Summary
Decellularizzati ponteggi cartilagine-derivato possono essere utilizzati come un'impalcatura per la riparazione della cartilagine di guida e come un mezzo per rigenerare il tessuto osteocondrali. Questo articolo descrive dettagliatamente il processo di decellularizzazione e fornisce suggerimenti per utilizzare queste impalcature nelle impostazioni in vitro.
Abstract
Difetti osteocondrali non hanno sufficiente riparazione intrinseca capacità di rigenerare il tessuto dell'osso e della cartilagine funzionalmente suono. In questa misura, cartilagine ricerca si è concentrata sullo sviluppo di ponteggi rigenerative. Questo articolo viene descritto lo sviluppo di impalcature che completamente sono derivati dalla matrice extracellulare della cartilagine naturale, proveniente da un donatore equino. Potenziali applicazioni di impalcature includono la produzione di allotrapianti per la riparazione della cartilagine, che serve come impalcatura per osteochondral tissue engineering e fornendo modelli in vitro per studiare la formazione di tessuto. Di decellularizing il tessuto, le cellule del donatore vengono rimossi, ma molti dei suggerimenti di bioattivi naturali sono pensati per essere mantenuto. Il vantaggio principale dell'utilizzo di tali un'impalcatura naturale rispetto ad un'impalcatura prodotta sinteticamente è che nessun ulteriore funzionalizzazione di polimeri è necessaria alla rigenerazione tissutale osteocondrali di unità. I ponteggi di matrice della cartilagine-derivato possono essere utilizzati per la rigenerazione di tessuto dell'osso e della cartilagine nelle impostazioni sia in vivo che in vitro.
Introduction
Difetti della cartilagine articolare del ginocchio causato da eventi traumatici possono portare a disagio e soprattutto possono avere un grande impatto sulla vita della popolazione giovane e attiva1,2,3. Inoltre, il danno della cartilagine in giovane età può condurre a una più rapida insorgenza dell'osteoartrite più tardi nella vita4. Attualmente, l'unica terapia di salvataggio per l'osteoartrite generalizzata del ginocchio è la chirurgia di sostituzione dell'articolazione. Come la cartilagine è un tessuto avascolare, aneurali e hypocellular, la sua capacità rigenerativa è severamente limitato. Di conseguenza, gli approcci di medicina rigenerativa sono ricercati per aiutare e stimolare la capacità rigenerativa del tessuto nativo. Per questo scopo, ponteggi sono progettati e utilizzati come sia un cella-elemento portante o come un materiale induttivo che inciti alla differenziazione e rigenerazione del tessuto da cellule native5 del corpo.
Scaffold decellularizzati ampiamente sono stati studiati nell'ambito della medicina rigenerativa6. Ha avuto un certo successo, ad esempio, nel favorire la rigenerazione della pelle7, strutture addominali8e tendini9. Il vantaggio dell'utilizzo di impalcature decellularizzate è loro origine naturale e la loro capacità di trattenere spunti bioattivi che sia ottenere e inducono la differenziazione delle cellule verso la linea appropriata necessaria per la riparazione del tessuto6,10. Inoltre, poiché la matrice extracellulare (ECM) è un biomateriale naturale e decellularizzati impedisce una potenziale risposta immunitaria rimuovendo contenuti cellulari o genetico, sono superare questioni riguardanti la biocompatibilità e biodegradabilità.
Matrice della cartilagine-derivato (CDM) impalcature hanno dimostrato grande condrogenica potenziale negli esperimenti in vitro quando seminati con cellule stromali mesenchimali11. Inoltre, queste impalcature hanno dimostrato il potenziale di tessuto osseo forma attraverso l'ossificazione endochondral sulle posizioni ectopici in impostazioni in vivo12. Come CDM ponteggi guidano la formazione di entrambi dell'osso e tessuto cartilagineo, queste impalcature possono detenere potenziali per riparazione di difetti osteocondrali oltre la riparazione della cartilagine.
Questo articolo viene descritto un protocollo adattato da Yang et al (2010)13 per la produzione di decellularizzazione impalcature CDM da equino soffocare la cartilagine. Queste impalcature sono ricche di collagene di tipo II e privo di cellule e non contengono alcun glicosaminoglicani (gag) dopo decellularizzati. Gli esperimenti sia in vitro che in vivo su riparazione di difetti condrali (osteo) possono essere condotta utilizzando queste impalcature.
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Protocol
Per questo protocollo, cartilagine ginocchio equina è stata ottenuta da cavalli che erano morto da altre cause di osteoartrite. Tessuto è stato ottenuto con il permesso dei proprietari, in linea con i regolamenti etici istituzionali.
Nota: Questo protocollo descrive la fabbricazione di impalcature da decellularizzati cartilagine equina, che può essere utilizzato per applicazioni come le piattaforme di coltura di tessuti in vitro o in vivo l'impianto nelle strategie di medicina rigenerativa. La procedura di trattamento enzimatico deve essere eseguita nell'ordine cronologico descritto.
1. raccolta di cartilagine articolare da donatore (cadaverico) giunti
- Avanti del passo raccolto, preparare 1 L di cartilagine soluzione di lavaggio, consistente in sterile tampone fosfato salino (PBS), completato con penicillina 100 U/mL, 100 µ g/mL di streptomicina e 1% (v/v) amfotericina b.
- Indossare un camice da laboratorio e guanti durante l'intera procedura di raccolta, poiché il donatore può trasportare gli agenti patogeni.
- Ottenere un giunto intatto (cadaverico) per l'isolamento di cartilagine.
Nota: A questo punto, la pelle intorno all'articolazione è ancora intatta. Cartilagine equina soffocare ottenuta da cavallo è stata usata in questo protocollo, ma possono essere utilizzati anche altri giunti da altre specie. - Togliere la pelle che si trova intorno alla zona comune di interesse usando un bisturi e una pinzetta chirurgica. Inoltre, è possibile rimuovere eccessivo tessuto grasso e muscolo, se necessario, senza danneggiare il giunto sottostante. Facoltativamente, è possibile trasferire il cadavere preparato a una cappa di sicurezza biologica.
- Per eseguire un'artrotomia, vale a dire, una separazione del giunto, innanzitutto definire la posizione in cui l'articolazione si articola mediante l'esecuzione di estensione e flessione dell'articolazione.
- Rimuovere con attenzione più strati di grasso, muscoli e tendini con un bisturi e pinzette chirurgiche per aprire la zona comune.
- Fare un'incisione per raggiungere la cavità articolare.
Nota: La cavità articolare è riempita di liquido sinoviale, che può gocciolare dalla cavità quando si esegue un'incisione corretta. - Continuare ad aprire completamente il giunto di taglio attraverso i tendini che tengono insieme l'articolazione.
- Ispezionare la cartilagine per eventuali danni macroscopici.
Nota: Se la cartilagine articolare non ha un aspetto lucido e liscio o evidente formazione di vesciche, fessure o difetti sono presenti, eliminare la cartilagine. - Utilizzare un bisturi sterile per rimuovere la cartilagine dall'osso subcondrale. Tagliare tutta la strada fino all'osso subcondrale anche rimuovere la zona profonda della cartilagine (Figura 1). Per impedire che la cartilagine seccarsi, regolarmente gocciolare cartilagine soluzione di lavaggio sulla cartilagine.
Nota: In questo momento, non importa la dimensione delle fette della cartilagine. - Raccogliere le fette di cartilagine in provette da 50 mL contenente precedentemente preparato della cartilagine (Figura 2A) di soluzione di lavaggio.
- Dopo aver raccolto la cartilagine da tutte le aree di interesse, snap congelare le fette di cartilagine in azoto liquido per 5 min.
- Trasferire le fettine di cartilagine in provette da 50 mL e lyophilize immediatamente le fette di cartilagine per 24 h in un congelamento essiccatore. Impostare il congelamento essiccatore a circa 0.090 mbar mentre il condensatore di ghiaccio è da-51 ° C (Figura 2B).
- Memorizzare le fette di cartilagine in un luogo asciutto a temperatura ambiente fino al successivo utilizzo.
Nota: Fino al punto di formazione del patibolo, le soluzioni e la cartilagine non è necessario essere preparati e trattati in modo sterile.
2. creazione di Decellularized particelle di cartilagine
- Immergere le fette di cartilagine liofilizzato in azoto liquido.
- Macinare direttamente i campioni manualmente o mediante una fresatrice. Durante la molatura a mano le fette di cartilagine, utilizzare un mortaio e pestello e macinare le fette per circa 45 min fino a quando essi sono polverizzati (Figura 2 e 2D). Durante la molatura automaticamente, è possibile utilizzare una fresatrice alla sua velocità pre-impostati per pochi secondi fino a un minuto, fino a quando le fette di cartilagine snap-congelati sono polverizzate.
Nota: Pre-raffreddare il mortaio o il macinacaffè della fresatrice con l'aggiunta di azoto liquido. Quando si utilizza una fresatrice, assicurarsi che tutte le particelle sono terra, e che le particelle non soggiorno nella parte inferiore del vano di macinazione. - Passare al setaccio le particelle di cartilagine per sbarazzarsi di più grandi parti utilizzando un setaccio con maglie di dimensioni 0.71 mm.
- Memorizzare le particelle in un luogo asciutto a temperatura ambiente.
3. enzimatica decellularizzati con tripsina 0.25%-EDTA
- Preparare la soluzione di digestione, costituito da 0,25% tripsina con EDTA completato con penicillina 100 U/mL, 100 μg/mL di streptomicina e 1% (v/v) amfotericina B. Store la soluzione a 4 ° C.
Nota: Trypin è una proteasi che degrada le proteine residenti nel tessuto della cartilagine. Questo passaggio enzimatico aprirà la struttura densa della cartilagine. - Riempire le provette da 50 mL con le particelle di cartilagine polverizzato fino ad un volume di circa 7,5 mL per tubo.
-
Incubare le particelle di cartilagine con la soluzione preparata digestione a 37 ° C per 24 h in totale, durante l'aggiornamento la soluzione di digestione ogni 4 h.
- In primo luogo, aggiungere 30 mL di soluzione di digestione per ogni provetta da 50 mL contenente particelle di cartilagine.
- Quindi, risospendere le particelle utilizzando un vortice o una pipetta in modo che tutte le particelle sono esposti a soluzione enzimatica.
- Incubare i campioni per 4 h a 37 ° C su un rullo.
- Per aggiornare la soluzione di digestione, centrifugare le provette per 20 min a 3113 x g per provocare la sedimentazione delle particelle di cartilagine. Scartare il surnatante.
Nota: Il surnatante diventerà più chiaro con ogni periodo di incubazione di tripsina. - Ripetere il passaggio 3.3.1–3.3.4 fino a quando le particelle sono state incubate con la soluzione di digestione per 6 cicli di 4 h.
- Dopo l'ultimo ciclo, rimuovere il supernatante dopo centrifugazione e lavare le particelle in 30 mL di soluzione di lavaggio due volte della cartilagine. Centrifugare le particelle per 20 min a 3113 x g tra ciascuno dei lavaggi.
4. enzimatica decellularizzati con nucleasi trattamento
- Preparare un 10 mM Tris-HCl soluzione a pH 7.5 in acqua deionizzata.
- Aggiungere 50 desossiribonucleasi U/mL e 1 ribonucleasi U/mL al buffer di Tris-HCl, per ottenere la soluzione di nucleasi.
Nota: Questo passaggio viene eseguito per degradare specificamente desossiribonucleasi e ribonucleasi. - Per rimuovere la cartilagine soluzione dalle particelle della cartilagine (punto 3.4) di lavaggio, centrifuga per 20 min a 3.113 x ge rimuovere il surnatante.
- Aggiungere 30 mL di soluzione di nucleasi le particelle di cartilagine e mescolare le particelle attraverso la soluzione, assicurandosi che tutte le particelle sono esposti alla soluzione di nucleasi.
- Incubare i campioni su un rullo per 4 h a 37 ° C.
- Rimuovere la soluzione di nucleasi mediante centrifugazione le particelle di cartilagine per 20 min a 3.113 x g e scartare il surnatante.
- Lavare i campioni con l'aggiunta di 30 mL di 10 mM Tris-HCl soluzione senza la desossiribonucleasi e ribonucleasi alle particelle di cartilagine. Risospendere le particelle e lasciare i campioni su un rullo per 20 h a temperatura ambiente.
5. detergente decellularizzazione
- Rendere la soluzione detergente sciogliendo 1% (v/v) octoxynol-1 in PBS.
- Rimuovere la soluzione di Tris-HCl dalle particelle di cartilagine di centrifugazione per 20 min a 3.113 x g e scartare il surnatante.
- Aggiungere 30 mL di soluzione detergente preparata 1% per le particelle di cartilagine. Risospendere le particelle di cartilagine delicatamente per evitare la formazione di schiuma della soluzione.
Nota: Questo passaggio si rompe le membrane cellulari. - Incubare i campioni su un rullo per 24 h a temperatura ambiente su un rullo.
- Rimuovere la soluzione detergente mediante centrifugazione per 20 min a 3.113 x g e scartare il surnatante.
-
Per rimuovere tutti i resti delle soluzioni decellularizzazione, lavare le particelle di cartilagine in 6 cicli di 8 h in 30 mL di soluzione di lavaggio della cartilagine. Eseguire lavaggio su un rullo a temperatura ambiente.
- Per modificare il lavaggio successivo, centrifugare la sospensione per 20 min a 3.113 x g, scartare il surnatante e aggiungere cartilagine fresca soluzione di lavaggio.
- Lasciare l'ultimo lavaggio nei tubi e memorizzare le particelle di cartilagine decellularizzati a-80 ° C.
6. creazione di ponteggi dalle particelle decellularizzate
- Se le particelle sono state conservate a-80 ° C, scongelare i tubi chiusi che contengono le particelle di cartilagine in acqua calda prima di creare i ponteggi.
- Trasferire le particelle di cartilagine con un piccolo mestolo in uno stampo cilindrico, ad esempio, un flaconcino di plastica con un diametro di 8 mm e un'altezza di 2 cm.
- Quando si posizionano le particelle di cartilagine nello stampo plastica, premere le bolle d'aria-fuori per evitare di cavità sul patibolo e riempire lo stampo fino al bordo.
Nota: Sarà più difficile prendere i ponteggi fuori uno stampo di metallo dopo la formazione dell'impalcatura, che può portare a crepe nell'impalcatura. - Congelare gli stampi con particelle di cartilagine per 10 min a-20 ° C.
- Lyophilize i ponteggi di cartilagine all'interno di loro stampi per 24 h in un congelamento essiccatore.
- Dopo liofilizzazione, prendere l'impalcatura fuori dallo stampo (Figura 3) e loro legame incrociato con ultravioletto (UV) luce a distanza di 30 cm e 365 nm durante la notte.
- Per poter utilizzare i ponteggi per la coltura cellulare in vitro o in vivo dell'impianto, sterilizzare le impalcature con, ad esempio, di etilene ossido (EtO).
Nota: La Sterilizzazione EtO è eseguita da una parte esterna.
7. caratterizzazione delle impalcature decellularizzate con colorazioni istologiche
Nota: Per garantire la completa decellularizzazione e di visualizzare il carattere naturale rimanente della cartilagine, eseguire stainings istologici diversi prima di utilizzare i ponteggi in qualsiasi esperimento, compresi ematossilina ed eosina (H & E) colorazione per garantire decellularizzazione, Safranina-O macchiatura per visualizzare presenza residua di GAG, collagene di tipo I immunohistochemistry per distinguere tra il contenuto di collagene e collagene tipo II immunohistochemistry per distinguere tra il contenuto di collagene.
- Tagliare i ponteggi a fettine di circa 3 mm con un bisturi.
Nota: Se i ponteggi sono tagliati in dimensioni più grandi o più piccole, le durate dei cicli di disidratazione devono essere adattati. - Incorporare i ponteggi in un calo del 4% (p/v) alginato e indurre il cross-linking aggiungendo un simile volume di formalina tamponata non 3,7% che contiene 20 mM CaCl2.
Nota: Incorporamento di alginato rende le fette di impalcature e più rigido rispetto alla procedura di lavaggio prima dell'inclusione in paraffina. Nel caso che i ponteggi sono cellula-seminato o in vivo impiantato, alginato incorporamento non è necessario, come la composizione di impalcature sarà abbastanza resistente a causa di incorporazione di ECM da parte delle cellule. - Disidratare i campioni da inserendoli in una serie di etanolo graduato, a partire con un'ora cicli del 70%, 96%, etanolo 96%, 100% e 100%, seguiti da due cicli di 1h di xilene e termina con due cicli di 1h di paraffina a 60 ° C.
- Dopo la disidratazione, paraffina-incorporare i campioni in uno stampo e raffreddare i campioni.
- Tagliare i campioni con un microtomo a fette spesse di 5 μm.
- Prima della colorazione, reidratare i campioni ponendoli in una serie di etanolo graduato restituito. Iniziare con due lavaggi di xilene per 5 min, seguita da 2 lavaggi di etanolo 100%, 95% e 70% per 3 min a lavaggio. Infine, lavare i campioni 3 volte in acqua per 2 min.
Nota: In caso di utilizzo di alginato per processare i campioni per inclusione a paraffina, assicuratevi di lavare via l'alginato con acido citrico 10 mM prima della reidratazione delle sezioni di paraffina. - Macchiare i campioni con ematossilina ed eosina, Safranina-O, collagene I ed il collagene II come precedente descritto11.
8. caratterizzazione delle impalcature decellularizzate con analisi Quantitative
- Ottenere il digest di papaina delle impalcature come descritto in precedenza11.
- Eseguire un test con un kit di quantificazione del DNA fluorescenza-basata per misurare il contenuto di DNA double-strand di impalcature per garantire completa decellularizzati. Seguire il protocollo fornito dal produttore. Esprimere la quantità di DNA per peso a secco dell'impalcatura.
- Eseguire un'analisi di metilmetilene blu per quantificare il resto delle gag all'interno il patibolo, come descritto in precedenza11. Esprimere la quantità in GAG al DNA.
9. semina la chiodatura decellularizzati
- Tagliare scaffold sterilizzati dal passaggio 6.7 in 3mm fette spesse.
- Trasferire le impalcature in pozzetti separati di una piastra a 6 pozzetti.
- Reidratare impalcature con mezzo di coltura cellulare di pipettaggio 1 mL di terreno in cima al patibolo e lasciare in ammollo per 30 min. utilizzare chondrocyte o medio di espansione delle cellule staminali mesenchimali (MSC).
Nota: Utilizzare lo stesso mezzo per reidratazione dell'impalcatura per quanto riguarda la coltura delle cellule delle cellule che verrà effettuato il seeding. Medio di espansione di condrociti è costituito da supporti di Dulbecco modificati (DMEM) con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 10 ng/mL del fibroblasto (FGF-2) fattore di crescita-2. Medio di espansione di MSC è costituito da minimo essenziale medio alfa (a-MEM) con 10% calore-inattivati FBS, 0,2 mM 2-fosfato dell'acido L-ascorbico, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 10 ng/mL FGF-2. - Preparare 3 x 106 cellule in 100 μL di mezzo, che è il volume richiesto per ogni ponteggio con un diametro di 8 mm e un'altezza di 3 mm.
Nota: Più tipi di cellule appartenenti a specie diverse possono essere utilizzati per la semina. Quando si utilizza condrociti o cellule stromali mesenchimali, isolare le celle come descritto in precedenza11. Quando si utilizza condrociti, assicurarsi che essi sono stati espansi non passato il passaggio P1 al fine di ridurre al minimo il numero dei chondrocytes dedifferentiated. Quando si utilizza cellule stromali mesenchimali, essi devono essere testati sulla loro capacità per differenziazione multi-lignaggio, come descritto in precedenza14. - Pipettare 50 μL di sospensione cellulare in cima al patibolo pre-impregnato di preparato e incubare il patibolo per 1h a 37 ° C.
- Attentamente girare il patibolo testa in giù, dispensare il restante 50 µ l di sospensione cellulare su questo lato dell'impalcatura e incubare per 1h a 37 ° C.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 3 mL di mezzo di pozzetti e cultura i ponteggi cella-seminato a 37 ° C. Gestire la piastra di coltura con delicatezza per evitare il distacco delle cellule.
- I ponteggi della cultura per il periodo di tempo necessario per l'esperimento e cambiare il mezzo di 2 – 3 volte a settimana. Pipettare lentamente e quanto lontano dal patibolo come possibile.
- Dopo la coltura dell'impalcatura delle cellule seminate, tagliare i ponteggi a metà ed elaborarli per istologia e analisi biochimiche.
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Representative Results
Decellularizzazione di CDM ponteggi dovrà sempre essere confermati utilizzando stainings istologici, nonché mediante la quantificazione del DNA per misurare la quantità di resti di DNA. Decellularizzazione insufficiente potrebbe portare a risposte immunologiche indesiderate che influenzano i risultati in vivo in impostazioni15,16,17. Per questo metodo di decellularizzazione specifici, DNA era sotto la gamma di rilevazione, che ha iniziato a 13,6 ± 2.3 ng/mg DNA/a secco peso (n = 3). Completo decellularizzazione usando questo protocollo porterà alla produzione di un ponteggio che è ricco di collagene di tipo II (Figura 4) e non ha cellule (Figura 4A) o gag (Figura 4B). Cartilagine sana equina viene visualizzata come confronto, macchiato per Safranina-O (Figura 5A) e collagene II (figura 5B).
Il ponteggio deve visualizzare una porosità macroscopicamente omogenea. Bolle d'aria porterà a fori grandi facilmente rilevabili nell'impalcatura e sono, quindi, accuratamente rimosso. Questi fori di grande impalcatura possono avere un impatto negativo sulle proprietà meccaniche e portare a collegamento non omogeneo delle cellule al momento della semina. Produzione di successo dell'impalcatura comporta anche un passaggio di liofilizzazione durano per almeno 24 h; Questo porterà ad un ponteggio che ha un aspetto bianco (Figura 3). In caso di insufficiente liofilizzazione, l'impalcature avrà un colore giallastro e pori chiari non possono essere osservati.
In ordine per il patibolo essere utilizzato per in vivo applicazioni e in vitro delle cellule-semina, integrazione di cella con il patibolo, come pure la funzionalità cellulare, deve essere indicata. Qui, la impalcature sono state seminate con MSCs che prodotto ECM dopo 4 (Figura 6A-D) e 6 (Figura 6E-H) settimane di coltura in vitro. Formazione di GAG, collagene II e un collagene periferico, come pure la presenza di cellule, è stata mostrata. Inoltre, la specificità del collagene II viene visualizzata in figura 5B, dove cartilagine ma non osso è macchiato il positivo per il collagene II in una spina osteocondrali.
Figura 1: Equine ginocchio dopo la rimozione di pieno-spessore cartilagine. La cartilagine viene rimosso dai condili usando un bisturi fino a raggiunta lo strato di cartilagine calcificata che non può essere tagliato con un bisturi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: passaggi sequenziali nella creazione di decellularized particelle derivate cartilagine matrice. (A) cartilagine fette che sono stati rimossi dai condili sono lavate in una soluzione di antibiotico-infuso. (B) cartilagine fette sono liofilizzati e ora hanno un aspetto bianco e simile alla carta. (C) Snap-congelamento della cartilagine liofilizzata è eseguita subito prima (D) particelle di cartilagine polverizzazione di mano-fresatura con un mortaio e un pestello. Passo D può anche essere fatto con fresatura automatica. Questa figura è stata modificata da Benders et al.11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: il prodotto finale, un'impalcatura di matrice della cartilagine-derivato decellularizzati. Questa impalcatura cilindrica è 2 cm di altezza e ha un diametro di 8 mm. L'impalcatura ha una struttura chiara porosa. L'immagine di sinistra e destra visualizzare un'impalcatura da due angolazioni diverse. Si noti che nessun fori di grandi dimensioni sono presenti sulla superficie dell'impalcatura come tutte le bolle di aria sono stati rimossi prima della liofilizzazione. Questa figura è stata modificata da Benders et al.11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: caratterizzazione istologica dello scaffold. (A) H & E macchiatura spettacoli ECM particelle di diverse dimensioni e l'assenza di cellule. (B) Safranina O macchiatura dimostra che nessuna gag sono state mantenute nel processo di decellularizzazione. (C) del collagene tipo II immunolocalizzazione rivela che le particelle decellularizzate sono ricche di collagene di tipo II. Scala bar = 500 µm. Questa figura è stata modificata da Benders et al.11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: rappresentazione istologica di cartilagine sana equina. (A) un osteochondral spina macchiata con safranina-O e Fast Green osso spettacoli senza gag (verde), cartilagine con gag (rosso) e lo strato di cartilagine calcificata in mezzo. (B) una spina di collagene osteocondrali II-macchiato macchie di cartilagine ma non osso. Scala bar = 500 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6: formazione di Neo-matrix sul patibolo dopo 4 e 6 settimane di cultura utilizzando cellule stromali mesenchimali. Dopo 4 (A-D) e 6 (E-H) settimane della cultura, matrice formata di recente è ricco di cellule (A + E), collagene II (B + F) e gag (C + G), come si può osservare con H & E, collagene II e gli stainings Safranina-O, rispettivamente. Inoltre, collagene I è presente dopo 6 settimane (H) e 4 (D) nella periferia dell'impalcatura. Densità delle cellule come pure la quantità di deposizione di matrice è superiore alla periferia. Scala bar = 500 µm. Questa figura è stata modificata da piegatrici et al.11. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La ECM della cartilagine articolare è molto denso e abbastanza resistente a diversi trattamenti enzimatici. Il protocollo di decellularizzazione multi-passaggio descritto in questo articolo risolve tale resistenza e con successo genera matrici decellularizzate. Per raggiungere questo obiettivo, il processo si estende sopra parecchi giorni. Molti processi di decellularizzazione sono stati proposti per i diversi tipi di tessuti18, e in questo articolo viene descritto un protocollo adatto per decellularizzazione di cartilagine. In questo protocollo, è, tuttavia, necessario seguire il trattamento enzimatico con i detergenti passi al fine di rimuovere tutte le cellule. La quantità di DNA è diminuita notevolmente nei primi passi che coinvolgono il trattamento con tripsina, e lasciando fuori questi passaggi non si tradurrà in corretto decellularizzazione11.
Si noti che questo protocollo è basato su decellularizzazione di tessuto cartilagineo equina. L'attività di soluzioni enzimatiche utilizzato è stato trovato sufficiente per la rimozione adeguata dei condrociti equini. Tuttavia, nonostante la conservazione della composizione matrice tra le specie, il protocollo potrebbe essere necessario essere regolata per decellularizzazione di cartilagine da altri animali a causa delle differenze nella quantità naturalmente che risiedono nei condrociti19. Ad esempio, cartilagine di piccoli animali è noto per avere un contenuto più elevato di cellule e può, pertanto, richiedono un processo di decellularizzazione più aggressivo. Una particolare ragione per la scelta della cartilagine equina per creare impalcature decellularizzate è quella somiglianza di chiara Visualizza cartilagine equina e umana in spessore, densità cellulare e biochimico make-up20.
Per garantire un prodotto riproducibile, diversi criteri di valutazione possono essere importanti determinare se decellularizzazione completo è stato raggiunto. In questo protocollo, un H & E colorazione e alla quantificazione biochimici sono stati usati per valutare la quantità residua di DNA nel prodotto finale. Altri ricercatori hanno anche proposto determinare le dimensioni del DNA rimanente, con un massimo di 200 bp in lunghezza per una qualità di controllo21, o una quantità di DNA residua di meno di 50 ng/mg a secco tessuto peso18,22. Indipendentemente da ciò, alterazioni del protocollo devono sempre essere continuate con la valutazione istologica e analisi quantitative per determinare l'effetto di decellularizzazione, come pure i restanti prodotti ECM.
Il limite principale di questo protocollo è che, la procedura di decellularizzazione approfondita che comportano l'esposizione a tripsina conduce a vasta perdita di gag. Anche se tripsina non cleave gag, la ragione per la perdita di gag possa spettare l'apertura del tessuto cartilagineo da tripsina proteine che ancorano o incapsulano gag di sfaldatura. Componenti della ECM come gag sono importanti per trattenere l'acqua nella cartilagine articolare e quindi un ruolo significativo nella resilienza biomeccanica del tessuto4. Protocolli che mirano a ridurre la perdita di gag durante tutto il processo di decellularizzazione influenzerà l'accuratezza del processo di decellularizzazione.
Dopo decellularizzazione, funzione e l'integrazione delle cellule sono stati indicati in cella-seminato impalcature. La ricerca precedente ha indicato che la produzione di matrice di condrociti su questa impalcatura è insoddisfacente, soprattutto se confrontato con la deposizione di matrice abbondante di cellule stromali mesenchimali11. Come cartilagine-come il tessuto viene depositato sul patibolo, questa nuova matrice generalmente è depositata in primo luogo nella periferia dell'impalcatura prima di invadere il resto delle impalcature. Questo può essere osservato chiaramente sulle sezioni istologiche di dove una cellula-ricca periferia, piuttosto che un centro di cellula-ricco, è spesso visto (Figura 6). Tuttavia, questo effetto può essere ridotto quando si utilizza bioreattori a perfusione per semina cellulare e per rendere lo scambio dei nutrienti. Deposizione di matrice si verifica, l'impalcature considererà anche un aspetto più lucido, diventando più meccanicamente coerenti e meno fragile. Come tali, possono essere facilmente tagliati usando un bisturi senza cadendo a pezzi. Le proprietà della matrice formata di recente possono essere valutate utilizzando sia gli stainings istologici e analisi quantitative. Come nessuna gag sono a sinistra dopo il processo di decellularizzazione, tutte le gag che possono essere misurate quantitativamente sarà un prodotto di neosintesi.
I ponteggi prodotti usando questo protocollo di decellularizzazione forniscono una soluzione disponibile immediatamente e possono essere impiantati senza la necessità di cella-semina prima dell'impianto. Tuttavia, quando applicato come trattamento per difetti cartilaginei (osteo), dovrà essere migliorato per diminuire la possibilità di rientro del costrutto nelle prime fasi di carico articolare le proprietà biomeccaniche. Co-impianto con strati protettivi sulla parte superiore, o altre strategie di rinforzo potrebbe essere necessario essere implementato. In futuro, raffinatezza del protocollo può migliorare ulteriormente il potenziale rigenerativo dell'impalcatura. Per esempio, la ritenzione di gag, la preservazione dell'orientamento delle fibre collagene, o la combinazione con altri biomateriali a rafforzare queste impalcature può essere utile per consentire una superficie articolare migliorata e senza intoppi rigenerata. Di conseguenza, queste impalcature possono svolgere un ruolo come componenti della prossima generazione di innesti rigenerativi per il trattamento di difetti cartilaginei (osteo).
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Gli autori desidera ringraziare W. Boot per assistenza nella produzione di impalcature. K.E.M. curvatubi è supportato dall'Alexandre Suerman Stipendium da University Medical Center. R. Levato e J. Malda sono supportati dalla olandese Arthritis Foundation (concedere accordi CO-14-1-001 e LLP-12, rispettivamente).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
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