Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

לוקליזציה של Coeruleus לוקוס במוח העכבר

Published: March 7, 2019 doi: 10.3791/58652
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 4, 1
1Department of Physiology, Johns Hopkins University, School of Medicine, 2Department of Neuroscience, Johns Hopkins University, 3Department of Molecular and Medical Genetics, OHSU, 4X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

ERRATUM NOTICE

Summary

Coeruleus לוקוס יש מקבץ קטן של נוירונים מעורב במגוון רחב של תהליכים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול כדי להתכונן חלקים במוח העכבר מחקרים של חלבונים, מתכות בגרעין הזה.

Abstract

Coeruleus לוקוס (LC) היא מרכז חשוב של נוראדרנלין לייצר נוירונים זה לווסת את מספר פונקציות פיזיולוגיים. מומים מבניים או פונקציונלי של LC להשפיע מספר אזורים במוח כולל קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן, עשוי לתרום דיכאון, הפרעה דו קוטבית, חרדה, כמו גם מחלת פרקינסון, אלצהיימר. הפרעות אלה הקשורים לעתים קרובות עם misbalance מתכת, אך התפקיד של מתכות LC מובנת באופן חלקי בלבד. מחקרים מורפולוגיות ופונקציונליים של LC נחוצים כדי להבין טוב יותר את פתולוגיות האנושית ואת התרומה של מתכות. עכברים הם מודל ניסיוני בשימוש נרחב, אבל העכבר LC הוא קטן (~0.3 מ"מ קוטר), קשה לזהות שאינו מומחה. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול מבוסס אימונוהיסטוכימיה צעד אחר צעד כדי להתאים לשפה של LC במוח העכבר. דופמין-β-hydroxylase. דבח, (. מלך אקסום), לחלופין, טירוזין hydroxylase (ה), שני אנזימים מאוד שבאה לידי ביטוי LC, משמשים כסמני immunohistochemical פרוסות המוח. מקטעים סמוכים למקטעים המכילים LC יכול לשמש לצורך ניתוח נוסף, כולל היסטולוגיה מחקרים מורפולוגי, בדיקות מטבוליות, כמו גם הדמיה מתכת על ידי רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ (XFM).

Introduction

Coeruleus לוקוס (LC) הוא אזור חשוב לגזע המוח, האתר העיקרי של נוראפינפרין (NE) ייצור1. LC שולחת תחזיות ברחבי המוח2 קליפת המוח, ההיפוקמפוס של המוח הקטן3 , ולאחר מווסת תהליכים פיזיולוגיים העיקריים, כולל שעון ביולוגי4,5, תשומת לב, זיכרון6, להדגיש7, תהליכים קוגניטיביים8ו9,רגש10. תפקוד לקוי של LC היה מעורב והפרעות נוירולוגיות מנוטלי11, כולל פרקינסון מחלת12,13,14, מחלת אלצהיימר14, דיכאון15 16, ,17, הפרעה דו קוטבית18,19, ו חרדה20,21,22,23, 24. בהתחשב תפקידים אלה, ניתוח של LC הוא חיוני כדי ללמוד שלה ותפקוד לקוי.

עכברים נמצאים בשימוש נרחב עבור מחקרים של הפיזיולוגיות תהליכים pathophysiologic. עקב גודלם הקטן, העכבר LC יש של קוטר ממוצע של μm ~ 300, שמוביל קושי באיתור המבנה. במהלך המוח חלוקתה, LC ניתן בקלות לוותר בסעיפים הילתית או הווריד. מחקרים זמין המתארת זיהוי של LC בבעלי חיים לא מציעים פרוטוקול צעד אחר צעד שאינו מומחה יכול לעקוב אחר1,25. לפיכך, להציע הדרכה והסבה של LC, נתאר את פרוטוקול שפיתחנו כדי לאתר אזור זה במוח העכבר עבור מספר יישומים (איור 1, איור 2, איור 3). הפרוטוקול חלה זיהוי חלוקתה, immunohistochemical המוח מבוקר בקפידה של דבח, מלך אקסום26,27, או לחילופין ה24, שני אנזימים מאוד מועשר בתמציות של LC28. ברגע LC ממוקם על-ידי אימונוהיסטוכימיה, המוח סמוך פרוסות יכול לשמש ללימודים נוספים, כולל ניתוח מורפולוגי, חילוף החומרים, כמו גם מתכת מחקרי הדמיה באמצעות קרני רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ (XFM)29. אנו מתארים XFM כדוגמה בפרוטוקול הזה (איור 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

מחקרים של חיות אושרה על ידי ג'ונס הופקינס אוניברסיטת טיפול בעלי חיים, מספר פרוטוקול שימוש (ACUC) M017M385.

1. המוח חותך

  1. לשתק, עזים ומתנגד עכברים על-ידי היישום של 3% איזופלוריין.
    1. לספוג כדור צמר גפן עם טיפות של איזופלוריין והנח אותו בצינור microcentrifuge 15 mL. המקום האף של החיה לתוך הצינור ולאפשר לשאוף את איזופלוריין. בדוק עומק ההרדמה לתחושה של חוסר תגובה הבוהן-קורט.
  2. במקום החיה על גבו, לשתק אותו על-ידי הצמדת הגפיים שלו עם סיכה T תוך גישה בבטן.
  3. לחתוך את החיה עם מספריים כירורגיים על ידי ביצוע חיתוך בעור בטן ו לחתוך העור באזור החזה. להצמיד את העור באמצעות סיכות T. ואז לשבור את קרום הצפק אל בית החזה. לחשוף את הלב על-ידי פיצוח בחלל בית-החזה וחיתוך הסרעפת.
  4. חותכים אטריום ימין כדי לאפשר את הדם לזרום מתוך החיה. הוספת מזרק 10 מ"ל עם מחט 25-מד לתוך החדר השמאלי, perfuse עם 10 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS).
    הערה: פעולה זו מאפשרת את הפתרון לזרום דרך מחזור מערכתי ויציאה דרך אטריום ימין.
  5. הסר את המזרק 10 מ"ל ולהוסיף מחט 25-מד המצורפת את המזרק 60 מ. Perfuse דרך החדר השמאלי עם 50 מ של קרח קר 4% paraformaldehyde (PFA).
    1. הכנת הקרח קר 4% PFA פתרון על ידי דילול 10% הפתרון PFA H2O מצמרר הפתרון הסופי של כדורגלן 4% ב 4 º C.
  6. לבודד את הראש של העכבר ולהסיר למוח הגולגולת.
    1. לחתוך את העור מן הצוואר ולאחר מכן לחתוך לכיוון העיניים כדי לחשוף את הגולגולת. לפצח את הגולגולת מן הצוואר האף, ולאחר מכן מן עין אחת לאחרת. לקלף את הגולגולת החוצה, לסלק את כל המוח.
  7. דגירה המוח ב- 4% PFA במשך 24 שעות ביממה ב 4 º C.
  8. להעביר את המוח עם מלקחיים לתוך צינור חרוטי 50 מ ל מלא עם 25 מ של 30% סוכרוז פתרון. שמור אותו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 48-72 h עד המוח שוקע לתחתית של התחתית.
  9. לחתוך המוח עם מבצעה מוח עכבר למבוגרים מטריקס הפרונטליים דרך המוח האמצעי (~ 3 מ מ האחורי של bregma). לשמור על המוח ושהקטע לגזע המוח.
    הערה: זה יגרום בשני הסעיפים המוח – אחד רוב המכיל קליפה (קדמי של החתך), אחד המכיל את גזע המוח/המוח הקטן (האחורי של החתך). השתמש במקטע גזע המוח עבור השלבים הבאים.
  10. להטביע את המקטע גזע המוח עם משטח חיתוך מניחים בתחתית תבנית להטבעה, מוקף טמפרטורה אופטימלית חיתוך המורכב (אוקטובר); להעביר את המוח מוטבע מקפיא-80 ° C ומקפיאים במשך לפחות 12 ח' – עד שימוש נוסף.
  11. חיתוך-cryostat: המקום ההטמעה עובש המכיל המוח באוקטובר לתוך cryostat; דגירה ב cryostat במשך מספר שעות להתאים את הטמפרטורה של הרחוב המוח לזה של cryostat זה.
  12. לקלף את להטבעה לחשוף את הבלוק OCT המכיל את המוח.
  13. השתמש סכיני גילוח להסרת עודף של OCT מפני השטח של הרחוב בלי לגעת במוח.
  14. הר הרחוב OCT על הצ'אק של cryostat, חשיפת פני לחתוך המוח לעבר החזית.
  15. להתאים פני לחתוך המוח כך זה הוא מונחה במקביל razorblades של cryostat.
  16. חתוך את המוח החל לשד, חיתוך 100 מיקרומטר מקטעים rostrally.
  17. חתוך rostrally עד המוח הקטן של גזע המוח לחתוך כמו פרוסה רציפה אחת. מתחילים באיסוף פרוסות-עובי 50 מיקרומטר.
    הערה: כפי אחד trims rostrally מ לשד, גזע המוח, מוח מאורך אחתוך שני מקטעים נפרדים. בסעיפים rostral, גזע המוח, מוח מאורך ימזג בסופו של דבר ברמת הנוזליםה 4. לאחר הקצוות לרוחב הנוזליםth 4 בנוי היטב, ואז המוח, גזע המוח ייצאו כמו פרוסה רציפה אחת.
    1. לאסוף את המוח מוקף OCT פרוסה עם מלקחיים ומניחים אותו בטוב של צלחת 24-ובכן מלא עם PBS (איור 2 א). LC יהיה הבולט ביותר כאשר המוח ואת רקתי נחות לפגוש אחד את השני-~-5.52 מ"מ אחורי של bregma (איור 1b).
      הערה: החלק הקדמי ביותר של LC ייעלם ברגע הקטן למחלקה לחלוטין כבר לא המקיף את רקתי נחות-~-5.34 מ"מ אחורי של bregma (איור 1 c).

2. אימונוהיסטוכימיה דופמין β-Hydroxylase או Hydroxylase טירוזין (איור 2)

  1. יום 1
    1. לשטוף את הפרוסות שנבחרו שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- PBS.
    2. Permeabilize במשך 24 שעות ביממה ב- 0.5% saline פוספט באגירה מלאה עם חומר ניקוי (PBSD) ב 4 º C.
      1. לדלל 125 µL של חומרי ב 25 מ של PBS.
  2. יום 2
    1. לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- 0.5% PBSD.
    2. הוסף את נוגדן ראשוני, אנטי-דבח, מלך אקסום או ה-anti עבור 18 h-לדילול שבערך ב- 0.5% PBSD ב 4 º C.
  3. יום 3
    1. לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 10 דקות ב- 0.5% PBSD.
    2. להוסיף הנוגדן הרצוי המשני (488 החמור נגד הארנב פלורסצנטיות ירוק) לדילול 1:1000 ב 0.5% PBSD עבור 16 h.
    3. לעטוף את הצלחת היטב 24 אלומיניום ובמקום ב 4 º C.
    4. לשטוף את פרוסות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב- 0.5% PBSD.
    5. לרחוץ למשך 5 דקות ב- PBS.
    6. העברת פרוסות עם מברשת עיפרון לתוך מיכל המים.
    7. הר פרוסות צף במים בשקופיות טעונה.
    8. סעיפים Coverslip עם הרכבה hard-set מדיה (ללא דאפי).
    9. יבש הסעיפים נטען המוח במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
    10. התמונה פרוסות המוח במיקרוסקופ קונפוקלי או פלורסנט עם הגדרות כדי לזהות אות נוגדן המשני המתאים fluorophore גל.
    11. להתאים את המיקרוסקופ מוקד המטוס הפרוסה המוח ולקחת תמונה אחת בהגדלה X 10.
    12. כדי לאתר אזור LC אפשרי של הפרוסה המוח, להשתמש הנוזליםth 4 לאוריינטציה; המוח הקטן נמצא מעל הנוזלים, פונס גזע המוח נמצאים מתחת30.
    13. כדי לאתר את LC, להתמקד הקצוות לרוחב הנוזליםth 4; LC מקורו של קצות החדרth ונקודות 4 לכיוון פונס / באזור גזע המוח (איור 2b, ג 2).
    14. בעקבות הדמיה לוקליזציה של LC פרוסות המוח מסוימים, לאחסן שקופיות המכילה פרוסות המוח ב 4 º C.

3. זיהוי LC פרוסות המוח

  1. כדי לאתר את המוח המקטע המכיל את LC, לחתוך את המוח העכבר כפי שתואר לעיל, לאסוף במקטעים PBS מלא 24 מנות היטב, כפי שמוצג באיור 2a.
    1. במקום סעיף מוח אחד לכל טוב כדי לאפשר לוקליזציה נאותה של LC.
  2. לאסוף סכום כולל של 48 פרוסות המוח זה יהיה immunostained לפי המוח.
    הערה: כל הבארות של שתי מנות שמוצג באיור 2a להכיל פרוסות המוח של חיה אחת.
  3. Immunostain כל פרוסה השלישית עד החמישית דבח, מלך אקסום, או TH. רצוי, לבצע אימונוהיסטוכימיה של אלה פרוסות המוח סמוכים אלה הם לבדיקה נוספת (באמצעות קרני רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ, XFM).
    הערה: הליך זה מאפשר לוקליזציה המדויק של LC פרוסות הסופית assay (איור 2 א; המסומנות במספרים בין הבארות).
  4. להתאים את מספר הפרוסות המוח כי הם immunostained בהתאם ליישום, למשל, בין אם הם דורשים את המיקום המדויק של המרכז ושל קצה של LC, או רק הערכה קשה.
  5. בעקבות אימונוהיסטוכימיה, לאתר את פרוסות המוח המכיל LC באמצעות תבנית אופיינית של ביטוי בשני הצדדים של החדרth 4 (איור 2b, ג 2). ההגדלה של האות דבח, מלך אקסום ב LC הפרוסות המוח רצופים מוצג איור דו-ממדי, 2e; התמונה בהגדלה של LC זה היא מוכתמת על תאנון מוצג איור 2f.
  6. השתמש הסעיפים סמוכים אלה LC המכיל ללימודי - במקרה זה עבור XFM לכמת רמות מתכת (איור 3).
  7. כדי לבצע XFM, לאסוף 10-30 מיקרומטר (בהתאם ההתקנה) פרוסות דק המוח הילתית על סרט דק פולימריים שבה הם להיות רכוב על מחזיקי לדוגמה, עם תמונה-סינכרוטרון.
  8. חנות פרוסות המוח אשר מוכנים על סרט דק פולימריים XFM בטמפרטורת החדר ולבצע XFM.

4. מתכת הדמיה ב LC ויה XFM

  1. לחתוך מוח העכבר דוגמה כמתואר לעיל, לקבוע LC, ומדידת רמות מתכת ויה XFM מ פרוסות המוח אלה המכילים את LC.
  2. התמונה הפצות היסודות על הפרעות לקרן החלקיקים 2-מזהה-E למקור הפוטון מתקדם (Argonne National Laboratory, איל Argonne).
  3. להקליט את הנתונים "לטוס" כפי שתואר לעיל31.
  4. לקבוע ריכוז היסודות פרוסות המוח המכיל את LC באמצעות תוכנית מפות32,33.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שינויים הומאוסטזיס מתכת (כגון Cu, Fe, Zn, Mn) הם נצפו לעתים קרובות בהפרעות רגשיות ונוירולוגיות, לרבות שינויים LC34,35. לפיכך, קביעת רמות מתכת במוח הכרחי להבנה של מנגנוני המחלה. הסעיפים המוח שנוצרו באמצעות פרוטוקול המתואר ניתן לכמת את הרמות של Cu ומתכות אחרות LC ולהשוות אותם על הרמות באזורים מחוץ LC. (איור 3). בדוגמה שלנו, הפרוסה המוח זה נחתך באמצעות LC, פוספט, אשלגן, כלוריד, נחושת נמדדה. נחושת היחיד היה גבוה במיוחד ב LC. ניתן גם לבצע הדמיה על XFM ברזולוציה גבוהה יותר (לא מוצג כאן) לצורך זיהוי של התפלגות subcellular של רמות מתכת. בהמשך היישומים האפשריים של פרוטוקול זה כוללים זיהוי שפע והפצה תאיים של דבח, מלך אקסום (איור 2b2d, 2e), TH (איור 2 c, 2f) לחלבונים אחרים לידי ביטוי LC בנפרד או שיתוף מכתים מבחני, מחקרים של מורפולוגיה LC וצפיפות עצביים.

Figure 1
איור 1: לוקליזציה של LC ב העכבר לגזע המוח. () מפרטים טכניים הממחיש את האזור של גזע המוח זה למחלקה כדי להתאים לשפה של LC. אטלס (b) מבוסס על המוח Paxinos ופרנקלין30, LC יהיה הבולט ביותר שיהפכו המוח הקטן, נחות נפגשים אחד לשני (מ מ-5.52 האחורי של bregma). התמונה השמאלית מראה קטע הילתית לחתוך את LC, ואילו הדמות הנכונה מדגים לוקליזציה של LC על הקצוות לרוחב הנוזליםth 4 דרך Nissl מכתים. (ג) הקדמי ביותר חלק LC יעלמו ברגע הקטן למחלקה לחלוטין כבר לא המקיף את רקתי נחות (מ מ-5.34 האחורי של bregma). Nissl מכתים על הדמות הנכונה מראה LC היא רק נוכח שולית זו פרוסה הילתית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זיהוי של LC על ידי המוח immunostaining פרוסות דבח, מלך אקסום או נ המוח עכבר אחד () למחלקה לפרוסות μm 50 סביב גזע המוח ונאסף במנות טוב שני 24. כל 5th 8 פרוסה המוח שנאספוth היה רכוב על הסרט מכוסה coverslip עבור הדמיה באמצעות XFM. פרוסות אלה מסומנות במספרים כחול בין הבארות. סמוך פרוסות צף PBS היו immunostained עבור דבח, מלך אקסום לזהות LC (המסומנת הצלב האדום על וולס). עיגולים ירוקים מציינות פרוסות חיובי לאות דבח, מלך אקסום, ובכך להכיל LC. (b) של המוח הילתית פרוסה המכיל LC immunostained עם דבח, מלך אקסום, עם תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי. התמונה מראה קליטה טובה LC (בירוק). (ג) A פרוסה הילתית המכיל LC immunostained עבור hydroxylase טירוזין (ה), עם תמונה במיקרוסקופ פלואורסצנטי. התמונה מציגה את האות חזק שמאלה וימינה LC. (ד) פרוסות היו immunostained עבור דבח, מלך אקסום, פרוסות 7 (בצד השמאל) ו-9 (בצד ימין) הכלול LC. חלקים סמוכים נבחרו לניתוח XFM. (e) פרוסה 10 הראה גם LC. בסעיף זה, LC השמאלי נחתך באמצעות המרכז שלו בזמן הזכות LC נתפס בקצה הקדמי ביותר. (f) של המקטע המכיל LC immunostained עבור ה, עם תמונה במיקרוסקופ קונפוקלי. התמונה מראה TH לבטא נוירונים בריכוזים LC המסומנות בירוק. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: הדמיה של מתכת רמות ב LC- המוח של עכבר זכר בן שבוע 12 בנוק אאוט של Cu-טרנספורטר ATP7B היה מבודד והכינו כפי שמתואר פרוטוקול זה. פרוסות שהוכתמו שאינם סמוכים למקטעים המכילים LC נלקחו, רמות מתכת נמדדו באמצעות XFM. רמות cu היו במיוחד עלה ב LC (עם תוויות חיצים צהובים) לעומת האזור במוח שמסביב, בעוד השני אלמנטים (K, P ו- Cl) לא השתנו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כראוי המכוונת את הדגימה היא שלב קריטי פרוטוקול זה. מאחר ואנו משתמשים תכונות אנטומיות של המשטח הגבי של המוח כדי לאתר LC (הגבול בין המוח הקטן רקתי נחות), חשוב כי הסעיפים ליישר כהלכה. הדבר דורש טיפול בקביעת כראוי המוח לתוך מאטריקס מבצעה מוח העכבר. אנו ממליצים לחתוך ~ 500 μm יותר רקמות anterior ואת אחורי כדי LC כדי למנוע חסר הגרעין. הטעות הנפוצה ביותר היא לחתוך קטעים מעטים מדי כי התוצאות מפספס לחלוטין את LC. לפיכך, לראשונה אחד בעקבות פרוטוקול זה, אנו ממליצים לחתוך קטעים יותר מהדרוש. לימוד מעמיק של המוח אטלס תמונות לפני צביעת שימושי מאוד. המראה של גזע המוח משתנה מיקרון כל כמה מאות ניכרת, עם קצת ניסיון, זה אפשרי לדעת מה מקטעים ששווה לשלב אותם פשוט על-ידי המראה מאקרוסקופית.

במהלך תהליך לוקליזציה של LC, אולי יש וריאציות של האות תלוי עד כמה המוח היה מונחה במהלך חלוקתה. חיתוך דרך מרכז LC, כאשר האות בהיר, מכסה שטח גדול יותר לעומת הקצה של LC, אשר יופיע בתור אות על פני שטח קטן יותר. במקרה כי פרוסות הילתית הם מעט מוטה, LC צידו האחד של החדרth 4 עשוי להיות ניכרת, האחד בצד השני רק יהיה גלוי בשקופית סמוכים. לכן, אי אפשר תמיד לצפות את המראה של שני האזורים LC בעוצמה מקסימלית בתוך המוח פרוסה. החפץ יכול להימנע על ידי חיתוך המוח בדיוק הילתית במטריצה מבצעה מוח העכבר ולאחר בקפידה הטמעה לתוך להטבעה cubical המוח בעזרת OCT.

Immunostaining, לפחות עם הנוגדן אנטי-טירוזין hydroxylase, מאוד סלחן, מניסיוננו, עבודות על סעיפים עד 100 μm עובי. מצאנו כי חסימת הפתרון אינו הכרחי עבור אות לרעש גבוה מכתים של LC, להפחית את עלות, להפחית את כמות הזמן הדרושה כדי לאתר LC. מניסיוננו, פרוטוקול מכתימים יכול האיץ את זה – גם אם עם הקטינה את האיכות ואת penetrance מכתים – על-ידי הפחתת permeabilization 2 h, נוגדן ראשוני עבור 8 שעות של נוגדנים משניים עבור 2 ה. בנוסף, אם תהיה מעוניין באיתור LC ( למשל, עבור אימות הזרקה של מכשיר וירוס/מעקב), ניתן לחתוך חלקים מהמוח קבוע ב- vibratome ב- 100 μm עובי.

מגבלה אחת של פרוטוקול זה הוא שזה, על ידי עיצוב, דורש המתות חסד החיה והסרה של המוח. לכן, זה לא שימושי עבור ויוו לשפות אחרות (למשל, הקלטות electrophysiologic). מגבלה נוספת היא כי פרוטוקול זה מחייב קיבעון מחברים אשר עלולה לשנות את המדינה מקורית של הרקמה. שינויים אלה כוללים את התוכן אלמנטלים כגון נחושת, סידן, ברזל, אבץ36. משינוי בפועל של התפלגות ממתכת הנגרמת על ידי קיבוע PFA עשוי להיבדק מדגם אחד אשר ניתן להפעיל במקביל מדגם שאינו קבוע. השוואה של ההתפלגות מתכת בין ששני מדגמים אלה תספק ראיות על ההשפעה של כדורגלן קיבעון על חלוקת המתכת אשר הוא עניין במחקר מסוים. אם יש להימנע PFA קיבעון, העיקרון הכללי של הפרוטוקול (איתור LC מאת immunostaining ושימוש חלקים סמוכים לניסויים מעקב) ניתן להרחיב לסעיפים קפואים בלי קיבוע.

נציין כי פרוטוקול זה הוא במידה רבה עידון של שיטות קיימות כדי לפתור בעיה זו. החידוש קיימת התאמת הגישות הקודמות לאתר גרעין קטן מאוד, שלא נענתה בקלות. אנו מצפים כי פרוטוקול זה יכול להיות בקלות לשינוי והרחבה על בסיס צורך (למשל, באמצעות בעלי חיים מהונדס המבטא fluorophores ב LC להימנע immunostaining).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

. לא-

Acknowledgments

אנו מודים Abigael Muchenditsi על קיומו של המושבה העכבר. השימוש המקור הפוטון מתקדם ב Argonne National Laboratory נתמכה על ידי משרד האנרגיה האמריקני, משרד המדע, משרד של בסיסי אנרגיה למדעים, תחת מספר חוזה: דה-AC02-06CH11357. אנו מודים אולגה Antipova, ד ר סטפן ווגט על המשתמש תמיכה וסיוע למקור הפוטון מתקדם. עבודה זו מומן על ידי 2R01GM101502 גרנט המכון הלאומי לבריאות ל SL.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adult mouse brain slicer matrix Zivic Instruments BSMAS001-1
Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source - donkey) Thermo Fisher Scientific A-21206
Charged glass slides Genesee 29-107
Confocal microscope Zeiss LSM 800
Cryostat Microm GmbH HM 505E
Cryostat cutting blades Thermo Fisher Scientific MX35
Scissors Mini, 9.5cm Antech Diagnostcs 503241
DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) Sigma-Aldrich D9542-10MG
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - inhouse production (source - rabbit) B. Eipper -
Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody - commercially availabe (source - rabbit) Cell Signaling 8586
Falcon tubes, 50ml USA Scientific 339652
Forane (isofluorane) Baxter NDC 1019-360-60
Forceps Micro Adson Antech Diagnostcs 501245
Hardset mounting media EM sciences 17984-24
Microscope Pascal LSM 5
Multi-well plates, 24 wells Thermo Fisher Scientific 930186
Optimal cutting temperature compound (OCT) VWR/ tissue tech 102094-106
Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% Fisher Scientific SF98-4
Peel-A-Way disposable embedding molds Polysciences Inc. 18646A
Pencil brush
Phosphate buffered saline (PBS) Life Tech 14190250
Razor blades Amazon ASIN: B000CMFJZ2
Spatulas Antech Diagnostcs 14374
T pins Office Depot 344615
The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition Amazon ISBN: 978-0123694607
Triton-X 100 (to prepare PBSD) Sigma-Aldrich T8787
Tween 20 Sigma-Aldrich P7949-500ml
Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source - rabbit) EMD Millipore AB152
Ultralene thin film for XRF SPEX Sample Prep 3525
Wide-field fluorescent microscope Zeiss Axio Zoom.V16

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Robertson, S. D., Plummer, N. W., de Marchena, J., Jensen, P. Developmental origins of central norepinephrine neuron diversity. Nature neuroscience. 16, 1016-1023 (2013).
  2. Kobayashi, R. M., Palkovits, M., Jacobowitz, D. M., Kopin, I. J. Biochemical mapping of the noradrenergic projection from the locus coeruleus. A model for studies of brain neuronal pathways. Neurology. 25, 223-233 (1975).
  3. Olson, L., Fuxe, K. On the projections from the locus coeruleus noradrealine neurons: the cerebellar innervation. Brain research. 28, 165-171 (1971).
  4. Costa, A., Castro-Zaballa, S., Lagos, P., Chase, M. H., Torterolo, P. Distribution of MCH-containing fibers in the feline brainstem: Relevance for REM sleep regulation. Peptides. , 50-61 (2018).
  5. Semba, J., Toru, M., Mataga, N. Twenty-four hour rhythms of norepinephrine and serotonin in nucleus suprachiasmaticus, raphe nuclei, and locus coeruleus in the rat. Sleep. 7, 211-218 (1984).
  6. Takeuchi, T., et al. Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory. Nature. 537, 357-362 (2016).
  7. Korf, J., Aghajanian, G. K., Roth, R. H. Increased turnover of norepinephrine in the rat cerebral cortex during stress: role of the locus coeruleus. Neuropharmacology. 12, 933-938 (1973).
  8. Sara, S. J., Segal, M. Plasticity of sensory responses of locus coeruleus neurons in the behaving rat: implications for cognition. Progress in brain research. 88, 571-585 (1991).
  9. Markevich, V. A., Voronin, L. L. Synaptic reactions of sensomotor cortex neurons to stimulation of emotionally significant brain structures]. Zhurnal vysshei nervnoi deiatelnosti imeni I P Pavlova. 29, 1248-1257 (1979).
  10. File, S. E., Deakin, J. F., Longden, A., Crow, T. J. An investigation of the role of the locus coeruleus in anxiety and agonistic behaviour. Brain research. 169, 411-420 (1979).
  11. Pamphlett, R. Uptake of environmental toxicants by the locus ceruleus: a potential trigger for neurodegenerative, demyelinating and psychiatric disorders. Medical hypotheses. 82, 97-104 (2014).
  12. Wang, J., et al. Neuromelanin-sensitive magnetic resonance imaging features of the substantia nigra and locus coeruleus in de novo Parkinson's disease and its phenotypes. European journal of neurology. 25, 949-973 (2018).
  13. Oliveira, L. M., Tuppy, M., Moreira, T. S., Takakura, A. C. Role of the locus coeruleus catecholaminergic neurons in the chemosensory control of breathing in a Parkinson's disease model. Experimental neurology. , 172-180 (2017).
  14. Zarow, C., Lyness, S. A., Mortimer, J. A., Chui, H. C. Neuronal loss is greater in the locus coeruleus than nucleus basalis and substantia nigra in Alzheimer and Parkinson diseases. Archives of neurology. 60, 337-341 (2003).
  15. Chandley, M. J., et al. Gene expression deficits in pontine locus coeruleus astrocytes in men with major depressive disorder. Journal of psychiatry & neuroscience : JPN. 38, 276-284 (2013).
  16. Bernard, R., et al. Altered expression of glutamate signaling, growth factor, and glia genes in the locus coeruleus of patients with major depression. Molecular psychiatry. 16, 634-646 (2011).
  17. Gos, T., et al. Tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the locus coeruleus is elevated in violent suicidal depressive patients. European archives of psychiatry and clinical neuroscience. 258, 513-520 (2008).
  18. Bielau, H., et al. Immunohistochemical evidence for impaired nitric oxide signaling of the locus coeruleus in bipolar disorder. Brain research. 1459, 91-99 (2012).
  19. Wiste, A. K., Arango, V., Ellis, S. P., Mann, J. J., Underwood, M. D. Norepinephrine and serotonin imbalance in the locus coeruleus in bipolar disorder. Bipolar disorders. 10, 349-359 (2008).
  20. Borodovitsyna, O., Flamini, M. D., Chandler, D. J. Acute Stress Persistently Alters Locus Coeruleus Function and Anxiety-like Behavior in Adolescent Rats. Neuroscience. 373, 7-19 (2018).
  21. Hirschberg, S., Li, Y., Randall, A., Kremer, E. J., Pickering, A. E. Functional dichotomy in spinal- vs prefrontal-projecting locus coeruleus modules splits descending noradrenergic analgesia from ascending aversion and anxiety in rats. eLife. 6, (2017).
  22. McCall, J. G., et al. CRH Engagement of the Locus Coeruleus Noradrenergic System Mediates Stress-Induced Anxiety. Neuron. 87, 605-620 (2015).
  23. Borges, G. P., Mico, J. A., Neto, F. L., Berrocoso, E. Corticotropin-Releasing Factor Mediates Pain-Induced Anxiety through the ERK1/2 Signaling Cascade in Locus Coeruleus Neurons. The international journal of neuropsychopharmacology. 18, (2015).
  24. Simone, J., et al. Ethinyl estradiol and levonorgestrel alter cognition and anxiety in rats concurrent with a decrease in tyrosine hydroxylase expression in the locus coeruleus and brain-derived neurotrophic factor expression in the hippocampus. Psychoneuroendocrinology. 62, 265-278 (2015).
  25. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nature. 13, 1526-1533 (2010).
  26. Fan, Y., et al. Corticosterone administration up-regulated expression of norepinephrine transporter and dopamine beta-hydroxylase in rat locus coeruleus and its terminal regions. Journal of neurochemistry. 128, 445-458 (2014).
  27. Xiao, T., et al. Copper regulates rest-activity cycles through the locus coeruleus-norepinephrine system. Nature chemical biology. 14, 655-663 (2018).
  28. Amaral, D. G., Sinnamon, H. M. The locus coeruleus: neurobiology of a central noradrenergic nucleus. Progress in neurobiology. 9, 147-196 (1977).
  29. Ralle, M., et al. Disease at a Single Cell Level: intracellular copper trafficking activates compartment-specific responses in hepatocytes. The Journal of Biological Chemistry. 285, 30875-30883 (2010).
  30. Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. Franklin, K. B. J. , Boston, Amsterdam. (2013).
  31. Bonnemaison, M. L., et al. Copper, zinc and calcium: imaging and quantification in anterior pituitary secretory granules. Metallomics : integrated biometal science. 8, 1012-1022 (2016).
  32. Nietzold, T., et al. Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2018).
  33. Vogt, S. MAPS: A set of software tools for analysis and visualization of 3D X-ray fluorescence data sets. J. Phys. IV France. 104, 635-638 (2003).
  34. Davies, K. M., et al. Copper pathology in vulnerable brain regions in Parkinson's disease. Neurobiology of aging. 35, 858-866 (2014).
  35. Davies, K. M., Mercer, J. F., Chen, N., Double, K. L. Copper dyshomoeostasis in Parkinson's disease: implications for pathogenesis and indications for novel therapeutics. Clinical science. 130, London, England. 565-574 (2016).
  36. James, S. A., et al. Quantitative comparison of preparation methodologies for X-ray fluorescence microscopy of brain tissue. Analytical and bioanalytical chemistry. , 853-864 (2011).

Tags

מדעי המוח גיליון 145 המוח לוקוס coeruleus מתכות אימונוהיסטוכימיה רנטגן פלורסצנטיות מיקרוסקופ נוראדרנלין נחושת דבח מלך אקסום TH ATP7A ATP7B

Erratum

Formal Correction: Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain
Posted by JoVE Editors on 04/08/2019. Citeable Link.

An erratum was issued for: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain.  An author affiliation was updated.

The affiliation for Evan Maxey was updated from:

Department of Neuroscience, Johns Hopkins University

to:

X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

לוקליזציה של Coeruleus לוקוס במוח העכבר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M.,… More

Schmidt, K., Bari, B., Ralle, M., Washington-Hughes, C., Muchenditsi, A., Maxey, E., Lutsenko, S. Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (145), e58652, doi:10.3791/58652 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter