Summary
Les estimations du nombre de néphron de rein entier sont importantes cliniquement et expérimentalement, car il y a une association inverse entre le nombre de néphron et un risque accru de maladie rénale et cardiovasculaire. Dans les présentes, l’utilisation de la méthode de macération acide, qui fournit des estimations rapides et fiables du nombre de néphron du rein entier, est démontrée.
Abstract
La dotation de néphron fait référence au nombre total de néphrons dont naît une personne, car la néphrogenèse chez l’homme est complétée par 36 semaines de gestation et aucun nouveau néphrons n’est formé après la naissance. Le nombre de néphron se rapporte au nombre total de néphrons mesurés à tout moment après la naissance. Les facteurs génétiques et environnementaux influencent à la fois la dotation en néphron et le nombre. Comprendre comment des gènes ou des facteurs spécifiques influencent le processus de la néphrogenèse et de la perte ou de la disparition de néphron est important car les individus ayant une dotation ou un nombre de néphron inférieur sont considérés comme étant à un risque plus élevé de développer une maladie rénale ou cardiovasculaire. Comprendre comment les expositions environnementales au cours de la vie d’une personne affectent le nombre de néphron sera également vital pour déterminer le risque futur de la maladie. Ainsi, la capacité d’évaluer le nombre de néphron de rein entier rapidement et de manière fiable est une exigence expérimentale de base pour mieux comprendre les mécanismes qui contribuent à ou favorisent la néphrogenèse ou la perte de néphron. Ici, nous décrivons la méthode de macération acide pour l’estimation du nombre de néphron de rein entier basé sur la procédure décrite par Damadian, Shawayri, et Bricker, avec de légères modifications. La méthode de macération acide fournit des estimations rapides et fiables du nombre de néphron (tel qu’évalué par le comptage des glomérules) qui sont à moins de 5% de ceux déterminés en utilisant des méthodes plus avancées, quoique coûteuses, telles que l’imagerie par résonance magnétique. En outre, la méthode de macération acide est une excellente méthode à haut débit pour évaluer le nombre de néphron dans un grand nombre d’échantillons ou de conditions expérimentales.
Introduction
Le néphron est à la fois la structure de base et l’unité fonctionnelle du rein1. Structurellement, le néphron se compose des glomérulus (capillaires et podocytes) situés à l’intérieur de la capsule du Bowman et du tubule rénal, composé du tubule proximale, de la boucle de Henle et du tubule distal qui se termine dans le canal collecteur. Fonctionnellement, le rôle du néphron est la filtration et la réabsorption de l’eau et des électrolytes et la sécrétion des déchets. En général, la néphrogenèse est achevée à 36 semaines de gestation chez l’homme et peu après la naissance chez plusieurs espèces comme la souris et le rat2. La dotation de néphron se rapporte au nombre total de néphrons avec lesquels un individu naît, alors que le nombre de néphron est le nombre total de néphrons mesurés à tout moment après la naissance3. Le nombre de néphron terme et le nombre glomérulaire sont souvent utilisés indifféremment. Comme il n’y a qu’un seul glomérulus par néphron, l’évaluation du nombre de glomérules est un substitut important pour estimer le nombre de néphron.
L’évaluation de la dotation en néphron et du nombre de néphron est d’intérêt clinique, car les études ont démontré une association entre la dotation en néphron et les nombres de néphron réduits avec une incidence accrue de maladies cardiovasculaires4,5 ,6,7,8,9,10,11,12,13,14, 15. sur la base des résultats obtenus dans les reins lors de l’autopsie, le Brenner a observé que les personnes hypertensives présentaient un nombre total inférieur de néphrons par rapport aux individus normotensifs16. Ainsi, Brenner a émis l’hypothèse qu’il existe une relation inverse entre le nombre de néphron et le risque de développer une hypertension plus tard dans la vie. Brenner a également émis l’hypothèse qu’une réduction du nombre de néphron était compensée par les néphrons qui restaient. Afin de maintenir le taux de filtration normal dans le rein, les néphrons résiduels compensent en augmentant leur surface glomérulaire (hypertrophie glomérulaire), ce qui permet d’atténuer tout effet indésirable de la perte de néphron sur la fonction rénale4 ,16.
Alors que la protection à court terme, l’hypertrophie glomérulaire, à long terme, conduit à une augmentation de la rétention de sodium et de liquide, augmentation du volume de liquide extracellulaire, et l’augmentation de la pression artérielle, conduisant à un cycle vicieux de nouvelles augmentations de pression capillaire glomérulaire, hyperfiltration glomérulaire, et cicatrices néphroniques (sclérose) et blessure4,16.
L’obtention d’estimations ou de dénombrements du nombre de néphron offre quelques avantages expérimentaux: 1) il fournit des informations sur le processus de néphrogenèse, qui peut ensuite être lié à des gènes ou des facteurs spécifiques dans l’embryon ou l’environnement maternel-fœtal, et 2) Il y a une association de nombre de néphron avec des maladies cardiovasculaires et, ainsi, il y a le potentiel que des estimations du nombre de néphron pourraient être employées pour prédire le risque cardiovasculaire futur2,17,18, le 19 , la vingtaine , le 21 , 22. en plus de l’environnement maternel-fœtal, plusieurs maladies affectent directement le nombre de néphron et la fonction rénale, y compris l’athérosclérose, le diabète, l’hypertension, et même le vieillissement normal2,9, 10,11,12,22,23. Ainsi, l’évaluation du nombre de néphron du rein entier est importante pour comprendre à la fois les facteurs génétiques et environnementaux qui affectent la néphrogenèse (c.-à-d., la dotation de néphron) et le nombre de néphron au cours de la vie d’une personne et les effets résultants sur la fonction rénale et la santé cardiovasculaire.
Actuellement, il existe plusieurs méthodes disponibles pour la détermination et la quantification du nombre de néphron, chacun avec ses propres avantages et limitations24,25,26,27,28 ,29,30. Les méthodes sophistiquées pour déterminer le nombre de néphron du rein entier comprennent des méthodes stéréologiques, telles que la méthode du dissecteur/fractionnement, et l’imagerie par résonance magnétique25,26. Souvent considéré comme l’étalon-or pour déterminer le nombre de néphron du rein entier, la méthode dissectorielle/fractionnatrice est à la fois coûteuse et chronophage. Les progrès récents et l’amélioration de l’imagerie et du traitement par résonance magnétique ont fourni les outils nécessaires pour compter chaque néphron individuellement. Cependant, l’imagerie par résonance magnétique n’est pas seulement chronophage mais aussi extrêmement coûteuse. En outre, la méthode dissectorielle/fractionnée et l’imagerie par résonance magnétique requièrent une expertise technique avancée, limitant ainsi l’utilisation de ces méthodes dans la majorité des laboratoires de recherche.
La plupart des méthodes de détermination du nombre de néphron font des dénombrements ou des estimations basés sur l’identification des glomérules, car ils sont facilement identifiables structurellement. Dans cet article, la méthode de macération acide pour estimer le nombre de néphron dans le rein entier est décrite et démontrée27. La méthode de macération acide est rapide, fiable et significativement moins coûteuse que d’autres méthodes, telles que la méthode dissectorielle/fractionnatrice et l’imagerie par résonance magnétique. En outre, la méthode de macération acide fournit des estimations hautement reproductibles du nombre de néphron qui ont été signalés comme étant dans la fourchette de ceux déterminés à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique26.
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Protocol
Les fournitures et les réactifs énumérés ci-dessous sont pour la détermination du nombre entier de néphron de rein dans une souris, c’est-à-dire deux reins. Les modifications pour l’utilisation de la méthode de macération acide pour rat sont identifiées par des astérisques. Tous les protocoles expérimentaux sont conformes au Guide national des instituts de santé pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du centre médical de l’Université du Mississippi.
1. procédure d’isolement des reins
- Peser la souris (ou d’autres espèces) et l’euthanasier avec un isoflurane (5%-8%) surdosage ou pentobarbital (150 mg/kg d’injection intrapéritonéale).
- Une fois que la souris est euthanasiée, ouvrez sa cavité abdominale en utilisant des ciseaux chirurgicaux fins le long de la ligne médiane.
- Soulevez délicatement les intestins et l’adiposture reproductrice sur le côté droit de la cavité abdominale. Par dissection grossière, isoler le rein gauche. À l’aide de ciseaux chirurgicaux fins, coupez l’artère rénale gauche et la veine et retirez délicatement le rein gauche, plaçant le rein dans un bateau de pesée (numéro de souris/identificateur) convenablement étiqueté contenant une solution saline tamponnée au phosphore (PBS).
- Répétez la procédure pour le rein droit.
- Retirez chaque rein de son bateau de pesée respectif et placez-le sur une gaze chirurgicale pré-humidifiée avec du PBS.
- En laissant le rein sur la gaze chirurgicale, enlevez rapidement tout tissu non-rénal adhérent (comme l’adipode perirénal ou la glande surrénale) suivi de l’ablation de la capsule rénale. Peser chaque rein individuellement, en enregistrant le poids du rein gauche et droit séparément dans un cahier de laboratoire.
2. homogénéisation, incubation et procédures de contrainte
- Une fois que chaque rein est pesé, égoutter chaque bateau de pesage de PBS et replacez les reins dans le bateau de pesée convenablement étiqueté. À l’aide d’une lame de rasoir propre, coupez le rein en deux, en longueur. Placez chaque moitié de rein vers le bas et coupez chaque moitié en morceaux de 2 mm ou plus petits.
- À l’aide de la même lame de rasoir, recueillir et placer soigneusement les morceaux de rein hachés dans un tube conique de 15 mL étiqueté (numéro/identificateur de la souris; rein gauche versus droit).
- Répétez la procédure pour le rein opposé, à l’aide d’une nouvelle lame de rasoir. Placer le rein haché dans un tube conique de 15 mL, étiqueté séparément.
- Dans une hotte bien ventilée, ajouter 5 mL d’acide chlorhydrique 6 M (HCl) à chaque tube conique de 15 mL.
- Replacer le capuchon dans le tube conique, agiter doucement le mélange rein/HCl et placer le tube conique de 15 mL dans un bain d’eau préchauffé réglé à 37 ° c pendant 90 min (* 120 min pour les reins de rat).
- Agiter brièvement chaque tube de 15 mL toutes les 15 min pendant l’incubation afin de s’assurer que tous les tissus sont exposés à l’acide HCl.
- Insérez une aiguille de 18 G dans une seringue de 5 mL (* seringue de 10 mL pour rat) et retirez délicatement le piston de la seringue. Placer la seringue dans un tube conique de 50 mL (tube #1) dans une hotte.
- Retirer la solution rénale/HCl du bain d’eau et verser la solution tissulaire dans l’extrémité ouverte de la seringue et mettre le tube conique de 15 mL de côté dans un rack de tube à essai. Remplacez délicatement le piston et poussez lentement le piston de manière à extruder la solution à travers l’aiguille et dans le tube #1.
- Lavez le tube conique de 15 mL avec 5 mL de solution PBS. Agiter le PBS dans le tube conique de 15 mL de façon à solubiliser les tissus rénaux restants.
- Encore une fois, retirez délicatement le piston de la seringue de 5 mL contenant l’aiguille de 18 G et versez le contenu du tube conique de 15 mL dans l’extrémité ouverte de la seringue. Remplacez délicatement le piston et rincez la seringue en poussant doucement vers le bas sur le piston, dans le tube #1. Répétez ce processus 2x (effectué 3x au total).
- Insérez une aiguille de 21 G dans une nouvelle seringue de 5 mL (* seringue de 10 mL pour rat) et retirez délicatement le piston de la seringue. Placer la seringue avec l’aiguille de 21 G attachée dans un nouveau tube conique de 50 mL (tube #2).
- Versez le contenu du tube #1 dans l’extrémité ouverte de la seringue contenant l’aiguille de 21 G. Insérez délicatement le piston et rincez la seringue en poussant doucement le piston de la seringue et en plaçant la solution extrudée dans le tube #2.
- Laver le tube #1 avec 5 mL de solution PBS. Agiter le PBS dans le tube #1 de façon à solubiliser les tissus rénaux restants.
- Encore une fois, retirez délicatement le piston de la seringue de 5 mL contenant l’aiguille de 18 G et versez le contenu du tube #1 dans l’extrémité ouverte de la seringue. Remplacez délicatement le piston et rincez la seringue en poussant doucement vers le bas sur le piston, en extrudant la solution dans le tube #2. Répétez ce processus 2x (effectué 3x au total).
- Apportez le volume total du tube #2 jusqu’à 50 mL en ajoutant du PBS supplémentaire, jusqu’à la ligne de 50 mL sur le tube #2.
- Incuber le tube #2 contenant la solution de tissu de rein dans un rack de tube sur une plaque à bascule dans un réfrigérateur réglé à 4 ° c pendant la nuit (minimum 8-10 h).
3. comptage des glomérules et extrapolation du nombre de néphron
- Retirez le tube #2 du réfrigérateur et Resuspendez le tissu granulé en l’invertant doucement plusieurs fois afin de créer une solution homogène. Nous recommandons de compter les glomérules dans les 5 d après le traitement.
- Soigneusement aliquote 500 μL de la solution rénale dans un seul puits d’une plaque de 12 puits. Répétez cette 2x, en plaçant chaque aliquote dans un puits séparé de sorte qu’il y ait trois puits de solution rénale par rein, pour l’analyse en triplicate.
- Ajouter 500 μL de PBS dans chacun des trois puits contenant la solution rénale, pour une dilution de 1:1.
- À l’aide d’un microscope inversé, comptez le nombre de glomérules par puits. Le comptage est facilité par l’utilisation d’une grille de 16 sections distinctes placées sur le fond de chaque puits. Comptez le nombre de glomérules par chaque section quadrillée, puis additionnez le nombre par grille pour obtenir le total des glomérules par puits. Les glomérules sont facilement identifiables par leur structure sphérique. D’autres identificateurs comprenaient une teinte rougeâtre due à des capillaires remplis de sang, ainsi que des pré-ou post-artérioles qui demeurent attachés au corps de glomérules individuels (figure 1).
- Ajouter le nombre total de glomérules comptés par chacun des trois puits, puis les diviser par trois pour le nombre moyen de glomérules par 500 μL de solution rénale. Si la variance du nombre moyen de glomérules par puits est supérieure à 10%, répéter la procédure de comptage néphron, en accordant une attention particulière à la nature homogène de la solution rénale. Multiplier le nombre de glomérules comptés par puits fois 100 pour le nombre moyen de glomérules par rein. Le nombre total de néphron peut être exprimé par rein ou, en utilisant le poids de rein, par mg ou g de tissu.
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Representative Results
Voici des estimations représentatives du nombre de néphron de rein entier d’un modèle de souris établi de l’hypertension et un modèle génétique de rat de la maladie rénale chronique liée à l’âge. Les principales caractéristiques d’identification des glomérules, telles qu’une structure sphérique avec ou sans structures pré-ou post-artériolaires ou tubulaires attachées, sont mises en évidence pour celles qui sont nouvelles à la méthode de macération acide (figure 1).
Dans le premier exemple expérimental, les nombres de néphron totaux ont été déterminés chez des souris (mâles C57BL/6, 6 semaines) perfusées avec le véhicule (solution saline) ou l’angiotensine II pendant 14 jours. Chez les souris infusées dans un véhicule, le nombre de néphron était de 12 411 ± 248 néphrons par rein, tel que déterminé à l’aide de la méthode de macération acide (figure 2). Ces estimations concordent avec les gammes de néphron du rein entier rapportées antérieurement chez la souris (tableau 1). L’angiotensine a augmenté la pression auriculaire d’environ 40 mmHg après 14 jours de perfusion et a été associée à une réduction significative du nombre de néphron (9 122 ± 193 néphrons par rein) de près de 26% (figure 2). Ces données suggèrent que la perfusion d’angiotensine II n’est pas seulement associée à l’hypertension mais, aussi, une réduction significative du nombre de néphron est associée à la perte de néphron due à la sclérose ou aux lésions glomérulaires.
Dans le deuxième exemple expérimental, les résultats antérieurs du nombre de néphron dans un modèle génétique de rat d’agénèse rénale, le modèle hétérogène dérivé de l’agénèse rénale unilatérale (HSRA) rat, ont été confirmés. Le modèle HSRA présente des phénotypes de pénétrance incomplète pour les défauts du rein et des voies urinaires, certains animaux étant nés normaux (avec deux reins) et d’autres nés avec un rein. Chez les rats nés avec deux reins (mâle hA-Control; 12 semaines d’âge), les estimations du nombre de néphron utilisant la méthode de macération acide ont été 27 288 ± 336 néphrons par rein (figure 3). En revanche, chez les rats nés avec un rein solitaire (mâle hA-solitaire; 4 semaines d’âge), les estimations du nombre de néphron ont été significativement inférieures à 24 594 ± 883 néphrons par rein (figure 3). Les estimations du nombre de néphron obtenus dans ces échantillons sont également cohérentes avec les gammes rapportées antérieurement chez le rat (tableau 1). Il est à noter que ces données concordent avec les résultats antérieurs dans lesquels on a constaté que les rats de la hA-solitaire présentent une diminution de la dotation ou des nombres de néphron (comparativement à un rein témoin) reflétant vraisemblablement les facteurs génétiques sous-jacents associés à la naissance avec un seul rein31.
Figure 1 : Identificateurs clés des glomérules pour le comptage et l’évaluation du nombre de néphron du rein entier. Les glomérules sont facilement identifiables par leur structure sphérique, comme l’indiquent les flèches. D’autres identificateurs comprennent une teinte rougeâtre due à des capillaires remplis de sang, ainsi que des pré-ou post-artérioles (ou tubules) qui peuvent demeurer attachés au corps des glomérules individuels après traitement (comme celui identifié au bas de cette Micrographe). Également présents dans cette image sont des restes de tubules et de vaisseaux sanguins. Grossissement = 10X; barre d’échelle = 100 μM. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2 : Néphron comptant chez la souris. (A) image représentative des glomérules d’un rein de souris unique plaqué dans un puits à fond plat de 22,1 mm d’une plaque de culture de 12 puits, comme on le voit à l’aide d’un microscope inversé. Les glomérules et les tubules rénaux sont observés à densité modérée lorsqu’ils sont dilués par un facteur de deux (0,5 mL de solution rénale plus 0,5 mL de 1x PBS). Beffet d’un véhicule de 14 jours ou d’une perfusion d’angiotensine II sur le nombre de néphron chez des souris mâles C57BL/6, évaluée par comptage glomérulaire. La perfusion de l’angiotensine II à 1 000 ng/kg/min (via une minipompe osmotique) a été associée à une hypertension et a marqué une réduction du nombre de néphron par rapport au nombre de néphron chez les souris perfusées avec le véhicule. Les nombres de néphron chez les souris infusées par véhicule sont cohérents avec les estimations précédemment rapportées du nombre de néphron chez les souris (tableau 1). Véhicule: n = 3, angiotensine II: n = 3, *p < 0,05. Barres d’erreur = SE. grossissement = 4X; barre d’échelle = 250 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Néphron comptant chez le rat. (A) image représentative des glomérules d’un rein de rat unique plaqué dans un puits à fond plat de 22,1 mm d’une plaque de culture de 12 puits, comme on le voit à l’aide d’un microscope inversé. Les glomérules et les tubules rénaux sont observés à une densité significativement plus élevée par rapport à celle de la souris. Bla quantification du nombre de néphron chez les rats HSRA-Control et HSRA-s révèle que le nombre de néphron est moins présent dans le HSRA-s comparativement aux rats HSRA-C et qu’il est conforme aux résultats antérieurs de ce modèle31. HSRA-C, rats nés avec deux reins: n = 3; HSRA-S, rats nés avec un rein solitaire: n = 3,* p < 0,05. Barres d’erreur = SE. grossissement = 4X; barre d’échelle = 250 μm. s’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| espèce | Nombre de néphron par rein | référence |
| souris | 9000 à 21000 | 18-22, 28 |
| rat | 13000- | 31, 33 |
| mouton | 200000 à 800 000 | 23, 29, 34 |
| cochon | 1600000-4600000 | 32, 35 ans |
| humain | 500000-2,000,000 | 8-15 |
Tableau 1: plages déclarées de nombre de néphron chez plusieurs espèces.
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Discussion
Avec une bonne technique expérimentale, la méthode de macération acide est idéale pour estimer le nombre de néphron dans le rein entier. Bien que le rein soit dissous dans l’acide, les glomérules demeurent largement intacts et sont facilement identifiables, rendant le comptage des glomérules individuels relativement facile et direct. La technique de macération acide est particulièrement avantageuse pour plusieurs raisons. Premièrement, la méthode de macération acide est une méthode rapide et pratique qui nécessite relativement peu en termes de dépense et d’effort physique. Tous les réactifs et consommables nécessaires à la réalisation de la méthode de macération acide sont facilement disponibles dans la plupart des laboratoires de base, la seule exigence majeure étant l’accès à un microscope inversé pour le comptage glomérulaire. En termes de dépense, on estime que la méthode de macération acide ne coûte que quelques centaines de dollars par animal, ce qui n’est pas beaucoup comparé aux coûts associés à d’autres méthodes de comptage glomérulaire des reins entiers, comme l’imagerie par résonance magnétique, qui peut s’intégrer à des milliers de dollars par animal de temps de numérisation et d’expertise technique.
Deuxièmement, la méthode de macération acide implique significativement moins de temps de traitement tissulaire comparé à d’autres méthodes de nombre de néphron du rein entier comme la méthode de dissecteur/fractionnement24. Du début à la fin, la méthode de macération acide nécessite moins de 24 heures de temps total, dont moins de 1-2 heures sont passées à traiter les reins, puis à compter les glomérules individuels par animal expérimental. En revanche, la méthode du dissecteur/fractionnement est intensive en main-d’œuvre, nécessitant une estimation de 15 heures de travail (4-6 heures de coupe, 2-3 heures de coloration et 4-5 heures de comptage) par rein, sans compter les 48-72 heures nécessaires pour traiter les reins en GL méthacrylate de ycol24. En raison des avantages du coût et du temps, la méthode de macération acide est particulièrement utile dans les études où les estimations du nombre de néphron du rein entier doivent être faites chez un grand nombre d’animaux avec ou sans interventions génétiques ou pharmacologiques. Le coût et le temps associés à la méthode du désecteur/fractionnement et à l’imagerie par résonance magnétique ont été considérés comme un facteur limitatif majeur dans leur adoption dans la plupart des laboratoires de recherche.
Enfin, la méthode de macération acide fournit des estimations du nombre de néphron du rein entier qui sont comparables aux mesures utilisant des méthodes plus sophistiquées telles que l’imagerie par résonance magnétique26. Par exemple, en utilisant l’étiquetage de la ferritine cationique des glomérules et le traitement d’images tridimensionnels pour compter chaque néphron dans un seul rein du rat Sprague-Dawley, l’imagerie par résonance magnétique a donné des dénombrements moyens de 34 000 glomérules individuels par le rein26. Dans les reins non cationiques marqués par la ferritine, l’imagerie par résonance magnétique a donné des dénombrements de structures de type néphron 2 000 en raison du comptage de régions non glomérulaires de rein avec des signaux magnétiques de magnitude et de forme semblables à ceux des glomérules marqués par la ferritine. Lorsque ces artefacts sont soustraits des dénombrements déterminés par les reins marqués par la ferritine cationique, le nombre effectif de glomérules déterminés, à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique, est plus proche de 32 000 néphrons par rein26. Dans cette même étude, les expériences de validation ont donné des dénombrements glomérulaires moyens de 31 000 par rein à l’aide de la méthode de macération acide26. Ainsi, la méthode de macération acide produit des estimations du nombre de néphron du rein entier qui sont dans < 5% de ceux déterminés à l’aide de techniques de pointe telles que l’imagerie par résonance magnétique.
Bien qu’il existe plusieurs avantages clés associés à la méthode de macération acide, les enquêteurs doivent également être conscients des limitations associées à cette méthode. Une limitation concerne l’utilisation de rein entier. Comme le rein entier est dissous et homogénéisé, les informations concernant la distribution spatiale des glomérules dans le cortex rénal ne peuvent pas être déterminées. Si connaître la distribution intrarénale du volume glomérulaire est important, alors l’utilisation de l’imagerie par résonance magnétique serait une méthode mieux adaptée.
Par rapport à d’autres méthodes, l’utilisation de la méthode de macération acide semble légèrement sous-estimer le nombre total de néphron. Les petites estimations sont vraisemblablement dues, en partie, à la dissolution d’un faible pourcentage de glomérules dans l’acide ou pendant la macération du rein. En outre, avec le vieillissement ou la maladie, il y a une perte de néphrons fonctionnels, qui, bien que ne contribuant pas à la formation d’urine, peut être plus sensible à la macération acide et peut être détruit pendant la transformation, contribuant ainsi à abaisser les estimations de néphron total nombre. Ainsi, les soins doivent être utilisés lors de la collecte et de la transformation des reins afin de ne pas laisser de tissus rénaux in vivo lors de la hachure du rein, ou dans les seringues lors de l’extrusion des échantillons de tissus. Globalement, cependant, la sous-estimation du nombre total de néphron due au traitement tissulaire semble relativement faible.
Comme le comptage des glomérules à l’aide de la méthode de macération acide est subjectif, la sous-estimation du nombre de néphron peut également refléter le biais d’observateur, qui peut être facilement surmonté par des mesures effectuées par deux enquêteurs distincts aveuglé à informations concernant les animaux ou les conditions expérimentales. S’il y a une inquiétude importante quant à ce qui constitue un glomérulus, une autre approche consisterait à infutiliser des animaux expérimentaux avec de l’oxyde de fer avant l’euthanasie. Lorsqu’il est perfusé par voie intraveineuse, l’oxyde de fer pénètre et se coince dans le glomérule; ainsi, les glomérules transformés devraient tacher le noir foncé, permettant une plus grande identification des glomérules lors du comptage30.
La méthode de macération acide évalue le nombre de néphron du rein entier en fonction de la mesure de petits échantillons (3 x 0,5 ml ou 1,5 mL) par opposition aux mesures de la solution entière de rein (50 mL). La méthode de macération acide est hautement reproductible dans la nature, et les nombres de glomérules dans les échantillons d’un seul rein et dans les groupes expérimentaux sont très cohérents. De plus, les résultats représentatifs rapportés dans la présente étude à partir de souris C57Bl/6 de type sauvage et de rats nés avec un seul rein (figures 2 et 3) sont très cohérents avec les résultats antérieurs, ainsi qu’avec les gammes précédemment rapportées (tableau 1 )5,31. Si désiré, des mesures additionnelles pourraient être faites facilement pour mieux estimer le nombre total de néphron par rein.
Bien que la technique de macération acide fournisse des estimations fiables et reproductibles du nombre de néphron, cette méthode n’est pas recommandée pour l’obtention de mesures de volume glomérulaire, car l’exposition à l’acide produit probablement des altérations du volume des glomérules. Comme la détermination du volume glomérulaire est importante dans la détermination de l’ensemble de la surface glomérulaire rénale, il est recommandé que ces mesures soient effectuées à l’aide de méthodes histologiques et stéréologiques24,25. En particulier, les méthodes stéréologiques qui utilisent le méthacrylate de glycol intègrent les reins afin de limiter le gonflement et l’expansion tissulaires et, par conséquent, maintiennent la géométrie glomérulaire aussi près que possible de celle in vivo.
Enfin, une autre limitation de la technique de macération acide, et celle qui est commune à d’autres méthodes d’évaluation du nombre de néphron, est qu’aucune information concernant la fonction glomérulaire (comme le taux de filtration glomérulaire) ne peut être vérifiée à partir de glomérules une fois préparé industriellement. Ainsi, alors que les glomérules individuels peuvent être comptés, son état fonctionnel (formation d’urine ou non-formation d’urine) ne peut pas être déterminé à l’aide de la méthode de macération acide. De même, aucune information longitudinale ne peut être vérifiée à l’aide de la méthode de macération acide chez les souris individuelles. Au lieu de cela, des groupes distincts d’animaux à divers moments sont nécessaires pour obtenir un aperçu des changements dans le nombre de néphron sur la durée de vie d’un animal ou une intervention pré-ou postgénétique ou pharmacologique.
En résumé, la méthode de macération acide est une méthode à faible coût, à haut débit et efficace pour estimer le nombre de néphron du rein entier. La méthode de macération acide fournit un degré élevé de reproductibilité comme en témoignent les deux exemples présentés ici, ainsi que par ceux précédemment rapportés en utilisant cette méthode18,19,20,21 , le 22 , 28. alors que l’utilisation de la méthode de macération acide a été décrite pour une utilisation dans la souris (et le rat), la méthode de macération acide peut également être mise à l’échelle pour une utilisation dans des espèces plus grandes, comme le chien et le porc27,32.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus en partie par les instituts nationaux de santé, National Heart, Lung et Blood Institute (R01HL107632).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane anesthesia | Abbott Laboratories | 05260-05 | |
| Isoflurane vaporizor system & flow gauge | Braintree Scientific | VP I | Include medical grade oxygen supply |
| Leica Inverted Microscope DMIL LED | Leica Microsystems | DMIL LED | Any make also suitable |
| Digital water bath | Fisher Scientific | 2239 | Any make also suitable |
| ToughCut Fine surgical scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | 25 mm cutting edge, 11.5 cm length; Tips: sharp-sharp; Tip shape: straight |
| Micro dissecting forceps 4 1/4 in. | Biomed Res Instruments, Inc | 10-1760 | Curved tip |
| Plexiglass board 5 in. x 7 in. | any source suitable | n/a | Any make also suitable |
| Hexagonal polystyrene weighing dish | Fisher Scientific | 02-2002-100 | Any make also suitable |
| Razor blades | Fisher Scientific | 12-640 | Single edge carbon steel 0.009 |
| Gauze sponges 4 x 4 in. 8 ply | Fisher Scientific | MSD-1400250 | |
| 10x concentrate phosphate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5493-4L | Dilute to 1x |
| 6 N Hydrocholric acid solution | Sigma Aldrich | 3750-32 | |
| 15 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-70C | Any make also suitable |
| 50 mL conical centrifuge tube | Fisher Scientific | 14-959-49A | Any make also suitable |
| Disposable 5 mL syringe | Cole Palmer | EW-07944-06 | Any make also suitable |
| 18G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | Any make also suitable |
| 21G1.5 disposable needle | Fisher Scientific | 14-826-5B | Any make also suitable |
| 12-well multiple-well cell culture plates with lid | Cole Palmer | #FW-01959-06 | Any make also suitable |
| Polypropylene modular test tube rack | Cole Palmer | #EW-06733-00 | Capable of accommodating 15 and 50 mL conical tubes; any make also suitable |
References
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