (CTSC) של התיק Western Reserve אוניברסיטת הליבה ניצול טייס גרנט (ל J.J.Z.). עבודה זו מנוצל מיקרוסקופ קונפוקלי SP8 לייקה אשר נרכש עם מימון מוסדות לאומיים של בריאות סיג גרנט 1S10OD019972-01.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SWCNTs | Millipore-Sigma | 704113 | |
| DSPE-PEG2000-Amine | Avanti Polar Lipids | 880128 | |
| bath sonicator | VWR | 97043-992 | |
| 4 mL centrifugal filter | Millipore-Sigma | Z740208-8EA | |
| UV/VIS spectrometer | Thermo Fisher Scientific | accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | extinction coefficient of 0.0465 L/mg/cm at 808 nm |
| Sulfo-LC-SPDP | ProteoChem | c1118 | |
| DTT solution | Millipore-Sigma | 43815 | |
| NAP-5 column | GE Healthcare | 17-0853-01 | |
| in vivo imaging system | PerkinElmer | ||
| NOD.CB17-Prkdcscid/J mice | Charles River lab | 250 | |
| Flow cytometer | Becton Dickinso | ||
| Lipofectamine | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine2000 |
| Fetal bovine serum (FBS) | Invitrogen | 10437-028 | |
| RMPI-1640 medium | Invitrogen | 11875-093 | |
| MALAT1-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- GTTCTGATCCCGCTGCTATT - 3’ | |
| MALAT1-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- TCCTCAACACTCAGCCTTTATC - 3’ | |
| GAPDH-QF: | synthesized by IDT Company | 5’- CAAGAGCACAAGAGGAAGAGAG - 3’ | |
| GAPDH-QR: | synthesized by IDT Company | 5’- CTACATGGCAACTGTGAGGAG - 3’ | |
| Quantitative PCR using SYBR Green PCR master mix | Thermo Fisher Scientific | A25780 | |
| RevertAid first-stand cDNA synthesis kit | Thermo Fisher Scientific | K1621 | |
| anti-MALAT1 | synthesized by IDT Company | 5’-mC*mG*mA*mA*mA*C*A*T*T *G*G*C*A*C*A*mC*mA*mG*mC*mA-3’ |
|
| Cell Viability Assay Kit | Promega Corporation | G7570 | CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay Kit |
| accuSkan GO UV/Vis Microplate Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| centrifugal filter | Millipore-Sigma | UFC910008 | |
| SPSS software | IBM | version 24.0 | |
| D-Luciferin | Millipore-Sigma | L9504 |
References
- Jiang, X., et al. RNase non-sensitive and endocytosis independent siRNA delivery system: delivery of siRNA into tumor cells and high efficiency induction of apoptosis. Nanoscale. 5 (16), 7256-7264 (2013).
- Murakami, T., et al. Water-dispersed single-wall carbon nanohorns as drug carriers for local cancer chemotherapy. Nanomedicine (Lond). 3 (4), 453-463 (2008).
- Kam, N. W., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular protein transporters: generality and biological functionality. Journal of the American Chemical Society. 127 (16), 6021-6026 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Functionalization of carbon nanotubes via. cleavable disulfide bonds for efficient intracellular delivery of siRNA and potent gene silencing. Journal of the American Chemical Society. 127 (36), 12492-12493 (2005).
- Kam, N. W., Liu, Z., Dai, H. Carbon nanotubes as intracellular transporters for proteins and DNA: an investigation of the uptake mechanism and pathway. Angewandte Chemie International Edition in English. 45 (4), 577-581 (2006).
- Ntziachristos, P., Abdel-Wahab, O., Aifantis, I. Emerging concepts of epigenetic dysregulation in hematological malignancies. Nature Immunology. 17 (9), 1016-1024 (2016).
- Evans, J. R., Feng, F. Y., Chinnaiyan, A. M. The bright side of dark matter: lncRNAs in cancer. Journal of Clinical Investigation. 126 (8), 2775-2782 (2016).
- Ronchetti, D., et al. Distinct lncRNA transcriptional fingerprints characterize progressive stages of multiple myeloma. Oncotarget. 7 (12), 14814-14830 (2016).
- Wong, K. Y., et al. Epigenetic silencing of a long non-coding RNA KIAA0495 in multiple myeloma. Molecular Cancer. 14, 175 (2015).
- Schmidt, L. H., et al. The long noncoding MALAT-1 RNA indicates a poor prognosis in non-small cell lung cancer and induces migration and tumor growth. Journal of Thoracic Oncology. 6 (12), 1984-1992 (2011).
- Ji, P., et al. MALAT-1, a novel noncoding RNA, and thymosin beta4 predict metastasis and survival in early-stage non-small cell lung cancer. Oncogene. 22 (39), 8031-8041 (2003).
- Luo, J. H., et al. Transcriptomic and genomic analysis of human hepatocellular carcinomas and hepatoblastomas. Hepatology. 44 (4), 1012-1024 (2006).
- Guffanti, A., et al. A transcriptional sketch of a primary human breast cancer by 454 deep sequencing. BMC Genomics. 10, 163 (2009).
- Cho, S. F., et al. MALAT1 long non-coding RNA is overexpressed in multiple myeloma and may serve as a marker to predict disease progression. BMC Cancer. 14, 809 (2014).
- Handa, H., et al. Long non-coding RNA MALAT1 is an inducible stress response gene associated with extramedullary spread and poor prognosis of multiple myeloma. British Journal of Haematology. 179 (3), 449-460 (2017).
- Hu, Y., et al. Targeting the MALAT1/PARP1/LIG3 complex induces DNA damage and apoptosis in multiple myeloma. Leukemia. , (2018).
- Lennox, K. A., Behlke, M. A. Cellular localization of long non-coding RNAs affects silencing by RNAi more than by antisense oligonucleotides. Nucleic Acids Research. 44 (2), 863-877 (2016).
- Kam, N. W., O'Connell, M., Wisdom, J. A., Dai, H. Carbon nanotubes as multifunctional biological transporters and near-infrared agents for selective cancer cell destruction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (33), 11600-11605 (2005).
- Zeineldin, R., Al-Haik, M., Hudson, L. G. Role of polyethylene glycol integrity in specific receptor targeting of carbon nanotubes to cancer cells. Nano Letters. 9 (2), 751-757 (2009).
- Amodio, N., D'Aquila, P., Passarino, G., Tassone, P., Bellizzi, D. Epigenetic modifications in multiple myeloma: recent advances on the role of DNA and histone methylation. Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (1), 91-101 (2017).
- Ahmad, N., Haider, S., Jagannathan, S., Anaissie, E., Driscoll, J. J. MicroRNA theragnostics for the clinical management of multiple myeloma. Leukemia. 28 (4), 732-738 (2014).
- Amodio, N., et al. Drugging the lncRNA MALAT1 via. LNA gapmeR ASO inhibits gene expression of proteasome subunits and triggers anti-multiple myeloma activity. Leukemia. , (2018).
- Highleyman, L. FDA approves fomivirsen, famciclovir, and Thalidomide. Food and Drug Administration. BETA. 5, (1998).
- Smith, R. J., Hiatt, W. R. Two new drugs for homozygous familial hypercholesterolemia: managing benefits and risks in a rare disorder. JAMA Internal Medicine. 173 (16), 1491-1492 (2013).
- Aartsma-Rus, A. FDA Approval of Nusinersen for Spinal Muscular Atrophy Makes 2016 the Year of Splice Modulating Oligonucleotides. Nucleic Acid Therapeutics. 27 (2), 67-69 (2017).
- Nelson, S. F., Miceli, M. C. FDA Approval of Eteplirsen for Muscular Dystrophy. The Journal of the American Medical Association. 317 (14), 1480 (2017).
- Liu, Z., Sun, X., Nakayama-Ratchford, N., Dai, H. Supramolecular chemistry on water-soluble carbon nanotubes for drug loading and delivery. American Chemical Society Nano. 1 (1), 50-56 (2007).
- Ali-Boucetta, H., et al. Multiwalled carbon nanotube-doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics. Chemical communications (Cambridge). (4), 459-461 (2008).
- Bianco, A., Kostarelos, K., Partidos, C. D., Prato, M. Biomedical applications of functionalised carbon nanotubes. Chemical communications. (5), Cambridge. 571-577 (2005).
- Hadidi, N., Kobarfard, F., Nafissi-Varcheh, N., Aboofazeli, R. Optimization of single-walled carbon nanotube solubility by noncovalent PEGylation using experimental design methods. International Journal of Nanomedicine. 6, 737-746 (2011).
- Padilla-Parra, S., et al. Quantitative imaging of endosome acidification and single retrovirus fusion with distinct pools of early endosomes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17627-17632 (2012).
- Wu, H., Zhu, L., Torchilin, V. P. pH-sensitive poly(histidine)-PEG/DSPE-PEG co-polymer micelles for cytosolic drug delivery. Biomaterials. 34 (4), 1213-1222 (2013).
- Oishi, M., Nagatsugi, F., Sasaki, S., Nagasaki, Y., Kataoka, K. Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages. Chembiochem. 6 (4), 718-725 (2005).
- Dong, H., Ding, L., Yan, F., Ji, H., Ju, H. The use of polyethylenimine-grafted graphene nanoribbon for cellular delivery of locked nucleic acid modified molecular beacon for recognition of microRNA. Biomaterials. 32 (15), 3875-3882 (2011).
- Arunachalam, B., Phan, U. T., Geuze, H. J., Cresswell, P. Enzymatic reduction of disulfide bonds in lysosomes: characterization of a gamma-interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 745-750 (2000).
- Lelimousin, M., Sansom, M. S. Membrane perturbation by carbon nanotube insertion: pathways to internalization. Small. 9 (21), 3639-3646 (2013).
- Thomas, M., Enciso, M., Hilder, T. A. Insertion mechanism and stability of boron nitride nanotubes in lipid bilayers. J Phys Chem B. 119 (15), 4929-4936 (2015).
- Jin, H., Heller, D. A., Strano, M. S. Single-particle tracking of endocytosis and exocytosis of single-walled carbon nanotubes in NIH-3T3 cells. Nano Letters. 8 (6), 1577-1585 (2008).
- Jin, H., Heller, D. A., Sharma, R., Strano, M. S. Size-dependent cellular uptake and expulsion of single-walled carbon nanotubes: single particle tracking and a generic uptake model for nanoparticles. American Chemical Society Nano. 3 (1), 149-158 (2009).
- Ruggiero, A., et al. Paradoxical glomerular filtration of carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (27), 12369-12374 (2010).
