Summary
Målet med detta protokoll är att identifiera lymfatiska endotelceller populationer inom levern med beskrivs märkpennor. Vi använder kollagenas IV och DNAS och en skonsam malning av vävnad, kombinerat med flödescytometri, för att identifiera en distinkt befolkning av lymfatiska endotelceller.
Abstract
Inom levern, lymfkärl finns inom portalen triaden, och deras beskrivs funktion är att ta bort interstitiell vätska från levern till lymfkörtlarna där cellulära skräp och antigener kan vara tillfrågade. Vi är mycket intresserade av att förstå hur den lymfatiska kärl kan vara inblandade i inflammation och immunceller funktion inom levern. Mycket lite har dock publicerats om inrättande av matsmältningen protokoll för isolering av lymfatiska endotelceller (LECs) från levern eller specifika markörer som kan användas för att utvärdera levern LECs på basis per cell. Därför optimerat vi en metod för matsmältningen och färgning av levern för att utvärdera LEC befolkningen i levern. Vi är övertygade om att den metod som anges här kommer att vara användbart för identifiering och isolering av LECs från levern och stärker vår förståelse av hur LECs bemöta den levern mikromiljö.
Introduction
Lymfkärl och LECs roll i levern är inte väl förstått. Medan lymfkärl finns inom portalen triaden av levern1 och expandera under sjukdom2, förstås mycket lite när det gäller funktion och fenotyp av LECs inom levern. Med upptäckten av markörer som finns främst på LECs3, fyller vikten av dessa celler inom olika vävnad nischer i homeostas och sjukdom en viktig lucka i vår förståelse. LECs har en viktig roll i att upprätthålla perifer tolerans i lymfkörteln och metastaserande tumörer genom att interagera direkt med T celler4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13. LECs i lymfkörteln kan främja skyddande immunitet via deras interaktioner med flyttande dendritiska celler14,15,16. Därför finns det flera roller för LECs som kan vara specifika för vävnader och interaktioner där de förekommer. Dock är mycket lite förstås om hur LECs interagerar med immunceller i vävnaden eller hur LECs fungerar i olika organsystem; Således, utvärdera LECs på basis per cell inom levern eller andra organ kan leda till framsteg i hur LECs program vävnadsspecifika immunitet. Medan mycket av den litteratur som fokuserar på LECs i levern använder mikroskopi för att visualisera LECS-servern med hjälp av en eller två markörer och morfologi17, har mycket lite gjorts för att särskilt utvärdera LECs på en cell för cell grund med hjälp av flödescytometri, men en studie utvärdera skillnaderna mellan leverns sinusformig endothelial celler (LSECs) och LECs18. Att kunna analysera LEC populationer i levern av flödescytometri kan den djupgående studien av LEC fenotyp under normala homeostas eller sjukdom.
För att utvärdera LECs av flödescytometri, behövs flera yta markörer. Typiskt, LECs visualiseras genom uttryck av prospero-relaterade homeobox 1 (Prox-1), lymfatiska kärl endothelial hyaluronan receptor 1 (LYVE1) eller en vaskulär endotelial tillväxtfaktor receptor 3 (VEGFR3) med mikroskopi. Dock i levern är uttrycket av dessa markörer inte begränsad till LECs. Prox-1 uttrycks allmänt av hepatocyter under levern utveckling, förnyelse och skada19och LYVE1 och VEGFR3 uttrycks av leverns sinusformig endothelial celler18. I lymfkörteln, LECs identifieras med flödescytometri som kluster av differentiering (CD) CD45-, CD31 + och podoplanin + (PDPN)16. Detta tillvägagångssätt är dock alltför minimal att isolera LECs i levern eftersom CD45 - CD31 + celler kommer att fånga endotelceller, och den dominerande befolkningen av vascular endothelial celler i levern är LSECs. Således behövs andra markörer för att skilja sällsynta LEC befolkningen från den rikliga LSEC befolkningen. Både CD16/32 (uttryckt i mogna LSECs18) och CD146 (en gemensam vaskulära endotelceller markör som huvudsakligen som uttrycks inom den leverskada sinusoider av leverns sinusformig endothelial celler20 med liten eller ingen uttryck av lymfatiska endotelceller21) var kandidat markörer.
Därför optimerat vi en metod för att isolera och visualisera LECs i levern med hjälp av den ovan markörer, CD45, CD31, CD146, CD16/32 och PDPN för flödescytometri. Vi beskriver användning av kollagenas IV, DNase 1 och mekanisk separation för levervävnad matsmältningen till en enskild cell suspension. Vi beskriver också användningen av iodixanol täthetlutning för isolering av icke-parenkymal celler (NPC) och att eliminera cellulära skräp. Slutligen fastställa använder flera markörer, vi optimalt flöde flödescytometri Usenets strategin att identifiera LECs från levern med PDPN som den dominerande markören.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Colorado Anschutz Medical Campus.
1. beredning av material
- Göra en 5 mg/mL lösning av DNAS I fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Göra en matsmältningen blandningen genom att lägga till 5.000 U/mL kollagenas IV klickas EHAA media.
- Varma matsmältningen blandning vid 37 ° C i 30 min innan användning.
- Göra en isolering buffert genom att lägga till 4,8% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) till Hanks balanserad saltlösning (HBSS).
- Göra en röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert genom att lägga 100 mM ammoniumklorid, 10 mM KHCO3och 0,1 mM EDTA till destillerat H2O.
2. beredning av en Single-cell avstängning från en mus lever
- Avliva musen med CO2 och cervikal dislokation.
- Spraya ner musen med 70% etanol till våt dess päls. Fästa musens fötter till en dissektion styrelse.
- Med dissektion sax för att klippa huden ca 1 cm ovan anus, var noga med att skära endast genom huden (ca 1 mm). Dra ut huden från kroppen med tandad tång och infoga saxen mellan hud och bukhinnan. Öppna saxen för att separera huden från bukhinnan och, sedan, skära huden från snittet till halsen.
- Fästa huden att dissekering styrelsen med en PIN-kod under varje arm och ovanför varje ben. Dra peritoneal sac upp och skär uppåt mot halsen. Greppa loberna i levern och skär strax under bröstbenet.
Obs: Bör vara försiktig om någon av levern kommer att användas för immunhistokemi (IHC). - Skär runt levern och levern ta bort musen och placera den i 4 mL klickas EHAA media.
- Med en skalpell skär levern i ~ 1 mm diameter bitar.
- Tillsätt 500 µL av matsmältningen blandningen och 500 µL av DNAS I (2 mg/mL) till levern.
- Inkubera i levern under 30 minuter vid 37 ° C. Efter 15 min, blanda vätskan med 5 mL pipett.
- Efter 30 min inkubering, överföra smält provet genom en 100 µm SIL till en 50 mL konisk tub.
- Skjut försiktigt in de återstående bitarna genom filtret med kolven i en 1 mL spruta.
- Tvätta filtret med 5 mL isolering buffert och tryck försiktigt vävnaden genom silen med baksidan av en kolv från en 1 mL spruta. Upprepa detta tills filtret tvättas med 25 mL isolering buffert.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g för 5 min. Aspirera försiktigt bort supernatanten.
- Återsuspendera pelleten med 4 mL lyseringsbuffert RBC. Inkubera cellerna i rumstemperatur i 5 min.
- Tvätta cellerna med 10 mL isolering buffert och centrifugera vid 400 x g under 5 minuter.
- Räkna cellerna på en hemocytometer att bestämma antalet full lever.
- Återsuspendera cellerna i 5 mL 20% iodixanol och lagret dem med 1 mL PBS.
- Centrifugera cellerna vid 300 x g i 15 min utan en broms.
- Ta bort lagret mellan PBS och iodixanol och placera dem, genom en 100 µm filter, in i en ny 50 mL koniska rör.
- Tvätta cellerna med 10 mL isolering buffert och centrifugera vid 400 x g under 5 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 500 µL av PBS med 2% fetalt bovint serum (FBS).
3. flöde flödescytometrisk analys av enstaka celler från levern
- Räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer och Mikroskop, använder trypan blå uteslutning för att mäta viabla celler. Tillsätt 10 µL av cellerna till 10 µL av trypan blå och omedelbart placera dem på en hemocytometer och räkna de levande cellerna (inte blå) under ett mikroskop. Sedan beräkna antalet celler per mikroliter.
- Alikvot cirka 5 miljoner av de återstående nonparenchymal cellerna i en enda bra av en plattan med 96 brunnar.
- Centrifugera cellerna vid 400 x g i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 90 µL av PBS med 2% FBS.
- Lägger till anti-CD45 (1: 200), anti-CD146 (1: 200), anti-CD31 (1: 200) och PDPN (1: 200) utspätt i 10 µL 10 x 2.4G2 eller anti-CD16/32 (1: 200).
Obs: Ingen Fc block (2.4G2) användes när anti-CD16/32-märkt antikropp användes. - För att avgöra var positiva och negativa gates bör anges, inkludera en fluorescens minus en (FMO) fläcken för varje färg och en antikropp isotypen kontroll.
- För att avgöra levande kontra döda celler, fläcken med en livskraft markör (t.ex. ghost röd 780). Inkubera cellerna vid 4 ° C i 30 min.
- Tvätta cellerna med 100 µL av PBS med 2% FBS.
- Använd en liten delmängd av celler för att justera laser och ersättning på flödescytometer. Färga celler med en antikropp till varje enskild fluorophore och en utan någon antikropp.
Obs: Beroende på den flödescytometer används, bör en kompensationsmatris fastställas ta bort spektrala överlappning. - Placera provet röret på cytometer sonden och samla alla händelser registreras.
4. dataanalys
- Tittar på side-scatter vs. framåt-scatter området, gate på ”live” celler baserat på storlek och granularitet och livskraft markör färgämne.
- Nästa, med CD45 lysande violett 510 och CD31 PerCp Cy5.5, gate på CD45 - CD31 + celler med hjälp av isotypen kontroller och FMO för att fastställa positiva och negativa populationer.
- Slutligen använder CD146 v450 eller CD16/32 FITC och PDPN APC, ta CD146 - PDPN + eller CD16/32-PDPN + celler, igen med isotypen kontroller och FMO, för att fastställa positiva och negativa populationer. Dessa celler är LECS-servern.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Studier analysera lever lymfkärlen har främst använt immunohistokemi för att kvantifiera frekvens och diameter på lymfkärl i levern. Dock tillåter inte denna metod för utvärdering av LECs på basis av cell för cell eller för uttryck av flera markörer, cytokiner, chemokiner eller transkriptionsfaktorer. Därför frågade vi om levern LECs kunde isoleras från levern och utvärderas med hjälp av flödescytometri. Tidigare arbete isolera lymfkörtel LECs utfördes med hjälp av Liberase DL (kollagenas i-II-och-dispase) och DNAS 1 kombinerad med mekanisk separation av lymfkörteln vävnad med nålar14,16. Därför samma matsmältning protokoll på levervävnad användes eller kollagenas IV och DNAS 1 användes som tidigare beskrivits, immunceller isolering av levern22 och följde matsmältningen med en täthet lutning separation (iodixanol) steg till ta bort hepatocyter och öka frekvensen av andra celltyper i levern (figur 1A). Efter levern matsmältningen och centrifugering med täthetlutningen, cellerna var fläckade CD45, CD31, PDPN och CD16/32. CD16/32 har beskrivits för att uttryckas genom mogen LSEC populationer, men inte LEC populationer18. Således, LECs var gated som CD45-, CD31 +, CD16/32-, PDPN + celler, medan LSECs var gated som CD45-, CD31 +, CD16 / 32 + och PDPN-(figur 1A). Gates fastställdes på levande celler (ghost röda negativa) och utifrån isotypen kontroller och FMO färgning (figur 1A). LYVE-1 APC på LEC befolkningen var också bekräftade (figur 1B). Båda metoderna tillåtna visualisering av LEC befolkningen inom levern; färgning profilen av cellerna var dock visuellt bättre när du använder kollagenas IV och DNAS 1 än kollagenas jag-II-och-dispase (figur 1 c). Därför utfördes alla framtida manipulationer med kollagenas IV och DNAS 1, som beskrivs i protokollet. I genomsnitt fick vi cirka 1.300 LECs per gram levervävnad eller 2.200 LECs per naiva levern, här matsmältning-metoden.
Att optimera Usenets strategi och kombination av fluorophores och för att eliminera förorening av LSECs, användes både CD16/32 och CD146. CD16/32 är Fc gamma receptorer II och III och uttrycks på mogna LSECs men inte på LECs18. CD16/32 kunde skilja PDPN + CD16/32-cellerna från de PDPN-CD16 / 32 + celler, speciellt när använder PDPN konjugerat till APC eller PE och CD16/32 konjugerat FITC (figur 1A), men mindre väl när PDPN var konjugerat till PE-Cy7 (figur 1 c). Uttrycket av CD16/32 hittas inte LECs men finns på LSECs. FC block använder CD16/32 antikroppen för att minimera den Fc receptor och nonantigen specifik bindning av immunglobuliner till Fc-receptorer. Eftersom CD16/32 användes för att visualisera LSECs, icke-specifik bindning av immunglobuliner var högre och CD146 var optimerad som ett alternativ att mäta LSECs. Därför testade vi CD146 konjugerat till V450, vaskulära endotelceller markör uttryckt mycket av LSECs och andra vaskulära endotelceller20 men med låg till ingen uttryck av LECs23. Vi optimerat första färgningen av CD146 använder FMO och isotypen kontroller för både CD16/32 och CD146 (figur 2A). Om vi utvärderat endast CD16 / 32 + celler eller CD16/32-cellerna, CD16 / 32 + celler var alla CD146 + och PDPN - medan CD16/32-cellerna var främst CD146 - och PDPN- eller PDPN + (figur 2B). För att bekräfta detta färgning, användes FMO. Genom att ta bort PDPN från fläcken, försvann PDPN + befolkningen (figur 2 c). Intressant nog fanns det inga CD146 + PDPN +-celler, som bekräftar att CD146 inte eller mycket ödmjuk uttrycks av PDPN + LECs. Därför är vi övertygade om att någon av dessa markörer kan användas till gate ut vascular endothelial celler i levern.
För att ytterligare verifiera att PDPN är en lämplig markör för LECs, var lever sektioner från möss fläckad med både PDPN (grön) och F4/80 (brun) (figur 3A). Den vaskulära endotel varken makrofager uttryckt PDPN i murina levern. Vi kunde också urskilja cholangiocytes, som kan färga positivt för PDPN, från lymfkärl, baserat på tydliga kärn strukturer av gallgångarna och av cytokeratin 7 färgning (figur 3B; red: cytokeratin 7, gröna: PDPN). Eftersom flera markörer används för flödescytometri, såsom CD31, som inte är uttryckt av cholangiocytes24, vi är övertygade om att vi tar bort dessa celler från analysen, därmed bekräftar att celler från levern som är CD45-, CD31 +, CD146 Lo/neg, CD16/32-, och PDPN + är LECs. Slutligen, för att tillhandahålla bevis för att de färgade cellerna är LECs, vi sorteras denna population av celler och används kvalitativ realtid polymeraskedjereaktion för att utvärdera Vegfr3 och prox-1 uttryck. Både Vegfr3 och prox-1 utvärderades, då dessa avskrifter uttrycks av andra celler i levern —prox1 av hepatocyter och Vegfr3 av LSECS (bland andra) — men inga andra celler förutom LECs uttrycka båda. Uttrycket av båda dessa markörer var signifikant högre i den sorterade befolkningen än i den odlade murina makrofag cell linje (RAW264.7) som uttrycker inte normalt dessa markörer men är liknande i uttryck att odlade murina LECs (figur 3 c ).
Figur 1 : Representativa Flödesanalys för flödescytometri av kollagenas jag-II-dispase och kollagenas IV-rötas murina levervävnad. (A) denna panel visar den portande strategin, fluorescens minus en färgning, och isotypen kontroller för förfarandet. (B) i denna panel visas de LYVE-1 färgning av CD16/32-PDPN +-celler. (C), denna panel visar slutliga flöde flödescytometri grinden efter smälta mus lever med antingen kollagenas jag-II-dispase (t.ex., Liberase DL) eller kollagenas IV och utvärdera CD16/32 PerCP X PDPN PE-Cy7 där LECs är CD16/32- och PDPN +. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Identifiering av CD146 och PDPN som lämpliga markörer för levern lymfatiska endotelceller. (A) denna panel visar fluorescens minus en och isotyp-kontroller för CD16/32 (vänster) och CD146 (höger). (B) i denna panel visas gated CD16/32 positiva eller negativa celler bestäms från sidopanelen A. Visas är CD146XPDPN från båda populationerna. (C) i denna panel visas fluorescens minus en för PDPN att påvisa att färgningen är frånvarande när antikroppen läggs inte. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Identifiering av flöde PDPN + celler som lymfatiska endotelceller. (A) denna panel visar representativa immunohistokemi från en mus lever färgas med PDPN (grön) och F4/80 (brun). De lymfatiska kärl (LV), blodkärl (BV) och makrofag (MF) är märkta. Skalstapeln = 100 µm. Formalin-fast paraffin-inbäddat vävnad var deparaffinized i 20 min i xylen. Vävnaderna var hydrerade vatten genom en gradient av etanol, och antigen retrieval utfördes med hjälp av pH 6 antigen retrieval buffert i en tryckkokare för 15 min. vävnad blockerades med 0,1% BSA och färgas med antimus PDPN och antimus F4/80 för 1 h på rummet temperatur. Anti hamster IgG HRP och anti-kanin IgG HRP användes som sekundära antikroppar. 3, 3'-Diaminobenzidin (DAB) + och Vina grön användes att detektera F4/80 och PDPN, respektive. Vävnaden var counterstained med hematoxylin och avbildas på ett mikroskop. (B) i denna panel visas samma experiment utförs som i panelen en, utom här, PDPN visas i grönt, cytokeratin 7 i rött och 4′, 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) i blått. Skalstapeln = 100 µm. vävnad blockerades med 5% åsna och 5% get serum och färgas med antimus PDPN (8.1.1) 1: 100 och antimus cytokeratin 7 1: 200 för 1 h i rumstemperatur. Anti hamster IgG AF647 och anti-kanin IgG-PE användes som sekundära antikroppar. Vävnaden var counterstained med DAPI och avbildas. Skalstapeln = 100 µm. De lymfatiska kärl (LV), blodkärl (BV) och gallgången (BD) är märkta. (C), denna panel visar en logg-faldig förändring av Vegfr3 och prox-1 uttryck från sorterade lever LECs baserat på färgningen i protokollet (CD45-, CD31 +, CD146lo/negoch PDPN +) jämfört med RAW celler eller primära murina lymfkörtel LECs. Sorterade celler var passerade en biopolymer-fragmentering kolumn, RNA extraherades med en RNA extraktion kit och cDNA gjordes med en omvänd Transkription kit. Avskrift överflöd var normaliserade till städning genen Gapdh, för varje prov. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Totala vikten av LECs i immun homeostas och förordning har nyligen kommit till ljus25. Mycket av den publicerade lymfatiska litteraturen fokuserar på hud och lymfkörtlar; dock lymfkärlen finns i hela kroppen26 och, således, vår förståelse av deras betydelse i olika organ behövs. Här visar vi en metod där LECs i levern kan studeras på en cell för cell grund för att bättre förstå deras samtidiga uttryck för olika yta markörer, cytokiner, chemokiner och intracellulära proteiner som transkriptionsfaktorer. Denna metod kommer att vara användbar för framtida studier att bedöma fenotyp och funktionen av LECs i levern under hälsa och sjukdom.
En av hinder för identifiering av LECs i levern är deras relativt låg frekvens jämfört med andra celltyper. Hepatocyter utgör ca 80% av levern, och ta bort dessa celler med täthetlutning (iodixanol) innan kör levern på en flödescytometer kräver mindre tid och, sålunda, ger bättre lönsamhet. För att särskilja befolkningen av LYVE1 + LECs i levern från LYVE1 + LSECs, använde vi markörer CD16/32 och CD146 finns på LSECs och med låga till inget uttryck av LECs. Detta, i kombination med avsaknad eller låg uttryck för PDPN av alla andra endothelial celler i levern, tillåts validering av flödescytometri att befolkningen vi identifierade var LECs. Faktiskt, nedströms transkriptionell analys bekräftade att denna Usenets strategi producerade LECs (figur 3 c).
Isolering av LECs från lymfkörteln är bäst gjort med kollagenas jag-II-och-dispase; Vi fann dock att, medan denna metod extrakt LECs från levern, en nedsatt matsmältning-protokollet använder kollagenas IV ger en bättre nedströms analys med flödescytometri. Med hjälp av en mekanisk störning av levern kan kollagenas mer yta att bättre interagera med extracellulära matrix-associerade celler, som LECs, och använda klickas EHAA media utan FBS möjliggör nedbrytning av levern uppstå i endast 30 min. Detta minskade tiden underhåller LEC livskraft för nedströms analyser som flödescytometri eller flöde sortering. Vi var faktiskt kunna återställa tillräckligt viabla celler för att visualisera LECs genom flödescytometri och flöde sortering för nedströms transkriptionell analys.
Kombinerat, separation av hepatocyter från de icke-parenkymal cellerna, användning av kollagenas typ IV, och förtydligande och demonstration av markörer som är specifika för LECs i levern och markörer specifika för andra endotelceller populationer, till exempel CD16/32 och CD146, får korrekt identifiering av LECs i levern. Dessa metoder fylla en stor lucka i litteraturen om hur LECs i levern kan identifieras av flödescytometri, särskilt eftersom levern innehåller ett antal andra celler som uttrycker markörer kända för att vara unika för LECs i lymfkörteln (prox1 och vegfr3). Därför, dessa metoder leder till nedströms studier angående LEC leverfunktionen. Denna metod kan dessutom modifieras för andra vävnader för att bättre utvärdera vävnadsspecifika LEC markörer och undergrupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Författarna vill tacka de GI och levern medfödd immun program för monetära stöd för detta projekt. B.A.J.T. finansieras också av R01 AI121209.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Clicks/EHAA media | Irvine Scientific | 9195 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical corporation | LS004188 | |
| DNase I | Worthington Biochemical corporation | LS002145 | Deoxyribonuclease 1 |
| OptiPrep | Sigma Aldrich | D1556 | Density Gradient Medium |
| V450 anti mouse CD146(clone ME-9F1) | BD biosciences | 562232 | |
| FITC anti mouse CD146 (clone ME-9F1) | Biolegend | 134706 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| Pacific Blue anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102422 | |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD31(clone 390) | Biolegend | 102420 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| APC anti mouse PDPN (clone 8.1.1) | Biolegend | 127410 | Allophycocyanin (APC), podoplanin (PDPN) |
| APC/Cy7 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103116 | |
| Brilliant Violet 510 anti mouse CD45 (clone 30-F11) | Biolegend | 103138 | |
| FITC anti mouse CD16/32 (clone 93) | Biolegend | 101306 | Fluorescein isothiocyanate (FITC) |
| PerCp/Cy5.5 anti mouse CD16/32(clone 93) | Biolegend | 101324 | Peridinin-chlorophyll proteins-Cyanine 5.5 (PerCP-Cy5.5) |
| ghost red 780 viability dye | TONBO biosceinces | 3-0865-T100 | |
| APC syrian hamster IgG (clone SHG-1) | Biolegened | 402102 | |
| PerCp/Cy5.5 rat IgG2a (clone RTK2758) | Biolegend | 400531 | |
| FITC rat IgG2 (clone eBR2a) | ebioscience | 1-4321-80 | |
| Anti mouse LYVE1 (clone 223322) | R&D systems | FAB2125A | |
| anti-mouse Cytokeratin(clone EPR17078) | abcam | ab181598 | |
| anti-mouse F4/80 (clone Cl:A3-1) | Bio-rad | MCA497 | |
| BSA (fraction V) | Fischer | BP1600-100 | Bovine Serum Albumin (BSA) |
| Goat serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| Donkey Serum | Jackson Immunoresearch | 017-000-121 | |
| EDTA | VWR | E177 | Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) -for RBC lysis buffer |
| Ammonium Chloride | Fischer | A687-500 | for RBC Lysis buffer |
| Potassium Bicarbonate | Fischer | P184-500 | for RBC Lysis buffer |
| Scalpel | Feather | 2975#21 | |
| 100 μm cell strainer | Fischer | 22363549 | |
| 2.4G2 | in house/ATCC | ATCC HB-197 | FC block to inhibit non-specific binding to Fc gamma + cells -made from hybridoma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CV | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Gibco | 14185-052 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta biologicals | S11550 | |
| 96 well plate | Corning | 3788 | |
| 6 well plate | Corning | 3506 | |
| 50 mL conical | Truline | TR2004 | |
| 15 mL conical | Falcon | 352196 | |
| 1 mL Pipete tip | USA scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL pipete tip | USA scientific | 1110-1700 | |
| 10 µL pipete tip | USA scientific | 1111-3700 | |
| seriological 10 mL pipete | greiner bio-one | 607107 | |
| seriological 5 mL pipete | greiner bio-one | 606107 | |
| Cell incubator | Fischer | Heracell 160i | |
| BD FacsCanto II flow cytometer | BD biosciences | ||
| Clinical Centrifuge | Beckman coulter | model X-14R |
References
- Tanaka, M., Iwakiri, Y.
- Vollmar, B., Wolf, B., Siegmund, S., Katsen, A. D., Menger, M. D. Lymph vessel expansion and function in the development of hepatic fibrosis and cirrhosis. The American Journal of Pathology. 151 (1), 169-175 (1997).
- Podgrabinska, S., et al. Molecular characterization of lymphatic endothelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (25), 16069-16074 (2002).
- Cohen, J. N., et al. Lymph node-resident lymphatic endothelial cells mediate peripheral tolerance via Aire-independent direct antigen presentation. Journal of Experimental Medicine. 207 (4), 681-688 (2010).
- Cohen, J. N., et al. Tolerogenic properties of lymphatic endothelial cells are controlled by the lymph node microenvironment. PLoS One. 9 (2), e87740 (2014).
- Rouhani, S. J., et al. Roles of lymphatic endothelial cells expressing peripheral tissue antigens in CD4 T-cell tolerance induction. Nature Communications. 6, 6771 (2015).
- Tewalt, E. F., et al. Lymphatic endothelial cells induce tolerance via PD-L1 and lack of costimulation leading to high-level PD-1 expression on CD8 T cells. Blood. 120 (24), 4772-4782 (2012).
- Dubrot, J., et al. Lymph node stromal cells acquire peptide-MHCII complexes from dendritic cells and induce antigen-specific CD4(+) T cell tolerance. Journal of Experimental Medicine. 211 (6), 1153-1166 (2014).
- Hirosue, S., et al. Steady-state antigen scavenging, cross-presentation, and CD8+ T cell priming: a new role for lymphatic endothelial cells. Journal of Immunology. 192 (11), 5002-5011 (2014).
- Lund, A. W., et al. VEGF-C promotes immune tolerance in B16 melanomas and cross-presentation of tumor antigen by lymph node lymphatics. Cell Reports. 1 (3), 191-199 (2012).
- Lund, A. W., et al. Lymphatic vessels regulate immune microenvironments in human and murine melanoma. Journal of Clinical Investigation. 126 (9), 3389-3402 (2016).
- Swartz, M. A. Immunomodulatory roles of lymphatic vessels in cancer progression. Cancer Immunology Research. 2 (8), 701-707 (2014).
- Dietrich, T., et al. Cutting edge: lymphatic vessels, not blood vessels, primarily mediate immune rejections after transplantation. Journal of Immunology. 184 (2), 535-539 (2010).
- Kedl, R., et al. Migratory Dendritic Cells acquire archived antigen from Lymphatic Endothelial Cells for antigen presentation during lymph node contraction. Nature Communications. 8, 2034 (2017).
- Kedl, R. M., Tamburini, B. A. Antigen archiving by lymph node stroma: A novel function for the lymphatic endothelium. European Journal of Immunology. 45 (10), 2721-2729 (2015).
- Tamburini, B. A., Burchill, M. A., Kedl, R. M. Antigen capture and archiving by lymphatic endothelial cells following vaccination or viral infection. Nature Communications. 5, 3989 (2014).
- Yokomori, H., et al. Lymphatic marker podoplanin/D2-40 in human advanced cirrhotic liver--re-evaluations of microlymphatic abnormalities. BMC Gastroenterology. 10, 131 (2010).
- Nonaka, H., Tanaka, M., Suzuki, K., Miyajima, A. Development of murine hepatic sinusoidal endothelial cells characterized by the expression of hyaluronan receptors. Developmental Dynamics. 236 (8), 2258-2267 (2007).
- Dudas, J., et al. Prospero-related homeobox 1 (Prox1) is a stable hepatocyte marker during liver development, injury and regeneration, and is absent from "oval cells". Histochemistry and Cell Biology. 126 (5), 549-562 (2006).
- Schrage, A., et al. Murine CD146 is widely expressed on endothelial cells and is recognized by the monoclonal antibody ME-9F1. Histochemistry and Cell Biology. 129 (4), 441-451 (2008).
- Amatschek, S., et al. Blood and lymphatic endothelial cell-specific differentiation programs are stringently controlled by the tissue environment. Blood. 109 (11), 4777-4785 (2007).
- Huang, L., Soldevila, G., Leeker, M., Flavell, R., Crispe, I. N. The liver eliminates T cells undergoing antigen-triggered apoptosis in vivo. Immunity. 1 (9), 741-749 (1994).
- Shay, T., Kang, J. Immunological Genome Project and systems immunology. Trends in Immunology. 34 (12), 602-609 (2013).
- Li, B., et al. Adult Mouse Liver Contains Two Distinct Populations of Cholangiocytes. Stem Cell Reports. 9 (2), 478-489 (2017).
- Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2016).
- Olszewski, W. L. The lymphatic system in body homeostasis: physiological conditions. Lymphatic Research and Biology. 1 (1), discussion 21-14 11-21 (2003).
