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Chemistry

बड़े पैमाने पर शीर्ष नीचे प्रोटियोमिक् केशिका जोन का उपयोग कर ट्रो मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री

Published: October 24, 2018 doi: 10.3791/58644
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 2,3, 1
1Department of Chemistry, Michigan State University, 2Department of BioHealth Informatics, Indiana University-Purdue University Indianapolis, 3Center for Computational Biology and Bioinformatics, Indiana University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

एक विस्तृत प्रोटोकॉल जुदाई, पहचान के लिए वर्णित है, और प्रोटीन के नमूनों में proteoforms के लक्षण वर्णन केशिका क्षेत्र ट्रो-electrospray ionization-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (CZE-ईएसआई-ms/ प्रोटोकॉल सरल प्रोटीन नमूनों में proteoforms के उच्च संकल्प लक्षण वर्णन और जटिल proteome नमूनों में proteoforms की बड़े पैमाने पर पहचान के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Abstract

केशिका जोन ट्रो-electrospray ionization-मिलकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (CZE-ईएसआई-ms/ms) ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में पहचाना गया है जो जटिल proteoforms में proteomes को विशेषता प्रदान करता है । हालांकि, CZE के आवेदन-एमएस/ms के लिए बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् कम नमूना-लोडिंग क्षमता और CZE के संकीर्ण जुदाई खिड़की से बाधित किया गया है । यहां, एक प्रोटोकॉल एक microliter पैमाने पर नमूना-लोड हो रहा है वॉल्यूम और बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए एक ९०-ंयूनतम जुदाई खिड़की के साथ CZE-ms/ms का उपयोग कर वर्णन किया गया है । CZE-ms/ms प्लेटफ़ॉर्म एक रेखीय polyacrylamide (LPA) पर आधारित है-अत्यंत कम electroosmotic प्रवाह के साथ लेपित पृथक्करण केशिका, प्रोटीन स्टैकिंग के लिए एक उच्च दक्षता के साथ एक गतिशील पीएच-जंक्शन आधारित ऑनलाइन नमूना एकाग्रता विधि, एक इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप अत्यंत उच्च संवेदनशीलता के साथ म्यान फ्लो CE-एमएस इंटरफेस, और उच्च जन संकल्प और स्कैन गति के साथ एक आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमीटर. मंच सरल बरकरार प्रोटीन के नमूनों की उच्च संकल्प लक्षण वर्णन और विभिंन जटिल proteomes में proteoforms के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक उदाहरण के रूप में, एक मानक प्रोटीन मिश्रण का एक अत्यधिक कुशल जुदाई और कई मंच का उपयोग अशुद्धियों का एक अति संवेदनशील पता लगाने का प्रदर्शन किया है । एक अंय उदाहरण के रूप में, इस मंच पर ५०० proteoform और १९० प्रोटीन पहचान एक ई कोलाई proteome से एक एकल CZE में उत्पादन कर सकते है एमएस/

Introduction

ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् (तेदेपा) एक proteome के भीतर proteoforms के बड़े पैमाने पर लक्षण वर्णन के लिए करना है । तेदेपा electrospray ionization से पहले बरकरार प्रोटीन के प्रभावी तरल चरण जुदाई पर निर्भर करता है-मिलकर जन स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-ms/ms) उच्च जटिलता और बड़ी एकाग्रता proteome1,2 के गतिशील रेंज के कारण विश्लेषण ,3,4,5. केशिका जोन ट्रो (CZE) अपने आकार के लिए चार्ज अनुपात6के आधार पर अपने अणुओं के विभाजन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है । CZE अपेक्षाकृत सरल है, केवल एक खुले ट्यूबलर से जुड़े सिलिका केशिका, एक पृष्ठभूमि इलेक्ट्रोलाइट (BGE), और एक बिजली की आपूर्ति की आवश्यकता होती है । बरकरार प्रोटीन का एक नमूना केशिका में दबाव या वोल्टेज का उपयोग कर लोड किया जा सकता है, और जुदाई BGE में केशिका के दोनों सिरों को डुबोने और एक उच्च वोल्टेज लागू करने से शुरू की है । CZE अल्ट्रा उच्च जुदाई दक्षता दृष्टिकोण कर सकते है (> १,०००,००० सैद्धांतिक प्लेटें)7अणुओं की जुदाई के लिए । CZE-एमएस एक काफी उच्च संवेदनशीलता है व्यापक रूप से इस्तेमाल किया उलट-चरण तरल क्रोमैटोग्राफी (RPLC)-बरकरार प्रोटीन8के विश्लेषण के लिए एमएस । हालांकि CZE-MS बड़े पैमाने पर ऊपर से नीचे प्रोटियोमिक् के लिए एक महान क्षमता है, प्रोटियोमिक् में अपने विस्तृत आवेदन एक कम नमूना लोड क्षमता और संकीर्ण जुदाई खिड़की सहित कई मुद्दों, द्वारा बाधित किया गया है. CZE में ठेठ नमूना लोड हो रहा है मात्रा के बारे में है 1% कुल केशिका मात्रा, जो आमतौर पर से मेल खाती है से कम करने के लिए १०० nL9,10,11. CZE की जुदाई खिड़की आम तौर पर मजबूत electroosmotic प्रवाह (EOF)9,10के कारण 30 मिनट से भी कम है । इन मुद्दों की सीमा एक जटिल proteome से proteoforms और कम प्रचुर मात्रा में proteoforms की एक बड़ी संख्या की पहचान के लिए CZE-ms/

बहुत प्रयास ऑनलाइन नमूना एकाग्रता तरीकों के माध्यम से CZE की नमूना लोड हो रहा है मात्रा में सुधार करने के लिए किया गया है (जैसे, ठोस चरण microextraction [SPME]12,13, क्षेत्र-बढ़ाया नमूना stacking [FESS]9 , 11 , 14, और गतिशील पीएच जंक्शन15,16,17,18) । FESS और गतिशील पीएच जंक्शन SPME से सरल हैं, केवल नमूना बफर और चालकता और पीएच में BGE के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर की आवश्यकता होती है । FESS BGE की तुलना में बहुत कम चालकता के साथ एक नमूना बफर रोजगार, नमूना क्षेत्र और केशिका में BGE क्षेत्र के बीच सीमा पर analytes के stacking के लिए अग्रणी । गतिशील पीएच जंक्शन नमूना प्लग के दोनों किनारों पर एक बुनियादी नमूना प्लग (उदाहरणके लिए, ५० mM अमोनियम बिकारबोनिट, पीएच 8) और एक अंलीय BGE (जैसे, 5% [v/v] एसिटिक एसिड, पीएच २.४) का इस्तेमाल करता है । एक उच्च सकारात्मक वोल्टेज के आवेदन पर केशिका के इंजेक्शन अंत में, बुनियादी नमूना प्लग के अनुमापन होता है, एक तंग प्लग में एक CZE जुदाई के दौर से गुजर से पहले analytes ध्यान केंद्रित. हाल ही में, सूर्य समूह व्यवस्थित की तुलना में बरकरार प्रोटीन की ऑनलाइन stacking के लिए FESS और गतिशील पीएच जंक्शन, प्रदर्शन है कि गतिशील पीएच जंक्शन बरकरार प्रोटीन की ऑनलाइन एकाग्रता के लिए FESS से ज्यादा बेहतर प्रदर्शन उपज सकता है जब नमूना इंजेक्शन की मात्रा कुल केशिका मात्रा19का 25% थी ।

तटस्थ रूप से लेपित जुदाई केशिकाओं (जैसे, रैखिक polyacrylamide [LPA]) केशिका में EOF को कम करने के लिए नियोजित किया गया है, नीचे CZE जुदाई धीमा और जुदाई खिड़की20,21को चौड़ा । हाल ही में, Dovichi समूह केशिकाओं की भीतरी दीवार पर स्थिर LPA कोटिंग की तैयारी के लिए एक सरल प्रक्रिया विकसित की है, मुक्त कट्टरपंथी उत्पादन और बहुलकीकरण 22 के लिए शुरुआत और तापमान (५० डिग्री सेल्सियस) के रूप में अमोनियम persulfate (एपीएस) का उपयोग . हाल ही में, सूर्य समूह बरकरार प्रोटीन की CZE जुदाई के लिए LPA लेपित जुदाई केशिका और गतिशील पीएच जंक्शन विधि कार्यरत, एक microliter पैमाने पर नमूना लोड हो रहा है वॉल्यूम और एक ९०-ंयूनतम जुदाई विंडो19तक पहुंचने । इस CZE प्रणाली का उपयोग करने के लिए दरवाजे खोलता है CZE-ms/बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए ms.

CZE-ms एमएस के लिए एक बहुत मजबूत और संवेदनशील जोड़ी CZE के लिए इंटरफेस की आवश्यकता है । तीन ce-एमएस इंटरफेस अच्छी तरह से विकसित किया गया है और ce-ms के इतिहास में व्यावसायिकता, और वे सह-अक्षीय म्यान-प्रवाह इंटरफेस23, के रूप में एक छिद्रित टिप का उपयोग कर रहे हैं, तो म्यान इंटरफ़ेस24, और इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफेस25,26। इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान-फ्लो-इंटरफेस-आधारित CZE-ms/ms एक कम zeptomole पेप्टाइड पता लगाने की सीमा तक पहुँच गया है9, पर १०,००० पेप्टाइड पहचान (आईडी) से हेला सेल proteome में एक ही रन14, एक तेजी से लक्षण वर्णन बरकरार प्रोटीन की11, और अत्यधिक स्थिर और reproducible विश्लेषण के अणुओं26। हाल ही में, LPA-लेपित जुदाई केशिका, गतिशील पीएच जंक्शन विधि, और इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफेस बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे एक ई कोलाई के प्रोटियोमिक् के लिए इस्तेमाल किया गया (ई. कोलाई) proteome19 ,27. CZE-ms/ms प्लेटफ़ॉर्म एक एकल रन19 और लगभग ६,००० proteoform ids में ५०० proteoform ids आकार-बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)-RPLC अंश27के साथ युग्मन के माध्यम से संपर्क किया । परिणाम स्पष्ट रूप से बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् के लिए CZE की क्षमता-ms/

साथ ही, बड़े पैमाने पर टॉप-डाउन प्रोटियोमिक् के लिए CZE-ms/ms का उपयोग करने की विस्तृत प्रक्रिया बताई गई है । CZE-ms/ms प्रणाली केशिका में EOF को कम करने के लिए LPA लेपित केशिका कार्यरत है, प्रोटीन की ऑनलाइन एकाग्रता के लिए गतिशील पीएच जंक्शन विधि, इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफ़ेस के लिए युग्मन CZE के लिए एमएस, एक orbitrap मास एमएस और एमएस के संग्रह के लिए स्पेक्ट्रोमीटर/एमएस स्पेक्ट्रा प्रोटीन की, और एक TopPIC (ऊपर-नीचे मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित Proteoform पहचान और लक्षण वर्णन) डेटाबेस खोज के माध्यम से Proteoform आईडी के लिए सॉफ्टवेयर ।

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Protocol

1. जुदाई केशिका की भीतरी दीवार पर LPA कोटिंग की तैयारी

  1. केशिका के उपचार
    1. एक फ्यूजन सिलिका केशिका फ्लश (लंबाई में १२० सेमी, इनर व्यास में ५० µm [आईडी], ३६० बाहरी व्यास में µm [ओडी]) क्रमिक के साथ ५०० µ एल के 1 एम सोडियम हीड्राकसीड, जल, 1 एम हाइड्रोक्लोरिक एसिड, जल, और नियंत्रण रेखा-एमएस ग्रेड मेथनॉल एक सिरिंज पंप का उपयोग कर.
    2. नाइट्रोजन गैस (10 साई, ≥ 12 एच) के साथ केशिका सूखी और ५०% (v/v) 3-(trimethoxysilyl) एक सिरिंज पंप का उपयोग कर मेथनॉल में propyl methacrylate के साथ केशिका भरें । सिलिका रबर के साथ केशिका के दोनों सिरों को सील करें और कम से कम 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर यह मशीन ।
      नोट: इस चरण के दौरान, केशिका की भीतरी दीवार सी के साथ कार्यात्मक है = c. अब एक अधिक पूर्ण प्रतिक्रिया के कारण बेहतर केशिका कोटिंग में गर्मी परिणाम.
    3. एक छोटा सा भाग (~ 5 मिमी) केशिकाओं से एक सट पत्थर के साथ दोनों सिरों से काटें । मेथनॉल (५०० µ एल) के साथ केशिका कुल्ला एक सिरिंज पंप का उपयोग करने के लिए प्रतिक्रिया व्यक्त की सफाई । नाइट्रोजन गैस (10 साई, ≥ 12 एच) के साथ केशिका सूखी ।
  2. LPA कोटिंग की तैयारी
    नोट: यह प्रक्रिया झू एट अल पर आधारित है । 22 मामूली संशोधनों के साथ ।
    1. एक acrylamide समाधान तैयार करें (४० मिलीग्राम acrylamide के 1 मिलीलीटर पानी में) और अमोनियम persulfate (एपीएस) समाधान (5% [w/v] पानी में) ।
    2. इस मिश्रण को acrylamide समाधान के ५०० µ l के लिए अनुप समाधान के 2-3 µ l को जोड़ें, और समाधान में ऑक्सीजन को हटाने के लिए 5 मिनट के लिए नाइट्रोजन गैस के साथ degas ।
    3. एक निर्वात का उपयोग कर इलाज केशिका में मिश्रण लोड, सिलिका रबर के साथ केशिका के दोनों सिरों को सील, और ४० मिनट के लिए ५० डिग्री सेल्सियस पर एक पानी स्नान में यह मशीन ।
    4. एक छोटा सा भाग (~ 5 मिमी) केशिकाओं से एक सट पत्थर के साथ दोनों सिरों से निकालें । पानी के साथ केशिका के बाहर प्रतिक्रिया समाधान पुश (२०० µ एल), सिरिंज पंप का उपयोग कर.
      नोट: सुनिश्चित बहुलक केशिका से बाहर धकेल दिया एक agarose जेल की तरह स्थिरता है । एक लंबी गर्मी कदम (अप करने के लिए ~ ४५-५० मिनट) एक बेहतर केशिका कोटिंग में परिणाम कर सकते हैं । अब प्रतिक्रिया अवधि के साथ, केशिका अवरुद्ध हो सकता है और उच्च दबाव पानी के साथ बाहर बहुलक धक्का करने के लिए आवश्यक है । एक HPLC पंप इस प्रयोजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

2. Hydrofluoric एसिड के साथ केशिका के नक़्क़ाशी

सावधानी: hydrofluoric अम्ल (HF) समाधानों को संभालते समय उचित सुरक्षा प्रक्रियाओं का उपयोग करें. सभी HF से संबंधित कार्यों के लिए एक रासायनिक डाकू में किया जाना चाहिए । किसी भी HF से संबंधित कार्रवाई करने से पहले, सुनिश्चित करें कि २.५% कैल्शियम gluconate जेल एक्सपोजर के मामले में उपयोग के लिए उपलब्ध है । डबल दस्ताने आवश्यक हैं, अंदर एक ठेठ nitrile दस्ताने और बाहर एक भारी neoprene दस्ताने । एक प्रयोगशाला कोट और रासायनिक सुरक्षा चश्मे पहनें । HF आपरेशनों के बाद, तरल और ठोस खतरनाक कचरे को अलग रखें । तरल HF अपशिष्ट अपशिष्ट लेने से पहले अस्थायी भंडारण के लिए एक उच्च एकाग्रता सोडियम हीड्राकसीड समाधान के साथ तुरंत बेअसर होना चाहिए । ठोस HF अपशिष्ट अस्थाई रूप से एक प्लास्टिक कंटेनर कि दो मोटी प्लास्टिक एक गैलन Ziploc बैग और एक ढक्कन के साथ लाइन में संग्रहित किया जा करने की आवश्यकता है । दोनों ठोस और तरल अपशिष्ट ठीक से लेबल किया जाना चाहिए ।

  1. केशिका के एक भाग के चारों ओर 4 सेमी दूर polyimide बाहरी कोटिंग (लंबाई में 1 सेमी) को दूर करने के लिए एक कोमल लौ (जैसे, जेब हल्का) का उपयोग कर एक हिस्से को जला । धीरे polyimide कोटिंग पूरी तरह से हटाने के लिए पोंछते द्वारा केशिका के जला हिस्से को साफ ।
    नोट: सावधानी के साथ आगे बढ़ें, polyimide कोटिंग के बिना केशिका के भाग के रूप में एक छोटे से कमजोर हो जाएगा ।
  2. केशिका बाहरी व्यास के रूप में एक ही आकार के चारों ओर एक २००-µ एल ट्यूब के अंत में एक छोटा सा छेद ड्रिल पर्याप्त जगह में केशिका पकड़ के लिए एक बार यह इस छेद के माध्यम से लड़ी पिरोया है । थ्रेड केशिका के अंत में जला भाग के पास है कि जब तक जला भाग ट्यूब में है छेद के माध्यम से ।
    नोट: यह छिद्र के आकार का परीक्षण करने के लिए की सिफारिश की है केशिका के अंत के साथ जला हिस्से से दूर सही आकार सुनिश्चित करने के लिए, केशिकाओं के जला हिस्से के रूप में नाजुक है ।
  3. जोड़ें ~ १५० HF के µ एल (४८%-५१% पानी में समाधान) के लिए २००-µ एल ट्यूब ताकि HF समाधान के बारे में आधे रास्ते पर जला भाग केशिका है । ९०-१०० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर HF समाधान में केशिका मशीन ।
    नोट: यह सिफारिश की है कि एक और छेद ट्यूब के ढक्कन में बनाया गया है और कुछ छोटी वस्तु (जैसे, एक छोटे से पिपेट टिप) को ट्यूब पकड़ जबकि मशीन जगह ले जा रहा है प्रयोग किया जाता है । पिपेट टिप फोम या कुछ अंय ठोस मंच से जो प्रतिक्रिया कक्ष से लटका कर सकते हैं, एक सुरक्षित वातावरण बनाने पंचर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । HF युक्त ट्यूब के नीचे कागज तौलिए प्लेस और एक फैल के मामले में उचित प्रक्रियाओं का पालन करें ।
  4. ट्यूब से केशिका निकालें और किसी भी अवशिष्ट HF को दूर करने के लिए पानी के साथ बाहरी धोने ।
    नोट: यह सुनिश्चित करें कि जला भाग के संकरे हिस्से पर केशिका के बाहरी व्यास अब १०० µm से छोटा है, के रूप में यह होना चाहिए ।
  5. एक छोर पर ओडी में कम से १०० µm के साथ एक जुदाई केशिका का उत्पादन करने के लिए एक सट स्टोन का उपयोग कर संकीर्ण भाग के बीच में केशिका का धंसा हिस्सा काटें । एक 1-एम जुदाई केशिका पाने के लिए केशिका के गैर धंसा अंत काट ।
    नोट: HF अपशिष्ट के निपटान के अनुसार संस्थागत निर्धारित प्रोटोकॉल ।

3. नमूनों की तैयारी

  1. एक मानक प्रोटीन मिश्रण की तैयारी
    1. cytochrome सी (Cyto सी, 12 केडीए, ०.१ मिलीग्राम/एमएल) युक्त एक मानक प्रोटीन मिश्रण तैयार करें, lysozyme (१४.३ केडीए, ०.१ mg/एमएल), β-कैसिइन (24 केडीए, ०.४ mg/एमएल), मायोग्लोबिन (१६.९ केडीए, ०.१ एमजी/एमएल), कार्बन anhydrase (सीए, 29 केडीए, ०.५ एमजी/एमएल), और गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA, ६६.५ केडीए , १.० मिलीग्राम/एमएल) में नियंत्रण रेखा-एमएस एक शेयर समाधान के रूप में ग्रेड पानी ।
      नोट: स्टॉक समाधान aliquoted और उपयोग के लिए-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
    2. CZE-एमएस विश्लेषण के लिए नियंत्रण रेखा-एमएस ग्रेड पानी में एक ५० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट समाधान (पीएच ८.०) के साथ 10 के एक कारक द्वारा शेयर समाधान पतला ।
      नोट: एक झिल्ली फिल्टर के साथ प्रयोग करने से पहले अमोनियम बिकारबोनिट समाधान फ़िल्टर (जैसे, ०.२ फाइबर नाइट्रेट झिल्ली और ५० मिमी व्यास में) की µm ।
  2. एक ई. कोलाई नमूने की तैयारी
    1. संस्कृति ई. कोलाई (K-12 MG1655) पौंड मध्यम में कोशिकाओं ३७ ° c जबकि २२५ rpm पर मिलाते हुए OD600 मान ०.७ दृष्टिकोण तक । (३,२८३ एक्स जी, 10 मिनट) केंद्रापसारक के माध्यमसे ई. कोलाई कोशिकाओं को इकट्ठा करने और उन्हें मध्यम निकालने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) के साथ कई बार धो ।
    2. lysis बफर में 8 मीटर यूरिया, चिढ़ाने अवरोधकों, और १०० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (पीएच ८.०) और बर्फ पर ultrasonicate 15 मिनट के लिए पूरा सेल lysis के लिए एक कप सींग के साथ एक अल्ट्रासोनिक कोशिका अवरोधक का उपयोग करने के लिए आइस पर शामिल ई. कोलाई कोशिकाओं को निलंबित ।
      1. कर्तव्य चक्र सेट (%) ५० और अल्ट्रासोनिक सेल व्यवधान के लिए 7 के लिए उत्पादन नियंत्रण सेट ।
    3. 10 मिनट के लिए १८,००० x g में lysate केंद्रापसारक. supernatant इकट्ठा और गोली त्यागें । bicinchoninic अम्ल (बीसीए) की परख के साथ प्रोटीन एकाग्रता माप के लिए supernatant के एक छोटे aliquot का प्रयोग करें ।
      ध्यान दें: lysate की जरूरत है तीन के एक कारक से कम से पतला करने के लिए 3 मीटर से कम यूरिया एकाग्रता को कम करने के क्रम में बीसीए परख के साथ संगत हो । बीसीए परख निर्माता की प्रक्रिया के आधार पर किया जाता है ।
    4. मिश्रण 1 1:4 के एक मात्रा अनुपात के साथ ठंडा एसीटोन के साथ ई. कोलाई प्रोटीन की मिलीग्राम और मिश्रण रखने के लिए-20 ° c रातोंरात प्रोटीन हाला ।
      नोट: एक रासायनिक डाकू में एसीटोन का उपयोग कर सभी प्रयोगों प्रदर्शन ।
    5. नीचे spins प्रोटीन (१२,००० x g, 5 मिनट) और supernatant को दूर स्पिन । ठंड एसीटोन के साथ फिर से गोली धो (पहले के रूप में एक ही मात्रा) और फिर नीचे स्पिन ।
    6. supernatant निकालें और गोली के लिए रासायनिक डाकू में मिनट के एक जोड़े के लिए सूखी अनुमति देते हैं ।
      नोट: प्रोटीन गोली overdry नहीं है ।
    7. १०० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (पीएच ८.०) में 8 मीटर यूरिया के २०० µ एल में हाला ई. कोलाई प्रोटीन (1 मिलीग्राम) भंग ।
    8. स्वभाव, कम, और alkylate नमूना ।
      1. प्रोटीन स्वभाव करने के लिए 30 मिनट के लिए ३७ ° c पर नमूना मशीन ।
      2. dithiothreitol (डीटीटी) के साथ कम 1 मीटर डीटीटी समाधान के 2 µ एल जोड़कर (१०० mM अमोनियम बिकारबोनिट में) नमूने में और 30 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर नमूना मशीन ।
      3. Alkylate के साथ प्रोटीन iodoacetamide (आईएए) 1 मीटर आईएए समाधान के 6 µ एल जोड़कर (१०० mM अमोनियम बिकारबोनिट में) नमूना और अंधेरे में कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए नमूना मशीन ।
      4. 1 एम डीटीटी समाधान के 2 µ एल जोड़कर डीटीटी के साथ अतिरिक्त आईएए बुझाने और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन । Acidify फार्म का एसिड (एफए) के साथ नमूना 1% की एक अंतिम एफए एकाग्रता पाने के लिए (v/
        नोट: कमी और alkylation बहाव विखंडन के लिए प्रोटीन का खुलासा सहायता करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं । उन कदमों डाइसल्फ़ाइड बांड की जानकारी खो देंगे । यदि लक्ष्य प्रोटीन पर डाइसल्फ़ाइड बांड का अध्ययन करने के लिए है, उन कदमों से बचें । एक रासायनिक हुड में सभी केंद्रित एसिड समाधान संभाल करने के लिए याद रखें ।
    9. एक HPLC प्रणाली के साथ एक C4 ट्रैप कॉलम (जैसे, आईडी के 4 मिमी, लंबाई में 10 मिमी, 3-µm कणों के साथ पैक का उपयोग करते हुए नमूने नमक ३००-Å pores) । पता लगाने के लिए २५४ एनएम के एक तरंग दैर्ध्य पर एक यूवी डिटेक्टर का प्रयोग करें ।
      1. मोबाइल चरण प्रवाह दर को 1 मिलीलीटर/यह ८०% के साथ निस्तब्धता द्वारा कॉलम सक्रिय (वी/वी) acetonitrile (ACN), 10 मिनट के लिए पानी में ०.१% एफए, और equilibrate के साथ इसे फ्लश द्वारा 2% (v/v) ACN, ०.१% पानी में एफए 10 मिनट के लिए ।
      2. लोड ५००-कॉलम और नमक पर µ जी प्रोटीन 2% के साथ उंहें फ्लश (v/वी) ACN, 10 मिनट के लिए पानी में ०.१% एफए एक 1 मिलीलीटर/
      3. Elute ८०% के साथ प्रोटीन (वी/वी) ACN, ०.१% पानी में एफए के लिए 3 मिनट के लिए एक 1 मिलीलीटर/ eluate ले लीजिए और यह एक वैक्यूम ध्यानी के साथ lyophilize ।
        नोट: C4 ट्रैप कॉलम प्रोटीन की बड़ी मात्रा में नमक संभव नमूना हानि के कारण प्रोटीन की नहीं कम माइक्रोग्राम के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । सीमित प्रोटीन सामग्री के लिए, प्रोटीन लवण के लिए C4 मीडिया के साथ पिपेट सुझावों का उपयोग करने पर विचार करें । प्रोटीन का नमूना lyophilizing करते समय overdry न बरतें ।
    10. प्रोटीन के ५०० µ जी भंग (नमूना तैयारी के दौरान कोई नमूना नुकसान संभालने) ५० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट के २५० µ एल में (पीएच ८.०) CZE-MS प्रयोगों के लिए ।

4. CZE के सेट-एमएस/एमएस सिस्टम और नमूनों का विश्लेषण

  1. CZE प्रणाली के सेट अप
    1. एक BGE 5% या 10% (v/v) एसिटिक एसिड (पीएच ~ २.४ या ~ २.२) नियंत्रण रेखा-MS ग्रेड में पानी युक्त तैयार करें । एक BGE शीशी में BGE के ~ १.५ मिलीलीटर रखो कि CZE नमूना के बफर ट्रे के साथ मेल खाता है ।
      नोट: हर हफ्ते ताजा BGE बनाएं और किसी भी प्रदूषित से बचने के लिए हर दिन शीशी में BGE घोल को बदल दें ।
    2. एक डालें ट्यूब के लिए एक नमूना समाधान (5-200 µ l) जोड़ें और CZE का नमूना ट्रे के साथ एक नमूना शीशी thatmatches में डालने ट्यूब डाल.
    3. नमूना, BGE, और जुदाई केशिका CZE नमूना में लोड करें ।
      नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की गई भाषा सबसे सही रूप से एक विशेष नमूना ( सामग्री की तालिकादेखें) के उपयोग को प्रतिबिंबित करती है, लेकिन सिद्धांतों को अंय नमूना के लिए लागू किया जा सकता है ।
      1. CZE नमूना के मैनुअल नियंत्रण पृष्ठ में नमूना लोड का चयन करें । नमूना के बफर ट्रे में BGE शीशी लोड, बफर ट्रे में अपनी स्थिति टिप्पण । नमूना का नमूना ट्रे में नमूना शीशी लोड नमूना ट्रे में अपनी स्थिति टिप्पण, ।
        नोट: साधन मुख्य साधन पृष्ठ पर डिवाइस की निगरानी के लिए साधन के चित्र पर क्लिक करके और फिर प्रत्यक्ष नियंत्रणके तहत मैनुअल का चयन करके मैनुअल नियंत्रण में संचालित किया जा सकता है.
      2. CZE पारखी में जुदाई केशिका लोड, केशिका के गैर धंसा अंत का उपयोग कर... मैंयुअल नियंत्रण का उपयोग करके संरेखण स्थिति में एक नमूना रखें । यह शारीरिक रूप से आगे पिरोया नहीं जा सकता है जब तक जुदाई केशिका पकड़ करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक छेद में गैर-धंसा हुआ अंत थ्रेड ।
        नोट: इस मामले में, केशिका के अंत इलेक्ट्रोड के अंत के रूप में लगभग एक ही ऊंचाई पर है, और नमूना शीशी में कम से ५० µ एल नमूने के अंत में इंजेक्शन के दौरान नमूना में डूबे है सुनिश्चित करने के लिए नमूना शीशियों में आवश्यक है । नमूना मात्रा कम है (यानी, 5 µ एल), केशिका के इंजेक्शन अंत की ऊंचाई चरण 4.1.3.2.1 में वर्णित के रूप में समायोजित करने की जरूरत है.
        1. नमूना मात्रा से कम है, तो केशिका के इंजेक्शन अंत की ऊंचाई समायोजित करें ५० µ l (अर्थात, 5 µ l). मैंयुअल नियंत्रण का उपयोग कर स्टैंडबाय के लिए एक नमूना स्विच करें । सिस्टम में नमूना स्थिति टाइप करें और केशिका नमूना करने के लिए ले जाएँ । नमूना शीशी के नीचे तक पहुंचने के लिए आगे केशिका के इंजेक्शन अंत पुश ।
          नोट: इस मामले में, नमूना इंजेक्शन शीशी में केवल 5 µ एल के एक नमूने के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ।
      3. मैनुअल नियंत्रण का उपयोग करने के लिए जारी रखने, 20 मिनट के लिए BGE के साथ केशिका फ्लश, 20 साई के एक दबाव का उपयोग कर.
  2. CZE-एमएस इंटरफेस के सेट अप
    1. ओडी में 20-40 µm के एक छिद्र के साथ दो electrospray उत्सर्जन में एक borosilicate ग्लास केशिका (ओडी में 1 मिमी, आईडी में ०.७५ मिमी, 10 सेमी लंबी) खींचो
      नोट: 4-5 सेमी के रूप में electrospray उत्सर्जक की लंबाई रखें और यदि आवश्यक हो तो यह एक सट पत्थर के साथ काट । एक sharps कंटेनर में सभी कांच कचरे के निपटान । 20-to ४०-µm युक्तियों को प्राप्त करने के लिए सेटिंग्स निंनानुसार हैं । ४९८ के लिए गर्मी सेट, 5, वेग करने के लिए खींचो 10, १५० करने के लिए देरी, और २०० के लिए दबाव. उपयोग करने से पहले एक खुर्दबीन के साथ उत्सर्जन के आकार की जांच करें । पैरामीटर थोड़ा यदि आवश्यक समायोजित करें ।
    2. माउंट एक वाणिज्यिक इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफेस ( सामग्री की तालिकादेखें) जन स्पेक्ट्रोमीटर के सामने करने के लिए । एक बफर के साथ म्यान बफर जलाशय भरें 10% (v/v) मेथनॉल और ०.२% (v/v) नियंत्रण रेखा-एमएस ग्रेड पानी में एफए ।
    3. एक सिरिंज के साथ मैन्युअल रूप से दबाव लागू करने के माध्यम से म्यान बफर के साथ इंटरफेस में टी फ्लश. एक आस्तीन टयूबिंग के माध्यम से एक electrospray उत्सर्जक के 1-mm-ओ. डी. अंत धागे और एक फिटिंग केमाध्यम से टीके एक बंदरगाह के साथ उत्सर्जक कनेक्ट । बस टी मैंयुअल रूप से फिर से फ्लश एक सिरिंज के साथ म्यान बफर के साथ भरने के लिए ।
    4. उत्सर्जक के छिद्र और मास स्पेक्ट्रोमीटर के प्रवेश द्वार के बीच की दूरी को समायोजित करने के लिए कैमरा है कि अंतरफलक के साथ आया की मदद से ~ 2 मिमी । एक 2-२.२-केवी वोल्टेज electrospray के लिए म्यान बफर शीशी पर लागू करें । एक स्थिर electrospray तक पहुंचने के लिए स्प्रे वोल्टेज को समायोजित करें ।
      नोट: यदि कोई electrospray या एक अस्थिर electrospray मनाया जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए इंटरफ़ेस की जाँच करें कि वहाँ उत्सर्जक में कोई बड़े बुलबुले, टीमें, और टयूबिंग कि म्यान बफर शीशी और टीकनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया. उत्सर्जक और जन स्पेक्ट्रोमीटर प्रवेश के छिद्र के बीच की दूरी मोटे तौर पर यह उत्सर्जक के 1 मिमी ओडी के साथ तुलना द्वारा अनुमान लगाया जा सकता है । स्प्रे वोल्टेज उत्सर्जक के आकार पर निर्भर करता है । 20 के लिए ४०-µm उत्सर्जक, 2-२.२ केवी काफी अच्छा है । हमेशा सावधान रहना जब उच्च वोल्टेज का उपयोग करने के लिए याद रखें ।
    5. स्प्रे वोल्टेज बंद करें और धीरे से उत्सर्जक में टी के माध्यम से जुदाई केशिका के धंसा अंत धागा जब तक यह आगे नहीं धकेल दिया जा सकता है । इस प्रक्रिया के दौरान केशिकाओं के इंजेक्शन अंत में एक कम दबाव (यानी, 5 साई) लागू करें केशिका में कोई बुलबुले नहीं हैं सुनिश्चित करने के लिए ।
      नोट: केशिका एक आस्तीन टयूबिंग और एक फिटिंग के माध्यम से टी से जुड़ा है । ५०० µm के भीतर करने के लिए कैमरे की मदद से उत्सर्जक में केशिका के धंसा अंत की स्थिति को समायोजित करें । दूरी मोटे तौर पर यह उत्सर्जनकर्ता के 1 मिमी ओडी के साथ तुलना द्वारा अनुमानित किया जा सकता है ।
    6. केशिका के इंजेक्शन अंत में कम दबाव बंद करो । उत्सर्जक एक छोटा सा म्यान बफर के साथ फ्लश । स्प्रे वोल्टेज का परीक्षण करने के लिए 2-२.२ केवी का पुन: लागू करें ।
  3. नमूना इंजेक्शन, जुदाई, केशिका निस्तब्धता, और डेटा अधिग्रहण के लिए जन स्पेक्ट्रोमीटर के ट्रिगर के लिए एक CZE विधि के सेट अप
    1. एक नई विधि शुरू करने के लिए मुख्य साधन स्क्रीन पर फ़ाइल ड्रॉप-डाउन मेनू के तहत नई विधि का चयन करें ।
    2. एसवी के रूप में प्रवेश का चयन करें/EV, नमूना के रूप में 5 साई, केवी के रूप में दबाव 0, और एक नमूना इंजेक्शन के लिए ९५ एस के रूप में अवधि ।
      नोट: नमूना लागू करने के दबाव के माध्यम से केशिका में इंजेक्ट है । नमूना इंजेक्शन की मात्रा Poiseuille के कानून का उपयोग कर दबाव और इंजेक्शन समय के आधार पर गणना की जा सकती है । उदाहरण के लिए, एक ९५-s नमूना इंजेक्शन के लिए 5 psi एक 1-m-लंबी जुदाई केशिका (५०-µm आईडी) के लिए नमूना लोडिंग मात्रा के बारे में ५०० nL से मेल खाती है ।
    3. CZE पृथक्करण के लिए पैरामीटर का चयन करें और डेटा प्राप्ति ट्रिगर करने के लिए पैरामीटर सेट ।
      1. InV के रूप में प्रवेश सेट, बफर के रूप में ट्रे , 0 साई, 30 के रूप में केवी के रूप में दबाव , और अवधि ४,२०० के रूप में मानक प्रोटीन मिश्रण नमूना की जुदाई के लिए एस । InV के रूप में प्रवेश सेट, बफर के रूप में ट्रे , 0 साई, 20 के रूप में केवी के रूप में दबाव , और ६,६०० के रूप में अवधि के रूप में ई. कोलाई proteome नमूना के जुदाई के लिए एस ।
        नोट: वोल्टेज जुदाई के लिए लागू नमूना जटिलता के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । सरल प्रोटीन के नमूनों के लिए, 30 केवी विश्लेषण को गति देने के लिए आवेदन किया जा सकता है । जटिल नमूनों के लिए, 20 केवी अलग नीचे धीमी और proteoform आईडी के लिए और अधिक एमएस/
      2. समय पर ईवेंट्सके अंतर्गत डेटा प्राप्ति ट्रिगर करने के लिए पैरामीटर्स सेट करें. सेट ०.० के रूप में समय (s) और चरण 1 में सक्रिय करने के लिए रिले 1 के रूप में लिखें ; सेट समय (s) १.० के रूप में और चरण 2 में निष्क्रिय के लिए रिले 1 के रूप में लिखें ।
    4. InV के रूप में प्रवेश का चयन करें, बफर के रूप में ट्रे , 10 साई, 30 के रूप में केवी , और केशिका निस्तब्धता के लिए ६०० एस के रूप में अवधि के रूप में दबाव ।
    5. CZE-ms और ms/ms प्रयोगों के लिए विधि फ़ाइलों को सहेजें ।
  4. एमएस और एमएस के सेट अप/
    1. एक quadrupole आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर बरकरार प्रोटीन विश्लेषण के लिए एमएस और एमएस/
      नोट: सकारात्मक आयन मोड और उच्च ऊर्जा collisioner पृथक्करण (HCD) विखंडन के लिए कार्यरत हैं ।
      1. धुन फ़ाइल सेटिंग्स को समायोजित: बरकरार प्रोटीन मोड पर बारी और ०.२ के एक ट्रैपिंग दबाव का उपयोग करें । आयन स्थानांतरण केशिका तापमान ३२० डिग्री सेल्सियस और एस लेंस आरएफ स्तर ५५ करने के लिए सेट करें ।
      2. ms और ms/ms विधि फ़ाइल बनाएं ।
        1. पूर्ण एमएस के लिए, microscans की संख्या सेट करने के लिए 3, संकल्प २४०,००० करने के लिए ( m/z २०० पर), स्वत: प्राप्त नियंत्रण (AGC) लक्ष्य मान 1E6 करने के लिए, अधिकतम इंजेक्शन समय ५० MS करने के लिए, और स्कैन रेंज ६००-२००० m/
      3. एमएस/एमएस के लिए, एक पूर्ण एमएस स्पेक्ट्रम में आठ सबसे तीव्र आयनों के लिए डेटा निर्भर अधिग्रहण (डीडीए) का उपयोग करें । आइसोलेशन विंडो को 4 m/z और सामान्यीकृत collisiond energy (NCE) को 20% पर सेट करें । microscans की संख्या सेट करने के लिए 1, संकल्प १२०,००० करने के लिए ( m/z २०० पर), AGC लक्ष्य मान 1E5 करने के लिए, और अधिकतम इंजेक्शन समय २०० ms.
      4. 1E5 करने के लिए फ़्रेग्मेंटेशन ट्रिगर के लिए तीव्रता थ्रेशोल्ड सेट करें और आयनों एक प्रभारी राज्य के साथ 5 से अधिक विखंडन के लिए अलग करने के लिए सेट करें । छोड़ो आइसोटोप को चालू करें और 30 s करने के लिए डायनेमिक बहिष्करण सेट ।
        नोट: एमएस/ms के लिए microscans की संख्या को बढ़ाकर 3 किया जा सकता है । इस मामले में, एक Top3 डीडीए विधि का उपयोग किया जा सकता है ताकि चक्र समय कम करने के लिए ।
    2. CE नमूना और स्वचालित ट्रिगर के लिए डेटा प्राप्ति के लिए मास-स्पेक्ट्रोमीटर के बीच एक वायर्ड कनेक्शन सेट करें । कनेक्ट करने के लिए एक तार के एक छोर रिले 1 से संपर्क करें एक और रिले 1 से संपर्क करें B CE का नमूना के पीछे. तार के दूसरे छोर से कनेक्ट करें में शुरू करने के लिए और में शुरू + मास स्पेक्ट्रोमीटर के पक्ष पर ।
  5. CZE-ms/एमएस प्रयोग और नमूनों का विश्लेषण
    1. 30 केवी लागू करें नमूना इंजेक्शन अंत पर CE मैनुअल नियंत्रण और 2-२.२ केवी म्यान बफर शीशी में अलग केशिका और electrospray परीक्षण करने के लिए बाहरी बिजली की आपूर्ति का उपयोग कर ।
      नोट: जुदाई वर्तमान, इस मामले में, के आसपास है 8-9 µA यदि 5% (v/v) एसिटिक एसिड BGE के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
    2. एक नया अनुक्रम का चयन करके मास-स्पेक्ट्रोमीटर कंप्यूटर पर एक डेटा प्राप्ति अनुक्रम सेट करें ।
      1. नमूना प्रकार के रूप में अज्ञात का चयन करें और कोई फ़ाइल नाम और पथ निर्दिष्ट करें । साधन विधिके तहत प्रत्येक नमूना चलाने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए एमएस विधि का संकेत.
        नोट: के बाद से वहाँ CE नमूना को नियंत्रित करने के लिए एक अलग कंप्यूटर है, नमूना स्थिति यहाँ निर्दिष्ट करने की आवश्यकता नहीं है.
    3. बफ़र स्थिति, नमूना स्थिति, और CZE विधि इंगित करने के लिए CE कंप्यूटर पर एक CZE पृथक्करण अनुक्रम सेट करें । कोई नया अनुक्रम प्रारंभ करने के लिए, मुख्य इंस्ट्रूमेंट पृष्ठ पर विश्लेषण ड्रॉप-डाउन मेनू के अंतर्गत अनुक्रम का चयन करें ।
    4. चलाएं अनुक्रम का चयन कर पहले मास स्पेक्ट्रोमीटर कंप्यूटर पर डेटा प्राप्ति विधि प्रारंभ करें (या एकल रन के लिए नमूना चलाएं ) । उसके बाद, ce नमूना कंप्यूटर पर ce अनुक्रम प्रारंभ करें ।
      नोट: जब जुदाई वोल्टेज पर है नमूना इंजेक्शन के बाद, एक संकेत डेटा अधिग्रहण ट्रिगर के लिए जन स्पेक्ट्रोमीटर करने के लिए CE के लिए एक नमूना से भेजा जाता है. जुदाई वर्तमान गतिशील पीएच जंक्शन नमूना स्टैकिंग के कारण जुदाई के दौरान शुरुआत में कमी होगी । फिर, वर्तमान ठीक धीरे ।

5. TopPIC सॉफ्टवेयर के साथ एकत्र रॉ फ़ाइलों के डाटाबेस खोज

  1. एक डेटाबेस खोज करने के लिए समर्पित कंप्यूटर के लिए मास स्पेक्ट्रोमीटर कंप्यूटर से एमएस और एमएस/ms डेटा, सहित रॉ फ़ाइलें, स्थानांतरण ।
    नोट: इन. raw फ़ाइलें बड़ी हो सकती है और एक तेज़ डेटाबेस खोज तक पहुंचने के लिए एक शक्तिशाली कंप्यूटर की आवश्यकता है ।
  2. डाउनलोड ProteoWizard और TopPIC सुइट कंप्यूटर खोज डेटाबेस के लिए समर्पित पर ।
    नोट: ProteoWizard और TopPIC सुइट खुले स्रोत सॉफ्टवेयर है और ऑनलाइन पाया जा सकता है (ProteoWizard: http://proteowizard.sourceforge.net; TopPIC सुइट: http://proteomics.informatics.iupui.e., u/software/TopPIC/ डेटाबेस खोजों के लिए UniProt डेटाबेस का उपयोग किया जाता है और UniProt वेबसाइट पर पाया जा सकता है ।
  3. msconvert, ProteoWizard28में एक MS फ़ाइल स्वरूप रूपांतरण उपकरण के साथ. mzML फ़ाइलों के लिए. raw फ़ाइलें कनवर्ट करें । msconvert (MSConvertGUI. exe) के GUI में, बटन ब्राउज़ करेंक्लिक करें, और. raw फ़ाइल कनवर्ट करने के लिए का चयन । आउटपुट स्वरूप के रूप में mzML का चयन करें और सभी अंय विकल्प उनके डिफ़ॉल्ट मानों पर रखें । GUI के नीचे दाईं ओर बटन प्रारंभ पर क्लिक करें.
  4. . mzML फ़ाइलों को. msalign फ़ाइलों में TopPIC suite29में TopFD उपकरण के साथ कनवर्ट करें ।
    1. TopFD (topfd_gui. exe) के GUI में, बटन फ़ाइल क्लिक करें और पिछले चरण में बनाई गई. mzML फ़ाइल का चयन करे । पैरामीटर के डिफ़ॉल्ट मान रखें, और उसके बाद, GUI के नीचे दाईं ओर बटन प्रारंभ करेंक्लिक करें ।
      नोट: TopFD monoisotopic जनता के लिए अग्रदूत और टुकड़ा isotopic समूहों धर्मांतरित और समान MS1 जनता और बंद माइग्रेशन समय के साथ अग्रदूत isotopic समूहों के संयोजन के द्वारा monoisotopic डेटा में संभव proteoform सुविधाओं की पहचान करता है । तीन फ़ाइलें TopFD, एक ms1. msalign फ़ाइल, एक ms2. msalign फ़ाइल और एक. feature फ़ाइल सहित, से जनरेट किया जाएगा । ms1. msalign और ms2. msalign फ़ाइलों में क्रमशः deconvoluted और ms/ms स्पेक्ट्रा के monoisotopic ms1 मास होते हैं । सुविधा फ़ाइल में संभावित proteoform सुविधाएं हैं ।
  5. TopPIC suite30में TopPIC (संस्करण 1.1.3) के साथ एक डेटाबेस खोज करते हैं ।
    1. TopPIC GUI में (toppic_gui. exe), पर क्लिक करें डेटाबेस फ़ाइल और खोज के लिए एक उपयुक्त डेटाबेस का चयन करें ।
    2. स्पेक्ट्रम फ़ाइल पर क्लिक करें और इनपुट के रूप में चरण 5.4.1 में उत्पन्न ms2. msalign फ़ाइल का चयन. MS1 सुविधा फ़ाइल का चयन करें और चरण 5.4.1 में जनरेट किया गया. सुविधा फ़ाइल चुनें ।
    3. आईएए उपचार के कारण एक निश्चित संशोधन के रूप में cysteine carbamidomethylation (C57) सेट करें ।
      नोट: एक पाठ फ़ाइल भी एक पाठ संपादक द्वारा विभिन्न निश्चित संशोधनों के साथ बनाया जा सकता है. उसके बाद, पाठ फ़ाइल TopPIC GUI में निश्चित संशोधनों के आगे फ़ाइल बटन का उपयोग करके चयनित किया जा सकता है ।
    4. डेको डेटाबेस सुविधा का चयन करें और, कटऑफ सेटिंग के तहत, स्पेक्ट्रम स्तरके बगल में ड्रॉप डाउन मेनू में एफडीआर (झूठी डिस्कवरी दर) का चयन करें. एफडीआर को proteoform लेवल पर स्पेक्ट्रम लेवल और ०.०५ पर ०.०१ पर सेट करें ।
      नोट: TopPIC परिणाम फ़िल्टरिंग के लिए एकाधिक विकल्प प्रदान करता है: स्पेक्ट्रम-स्तर एफडीआर, proteoform-स्तर एफडीआर, या दोनों । लक्ष्य-डेकोर दृष्टिकोण31के आधार पर एफडीआर का मूल्यांकन किया जाता है ।
    5. उत्पादन समारोह छोड़ अचयनित और 15 के लिए त्रुटि सहिष्णुता (पीपीएम) सेट ।
    6. उन्नत पैरामीटर्सके अंतर्गत, ड्रॉप-डाउन मेनू में बड़े पैमाने पर शिफ़्ट की अधिकतम संख्या के लिए 2 का चयन करें. ५०० डीए को अज्ञात संशोधनों की अधिकतम मास शिफ्ट (डीए) निर्धारित करें । उनके डिफ़ॉल्ट मूल्यों पर अन्य सभी मापदंडों छोड़ दो और जीयूआई के नीचे सही पर बटन शुरू क्लिक.
      नोट: TopPIC सॉफ़्टवेयर दो परिणामी पाठ फ़ाइलें जनरेट करता है । प्रत्यय के साथ फ़ाइल । OUTPUT_TABLE पहचान proteoform स्पेक्ट्रम मैचों (PrSMs), और एक प्रत्यय के साथ एक की सूची में शामिल है । FORM_OUTPUT_TABLE की पहचान proteoforms की सूची में शामिल है । प्रत्येक PrSM के लिए, सॉफ्टवेयर मैच, मनाया विखंडन पैटर्न पर सामांय जानकारी प्रदान करता है, टुकड़ा आयनों मिलान, और बड़े पैमाने पर बदलाव का पता लगाया ।

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Representative Results

चित्रा 1 प्रयोग में प्रयुक्त डायनेमिक पीएच-जंक्शन आधारित CZE-ईएसआई-MS सिस्टम का एक आरेख दिखाता है । एक बुनियादी बफर में नमूने का एक लंबा प्लग एक अंलीय BGE से भरा एक LPA-लेपित जुदाई केशिका में इंजेक्ट है । उच्च वोल्टेज मैं और द्वितीय लगाने के बाद, नमूना क्षेत्र में analytes गतिशील पीएच जंक्शन विधि के माध्यम से केंद्रित किया जाएगा । CZE-एमएस प्रणाली, एक मानक प्रोटीन मिश्रण (cytochrome सी, lysozyme, β-कैसिइन, मायोग्लोबिन, CA, और BSA) के प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए आम तौर पर विश्लेषण किया जाता है । मानक प्रोटीन मिश्रण के लिए प्रतिनिधि electropherogram चित्रा 2एमें दिखाया गया है । मानक प्रोटीन मिश्रण आम तौर पर भाग लेने की क्षमता और प्रणाली के reproducibility का मूल्यांकन करने के लिए डुप्लिकेट में कम से चला है । जुदाई दक्षता कुछ प्रोटीन की सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है, जैसा कि चित्रा 2बीमें दिखाया गया है । reproducibility प्रोटीन तीव्रता और माइग्रेशन समय के सापेक्ष मानक विचलन द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है । चित्रा 3 एक से पता चलता है एक electropherogram ई. कोलाई प्रोटीन नमूना गतिशील पीएच द्वारा विश्लेषित के एक के दृश्य में-जंक्शन आधारित CZE-ms/ सामान्यीकृत स्तर (NL) प्रोटीन की तीव्रता 108 के पैमाने पर होना चाहिए अगर ई. कोलाई प्रोटीन के 1 µ जी एक quadrupole आयन जाल जन स्पेक्ट्रोमीटर के साथ विश्लेषण के लिए लोड कर रहे हैं । electropherogram का एक ज़ूम-इन दृश्य सिस्टम के पृथक्करण विंडो का आकलन करने के लिए उपयोग किया जा सकता है । इस स्थिति में, जुदाई विंडो है ८०-९० min. figure 3B एक उदाहरण PrSM, सामान्य संगत proteoform जानकारी, प्रोटीन अनुक्रम, स्वीकार्य विखंडन पैटर्न, और संशोधनों सहित दिखाता है । बहुत कम e-मूल्य (2.11 E-४८) और वर्णक्रमीय एफडीआर (0) proteoform आईडी के उच्च विश्वास का सुझाव देते हैं । मिलान टुकड़ा आयनों की उच्च संख्या (६०) आगे आईडी के उच्च विश्वास इंगित करता है । स्वीकार्य विखंडन पैटर्न से पता चलता है कि proteoform के विखंडन टर्मिनी और proteoform के मध्य भाग को कवर अत्यधिक कुशल है । तीन अमीनो एसिड (एमटीएम) के एन टर्मिनल दरार डेटाबेस खोज के माध्यम से निर्धारित किया जाता है ।

Figure 1
चित्रा 1 : आरेख गतिशील पीएच-जंक्शन स्थित CZE-ईएसआई-एमएस सिस्टम । नमूना ५० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट, पीएच 8 में भंग कर रहा है । BGE 5% या 10% (v/v) एसिटिक एसिड, पीएच ~ २.४ या ~ २.२ है । एक 1-m LPA-लेपित केशिका जुदाई के लिए प्रयोग किया जाता है । एक इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान प्रवाह इंटरफेस एमएस के लिए जोड़ा CZE के लिए प्रयोग किया जाता है । एक quadrupole आयन ट्रैप मास स्पेक्ट्रोमीटर का प्रयोग किया जाता है । उच्च वोल्टेज मैं (एचवी मैं) बिजली की आपूर्ति के द्वारा प्रदान की जाती है जुदाई के लिए CE पारखी में एकीकृत. उच्च वोल्टेज द्वितीय (एचवी द्वितीय) electrospray के लिए एक अलग बिजली की आपूर्ति द्वारा प्रदान की जाती है । जन स्पेक्ट्रोमीटर जमीन है । उत्सर्जक और जन स्पेक्ट्रोमीटर के प्रवेश द्वार के छिद्र के बीच की दूरी ~ 2 मिमी है । उत्सर्जक में धंसा केशिका के अंत और उत्सर्जक के छिद्र के बीच की दूरी से कम है ५०० µm. electrospray उत्सर्जक के छिद्र का आकार 20-40 µm है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2 : एक मानक प्रोटीन मिश्रण का डेटा गतिशील पीएच द्वारा विश्लेषण-जंक्शन आधारित CZE-MS । (क) यह पैनल एक बेस पीक electropherogram को दिखाता है । (ख) यह पैनल तीन प्रोटीन की सैद्धांतिक प्लेटों (एन) की संख्या दिखाता है. नमूना इंजेक्शन की मात्रा ५०० nL थी । एचवी मैं जुदाई के लिए 30 केवी था, और एचवी द्वितीय electrospray के लिए २.२ केवी था । BGE 5% (वी/वी) एसिटिक एसिड, पीएच २.४ था । इसका नमूना ५० मिमी अमोनियम बिकारबोनिट (pH 8) में था और इसमें cytochrome c (०.०१ mg/lysozyme (०.०१ मिलीग्राम/एमएल), β-कैसिइन (०.०४ मिलीग्राम/एमएल), मायोग्लोबिन (०.०१ मिलीग्राम/एमएल), कार्बन anhydrase (सीए, ०.०५ मिलीग्राम/एमएल), और गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन (BSA, ०.१ मिलीग्राम/एमएल) । कोई ms/एमएस स्पेक्ट्रा मानक प्रोटीन मिश्रण नमूना के लिए अधिग्रहीत किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : गतिशील पीएच द्वारा ई. कोलाई proteomeanalyzed के डेटा-जंक्शन आधारित CZE-ms/ (क) यह पैनल ई. कोलाई प्रोटीन नमूना के आधार शिखर electropherogram के एक जूम-इन को देखने से पता चलता है । (ख) इस पैनल के एक उदाहरण के TopPIC डेटाबेस खोज के माध्यम से पहचान PrSM एमएस/ सामान्य इसी proteoform जानकारी, प्रोटीन अनुक्रम, स्वीकार्य विखंडन पैटर्न, और संशोधनों प्रस्तुत कर रहे हैं । व्यक्तिगत PrSM से मिलान टुकड़ा आयनों भी देखा जा सकता है अगर जरूरत है । एचवी मैं जुदाई के लिए 20 केवी था, और एचवी द्वितीय electrospray के लिए २.२ केवी था । BGE 10% (वी/वी) एसिटिक एसिड, पीएच ~ २.२ था । इसका नमूना ५० एमएम अमोनियम बिकारबोनिट (पीएच 8) में था और प्रोटीन एकाग्रता 2 मिलीग्राम/एमएल था । नमूना इंजेक्शन की मात्रा ५०० nL थी । डाटा हासिल करने के लिए एक top8 डीडीए पद्धति का इस्तेमाल किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

यहां हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करने के लिए CZE का उपयोग करें-ms/proteoforms के उच्च संकल्प लक्षण वर्णन के लिए सरल प्रोटीन के नमूनों में और जटिल proteome नमूनों में proteoforms की बड़े पैमाने पर पहचान के लिए एमएस । चित्र 1में CZE-ईएसआई-ms/ms सिस्टम का एक आरेख दिखाया गया है । प्रोटोकॉल में चार महत्वपूर्ण चरण हैं । सबसे पहले, जुदाई केशिका की भीतरी दीवार पर उच्च गुणवत्ता LPA कोटिंग की तैयारी अत्यंत महत्वपूर्ण है । एक LPA-लेपित जुदाई केशिका केशिका में EOF को कम कर सकते हैं, CZE की जुदाई खिड़की को चौड़ा, और अपने भीतर की दीवार19पर प्रोटीन सोखना को कम । LPA कोटिंग बनाने के लिए बहुलकीकरण प्रतिक्रिया acrylamide (मोनोमर ) और अमोनियम persulfate (बहुलकीकरण सर्जक) के मिश्रण के साथ केशिका भरने के द्वारा किया जाता है, एक पानी स्नान में केशिका हीटिंग के बाद ट्रिगर करने के लिए प्रतिक्रिया२२. जल स्नान में समय महत्वपूर्ण है । बहुत कम एक प्रतिक्रिया समय एक अपूर्ण प्रतिक्रिया और गरीब कोटिंग करने के लिए नेतृत्व करेंगे । हम आम तौर पर प्रतिक्रिया goup करने के लिए ५० मिनट की अनुमति, एक बेहतर कोटिंग के लिए एक लंबी अवधि के लिए आगे बढ़ने के लिए प्रतिक्रिया की अनुमति । अब प्रतिक्रिया अवधि के साथ, केशिका अवरुद्ध हो सकता है और एक HPLC पंप बाहर पानी के साथ केशिका के अंदर बहुलक धक्का करने के लिए इस्तेमाल किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है । एक LPA-लेपित केशिका लगातार के बारे में एक सप्ताह के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साहित्य डेटा और हमारे22अनुभव के आधार पर ।

दूसरा महत्वपूर्ण कदम है युग्मन CZE के साथ एमएस के लिए इलेक्ट्रो-काइनेटिक पंप म्यान फ्लो CE-एमएस इंटरफेस25,26. ईएसआई उत्सर्जक और उत्सर्जक छिद्र में जुदाई केशिका के अंत के बीच की दूरी CZE की संवेदनशीलता को प्रभावित करता है-एमएस काफी है, और एक छोटी दूरी एक उच्च संवेदनशीलता का उत्पादन25. जुदाई केशिका के अंत HF के साथ खोदना करने के लिए की जरूरत है, ३६० µm से कम १०० µm से अपने बाहरी व्यास को कम करने के लिए, केशिकाओं के अंत में उत्सर्जक छिद्र के करीब धकेल दिया जा करने के लिए अनुमति देता है । उत्सर्जक छिद्र और मास स्पेक्ट्रोमीटर प्रवेश के बीच की दूरी के लिए सबसे अच्छा संवेदनशीलता और अच्छा स्थिरता26तक पहुँचने के लिए अनुकूलित किया गया है । हम आम तौर पर 2 मिमी के आसपास दूरी रखते हैं ।

तीसरा महत्वपूर्ण कदम है CZE-एमएस और एमएस/एमएस विश्लेषण के साथ गतिशील पीएच-जंक्शन-आधारित ऑनलाइन स्टैकिंग नमूना19। नमूना बफर के पीएच और BGE कुशल नमूना स्टैकिंग सुनिश्चित करने के क्रम में काफी अलग होने की जरूरत है. नमूने में प्रोटीन एकाग्रता के लिए उपयुक्त होने की जरूरत है । यदि प्रोटीन एकाग्रता बहुत अधिक है, प्रोटीन नमूना स्टैकिंग के दौरान केशिका में उपजी जा सकता है । आंकड़े 2 और 3 के लिए इस्तेमाल नमूनों की प्रोटीन सांद्रता ठेठ उदाहरण के रूप में माना जा सकता है । proteoform IDs30के लिए TopPIC के साथ डेटाबेस खोज अंतिम महत्वपूर्ण चरण है । TopPIC के साथ डेटाबेस खोज करने से पहले फ़ाइल कनवर्ज़न के लिए एकाधिक चरणों की आवश्यकता है किया जा सकता है । एक उचित एफडीआर फिल्टर की पहचान की proteoforms की गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है । आमतौर पर हम डेटाबेस खोज परिणामों को फ़िल्टर करने के लिए 1% स्पेक्ट्रम-स्तर एफडीआर का उपयोग करते हैं । हम ऊपर से नीचे प्रोटियोमिक् पहल शीर्ष नीचे प्रोटियोमिक् तरीकों और डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर३२,३३के लिए एक बहुत अच्छा संसाधन है कि ध्यान दें ।

हमें ध्यान देना चाहिए कि प्रोटोकॉल के कुछ भागों को थोड़ा संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है और कुछ समस्या निवारण की आवश्यकता हो सकती है । LPA कोटिंग की तैयारी के लिए पानी के स्नान में बहुलकीकरण के समय विभिन्न प्रयोगशालाओं में भिन्न हो सकते हैं. जुदाई केशिका के HF नक़्क़ाशी के लिए समय थोड़ा अलग प्रयोगशालाओं में एक अलग तापमान के कारण संशोधित करने की आवश्यकता हो सकती है । जब CE-एमएस इंटरफेस की स्थापना, सुनिश्चित करें कि electrospray जुदाई केशिका electrospray उत्सर्जक में थ्रेडिंग से पहले स्थिर है । कोई electrospray या एक अस्थिर electrospray मनाया जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए इंटरफ़ेस की जाँच करें कि वहाँ उत्सर्जक में कोई बड़ा बुलबुले हैं, टीमें, या टयूबिंग कि म्यान बफर शीशी और टीकनेक्ट करने के लिए इस्तेमाल किया. इसके अलावा, उत्सर्जक और जन स्पेक्ट्रोमीटर प्रवेश द्वार के छिद्र के बीच की दूरी electrospray स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं और आमतौर पर के बारे में 2 मिमी है । electrospray वोल्टेज भी स्प्रे स्थिरता को प्रभावित कर सकते हैं । 20 के लिए ४०-µm उत्सर्जक, 2-२.२ केवी आमतौर पर काफी अच्छा है । के रूप में पिछले पैराग्राफ में वर्णित है, प्रोटीन के नमूने में एकाग्रता के लिए उपयुक्त होना चाहिए । यदि प्रोटीन एकाग्रता बहुत अधिक है, प्रोटीन नमूना स्टैकिंग के दौरान केशिका में उपजी जा सकता है । CE नमूना कंप्यूटर पर वर्तमान प्रोफ़ाइल पर ध्यान देना । यदि CZE चलाने के बहुत शुरुआत में वर्तमान शूंय है, इसका मतलब है कि हवा का एक प्लग नमूना इंजेक्शन कदम के दौरान केशिका में इंजेक्शन है । सुनिश्चित करें कि शीशी में नमूने की मात्रा काफी बड़ी है । यदि शुरुआत में वर्तमान सामान्य है और रन के दौरान अचानक शून्य हो जाता है, तो आमतौर पर इसका मतलब यह है कि प्रोटीन एकाग्रता बहुत अधिक है ।

CZE-ms/ms इस प्रोटोकॉल पर आधारित सरल प्रोटीन नमूनों की उच्च संकल्प लक्षण वर्णन और जटिल proteomes के बड़े पैमाने पर ऊपर-नीचे प्रोटियोमिक् सक्षम बनाता है । एक उदाहरण के रूप में, CZE-MS छह प्रोटीन19युक्त एक मानक प्रोटीन मिश्रण के उच्च संकल्प लक्षण वर्णन किया गया । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, CZE-एमएस स्पष्ट रूप से एक उच्च जुदाई दक्षता के साथ छह प्रोटीन अलग, β-कैसिइन के तीन रूपों से पता चला, और कई अशुद्धियों का पता लगाया. एक अंय उदाहरण के रूप में, एकल शॉट CZE-ms/ms reproducibly ५०० proteoform ids और ई. कोलाई proteome से १९० प्रोटीन आईडी पर झुकेंगे, एक 1% स्पेक्ट्रम स्तर µ19के साथ ई. कोलाई प्रोटीन का केवल 1 एफडीआर जी का उपयोग कर । CZE-ms/ms एक जटिल proteome से proteoform IDs की संख्या में सुधार कम से तीन बार, पिछले एकल शॉट CZE-ms/ms अध्ययन के साथ तुलना में । के रूप में चित्रा 3एमें दिखाया गया है, CZE-ms/ms एक साथ एक ५००-nL नमूना-लोड हो रहा है वॉल्यूम और ई. कोलाई proteome19के विश्लेषण के लिए एक ९०-ंयूनतम जुदाई खिड़की तक पहुंच गया । TopPIC सॉफ्टवेयर की पहचान proteoforms (चित्रा 3बी) के बारे में व्यापक जानकारी प्रदान कर सकते हैं । CZE-ms/ms प्रणाली बड़े पैमाने पर और उच्च संकल्प टॉप-डाउन प्रोटियोमिक् के लिए एक उपयोगी उपकरण के साथ प्रोटियोमिक् समुदाय प्रदान करता है ।

CZE-ms/ms अभी भी डीप टॉप-डाउन प्रोटियोमिक् के लिए कुछ सीमाएं हैं । यद्यपि हमने यह दर्शाया है कि CZE-ms/ms ई से 500proteoform आईडी पर पहुंच सकता है । एक ही भाग में कोलाई proteome, एकल शॉट CZE-ms/ms से proteoform IDs की संख्या केवल लगभग ५०% से है कि राज्य के अत्याधुनिक RPLC-ms/ms३४, ३५. इस प्रोटोकॉल में, केवल HCD प्रोटीन विखंडन के लिए प्रयोग किया जाता है, की पहचान की proteoforms सीमित विखंडन कवरेज के लिए अग्रणी । कई सुधार CZE एमएस/एमएस प्रोटोकॉल के लिए किया जा सकता है दोनों संख्या और एकल शॉट CZE से proteoform आईडी की गुणवत्ता में सुधार-ms/ सबसे पहले, जुदाई केशिका की लंबाई बढ़ाने एक व्यापक जुदाई खिड़की, अधिक proteoform आईडी के लिए अग्रणी प्रदान करना चाहिए । दूसरा, एक बहुत अधिक संपति शक्ति के साथ एक सामूहिक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग, तेजी से स्कैन दर, और कई विखंडन विधियों (जैसे, HCD,३६ इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण पृथक्करण [ETD],३७ और पराबैंगनी photodissociation [UVPD]३८ ) निश्चित रूप से proteoform आईडी और पहचान proteoforms के विखंडन कवरेज दोनों की संख्या में सुधार होगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक रसायन विज्ञान विभाग में Heedeok है हांगकांग समूह धंयवाद, मिशिगन राज्य विश्वविद्यालय, के लिए कृपया प्रयोगों के लिए ई कोलाई कोशिकाओं प्रदान करते हैं । लेखक राष्ट्रीय जनरल चिकित्सा विज्ञान संस्थान, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थानों (NIH) के माध्यम से अनुदान R01GM118470 (एक्स. लियू के लिए) और अनुदान R01GM125991 (एल सूरज और एक्स. लियू के लिए) से समर्थन का धंयवाद ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fused silica capillary Polymicro Technologies 1068150017 50 µm i.d. 360 µm o.d.
Sodium hydroxide pellets Macron Fine Chemicals 7708-10 Corrosive
LC-MS grade water Fisher Scientific W6-1
Hydrochloric acid Fisher Scientific SA48-1 Corrosive
Methanol Fisher Scientific A456-4 Toxic, Health Hazard
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate Sigma-Aldrich M6514 Moisture and heat sensitive
Hydrofluoric acid Acros Organics 423805000 Highy toxic
Acrylamide Acros Organics 164855000 Toxic, health hazard
Ammonium persulfate Sigma-Aldrich A3678 Health hazard, Oxidizer
lysozyme Sigma-Aldrich L6876
Cytochrome C Sigma-Aldrich C7752
Myoglobin Sigma-Aldrich M1882
ß-casein Sgma-Aldrich C6905
Carbonic anhydrase Sigma-Aldrich C3934
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A2153
Urea Alfa Aesar 36428-36
DL-Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632 Health Hazard
Iodoacetamide Fisher Scientific AC122270250 Health Hazard
Formic Acid Fisher Scientific A117-50 Corrosive, Health Hazard
C4 trap column Sepax Technologies 110043-4001C 3 µm particles, 300 Å pores, 4.0 mm i.d. 10 mm long
Acetonitrile Fisher Scientific A998SK-4 Toxic, Oxidizer
Ammonium bicarbonate Sigma-Aldrich 1066-33-7
Nalgene rapid-flow filters Thermo Scientific 126-0020 0.2 µm CN membrane, and 50 mm diameter
E. coli cells K-12 MG1655
Dulbecco's phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich D8537
BCA assay Thermo Scientific 23250
Acetone Fisher Scientific A11-1
HPLC system for protein desalting Agilient 1260 Infinity II
Acetic Acid Fisher Scientific A38-212
CE autosampler CMP Scientific ECE-001
Electro-kinetically pumped sheath flow interface CMP Scientific
Q Exactive HF Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer Thermo Fisher Scientific
Sutter flaming/brown micropipette puller Sutter Instruments P-1000
Ultrasonic cell disruptor for cell lysis Branson 101063196 Model S-250A
Vaccum concentrator Thermo Fisher Scientific SPD131DDA-115

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References

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McCool, E. N., Lubeckyj, R., Shen, X., Kou, Q., Liu, X., Sun, L. Large-scale Top-down Proteomics Using Capillary Zone Electrophoresis Tandem Mass Spectrometry. J. Vis. Exp. (140), e58644, doi:10.3791/58644 (2018).

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