Summary
Este é um protocolo para isolar vesículas extracelulares do tecido (EVs) do fígado. O protocolo descreve um processo da dois-etapa que envolve a perfusão do colagenase seguida pelo ultracentlee diferencial para isolar EVS do tecido do fígado.
Abstract
Vesículas extracelulares (EVs) podem ser liberados de muitos tipos de células diferentes e detectados na maioria, se não todos, fluidos corporais. Os EVs podem participar na comunicação célula a célula, transportando moléculas bioativas como RNA ou proteínas de uma célula para outra. A maioria dos estudos de EVs tem sido realizada em modelos de cultura celular ou em EVs isolados de fluidos corporais. Há interesse emergente no isolamento de EVs dos tecidos para estudar sua contribuição para os processos fisiológicos e como eles são alterados na doença. O isolamento de EVs com rendimento suficiente dos tecidos é tecnicamente desafiador por causa da necessidade de dissociação tecidual sem danos celulares. Este método descreve um procedimento para o isolamento de EVs do tecido do fígado do rato. O método envolve um processo de duas etapas começando com a digestão in situ do colagenase seguida pela ultra-centrifugação diferencial. A perfusão tecidual com colagenase proporciona uma vantagem sobre o corte mecânico ou homogeneização do tecido hepático devido ao seu aumento da produtividade de EVs obtidos. O uso deste processo de duas etapas para isolar EVs do fígado será útil para o estudo de EVs de tecido.
Introduction
Vesículas extracelulares (EVs) são vesículas ligadas à membrana que são liberadas de muitos tipos diferentes de células no corpo. Os EVs contêm uma carga de moléculas que incluem RNA, DNA e proteínas. A transferência desta carga por EVs de uma pilha a outra é postulada como um mecanismo por que as pilhas dentro dos tecidos se comunicam uns com os outros1. A maioria das informações sobre a carga ou papéis de EVs em saúde e doenças normais tem sido derivada de estudos sobre EVs obtidos a partir de células em cultura ou coletadas a partir da circulação ou outros fluidos corporais2. Para entender seus papéis fisiológicos in vivo, um método robusto é necessário para o isolamento de EVS teciduais que capta todas as populações de EVS e evita danos celulares ou contaminação3. O objetivo geral do método descrito neste documento é isolar EVs de tecido de fígados de mouse.
A maioria de tipos da pilha no fígado foram mostrados para produzir EVs, e o estudo da sinalização EV-baseada está avançando o conhecimento básico e a compreensão de doenças hepatic. Entretanto, o impacto combinado de EVs dos tipos diferentes da pilha dentro dos tecidos é compreendido somente parcialmente. A isolação de EVs dos tecidos do fígado é necessária a fim compreender as contribuições in situ dos EVS dentro do Milieu do tecido. A abordagem descrita neste documento é baseada em uma perfusão em duas etapas para melhorar a dissociação tecidual e minimizar os danos celulares. Subseqüentemente, os EVs são isolados do tecido de fígado dissociado. Abordagens utilizando perfusão em duas etapas para isolamento de hepatócitos têm sido utilizadas desde o início da década de 19504. Esses métodos de isolamento de hepatócitos foram modificados e continuamente melhorados e agora são abordagens padrão para o isolamento de hepatócitos em culturas, em suspensões celulares e de tecidos5,6,7. Na primeira etapa, o fígado é submetido a uma perfusão não recirculando com tampão cálcio-livre, solução de sal equilibrada de Hank (HBSS). Na segunda etapa, o fígado é perfundidos com o colagenase para dissolver a matriz extracelular para uma separação mais adicional de junções desmosomal da pilha-à-pilha. Um tempo de tratamento ideal para a dissolução da colagenase é de 7 a 10 minutos. Uma duração mais curta do tratamento causará a dissolução incompleta e manterá contatos da pilha no fígado, visto que uma duração mais longa pode causar dano de fígado ou rompimento da veia portal. Os EVs são então isolados usando a centrifugação diferencial para remover pilhas e restos celulares. Isto conduz à coleção do EV nos rendimentos elevados que podem ser usados para umas análises ou uns estudos mais adicionais a jusante.
Protocol
Todos os estudos envolvendo animais foram realizados de acordo com um protocolo que foi aprovado pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais da clínica Mayo.
1. preparação do banco
- Prepare um banho de água e ajuste-o a 37 ° c. Os outros equipamentos e set-up necessários são mostrados na Figura 1.
- Medir 100 mg de colagenase tipo IV e adicioná-lo a um balão de 125 mL contendo 100 mL de HBSS num banho de água (40 ° c). Certifique-se de que a colagenase foi dissolvida rodando o líquido no balão, e também certifique-se de que o balão está completamente submerso no banho de água. Para uma maior eficiência, permita que a colagenase se dissolva por pelo menos 30 min, embora possa parecer dissolver-se instantaneamente.
- Submergir um balão de 125 mL contendo 50 mL de HBSS num banho de água a 40 ° c. Isto será usado para o nivelamento inicial.
- Pulverize para baixo a superfície de todos os instrumentos tais como a tesoura e o fórceps com etanol 70%. Prepare alguns cotonetes limpos do algodão.
- Enxague o tubo da bomba executando 70% de etanol através da bomba e remova qualquer etanol residual enxaguando-o duas vezes com água corrente.
- Coloque uma almofada de bancada absorvente no banco do laboratório e coloque um recipiente de caixa rígido na parte superior. Isto será necessário para conter qualquer excesso de líquidos durante a perfusão do rato. Enrole uma almofada de espuma de poliestireno com folha de alumínio e colocá-lo dentro do recipiente.
- Coloque um prato de cultura estéril de 10 cm perto do banco. Isto será usado para prender o fígado digerido depois que a perfusão é terminada.
- Despeje 10 mL de meio de colagenase (passo 1,2) em um prato de cultura estéril com antecedência.
- Usando um conjunto de coleta de sangue alado, conecte o calibre 23 à extremidade livre da tubulação da bomba (cortar as asas fora da cânula de borboleta pode levar a um melhor manuseio). Passe até que a ponta da cânula da coleta de sangue seja preenchida.
2. preparação animal
- Antes de iniciar a anestesia usando isoflurano, certifique-se de que uma quantidade adequada de gás de abastecimento está disponível para a duração do procedimento. Ligue o fornecimento de oxigénio (O2) à câmara de indução a 1-2 L e, em seguida, ligue o isoflurano entre 2-4% utilizando um medidor de vazão.
- Coloque o mouse na câmara de indução e feche a porta superior. Monitore o mouse até que seja reclinada.
Nota: os gases da câmara mantêm os ratinhos anestesiados durante vários minutos. - Coloque o mouse em uma almofada de espuma de poliestireno envolvida com folha de alumínio. Mude o fluxo da câmara de indução para uma nosecona. Assegure-se de que a anestesia seja adequada. Se o mouse tiver começado a responder, contenha-o suavemente em um cone de nariz até que ele seja totalmente anestesiado.
- Assegure a anestesia monitorando a respiração e a resposta à estimulação durante o procedimento. Ajuste o fluxômetro da taxa como necessário para assegurar a anestesia adequada. As patas devem ser não responsivas ao teste de pinça anestesia. Detalhes adicionais podem ser obtidos a partir do guia de laboratório para o cuidado de animais.
- Tape ou pino para baixo todos os quatro membros do mouse.
- Limpe a pele sobre o abdômen pulverizando com o etanol 70% e limpando-a fora com gaze e uma almofada do álcool. Este passo é crítico para evitar a contaminação da pele do rato.
- Faça um corte largo-aberto através da pele do anterior ao osso da pelve usando um jogo de tesouras estéreis. Tenha cuidado para não cortar nenhum órgão interno. Deslocar os intestinos para o lado esquerdo do animal usando um aplicador com ponta de algodão para expor suavemente a veia porta (PV) e a veia cava inferior (IVC).
3. canulação e perfusão (0,5 h)
- Usando o fórceps curvado, coloc uma linha abaixo da veia portal e amarre um nó frouxamente para preparar o cinching firmemente após o cannulation.
- Insira a cânula (23G do conjunto de coleta de sangue) na veia porta 5-10 mm abaixo da ligadura. Não insira a cânula após a primeira ramificação do portal, caso contrário, o lobo anterior direito pode ser inadequadamente perfused. A cânula pode ser fixado ou fixado com rosca usando um nó de rolha.
- Inicie a bomba para Inutilizar no HBSS a um caudal baixo (1-2 mL/min). Uma vez que o canulação é confirmado para ser bem sucedido, o fígado começará a Blanch.
- Corte o IVC para aliviar a pressão e permitir que o fluido excessivo dentro do fígado para drenar. Isto é executado melhor usando os operadores a outra mão assim que a cânula não é movida.
- Aumente lentamente a taxa de fluxo a 8 mL/min e termine a perfusão usando o volume inteiro de 50 mL de HBSS através do fígado, sobre os 5 minutos seguintes.
- Mude a colagenase que contem o meio (etapa 1,2) no béquer apenas antes que o HBSS esteja começando a funcionar para fora. Certifique-se de que as bolhas de ar não estão presentes e não fluem para o fígado ao mudar o meio.
- Aplique a pressão transiente ao IVC em intervalos de 5 s apertando com fórceps. Isso fará com que o fígado inchar e ajudar com a digestão do tecido e dissociação (7-8 min). Como a digestão progride, o fígado vai inchar e tornar-se branco. O fígado pode inchar uniformemente a aproximadamente duas vezes o seu tamanho original.
- Desligue a bomba e retire a cânula quando a digestão estiver concluída. A conclusão da digestão do fígado dependerá do tamanho do rato e da condição do fígado. Um dente no fígado pode ser observado se um aplicador com ponta de algodão é usado para sondar suavemente o fígado.
- Retire a vesícula biliar do fígado, tendo cuidado para não rasgá-lo. Usando um par lavado de tesouras e fórceps, extraia o fígado do rato em um prato estéril da cultura de 10 cm que contem o Saline fosfato-tamponado (PBS) para a lavagem de superfície. Transfira o fígado cuidadosamente para o prato de cultura estéril de 10 cm contendo meio de colagenase (a partir do passo 1,8). Este é um passo crítico para evitar a contaminação do sangue do rato e bile.
- Agarre e rasgue o fígado com dois fórceps limpo ao agitar delicadamente as pilhas do fígado. Como isso acontece, o meio vai ficar nublado. Todos os hepatócitos podem ser abalados, deixando para trás o tecido conjuntivo e o tecido vascular.
- Triturar a solução celular muitas vezes usando uma seringa de 3 mL até que as partes não digeridas do fígado são sacudidas. Despeje-o em um tubo cônico de 50 mL com filtros de célula de nylon de 70 μm para filtrar qualquer tecido conjuntivo não digerido. Lave o prato com HBSS para recolher as células restantes e encher o tubo cônico 50 mL.
- Centrifugue suavemente o tubo cônico de 50 mL num rotor de balde oscilante a 50 x g durante 10 min a 4 ° c.
- Transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mL.
4. isolamento de EVs (5 h)
- Centrifugue o sobrenadante a 300 x g durante 10 min a 4 ° c. Transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico de 50 mL.
- Centrifugue o sobrenadante a 2000 x g durante 20 min a 4 ° c para remover detritos e agregados celulares.
- Transfira o sobrenadante para um tubo de fundo redondo e Centrifugue o sobrenadante a 10.000 x g por 70 min a 4 ° c.
- Colete o sobrenadante e coloque em um tubo de policarbonato ultracentlee e centrifugue a 100.000 x g por 70 min a 4 ° c.
- Colete o pellet em um tubo ultracentlee que é então lavado por re-suspendendo em PBS. Centrifugue o sobrenadante mais a 100.000 x g por 70 min a 4 ° c.
- A pelota final que compreende de nanovesicles celulares pode diretamente ser usada para experiências ou re-SUSPENDED com 1000 μL de PBS e armazenado em-80 ° c.
5. avaliação da qualidade e rendimento das isolações
- Avalie a distribuição e a concentração de tamanho usando a análise de rastreamento de nanopartículas ou a detecção de pulsos resistivos sintonáveis seguindo os protocolos do fabricante do instrumento.
- Realize mais isolamento e purificação de populações específicas de vesículas por várias abordagens, como a adição de um gradiente de sacarose ou almofada, técnicas de imunoafinidade ou cromatografia de exclusão de tamanho, com base em necessidades experimentais específicas.
Representative Results
O aparelho necessário para Estas isolações compreende equipamento de laboratório padrão, tornando-se uma abordagem relativamente simples e rentável. Foram realizadas isolações de camundongos Balb/c ou FVB, de doze a trinta semanas de idade, machos e fêmeas. A bandeja que prende o rato é alinhada com a folha de alumínio dentro de um recipiente duro-murado que colete líquidos excedentes durante a perfusão. Os frascos contendo HBSS ou meio contendo colagenase estão submersos em um banho de água (40 ° c) pronto para ser usado. São utilizados dois pratos de cultura estéreis de 10 cm. Um é necessário para a lavagem de superfície com PBS, e o outro para a separação de hepatócitos dos componentes do tecido conjuntivo.
Neste método, o fígado é perfundidos em uma maneira não-contínua através da veia portal na preferência ao canulação da veia inferior oca. Uma abordagem de perfusão alternativa e comumente utilizada é a realização de perfusão retrógrada por canulação da veia cava inferior e corte da veia porta para drenagem. No entanto, a canulação da veia porta é fácil de acessar e envolve uma curta distância do fígado, pois a veia porta se alimenta diretamente no fígado8. A seleção de um ponto de inserção para a canulação é crucial para o sucesso ideal (Figura 2). A cânula é colocada após os ramos do estômago e veias pancreáticas, mas não além do primeiro ramo do portal (veias portais hepáticas direita e esquerda). Uma vez que o local de inserção ideal na veia porta é identificado, fórceps curvo são usados para colocar uma rosca embaixo da veia portal e amarrar um nó solto. A agulha da cânula é fixada com rosca usando um nó de rolha para impedir que a agulha caia.
A Figura 3 esboça o esquema de processamento total para a centrifugação diferencial para o isolamento dos EVS do tecido do fígado. Ultracentlee remove células, detritos e outras impurezas. As primeiras quatro etapas da centrifugação (50 x g, 300 x g, 2.000 x g, 10.000 x g) são projetadas remover os hepatocytes, as outras pilhas intactas, as pilhas inoperantes, ou os restos da pilha respectivamente. (Figuras 4a e 4B). Após essas etapas, a ultracentlee é novamente realizada em 100.000 x g para coletar o pellet (Figura 4C). O pellet é lavado por re-suspendendo em PBS e submetido a uma ultracentlee final em 100.000 x g. O pellet após ultracentlee é absolutamente visível e viscid neste procedimento comparado a EVs de meios de cultura condicionados. Pipetagem muitas vezes é necessária até que quaisquer agregados marrons estão fora da vista e completamente dissolvido. O pellet final é re-suspenso com 1000 μL de PBS (Figura 4D). Ultracentlee remove impurezas e outros contaminantes solúveis do plasma, que podem afetar os resultados experimentais funcionais. A centrifugação é efectuada a 4 ° c.
A partir do fígado do camundongo, este método produz uma concentração de EV tecidual que varia de 1,74 a 4, 0 x 1012 com uma média de 3,46 x 1012 partículas por ml, conforme determinado pela análise de rastreamento de nanopartículas (NTA) (Figura 5). O tamanho médio dos EVs isolados do tecido do fígado era 157,7 nanômetro, com um tamanho da modalidade de 144,5 nanômetro e de tamanhos do EV que variam de 100-600 nanômetro por NTA. O rendimento de EV dependerá de fatores como o peso do fígado e as perdas dentro das etapas de perfusato ou ultracentogação.
Figura 1 : Preparação do banco. Os materiais e seus locais são: (A) bomba, (B) aquecido 125 mL frasco contendo HBSS e porta de sucção de água, (C) cone de nariz conectado a um vaporizador isoflurano, (D) porta de exaustão de água da bomba de conexão com agulha, (E) bandeja revestida com folha de alumínio dentro de um recipiente murado duro, e (F) o prato da cultura de 10 cm em que o meio do colagenase é derramado adiantado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Local do cannulation. A anatomia do abdômen do rato é mostrada. Usando fórceps curvo, uma rosca é colocada embaixo da veia porta (PV) e um nó solto é amarrado. O local de inserção está próximo ao fígado, 5-10 mm abaixo da ligadura, mas não além do primeiro ramo Portal (veias portais hepáticas esquerda e direita). A cânula é fixada ou presa usando rosca com um nó de rolha. Este nó serve como um marcador da posição do picovolt se a cânula é desalojada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3 : Esquema de etapas de centrifugação. O objetivo é remover células indesejadas e outros componentes e isolar EVs. As primeiras quatro etapas da centrifugação são projetadas remover os hepatócitos e as outras pilhas, pilhas inoperantes, ou restos da pilha usando a centrifugação diferencial. Após essas etapas, a ultracentetgação é realizada em 100.000 x g para coletar o pellet de EVs. O pellet é lavado por re-suspendendo em PBS e submetido a uma ultracentlee final em 100.000 x g. Todas as etapas de centrifugação são realizadas a 4 ° c. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Centrifugação diferencial. (A) após a centrifugação em 50 x g por 10 min, observa-se um pellet contendo hepatócitos. (B) um tubo redondo-inferior é usado para a centrifugação em 10.000 x g para 70 minutos para remover restos da pilha. (C) um tubo do ultracentlee do policarbonato é usado para A centrifugação em 100.000 x g para 70 minutos. O pellet é coletado em um tubo e lavado por re-suspendendo com PBS. (D) o pellet final é re-suspenso em 1000 μL de PBS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 : Resultado representativo. O tamanho e a concentração de EVs do tecido do fígado podem ser determinados pela análise de seguimento da nanopartícula (NTA). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Este protocolo descreve um método óptimo e reprodutível para o isolamento do tecido hepático EV usando um processo de perfusão em duas etapas através da veia porta seguida por ultracentlee diferencial. As etapas importantes do procedimento incluem a colocação da cânula, a concentração do colagenase e o tempo da digestão, velocidade do fluxo do meio, manipulação do tecido após a digestão, e ultracentlee diferencial clássico.
A separação da pilha é conseguida pela separação dos componentes do tecido conexivo após a digestão usando o tipo IV do colagenase. A concentração de colagenase utilizada para perfusão pode variar de 0,1 a 5 mg/mL. Pode haver uma variação considerável do lote-à-lote na eficácia do colagenase para a digestão do tecido. As concentrações de colagenase de 0,5 a 5 mg/mL foram testadas, mas a concentração utilizada não teve um grande impacto na produtividade dos EVs obtidos. Usando uma maior concentração de colagenase resultará em um inchaço mais rápido e clareamento do fígado. O objetivo é obter uma dissociação celular satisfatória sem contaminação ou dano excessivo. Uma concentração óptima de colagenase usada nestas isolações é 1-2 mg/ml perfundidos para 7-8 minutos em uma taxa de fluxo de 8 ml/min. Um procedimento de perfusão que é muito longo aumentará o risco de destruir o tecido conjuntivo fino dentro do fígado, bem como aumentar os riscos técnicos, como a desmontagem da agulha da veia porta ou aprisionamento de ar com a veia.
O aspecto mais desafiador deste protocolo é a canulação da veia porta. Isso pode ser desafiador para executar, especialmente em camundongos na faixa de tamanho de 18 a 25 g. As técnicas de perfusão de colagenases foram originalmente desenvolvidas para uso em ratos e subsequentemente adotadas para uso em camundongos após inúmeras modificações e ajustes. Canulação usando um conjunto de coleta de sangue 23G é mais fácil do que a colocação de um cateter em vasos sanguíneos de pequeno diâmetro luminal. A fixação da cânula usando rosca com um nó de rolha é recomendada para evitar o dislodgement e o nó também serve como um marcador de localização da veia porta no caso de a cânula sair da embarcação.
Para a análise a jusante, é extremamente importante ter a contaminação mínima das pilhas. Há diversas considerações importantes na manipulação do tecido após a digestão. Primeiro, o fórceps e as tesouras são alterados quando o fígado é extraído para evitar a contaminação do sangue. Em segundo, é crítico que a vesícula biliar seja removida com cuidado do fígado para evitar rasgar e a contaminação indesejada da bilis. Em terceiro lugar, uma vez que o fígado foi removido do rato, o fígado é lavado muito suavemente usando PBS para remover qualquer sangue. A minimização da contaminação com as células deve ser dada uma prioridade mais alta do que a redução no rendimento dos EVs obtidos.
A ultracentilugação é o método mais comumente utilizado para o isolamento e purificação de EVS8,9,10,11. Essa abordagem removerá a maioria das células parenquimatosas, como hepatócitos ou colangiócitos e células não parenquimatosas, como células de Kupffer, células endoteliais sinusoidais e células esteladas, além disso, restos de células, agregações de células e células mortas também serão removidos por centrifugação diferencial. A purificação e a isolação adicionais de populações específicas podem ser executadas pela cromatografia da exclusão do tamanho para remover todos os agregados ou lipoproteínas não-vesicular da proteína.
Uma limitação deste protocolo é que não pode capturar todas as vesículas do tecido, dada a possibilidade que algumas vesículas podem ser removidas no perfusate. Se for necessária uma avaliação global, deve-se considerar a coleta de perfusato e o isolamento de vesículas dentro do perfusato. Uma limitação mais adicional é o potencial para dano da pilha. Para monitorar o potencial impacto da morte celular excessiva, a viabilidade celular pode ser monitorada e incorporada dentro dos parâmetros de qualidade para isolamentos de EV tecidual. Em conclusão, este procedimento descreve um fluxo de trabalho aperfeiçoado usando uma técnica da perfusão da dois-etapa através da veia portal seguida pelo ultracentlee diferencial para obter EVS do tecido do fígado dos fígados de rato em um rendimento elevado. Estes EVs do tecido são apropriados para análises a jusante tais como a caracterização da composição Biomolecular e de outros estudos que visam caracterizar seus papéis fisiológicos ou patofisiológicos ou aplicações potenciais como marcadores da doença.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo financiamento do National Cancer Institute Grant CA-217833.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| 125 mL Erlenmeyer flask | Fisher scientific | FB500125 | |
| Curved non-serrated scissors | Fine Science Tools | 14069-12 | |
| Curved forceps | Fine Science Tools | 13009-12 | |
| Masking tape | Home supply store | ||
| Aluminum foil | Home supply store | ||
| Styrofoam pad | Home supply store | ||
| Absorbent Bench Underpad | Scientific inc. | B1623 | |
| Masterflex L/S Digital Miniflex Pump | Cole-parmer | ZX-07525-20 | |
| Water bath | Thermo Electron Precision | 2837 | |
| Blood collection sets | Becton Dickinson | 367292 | |
| Petri dish, clear lid 100x15 | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Falcon 70mm Nylon Cell Strainers | Fisher scientific | 352350 | |
| 50 mL conical tubes | Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| Cotton Tipped Applicators | Moore medical | 69622 | |
| 25mL Serological Pipet | Falcon | 357525 | |
| Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser | BioSurplus | 203-2751 | |
| O2 gas | |||
| Isoflurane | |||
| Levo Plus Motorized Pipette Filler | Scilogex | 74020002 | |
| Centrifuge 5804R | Sigma-aldrich | 22628048 | |
| Beckman Coulter Optima L-100 XP | Beckman | 969347 | |
| Beckman Coulter Avanti JXN-26 | Beckman | B34182 | |
| 70 Ti Fixed-Angle Rotor | Beckman | 337922 | |
| JA-25.50Fixed-Angle Rotor | Beckman | 363055 | |
| Nalgene Round-bottom tube | Thermo Scientific | 3118-0028 | |
| Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly | Beckman | 355618 | |
| Reagents | |||
| HyClone Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free | Fisher scientific | SH30588.01 | |
| Collagenase, Type IV, powder | Fisher scientific | 17104019 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Fisher scientific | SH30256.01 |
References
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