Summary
Bütün böbrek netron sayısının tahminleri klinik ve deneysel olarak önemli olup, ne, sayısı ile böbrek ve kardiyovasküler hastalık riski arasında ters bir ilişki olduğu için. Burada, tüm böbrek netron sayısının hızlı ve güvenilir tahminlerini sağlayan asit maserasyon yönteminin kullanımı gösterilmiştir.
Abstract
Nephron bağış bir bireyin doğduğu toplam nefron sayısını ifade eder, insanlarda nefrogenit gebelik 36 hafta tarafından tamamlanmış ve yeni nefron Doğum sonrası oluşturulur. Netron numarası, Doğum sonrası zaman içinde herhangi bir noktada ölçülen nefron toplam sayısını ifade eder. Hem genetik hem de çevresel faktörler hem netron bağış hem de sayıyı etkiler. Daha düşük netron tedavisi veya sayısına sahip bireyler böbrek veya kardiyovasküler hastalık gelişimi açısından daha yüksek bir risk altında olduğu düşünülmektedir gibi belirli genler veya faktörlerin nefrogenik ve netron kaybı veya ölümü sürecini nasıl etkilediğini anlamak önemlidir. Bir kişinin ömür boyu boyunca çevresel pozlarının netron numarasını nasıl etkilediğini anlamak, gelecekteki hastalık riskinin belirlenmesinde de hayati önem taşır. Böylece, tüm böbrek netron numarasını hızlı ve güvenilir bir şekilde değerlendirmek yeteneği, nefrogenit veya netron kaybına katkı sağlayan veya teşvik eden mekanizmaları daha iyi anlamak için temel bir deneysel gerekliliktir. Burada, Damadian, Shawayri ve Bricker tarafından açıklanan prosedüre göre tüm böbrek netron numarasının tahmin edilmesi için asit maserasyon yöntemini tarif ediyoruz, hafif modifikasyonlar ile. Asit maserasyon yöntemi, daha gelişmiş, pahalı olsa da, manyetik rezonans görüntüleme gibi yöntemler kullanılarak Belirlenenlerin% 5 ' i içinde olan netron sayısının hızlı ve güvenilir tahminler (glomeruli sayma tarafından değerlendirilir) sağlar. Dahası, asit maserasyon yöntemi çok sayıda numune veya deneysel koşullarda ne, sayısını değerlendirmek için mükemmel bir yüksek verimlilik yöntemidir.
Introduction
Netron hem temel yapısal hem de böbrek1' in fonksiyonel birimidir. Yapısal olarak, netron Bowman kapsülü içinde bulunan glomerülden (kapiller ve podositler) ve böbrek tübülü oluşur, proksimal tübül oluşan, Henle döngü, ve toplama kanalına sona erer distal tubüs. Fonksiyonel olarak, netron rolü su ve elektrolit filtrasyon ve reemilimi ve atıkların salgılanmasını olduğunu. Genel olarak, nefrogenis tamamlanan 36 gebelik hafta insanlarda ve kısa bir süre sonra fare ve sıçan2gibi çeşitli türler doğumdan sonra. Nefron bağış, bir bireyin doğduğu toplam nefron sayısını ifade eder, zira netron sayısı her zaman Doğum sonrası3olarak ölçülen nefron toplam sayısıdır. Netron numarası ve glomerüler sayı terimi sıklıkla birbirinin yerine kullanılır. Çünkü netron başına sadece bir glomerülden vardır, glomerül numarasının değerlendirilmesi ne, sayısı tahmin için önemli bir vekil olduğunu.
Netron bağış ve netron sayısının değerlendirilmesi, klinik ilginin değerlendirilmesinin netron bağış ve azalmış netron numaraları arasında bir ilişki gösterdiği gibi kardiyovasküler hastalığın daha fazla görülme sıklığı4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. otopsi sırasında böbreklerdeki bulgulara dayanarak, Brenner hipertansif bireylerin normotensif bireyler16daha düşük toplam nefron sayısı ile sunulan görüldü. Böylece, Brenner ne, sayısı ve daha sonra yaşam içinde hipertansiyon gelişimi riski arasında ters bir ilişki olduğunu hipotez. Brenner aynı zamanda, netron sayısında bir azalma olan nöfrisi tarafından telafi edildiğini hipotez. Böbrek normal filtrasyon hızını korumak için, kalıntı nefron onların glomerüler yüzey alanını artırarak telafi (glomerüler hipertrofisi), böylece Renal fonksiyon netron kaybı herhangi bir olumsuz etkisini azaltmak için çalışıyor4 ,16.
Kısa vadede koruyucu iken, glomerüler hipertrofisi, uzun vadede, artan sodyum ve sıvı tutma yol açar, artan ekstrellüler sıvı hacmi, ve arter kan basıncında artar, daha fazla artan bir kısır döngüye yol glomerüler kapiller basıncı, glomerüler Hiperfiltrasyon ve netron skarlık (skleroz) ve yaralanma4,16.
Tahminlerin veya netron numarasının sayılarının alınması, birkaç deneysel avantaj sunar: 1) nefrogenit süreci ile ilgili bilgi sağlar, bu da embriyo veya maternal-fetal ortamda belirli genler veya faktörlerle bağlantılı olabilir ve 2) kalp-damar hastalığı olan bir ne, sayısı ilişkisi vardır ve böylece, ne, sayısının tahminlerinin gelecekteki kardiyovasküler riski tahmin etmek için kullanılabileceği potansiyeli vardır2,17,18, 19 , 20 tane , 21 , 22. maternal-fetal çevreye ek olarak, çeşitli hastalıklar doğrudan netron numarası ve böbrek fonksiyonunu etkiler, ateroskleroz dahil, diyabet, hipertansiyon, ve hatta normal yaşlanma2,9, 10,11,12,22,23. Bu nedenle, tüm böbrek netron sayısının değerlendirilmesi, bir kişinin hayatı boyunca nefrogeninin (i.e.netron Endowment) ve netron numarasını etkileyen genetik ve çevresel faktörleri ve ortaya çıkan etkileri anlamak önemlidir böbrek fonksiyonu ve kardiyovasküler sağlık üzerinde.
Şu anda, her biri kendi avantajları ve sınırlamaları24,25,26,27,28 olan netron numarasının belirlenmesi ve ölçülmesine yönelik çeşitli yöntemler mevcuttur ,29,30. Tüm böbrek netron sayısını belirlemek için sofistike Yöntemler, disloji/fraksiyoncu yöntemi ve manyetik rezonans görüntüleme25,26gibi stereolojik yöntemler içerir. Genellikle tüm böbrek ne, sayısını belirlemek için altın standardı olarak kabul, disasyon/fraksiyoncu yöntemi hem pahalı hem de zaman alıcı. Manyetik rezonans görüntüleme ve işlemede son gelişmeler ve iyileştirme, her netron bireysel olarak saymak için Araçlar sağladı. Ancak, manyetik rezonans görüntüleme sadece zaman alıcı değil, aynı zamanda son derece pahalıdır. Buna ek olarak, hem disasyon/fraksiyoncu yöntemi hem de manyetik rezonans görüntüleme, gelişmiş teknik uzmanlık gerektirir, böylece araştırma laboratuvarlarının çoğunda bu tür yöntemlerin kullanımını kısıtlamaktadır.
Ne, sayısının belirlenmesinde çoğu Yöntem, glomerüllerin tanımlanmasını temel alarak sayar veya tahminler yapar, böylece yapısal olarak kolayca tanımlanabilir. Bu yazıda tüm böbreklerde ne, sayısını tahmin etmek için asit maserasyon yöntemi tarif edilir ve27' dir. Asit maserasyon yöntemi hızlı, güvenilir ve diğer yöntemlerden daha az pahalıdır, örneğin disik/fraksiyoncu yöntemi ve manyetik rezonans görüntüleme gibi. Dahası, asit maserasyon yöntemi, manyetik rezonans görüntüleme26kullanılarak belirlenen aralıktaki içinde olduğu bildirilmiştir netron numarasının son derece tekrarlanabilir tahminler sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Aşağıda listelenen sarf malzemeleri ve reaktifler, tek bir fareyle tüm böbrek netron numarasının belirlenmesi için, yani iki böbrek. Sıçan için asit maserasyon yönteminin kullanımı için değişiklikler yıldız ile tanımlanır. Tüm deneysel protokoller, Laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için Ulusal Sağlık Kılavuzu Enstitüleri 'ne konmuştur ve Mississippi Tıp Merkezi Üniversitesi 'nde kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.
1. böbrek yalıtım prosedürü
- Fare (veya diğer türler) tartmak ve bir izofluran ile ötenize (% 5-8%) doz aşımı veya pentobarbital (150 mg/kg intraperitoneal enjeksiyon).
- Fare ötenize edildikten sonra, orta çizgi boyunca ince cerrahi makas kullanarak karın boşluğunu açın.
- Dikkatle bağırsak ve üreme adipoz karın boşluğunun sağ tarafına kaldırın. Brüt diseksiyon, sol böbrek izole. İnce cerrahi makas kullanarak, sol böbrek arter ve ven kesmek ve dikkatle sol böbrek kaldırmak, uygun etiketli bir (fare numarası/tanımlayıcı) içine böbrek yerleştirerek fosfor-tamponlu tuzlu (PBS) içeren ağırlık tekne.
- Doğru böbrek için prosedürü tekrarlayın.
- Her böbreğini ilgili tartım teknesinden çıkarın ve PBS ile önceden nemlendirilmiş bir cerrahi gazlı bez üzerine yerleştirin.
- Böbrek cerrahi gazlı bez üzerinde bırakarak, hızlı bir şekilde herhangi bir yapışan böbrek dışı doku kaldırmak (örneğin perirenal anjiyomiksoma adipoz veya adrenal bezi) böbrek kapsülünün kaldırılması ile takip. Her böbreği bireysel olarak tartın, sol ve sağ böbreğin ağırlığını laboratuvar defterinde ayrı olarak kaydetme.
2. homojenizasyon, Inkübasyon ve süzme prosedürleri
- Her böbrek tartılır sonra, PBS her ağırlık tekne drenaj ve uygun etiketli tartım teknesine geri böbrekler yerleştirin. Temiz bir jilet kullanarak böbreğini ikiye kesebilir, uzunlamasına. Her böbrek yarısını aşağı bakacak şekilde yerleştirin ve her yarısını 2 mm veya daha küçük parçalara kesin.
- Aynı Razorblade kullanarak, dikkatle toplamak ve etiketli 15 mL konik tüp içine doğranmış böbrek parçaları yerleştirmek (fare numarası/tanımlayıcı; sol karşı sağ böbrek).
- Yeni bir jilet kullanarak, ters böbrek için prosedürü tekrarlayın. Ayrı etiketli 15 mL konik tüp içine doğranmış böbrek yerleştirin.
- İyi havalandırılmış bir duman kapında, her 15 mL konik tüpte 5 mL 6 M hidroklorik (HCl) asit ekleyin.
- Konik tüp için kapağı değiştirin, yavaşça böbrek/HCl karışımı karıştırın ve 15 mL konik tüp 37 °C ' de 90 dk (sıçan böbrekleri için * 120 dk) olarak ayarlanan bir ısıtılmış su banyosuna yerleştirin.
- Kısaca her 15-mL tüp her 15 dakikada kuluçdak sırasında tüm doku HCl asit maruz kalmasını sağlamak için karıştırılır.
- 5 mL şırıngaya 18-G iğne takın (sıçan için * 10 mL şırınga) ve şırınga pistonu dikkatle çıkarın. Şırınga bir 50 mL konik tüp (tüp #1) bir duman kaputu yerleştirin.
- Su banyosundan böbrek/HCl çözeltisi çıkarın ve şırınga açık ucuna doku solüsyonu dökün ve bir test tüp raf içinde 15 mL konik tüp kenara ayarlayın. Dikkatle piston değiştirin ve yavaşça iğne yoluyla çözüm ekstrüzyon ve tüp #1 gibi piston itin.
- 15 mL konik tüpü 5 mL PBS çözeltisi ile yıkayın. Girdap PBS 15-mL konik tüp böylece herhangi bir kalan böbrek dokusu çözünmek için.
- Yine, dikkatle 18-G iğne içeren 5 mL şırıngadan pistonu kaldırmak ve şırınga açık ucuna 15 mL konik tüp içeriğini dökün. Pistonu dikkatlice değiştirin ve şırıngayı hafifçe aşağı doğru tüp #1 içine itmek suretiyle enjektörü temizleyin. Bu işlemi 2x olarak tekrarlayın (Toplam 3x yapılır).
- Yeni 5 mL şırıngaya 21-G iğne takın (sıçan için * 10 mL şırınga) ve şırınga pistonu dikkatle çıkarın. Şırıngayı, 21-G iğne ile yeni bir 50-mL konik tüpüne (tüp #2) yerleştirin.
- 21-G iğne içeren şırınga açık ucuna tüp #1 içeriğini dökün. Şırıngayı dikkatlice takın ve şırınga pistonu hafifçe itmek ve ekstrüze solüsyonu tüp #2 içine koyarak şırıngayı temizleyin.
- 5 mL PBS çözeltisi ile yıkama tüpü #1. Girdap PBS tüp #1 böylece kalan böbrek dokusu çözünmek için.
- Yine, dikkatle 18-G iğne içeren 5 mL şırıngadan pistonu kaldırmak ve şırınga açık ucuna tüp #1 içeriğini dökün. Dikkatli bir şekilde pistonu yerine takın ve şırıngayı hafifçe aşağı doğru iterek, boru #2 ekstrüzyon çözeltisi ile temizleyin. Bu işlemi 2x olarak tekrarlayın (Toplam 3x yapılır).
- Tüp #2 50-mL hattına kadar ek PBS ekleyerek 50 mL 'ye kadar boru #2 toplam hacmini getirin.
- Bir buzdolabı içinde bir rocker plaka üzerinde bir tüp raf içinde böbrek dokusu çözeltisi içeren tüp #2 inkük 4 °C gece (minimum 8-10 h).
3. Glomeruli sayımı ve nephron numarasının Extrapolasyonu
- Soğutucudan tüp #2 çıkarın ve homojen bir çözüm oluşturmak için tüpün birkaç kez hafifçe ters çevirme ile pelleted doku pelletini. İşlendikten sonra 5 d içinde glomerül sayma öneririz.
- Dikkatle kısım 500 μL böbrek çözeltisi 12-kuyu plaka tek bir kuyu içine. Bu 2x tekrarlayın, her bir kısım ayrı bir kuyuya yerleştirerek böylece böbrek başına böbrek çözeltisi üç kuyuları vardır, triplicate analizi için.
- 1:1 seyreltme için böbrek çözeltisi içeren üç kuyunun her biri için 500 μL PBS ekleyin.
- Ters bir mikroskop kullanarak, iyi başına glomerül sayısını saymak. Sayım, her bir kuyunun altına yerleştirilen 16 ayrı bölümden oluşan bir ızgara kullanılarak desteklenir. Her gridded bölüm başına glomerül sayısını saymak ve sonra iyi başına glomerül toplam sayısını almak için ızgara başına sayım toplamı. Glomeruli küresel yapısı ile kolayca tanımlanabilir. Ek tanımlayıcılar, kan dolu kılcal damarların yanı sıra, bireysel glomerüllerin gövdesine bağlı kalan ön veya sonrası arterioller nedeniyle kırmızımsı bir ton içeriyordu (Şekil 1).
- Glomerül toplam sayısı üç kuyuların her biri olarak sayılan ekleyin ve daha sonra üç tarafından glomerül ortalama sayısı için ikiye böler böbrek çözeltisi 500 μL başına. Eğer iyi başına glomerül ortalama sayısının farkı% 10 ' dan büyükse, ne, sayım prosedürü tekrarlayın, böbrek çözeltisi homojen doğası yakın dikkat. Çoğalan glomerül sayısı iyi kez 100 böbrek başına glomerül ortalama sayısı için sayılır. Toplam netron sayısı böbrek başına veya böbrek ağırlığı, mg veya g dokusu kullanılarak ifade edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Aşağıda hipertansiyon kurulan bir fare modeli ve yaş ile ilgili kronik böbrek hastalığı bir genetik sıçan modeli tüm böbrek netron numarasının temsili tahminleri vardır. Glomerüllerin anahtar tanımlayıcı özellikleri, örneğin ön veya post-arteriolar veya tübüler yapıları ile veya bağlı olmayan küresel bir yapı gibi, asit maserasyon yöntemine yeni olanlar için vurgulanır (Şekil 1).
İlk deneysel örnekte, araç (tuz) veya Anjiyotensin II ile 14 gün boyunca kullanılan farelerde (erkek C57BL/6, 6 hafta) Toplam netron numaraları belirlendi. Araç infitleme farelerinde, asit maserasyon yöntemi kullanılarak belirlenen böbrek başına 12.411 ± 248 nefron idi (Şekil 2). Bu tahminler, daha önce fareler içinde bildirilen tüm böbrek netron sayısının aralıklarını ile uyumludur (Tablo 1). Anjiyotensin, yaklaşık 40 mmHg 'ye göre atriyal basıncını arttırarak 14 gün boyunca infüzyon ve netron sayısında önemli bir azalma ile ilişkilidir (böbrek başına 9.122 ± 193 nefron) yaklaşık olarak% 26 (Şekil 2). Bu veriler Anjiyotensin II infüzyon sadece hipertansiyon ile ilişkili değil, aynı zamanda, netron sayısında önemli bir azalma skleroz veya glomerüler yaralanma nedeniyle netron kaybı ile ilişkili olduğunu düşündürmektedir.
İkinci deneysel örnekte, böbrek agenezinin genetik sıçan modelinde netron numarasının önceki bulguları, tek taraflı böbrek agenezi (HSRA) sıçan heterojen stok türevi Model doğrulandı. Hsra modeli, böbrek ve idrar yollarının kusurları için eksik penetrans fenotipleri sergiler, bazı hayvanlar normal (iki böbrek ile) ve diğerleri bir böbrek ile doğmuş doğmakta. İki böbrekle doğan fareler (erkek ha-kontrol; 12 hafta), asit maserasyon yöntemini kullanarak netron sayısının tahminleri böbrek başına 27.288 ± 336 nefron idi (Şekil 3). Buna karşılık, tek böbrek (erkek ha-soliter; 4 hafta yaş) ile doğan farelerde, böbrek başına 24.594 ± 883 nefron ' da önemli ölçüde daha düşük olduğu tespit edildi (Şekil 3). Bu örneklerde elde edilen ne, sayısı tahminleri de daha önce sıçan içinde bildirilen aralıkları ile tutarlı (Tablo 1). Bu verilerin, büyük olasılıkla doğma ile ilişkili temeldeki genetik faktörlerin yansıtıldığı (bir kontrol böbreğine kıyasla) düşük netron bağış veya numaralarının ortaya konulmasına neden olan ha-soliter fareler bulunmuş önceki bulgularla tutarlı olduğunu unutmayın. tek bir böbrek ile31.
Şekil 1 : Tüm böbrek netron sayısını saymak ve değerlendirmek için glomerül anahtar tanımlayıcıları. Glomeruli, oklar tarafından belirtildiği gibi, küresel yapısı ile kolayca tanımlanabilir. Ek tanımlayıcılar kan dolu kılcal nedeniyle kırmızımsı bir ton içerir, hem de öncesi veya sonrası arterioller (veya tubules) Bu işleme aşağıdaki bireysel glomerül gövdesine bağlı kalabilir (gibi bir bu altında tanımlanan mikrograf). Ayrıca bu resimde mevcut tübüller ve kan damarlarının kalıntıları vardır. Büyütme = 10X; ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 2 : Netron fareler saymak. (A) tek bir fare böbreği bir 22,1-mm düz dipli iyi bir 12-Well kültür plaka, ters bir mikroskop kullanarak görüldüğü kaplama bir glomerül temsili görüntü. Glomeruli ve renal tübüller, iki faktör (0,5 mL böbrek çözeltisi artı 0,5 mL 1x PBS) ile seyreltilmiş ılımlı yoğunlukta görülür. (B) glomerüler sayım ile değerlendirildiği gibi erkek C57Bl/6 farelerde 14 günlük araç veya Anjiyotensin II infüzyon netron sayısına etkisi. 1.000 ng/kg/dak (osrotik minipumpyoluyla ) anjiyootensin II infüzyon hipertansiyon ile ilişkili ve araç ile infüzyon farelerde ne, sayısına kıyasla netron sayısında bir azalma işaretli. Araçtaki farelerde Neo numaraları, farelerde daha önce bildirilen ne, sayısı ile uyumludur (Tablo 1). Araç: n = 3, Anjiyotensin II: n = 3, *p < 0,05. Hata çubukları = SE. büyütme = 4X; ölçek çubuğu = 250 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
Şekil 3 : Netron sıçan saymak. (A) tek bir sıçan böbreğinden glomerulinin temsili görüntüsü, ters bir mikroskop kullanılarak görüldüğü gibi, 12-Well kültür plakasının 22,1 mm 'lik düz dipli iyi bir kaplamadır. Glomeruli ve böbrek tübülleri, fare ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek bir yoğunlukta görülür. (B) Hsra-Control ve Hsra-s farelerinin ne, sayısının ölçülmesini Hsra-s ' d e k i Hsra-C farelerine kıyasla ve bu model31' deki önceki bulgularla tutarlı olan netron sayısının daha az olduğunu ortaya koyuyor. HSRA-C, iki böbreklerle doğmuş fareler: n = 3; HSRA-S, yalnız böbrek ile doğmuş fareler: n = 3,* p < 0.05. Hata çubukları = SE. büyütme = 4X; ölçek çubuğu = 250 μm. Bu rakam daha büyük bir sürümünü görüntülemek Için lütfen buraya tıklayın .
| Tür | Böbrek başına netron sayısı | Başvuru |
| Fare | 9000-21000 | 18-22, 28 |
| Sıçan | 13000-27000 | 31, 33 |
| Koyun | 200000-800.000 arasında | 23, 29, 34 |
| Domuz | 1,600,000-4,600,000 | 32, 35 |
| Insan | 500,000-2.000.000 | 8-15 |
Tablo 1: çeşitli türlerde ne, sayısı bildirilen aralıkları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
İyi deneysel teknikle, asit maserasyon yöntemi tüm böbreklerde netron numarasını tahmin etmek için idealdir. Böbrek asit içinde çözünmüş olsa da, glomerül büyük ölçüde bozulmamış kalır ve kolayca tanımlanabilir, bireysel glomerül sayımı nispeten kolay ve basit hale. Asit maserasyon tekniği özellikle çeşitli nedenlerle avantajlıdır. İlk olarak, asit maserasyon yöntemi gider ve fiziksel çaba açısından nispeten az gerektiren hızlı ve kullanışlı bir yöntemdir. Asit maserasyon yöntemini gerçekleştirmek için gereken tüm reaktifler ve sarf malzemeleri en temel laboratuvarlarda kolayca kullanılabilir, glomerüler sayım için ters bir mikroskop erişimi olan tek büyük gereksinim. Masraf açısından, bu asit maserasyon yöntemi maliyeti sadece bir çift hayvan başına yüz dolar, hangi bir çok zaman tüm böbrek glomerüler sayma diğer yöntemler ile ilişkili maliyetleri karşılaştırıldığında, bu tür manyetik rezonans görüntüleme gibi, tahmin edilir Hangi Tarama süresi ve teknik uzmanlık hayvan başına binlerce dolar içine Aralık olabilir.
İkinci olarak, asit maserasyon yöntemi, disik/fraksiyoncu yöntemi24gibi tüm böbrek netron sayısının diğer yöntemlerine kıyasla önemli ölçüde daha az doku işleme süresi içerir. Başından sonuna kadar, asit maserasyon yöntemi toplam zaman daha az 24 saat gerektirir, hangi az 1-2 saat böbrekler işleme harcanan ve daha sonra deneysel hayvan başına bireysel glomerül sayma. Buna karşılık, distican/fractionator yöntemi işgücü yoğun, tahmini 15 saat işçilik gerektiren (4-6 saat seksiyonlama, 2-3 saat boyama, ve 4-5 saat sayım süresi) böbrek başına, dahil değil 48-72 saat içinde böbrekleri işlemek için gerekli GL ycol metakrilgeç24. Maliyet ve zamanın avantajları nedeniyle, asit maserasyon yöntemi özellikle tüm böbrek netron sayısının tahminlerinin genetik veya farmakolojik müdahalelerle veya olmayan hayvanların çok sayıda yapılması gereken çalışmalarda yararlıdır. Hem çalışma maliyeti hem de zaman/fraksiyoncu yöntemi ve manyetik rezonans görüntüleme ile ilgili çoğu araştırma laboratuvarlarında benimsenmesi büyük bir sınırlama faktörü olarak kabul edilmiştir.
Son olarak, asit maserasyon yöntemi, manyetik rezonans görüntüleme26gibi daha sofistike yöntemler kullanarak önlemler karşılaştırılabilir tüm böbrek netron sayısının tahminleri sağlar. Örneğin, glomerül ve üç boyutlu görüntü işleme katyonik ferritin-etiketleme kullanarak Sprague-Dawley sıçan tek bir böbrekte her ne, saymak için, manyetik rezonans görüntüleme başına 34.000 bireysel glomerül ortalama sayar sağladı böbrek26. Non-cationic ferritin etiketli böbrekler, manyetik rezonans görüntüleme, ferritin etiketli glomerül olarak benzer büyüklükte ve şekil manyetik sinyaller ile böbrek olmayan glomerüler bölgelerin sayımı nedeniyle 2.000 netron benzeri yapıların sayar vermiştir. Bu eserler, katyonik ferritin etiketli böbrekler tarafından belirlenen sayılardan çıkarılır, manyetik rezonans görüntüleme kullanılarak belirlenen glomerüllerin etkili sayısı, böbrek başına 32.000 nefron daha yakındır26. Bu aynı çalışmada, doğrulama denemeleri asit maserasyon yöntemi26kullanarak böbrek başına 31.000 ortalama glomerüler sayar vermiştir. Böylece, asit maserasyon yöntemi bu manyetik rezonans görüntüleme gibi State-of-the-art teknikleri kullanarak belirlenen <% 5 içinde olan tüm böbrek netron sayısının tahminleri üretir.
Asit maserasyon yöntemi ile ilişkili birkaç önemli avantajları olsa da, müfettişlerin de bu yöntemle ilişkili sınırlamaları farkında olmalıdır. Bir sınırlama tüm böbrek kullanımı ile ilgilidir. Tüm böbrek çözünmüş ve homojenize olduğu için, böbrek korteks içinde glomerülün uzamsal dağılımı ile ilgili bilgiler belirlenemez. Glomerüler hacminin intrarenal dağılımı önemliyse, manyetik rezonans görüntüleme kullanımı daha uygun bir yöntem olacaktır.
Diğer yöntemlerle karşılaştırıldığında, asit maserasyon yönteminin kullanımı, toplam netron numarasını biraz hafife almak için görünür. Küçük tahminler muhtemelen nedeniyle, kısmen, asit glomerül küçük bir yüzdesi veya böbreğin maserasyon sırasında çözünmesi için. Buna ek olarak, yaşlanma veya hastalık ile, fonksiyonel nephrons kaybı vardır, hangi, idrar oluşumuna katkı olmasa da, asit maserasyona daha duyarlı olabilir ve işleme sırasında tahrip olabilir, böylece Total netron daha düşük tahminler katkıda Numarası. Böylece, bakım toplama ve böbrek işleme, böylece herhangi bir böbrek dokusu bırakmak değil olarak kullanılması gereken ne zaman böbreği kesme, ya da şırınga doku örnekleri ekstrüzyon içinde. Ancak genel olarak, doku işleme nedeniyle toplam netron numarasının yetersiz tahmininde nispeten küçük görünmektedir.
Asitli maserasyon yöntemini kullanan glomerüllerin sayımı subjektif olduğu için, netron numarasının düşük öngörü de gözlemci önyargı yansıtıcı olabilir, hangi kolayca iki ayrı müfettişlerin tarafından gerçekleştirilen ölçümler tarafından üstesinden gelebilir deneysel hayvan veya durum ile ilgili bilgi. Bir glomerulus teşkil ne olarak önemli bir endişe varsa, alternatif bir yaklaşım ötenazi önce demir oksit ile deneysel hayvanların infkullanma içerir. İntravenöz olarak infürle, demir oksit girer ve glomerulus sıkışıp olacak; Bu nedenle, işlenmiş glomerül siyah leke gerekir, glomerül daha büyük bir kimlik için izin verirken30sayma.
Asit maserasyon yöntemi, küçük numunelerin (3 x 0,5 mL veya 1,5 mL) ölçümüne dayalı olarak tüm böbrek netron numarasını tahmin eder (50 mL) tüm böbrek çözeltisi ölçümlerinin aksine. Asit maserasyon yöntemi doğada son derece tekrarlanabilir, ve glomerül tek bir böbrek örnekleri içinde sayar ve deneysel gruplar içinde son derece tutarlı olduğu görülmektedir. Dahası, mevcut çalışmada vahşi tip C57Bl/6 fareler ve tek bir böbrek (Şekil 2 ve 3) ile doğmuş fareler gelen bildirilen temsili sonuçlar son derece önceki bulgular ile tutarlı, yanı sıra daha önce bildirilen aralıkları ile (Tablo 1 )5,31. İstenirse, böbrek başına toplam netron numarasını daha iyi tahmin etmek için ek ölçümler kolayca yapılabilir.
Asit maserasyon tekniği ne, sayısının güvenilir ve tekrarlanabilir tahminler sağlar iken, bu yöntem glomerüler hacminin ölçümleri elde etmek için tavsiye edilmez, asit büyük olasılıkla glomerül hacminde değişiklikler üretir olarak maruz kalmaları. Glomerüler hacminin belirlenmesi tüm böbrek glomerüler yüzey alanının belirlenmesi açısından önemli olduğu için, bu tür ölçümlerin histolojik ve stereolojik yöntemler kullanılarak yapılması önerilir24,25. Özellikle, glikol metakrilgeç katıştırma böbrekleri kullanarak doku şişmesi ve genişlemesini sınırlamak ve böylece glomerüler geometriyi mümkün olduğunca yakın tutmak için stereolojik Yöntemler in vivo.
Son olarak, asit maserasyon tekniğinin bir başka kısıtlaması ve ne, numarasının değerlendirilmesi diğer yöntemlerle ortak olan bir, glomerüler fonksiyon (glomerüler filtrasyon oranı gibi) ile ilgili hiçbir bilgi glomerül bir kez tespit edilebilir olduğunu Işlenen. Böylece, bireysel glomerül sayılabilir iken, fonksiyonel durumu (idrar şekillendirme veya non-idrar-şekillendirme) asit maserasyon yöntemi kullanılarak belirlenemez. Benzer şekilde, hiçbir boyuna bilgi tek farelerde asit maserasyon yöntemi kullanılarak tespit edilebilir. Bunun yerine, bir hayvanın ömrü veya ön veya postgenetik veya farmakolojik müdahale üzerinden ne, sayısında değişikliklere ilişkin anlayış elde etmek için çeşitli zaman noktalarında hayvanların ayrı grupları gereklidir.
Özetle, asit maserasyon yöntemi düşük maliyetli, yüksek verimlilik ve tüm böbrek ne, sayısını tahmin etmek için verimli bir yöntemdir. Asitli maserasyon yöntemi, burada sunulan iki örnek tarafından kanıtlandığı gibi, daha önce bu yöntem18,19,20,21 kullanılarak bildirilen kişilerin yanı sıra yeniden üretilebilirliği yüksek ölçüde sağlar , 22 , 28. asit maserasyon yöntemi kullanımı fare (ve sıçan) kullanım için açıklanan iken, asit maserasyon yöntemi de köpek ve domuz27,32gibi büyük türler, kullanılmak üzere ölçeklendirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri, Ulusal Kalp, akciğer ve kan Enstitüsü (R01HL107632) tarafından kısmen destekleniyordu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
- Hall, J. E., Guyton, A. C. Guyton and Hall Textbook of Medical Physiology. , 13th, Elsevier. Philadelphia, PA. (2016).
- Wang, X., Garrett, M. R. Nephron number, hypertension, and CKD: physiological and genetic insight from humans and animal models. Physiological Genomics. 49 (3), 180-192 (2017).
- Didion, S. P. A novel genetic model to explore the Brenner hypothesis: Linking nephron endowment and number with hypertension. Medical Hypotheses. 106, 6-9 (2017).
- Brenner, B. M. Nephron adaptation to renal injury or ablation. American Journal of Physiology. 249 (3 Pt 2), F324-F337 (1985).
- Didion, S. P., Wang, X., Garrett, M. R. Direct correlation between blood pressure and nephron endowment in a genetic model of hypertension. Hypertension. 68, A052 (2016).
- Luyckx, V. A., Brenner, B. M. The clinical importance of nephron mass. Journal of the American Society of Nephrology. 21 (6), 898-910 (2010).
- Mackenzie, H. S., Brenner, B. M. Fewer nephrons at birth: a missing link in the etiology of essential hypertension? American Journal of Kidney Diseases. 26 (1), 91-98 (1995).
- Nyengaard, J. R., Bendtsen, T. F. Glomerular number and size in relation to age, kidney weight, and body surface in normal man. The Anatomical Record. 232 (2), 194-201 (1992).
- Denic, A., Glassock, R. J., Rule, A. D. Structural and functional changes with the aging kidney. Advances in Chronic Kidney Disease. 23 (1), 19-28 (2016).
- Denic, A., et al. The substantial loss of nephrons in healthy human kidneys with aging. Journal of the American Society of Nephrology. 28 (1), 313-320 (2016).
- Keller, G., Zimmer, G., Mall, G., Ritz, E., Amann, K. Nephron number in patients with primary hypertension. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 101-108 (2003).
- Hoy, W. E., et al. Nephron number, glomerular volume, renal disease and hypertension. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 17 (3), 258-265 (2008).
- Hoy, W. E., et al. Distribution of volumes of individual glomeruli in kidneys at autopsy: association with age, nephron number, birth weight and body mass index. Clinical Nephrology. 74 (Suppl 1), S105-S122 (2010).
- Hughson, M. D., et al. Hypertension, glomerular hypertrophy and nephrosclerosis: the effect of race. Nephrology Dialysis Transplantation. 29 (7), 1399-1409 (2014).
- Puelles, V. G., et al. Glomerular number and size variability and risk for kidney disease. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 20 (1), 7-15 (2010).
- Brenner, B. M., Garcia, D. L., Anderson, S. Glomeruli and blood pressure. Less of one, more of the other? American Journal of Hypertension. 1 (4 Pt 1), 335-347 (1988).
- Clark, A. T., Bertram, J. F.
- Benz, K., et al. Early glomerular alterations in genetically determined low nephron number. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (2), F521-F530 (2011).
- Zhao, H., et al. Role of fibroblast growth factor receptors 1 and 2 in the ureteric bud. Developmental Biology. 276 (2), 403-415 (2004).
- Sims-Lucas, S., Caruana, G., Dowling, J., Kett, M. M., Bertram, J. F. Augmented and accelerated nephrogenesis in TGF-beta2 heterozygous mutant mice. Pediatric Research. 63 (6), 607-612 (2008).
- Cullen-McEwen, L. A., Kett, M. M., Dowling, J., Anderson, W. P., Bertram, J. F. Nephron number, renal function, and arterial pressure in aged GDNF heterozygous mice. Hypertension. 41 (2), 335-340 (2003).
- Stelloh, C., et al. Prematurity in mice leads to reduction in nephron number, hypertension and proteinuria. Translational Research. 159 (2), 80-89 (2012).
- Galinsky, R., et al. Effect of intra-amniotic lipopolysaccharide on nephron number in preterm fetal sheep. American Journal of Physiology Renal Physiology. 301 (2), F280-F285 (2011).
- Bertam, J. F., et al. Why and how we determine nephron number. Pediatric Nephrology. 29 (4), 575-580 (2014).
- Nyengaard, J. R. Stereologic methods and their application in kidney research. Journal of the American Society of Nephrology. 10 (5), 1100-1123 (1999).
- Beeman, S. C., et al. Measuring glomerular number and size in perfused kidneys using MRI. American Journal of Physiology Renal Physiology. 300 (6), F1454-F1457 (2011).
- Damadian, R. V., Shawayri, E., Bricker, N. S. On the existence of non-urine forming nephrons in the diseased kidney of the dog. Journal of Laboratory and Clinical Medicine. 65, 26-39 (1965).
- Bonvalet, J. P., et al. Number of glomeruli in normal and hypertrophied kidneys of mice and guinea-pigs. The Journal of Physiology. 269 (3), 627-641 (1977).
- Bains, R. K., Sibbons, P. D., Murray, R. D., Howard, C. V., Van Velzen, D. Stereological estimation of the absolute number of glomeruli in the kidneys of lambs. Research in Veterinary Science. 60 (2), 122-125 (1996).
- Assmann, K. J., van Son, J. P., Koene, R. A. Improved method for the isolation of mouse glomeruli. Journal of the American Society of Nephrology. 2 (4), 944-946 (1991).
- Wang, X., et al. Nephron deficiency and predisposition to renal injury in a novel one-kidney genetic model. Journal of the American Society of Nephrology. 26 (7), 1634-1646 (2015).
- Lodrup, A. B., Karstoft, K., Dissing, T. H., Pedersen, M., Nyengaard, J. R. Kidney biopsies can be used for estimations of glomerular number and volume: a pig study. Virchows Archiv. 452 (4), 393-403 (2008).
- Fassi, A., et al. Progressive glomerular injury in the MWF rat is predicted by inborn nephron deficit. Journal of the American Society of Nephrology. 9 (8), 1399-1406 (1998).
- Wintour, E. M., et al. Reduced nephron number in adult sheep, hypertensive as a result of prenatal glucocorticoid treatment. The Journal of Physiology. 549 (Pt 3), 929-935 (2003).
- Van Vuuren, S. H., et al. Compensatory growth of congenital solitary kidneys in pigs reflects increased nephron numbers rather than hypertrophy. PLoS One. 7 (11), e49735 (2012).
