Summary
Decellularized kraakbeen afkomstige steigers kunnen worden gebruikt als een steiger aan gids kraakbeen reparatie en als een middel om te regenereren osteochondraal weefsel. Deze paper beschrijft het proces van de decellularization in detail en biedt suggesties voor deze steigers in in vitro-instellingen.
Abstract
Osteochondrale gebreken gebrek aan voldoende intrinsieke reparatie capaciteit om te regenereren functioneel gezonde been en kraakbeen weefsel. In zoverre heeft kraakbeen onderzoek gericht op de ontwikkeling van regeneratieve steigers. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van steigers die volledig zijn afgeleid van de extracellulaire matrix natuurlijke kraakbeen, afkomstig uit een paarden donor. Mogelijke toepassingen van de steigers omvatten allografts voor kraakbeen reparatie, bijeenkomen van een steiger voor osteochondraal weefsel engineering en het bieden van in vitro modellen om te bestuderen van de vorming van het weefsel te produceren. Decellularizing van het weefsel, de donor cellen worden verwijderd, maar veel van de natuurlijke bioactieve signalen zijn gedacht te worden bewaard. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van dergelijke een natuurlijke steiger in vergelijking met een synthetisch geproduceerde steiger is dat geen verdere functionalization van polymeren nodig om de schijf osteochondraal weefselregeneratie is. De steigers kraakbeen afkomstige matrix kunnen worden gebruikt voor de botten en het kraakbeen weefselregeneratie in zowel in vivo en in vitro-instellingen.
Introduction
Defecten van de articulaire kraakbeen in de knie veroorzaakt door traumatische gebeurtenissen kunnen leiden tot ongemak, en vooral een grote invloed kunnen hebben op het leven van de jonge en actieve bevolking1,2,3. Bovendien kan kraakbeenletsels op jonge leeftijd leiden tot een snellere begin van artrose verderop in leven4. Momenteel is de enige berging therapie voor veralgemeende artrose van de knie gewrichtsprothese chirurgie. Kraakbeen is een hypocellular, aneuraal en avasculaire weefsel, is haar regeneratief vermogen zeer beperkt. Daarom, regeneratieve geneeskunde benaderingen zijn gewild om te helpen en stimuleren van het regeneratieve vermogen van het oorspronkelijke weefsel. Voor dit doel, worden steigers ontworpen en gebruikt als ofwel een cel-carrier of als een inductieve materiaal dat aanzet differentiatie en regeneratie van weefsels tot door5inheemse cellen van het lichaam.
Decellularized steigers zijn binnen de regeneratieve geneeskunde6algemeen bestudeerd. Het heeft enig succes, bijvoorbeeld in de hulp aan het herstel van de huid7, abdominale structuren8en9van de pezen. Het voordeel van het gebruik van decellularized steigers is hun natuurlijke oorsprong en hun capaciteit voor het behouden van bioactieve signalen die zowel aantrekken en induceren van celdifferentiatie in de juiste geslacht nodig voor weefsel reparatie6,10. Bovendien, aangezien extracellulaire matrix (ECM) een natuurlijke biomaterial is, en decellularization wordt voorkomen een potentiële immuunrespons dat door het verwijderen van cellulaire of genetische inhoud, kwesties met betrekking tot de biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid worden overwonnen.
Kraakbeen afkomstige matrix (CDM) steigers hebben aangetoond grote chondrogenic potentieel in in vitro experimenten wanneer met mesenchymale stromale cellen11agarvoedingsbodem. Bovendien, deze steigers is gebleken de potentie om vorm botweefsel via endochondral ossificatie op ectopische locaties in in vivo instellingen12. CDM steigers begeleiden de vorming van zowel bot en kraakbeen weefsel, deze steigers kunnen houden potentiële voor osteochondraal defect reparatie naast kraakbeen reparatie.
Dit artikel beschrijft een protocol aangepast vanaf Yang et al. (2010),13 voor de productie van decellularized CDM steigers van paarden verstikken kraakbeen. Deze steigers zijn rijk in collageen type II en verstoken van cellen, en bevatten geen elke glycosaminoglycanen (GAGs) na decellularization. Zowel in vitro en in vivo experimenten op (osteo) chondrale gebrek reparatie kunnen plaatsvinden met behulp van deze steigers.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Voor dit protocol, is paarden verstikken kraakbeen verkregen uit paarden die was overleden aan andere oorzaken dan artrose. Weefsel werd verkregen met toestemming van de eigenaars, in overeenstemming met de institutionele ethische regels.
Opmerking: Dit protocol beschrijft de fabricage van steigers van decellularized paarden kraakbeen, die kan worden gebruikt voor toepassingen zoals in vitro weefselkweek platforms of voor in vivo inplanting in de regeneratieve geneeskunde strategieën. De enzymatische behandeling stappen moeten worden uitgevoerd in de beschreven volgorde.
1. verzamelen van articulair kraakbeen van Donor (dode foetussen) gewrichten
- Komende van de oogsten stap, bereiden 1 L van kraakbeen wassen oplossing, bestaande uit steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, en 1% (v/v) amfotericine-B.
- Draag handschoenen en een laboratoriumjas gedurende de gehele oogst procedure, aangezien de donor kan ziekteverwekkers dragen.
- Het verkrijgen van een intact (dode foetussen) gezamenlijke voor kraakbeen isolatie.
Opmerking: Op dit punt, is de huid rond het gewricht nog steeds intact. Paarden verstikken kraakbeen verkregen paard werd gebruikt in dit protocol, maar andere gewrichten van andere diersoorten kunnen ook worden gebruikt. - Verwijder de huid die met behulp van een scalpel en een chirurgische pincetten is gelegen rond het gemeenschappelijke gebied van belang. Daarnaast overmatig vet en spiermassa weefsel, indien nodig, te verwijderen zonder beschadiging van het onderliggende gewricht. Optioneel, het bereid stoffelijk overschot naar een biologische veiligheidskast overbrengen.
- Voor het uitvoeren van een arthrotomy, dat wil zeggen, een scheiding van het gewricht, eerst definiëren de locatie waar het gewricht articuleert door het uitvoeren van extensie en flexie van het gewricht.
- Verwijder voorzichtig meer lagen van vet, spieren en pezen met een scalpel en chirurgische pincetten openstelling van de gemeenschappelijke ruimte.
- Het maken van een sneetje te bereiken van de gezamenlijke holte.
Opmerking: De gezamenlijke holte gevuld met gewrichtsvocht, die uit de holte druppelen kan bij het uitvoeren van een juiste snede. - Blijven openstellen van het gewricht volledig door doorsnijden de pezen die het gewricht bij elkaar houden.
- Inspecteer het kraakbeen voor macroscopische schade.
Opmerking: Als het articulaire kraakbeen geen een glanzend en glad uiterlijk heeft of als duidelijk blaren, kloven, of gebreken aanwezig zijn, gooi het kraakbeen. - Gebruik een steriel scalpel te verwijderen van het kraakbeen van het subchondrale bot. Snijden helemaal tot in het subchondrale bot ook verwijderen van de diepe zone van het kraakbeen (Figuur 1). Om te verhinderen dat het kraakbeen uitdrogen, regelmatig druppelen kraakbeen wassen oplossing op het kraakbeen.
Opmerking: Op dit moment, de grootte van de segmenten van het kraakbeen maakt niet uit. - Het verzamelen van de segmenten van het kraakbeen in 50 mL tubes met eerder bereid kraakbeen wassen oplossing (figuur 2A).
- Na het verzamelen van het kraakbeen van alle gebieden van belang, bevriezen module plakjes van het kraakbeen in vloeibare stikstof gedurende 5 minuten.
- Breng de segmenten van het kraakbeen in 50 mL tubes en onmiddellijk lyophilize de plakjes kraakbeen gedurende 24 uur in een bevriezing van de droger. Stel de bevriezing droger op ongeveer 0.090 mbar, terwijl de ijs-condensor-51 ° C (figuur 2B is).
- De segmenten van het kraakbeen bewaren op een droge plaats bij kamertemperatuur tot verder gebruik.
Opmerking: Tot aan het punt van de formatie van de steiger, de oplossingen en kraakbeen hoeven niet te worden voorbereid en behandeld in een steriele manier.
2. het creëren van Decellularized kraakbeen deeltjes
- Borrelend gelyofiliseerd kraakbeen segmenten van vloeibare stikstof.
- Direct slijpen de monsters, hetzij handmatig, hetzij door een freesmachine. Wanneer het kraakbeen segmenten met de hand slijpen, gebruik een mortier en een stamper en slijpen van de segmenten voor ongeveer 45 min totdat zij verpulverde (figuur 2C en 2D). Wanneer automatisch slijpen, gebruik een freesmachine op de vooraf ingestelde snelheid voor een paar seconden tot een minuut, totdat de module-bevroren kraakbeen segmenten zijn verpulverd.
Opmerking: Cool vooraf de mortel of het slijpen compartiment van de freesmachine door toevoeging van vloeibare stikstof. Bij het gebruik van een freesmachine, zorg ervoor dat alle deeltjes zijn grond, en dat geen deeltjes blijven in de bodem van het slijpen compartiment. - Zeef het kraakbeen deeltjes om zich te ontdoen van grotere delen met behulp van een zeef met een maaswijdte van 0.71 mm.
- De deeltjes op een droge plaats bij kamertemperatuur worden opgeslagen.
3. enzymatische Decellularization met trypsine 0.25%-EDTA
- Bereid de oplossing van de spijsvertering, bestaande uit 0,25% trypsine met EDTA aangevuld met 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine, en 1% (v/v) amfotericine B. winkel de oplossing bij 4 ° C.
Opmerking: Trypin is een protease die degradeert eiwitten die woonachtig zijn in het weefsel kraakbeen. Deze enzymatische stap zal openstellen de dichte kraakbeen structuur. - Vul de 50 mL tubes met de verpulverde kraakbeen deeltjes tot een volume van ongeveer 7,5 mL per buis.
-
Incubeer de kraakbeen deeltjes met de oplossing bereid spijsvertering bij 37 ° C gedurende 24 uur in totaal, terwijl de spijsvertering oplossing elke 4 uur vernieuwd.
- Voeg eerst 30 mL van de oplossing van de spijsvertering aan elke 50 mL-buis die kraakbeen deeltjes bevat.
- Vervolgens resuspendeer de deeltjes met een vortex of Pipetteer zodat alle particles worden blootgesteld aan de enzymatische oplossing.
- Incubeer de monsters gedurende 4 uur bij 37 ° C op een roller.
- Centrifugeer als wilt vernieuwen de oplossing van de spijsvertering, de buizen voor 20 min bij 3113 x g tot de bezinking van de deeltjes van het kraakbeen. Verwijder het supernatant.
Opmerking: De bovendrijvende vloeistof zal duidelijker zijn met elke trypsine incubatietijd. - Herhaal stap 3.3.1–3.3.4 tot de deeltjes hebben zijn geïncubeerd met de spijsvertering-oplossing voor 6 cycli van 4 h.
- Na de laatste cyclus, verwijder het supernatant na centrifugeren en wassen van de deeltjes in 30 mL oplossing twee keer wassen kraakbeen. Centrifugeer de deeltjes gedurende 20 minuten bij 3113 x g tussen elk van de wast.
4. enzymatische Decellularization met Nuclease behandeling
- Voorbereiden van een 10 mM Tris-HCl-oplossing bij een pH 7.5 in gedeïoniseerd water.
- Voeg 50 U/mL deoxyribonuclease en 1 U/mL ribonuclease A aan de Tris-HCl-buffer, voor de oplossing van de nuclease.
Opmerking: Deze stap wordt uitgevoerd om te degraderen specifiek deoxyribonucleases en ribonucleasen. - Centrifugeer gedurende 20 min op 3,113 x gals wilt verwijderen van het kraakbeen wassen oplossing van het kraakbeen deeltjes (stap 3.4), en verwijder het supernatant.
- Voeg 30 mL van de oplossing van de nuclease aan het kraakbeen deeltjes en roer de deeltjes door de oplossing, om ervoor te zorgen dat alle deeltjes worden blootgesteld aan de oplossing van de nuclease.
- Incubeer de monsters op een roller voor 4 uur bij 37 ° C.
- Verwijder de nuclease oplossing door centrifugatie van het kraakbeen deeltjes gedurende 20 minuten bij 3,113 x g en verwijder het supernatant.
- Het wassen van de monsters door 30 mL van 10 mM Tris-HCl-oplossing zonder de deoxyribonuclease en ribonuclease A toe te voegen aan het kraakbeen deeltjes. Resuspendeer de deeltjes en laat de monsters op een roller voor 20u bij kamertemperatuur.
5. detergenten Decellularization
- Het schoonmaakmiddel maken door ontbinding van 1% (v/v) octoxynol-1 in PBS.
- De Tris-HCl-oplossing verwijderen door het kraakbeen deeltjes door gedurende 20 minuten bij 3,113 x g centrifugeren en het supernatant te verwijderen.
- Voeg 30 mL van de bereid wasmiddel 1%-oplossing aan het kraakbeen deeltjes. Resuspendeer de kraakbeen deeltjes voorzichtig en voorkom schuimvorming van de oplossing.
Opmerking: Deze stap is breekt van cellulaire membranen. - Incubeer de monsters op een roller gedurende 24 uur bij kamertemperatuur op een roller.
- Het reinigingsmiddel te verwijderen door middel van centrifugeren voor 20 min op 3,113 x g en verwijder het supernatant.
-
Om alle te verwijderen van de overblijfselen van de oplossingen van de decellularization, de deeltjes kraakbeen in 6 cycli van 8u in 30 mL kraakbeen wassen oplossing te wassen. Wassen op een roller bij kamertemperatuur uitvoeren.
- Ga naar de volgende wassen, centrifugeren van de suspensie voor 20 min op 3,113 x g, verwijder het supernatant en toevoegen van verse kraakbeen wassen oplossing.
- Laat de laatste wasbeurt in de buizen en slaan de decellularized kraakbeen deeltjes bij-80 ° C.
6. het maken van steigers van de Decellularized deeltjes
- Als de deeltjes zijn opgeslagen bij-80 ° C, Ontdooi de gesloten buizen die de deeltjes kraakbeen in warm water bevatten voordat u maakt de steigers.
- Het kraakbeen deeltjes met een kleine pollepel overbrengen in een cilindrische mal, bijvoorbeeld een plastic flesje met een diameter van 8 mm en een hoogte van 2 cm.
- Bij het plaatsen van de deeltjes van het kraakbeen in de plastic mal, druk op alle de-luchtbellen uit om te voorkomen dat de holten in de steiger en de mal vullen tot de rand.
Opmerking: Het zal moeilijker te nemen van de steigers uit een metalen mal na steiger formatie, die tot scheuren in de steiger leiden kan. - Bevriezen van de mallen met kraakbeen deeltjes gedurende 10 minuten bij-20 ° C.
- Lyophilize de steigers van kraakbeen binnen hun mallen gedurende 24 uur in een bevriezing van de droger.
- Na lyofilisatie, nemen de steiger uit de mal (Figuur 3) en cross-link hen met ultraviolet (UV) licht op 30 cm afstand en 365 nm's nachts.
- Om te kunnen gebruiken de steigers voor cultuur van de cel in vitro of in vivo implantatie, steriliseren de steigers met, bijvoorbeeld, ethyleen oxide (EtO) gas.
Opmerking: EtO-sterilisatie wordt uitgevoerd door een externe partij.
7. de karakterisering van de Decellularized steigers met histologische technieken
Opmerking: Om ervoor te zorgen volledige decellularization en visualiseren van het resterende natuurlijke karakter van het kraakbeen, verschillende histologische technieken uitvoeren voordat u de steigers in een experiment, met inbegrip van de haematoxyline en eosine (H & E) vlekken om ervoor te zorgen decellularization, Safranine-O vlekken om te visualiseren residuele GAG aanwezigheid, collageen type ik immunohistochemistry om te differentiëren tussen collageen inhoud en collageen type II immunohistochemistry onderscheid maken tussen inhoud van collageen.
- Snijd de steigers in dunne plakjes van ongeveer 3 mm met een scalpel.
Opmerking: Als de steigers worden gesneden in grotere of kleinere maten, de totale duur van de uitdroging cycli moeten worden aangepast. - De steigers insluiten in een daling van 4% (m/v) alginaat en veroorzaken cross-linking door toevoeging van een vergelijkbaar volume van 3,7% niet-gebufferde formaline waarin 20 mM CaCl2.
Opmerking: Alginaat insluiten, maakt de steiger segmenten meer rigide in vergelijking met de stappen wassen vóór paraffine insluiten. In geval die de steigers hebben zijn cel geplaatste of in vivo geïmplanteerd, is alginaat insluiten niet nodig, zoals de samenstelling van de steigers bestendig genoeg als gevolg van ECM opneming van informatie door de cellen zullen. - Uitdrogen van de monsters door de plaatsing ervan in een gesorteerde ethanol-serie, beginnen met één uur cycli van 70%, 96%, 96%, 100% en 100% ethanol, gevolgd door twee 1 h cycli van xyleen, en eindigend met twee 1 h cycli van paraffine bij 60 ° C.
- Na uitdroging, paraffine-insluiten de monsters in een mal en de monsters afkoelen.
- De monsters met een microtoom in plakjes van 5 μm dik gesneden.
- Voordat de kleuring, hydrateren de monsters door ze te plaatsen in een reeks van geretourneerde graded ethanol. Begin met twee wasbeurten xyleen gedurende 5 minuten, gevolgd door 2 wasbeurten van 100%, 95% en 70% ethanol voor 3 min per wasbeurt. Tot slot wassen de monsters 3 keer in water gedurende 2 min.
Opmerking: In het geval van het alginaat gebruikt voor het verwerken van monsters voor paraffine insluiten, zorg ervoor dat het alginaat met 10 mM citroenzuur vóór rehydratatie van de paraffine secties afwassen. - Vlekken van de monsters met haematoxyline en eosine, Safranine-O, collageen I, en collageen II als vorige beschreven11.
8. karakterisering van de Decellularized steigers met kwantitatieve Analyses
- Papaïne digests van de steigers zoals eerder beschreven11te verkrijgen.
- Het uitvoeren van een test met een fluorescentie-gebaseerde DNA kwantificering kit voor het meten van de inhoud van de DNA dubbele-onderdeel van de steigers te waarborgen van volledige decellularization. Volg het protocol geleverd door de fabrikant. Express de hoeveelheid DNA per drooggewicht van de steiger.
- Een dimethylmethylene blauw-test om te kwantificeren van de rest van de GAGs binnen de steiger, zoals eerder beschreven11uitvoeren Het bedrag in GAG per DNA Express.
9. het zaaien van de Decellularized steigers
- Gesneden gesteriliseerde steigers uit stap 6.7 in 3 mm dikke sneden.
- Overdracht van de steigers in aparte putjes van de plaat van een 6-well.
- Steigers met cel kweekmedium door pipetting 1 mL medium op de top van de steiger te hydrateren en laat het weken voor 30 min. chondrocyten of mesenchymale stamcellen (MSC) uitbreiding medium gebruiken.
Opmerking: Gebruik hetzelfde medium voor steiger rehydratie voor cultuur van de cel voor de cellen die zal worden ontpit. Chondrocyten uitbreiding medium bestaat uit Dulbecco van gemodificeerde media (DMEM) met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine en 10 ng/mL fibroblast groeifactor-2 (FGF-2). MSC uitbreiding medium bestaat uit minimum essentiële middellange alpha (a-MEM) met 10% warmte-geïnactiveerd FBS, 0,2 mM L-ascorbinezuur zuur 2-fosfaat, 100 U/mL penicilline, 100 μg/mL streptomycine en 10 ng/mL FGF-2. - 3 x 106 cellen in 100 μl van medium, dat is het vereiste volume voor elke steiger met een diameter van 8 mm en een hoogte van 3 mm voor te bereiden.
Opmerking: Meerdere celtypen van verschillende soorten kunnen worden gebruikt voor het zaaien. Wanneer u chondrocyten of mesenchymale stromale cellen, isoleren de cellen als eerder beschreven11. Bij het gebruik van chondrocyten, ervoor te zorgen dat ze niet uitgebreid langs de passage van de P1 om te minimaliseren van het aantal dedifferentiated chondrocyten. Bij het gebruik van mesenchymale stromale cellen, moeten ze worden getest op hun vermogen voor multi lineage differentiatie, als eerder beschreven14. - Pipetteer 50 μL van celsuspensie bovenop de vooraf doorweekt steiger voorbereid en Incubeer het schavot gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Zorgvuldig de steiger ondersteboven neer, Pipetteer de resterende 50 μl van celsuspensie draai aan deze kant van de steiger en incubeer gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Na incubatie, voeg 3 mL medium in de putjes en cultuur van de cel-geplaatste steigers bij 37 ° C. Omgaan met de cultuur plaat zachtjes Voorkom detachement van de cellen.
- Cultuur van de steigers voor de periode die nodig is voor het experiment en wijzig het medium 2 tot 3 keer per week. Pipetteer langzaam en zo ver weg van de steiger mogelijk.
- Na het kweken van de cel-geplaatste steiger, de steigers gesneden in de helft en verwerken voor zowel histologie en biochemische analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decellularization van CDM steigers moet altijd worden bevestigd met behulp van histologische technieken, alsmede met behulp van DNA kwantificering te meten van de hoeveelheid DNA-resten. Onvoldoende decellularization kan leiden tot ongewenste immunologische reacties die invloed hebben op de resultaten van in vivo instellingen15,16,17. Voor deze specifieke decellularization methode, DNA was onder het registratiebereik, die begon op 13.6 ± 2,3 ng/mg DNA/droog gewicht (n = 3). Volledige decellularization met behulp van dit protocol zal leiden tot de productie van een steiger die is rijk aan collageen type II (figuur 4C) en heeft geen cellen (figuur 4A) of GAGs (figuur 4B). Gezonde paarden kraakbeen wordt weergegeven als vergelijking, gekleurd voor Safranine-O (figuur 5A) en collageen II (figuur 5B).
De steiger moet een macroscopisch homogeen porositeit weergeven. Luchtbellen zal leiden tot gemakkelijk aantoonbaar grote gaten in de steiger en zijn, daarom zorgvuldig verwijderd. Deze grote gaten in de steiger kunnen een nadelige invloed hebben op de mechanische eigenschappen en leiden tot inhomogene cel bijlage bij het zaaien. Succesvolle productie van de steiger ook betrekking heeft op een freeze-drying stap gedurende ten minste 24 uur; Dit zal leiden tot een steiger met een wit uiterlijk (Figuur 3). In geval van onvoldoende lyofilisatie, de steigers hebben een gelige kleur en geen duidelijke poriën kunnen worden waargenomen.
Om de steiger moet worden gebruikt voor in-vivo moet-toepassingen en in vitro cel-zaaien, cel integratie met de steiger, evenals de cellulaire functionaliteit, worden vermeld. Hier, steigers waren bezaaid met MSCs die ECM geproduceerd na 4 (Figuur 6A-D) en 6 (figuur 6E-H) weken van het in vitro kweken. Vorming van GAG, collageen II en een perifere collageen ik, evenals de aanwezigheid van cellen, werd getoond. Bovendien, is de specificiteit van collageen II weergegeven in figuur 5B, waar kraakbeen maar niet bot positief voor collageen II in een osteochondrale stekker is gekleurd.
Figuur 1: Equine knie na het verwijderen van de volledige-dikte kraakbeen. Het kraakbeen wordt verwijderd uit de condyles met behulp van een scalpel totdat de kalkhoudend kraakbeen laag die niet kan worden gesneden met behulp van een scalpel is bereikt. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: opeenvolgende stappen in het creëren van decellularized matrix kraakbeen afkomstige deeltjes. (A) kraakbeen segmenten die zijn verwijderd uit de condyles worden gewassen in een antibioticum-geïnfundeerd oplossing. (B) kraakbeen segmenten zijn gelyofiliseerde vorm, en hebben nu een wit papier-achtige uitstraling. (C) module-bevriezing van het gelyofiliseerd kraakbeen is uitgevoerd vlak voor (D) pulverizing kraakbeen deeltjes door hand-frezen met behulp van een mortier en een stamper. Stap D kan ook worden gedaan met automatische frezen. Dit cijfer is gewijzigd van Benders et al.11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: het uiteindelijke product, een decellularized kraakbeen afkomstige matrix steiger. Deze cilindervormige steiger is 2 cm hoog en heeft een diameter van 8 mm. De steiger heeft een duidelijke poreuze structuur. De linker en rechter afbeelding weergegeven op een steiger vanuit twee verschillende hoeken. Merk op dat geen grote gaten aanwezig zijn op het oppervlak van het schavot als alle van de luchtbellen werden verwijderd voordat lyofilisatie. Dit cijfer is gewijzigd van Benders et al.11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: histologische karakterisering van de steiger. (A) H & E kleuring toont ECM deeltjes van verschillende grootte en het ontbreken van cellen. (B) Safranine-O kleuring toont aan dat er geen GAGs hebben gehandhaafd in het decellularization proces. (C) collageen type II immunolocalization blijkt dat de decellularized deeltjes rijk aan collageen type II zijn. Schaal bars = 500 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Benders et al.11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: histologische vertegenwoordiging van gezonde paarden kraakbeen. (A) een osteochondrale plug gekleurd met Safranine-O en snel groen toont been zonder GAGs (groen), kraakbeen met GAGs (rood) en de laag kalkhoudend kraakbeen ertussen. (B) een collageen II gebeitste osteochondrale plug vlekken kraakbeen maar niet bot. Schaal bars = 500 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6: Neo-matrix vorming op het schavot na 4 tot 6 weken van cultuur met behulp van mesenchymale stromale cellen. Na 4 (A-D) en 6 (E-H) weken van cultuur, nieuw gevormde matrix is rijk aan cellen (A + E), collageen II B + F, en GAGs (C + G), zoals kan worden waargenomen met H & E, collageen II en Safranine-O technieken, respectievelijk. Bovendien, collageen ik aanwezig is na 4 (D) en 6 (H) weken in de periferie van de steiger. Celdichtheid, alsmede de hoeveelheid matrix afzetting is hoger in de periferie. Schaal bars = 500 µm. Dit cijfer is gewijzigd van de Benders et al.11. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ECM voor articulair kraakbeen is zeer dicht en heel veerkrachtig voor verschillende enzymatische behandelingen. Het multi-step decellularization-protocol in dit artikel beschreven adressen van dergelijke weerstand en met succes genereert decellularized matrices. Om dat te bereiken, omvat het proces over meerdere dagen. Veel decellularization processen zijn voorgesteld voor verschillende soorten weefsels18, en dit artikel beschrijft een protocol geschikt voor de decellularization van kraakbeen. In dit protocol is het echter noodzakelijk te volgen van de enzymatische behandeling met het detergent stappen om alle cellen te verwijderen. De hoeveelheid DNA is opmerkelijk verminderd in de eerste paar stappen met betrekking tot de behandeling met trypsine en weglaten van deze stappen resulteert niet in de juiste decellularization11.
Merk op dat dit protocol is gebaseerd op de decellularization van equine kraakbeen weefsel. De activiteit van het enzym oplossingen gebruikt bleek voldoende voor de adequate verwijdering van de paarden chondrocyten. Echter, ondanks de instandhouding van de samenstelling van de matrix in soorten, het protocol wellicht worden aangepast voor decellularization van kraakbeen van andere dieren als gevolg van de verschillen in hoeveelheid natuurlijk wonen chondrocyten19. Bijvoorbeeld kraakbeen van kleinere dieren is bekend dat een hogere inhoud van de cel, en, dus, moet u mogelijk een meer agressieve decellularization proces. Een speciale reden voor het kiezen van equine kraakbeen maakt decellularized steigers is dat paarden en menselijk kraakbeen Toon duidelijke gelijkenis in dikte, celdichtheid en biochemische make-up20.
Een reproduceerbare om product te waarborgen, kunnen verschillende beoordelingscriteria zijn belangrijk om te bepalen of de volledige decellularization heeft bereikt. In dit protocol, werden zowel een H & E kleuring en biochemische kwantificering gebruikt voor het evalueren van de overblijvende hoeveelheid DNA in het eindproduct. Andere onderzoekers hebben ook voorgesteld om te bepalen van de grootte van het resterende DNA, met een maximum van 200 bp in lengte voor kwaliteit controle21, of een residuele DNA-bedrag van minder dan 50 ng/mg droog weefsel gewicht18,22. Ongeacht, moeten wijzigingen in het protocol altijd worden gevolgd met de histologische evaluatie en kwantitatieve tests om te bepalen van het effect van decellularization, evenals de overige ECM-producten.
De belangrijkste beperking van dit protocol is dat de grondige decellularization procedure met betrekking tot de blootstelling aan trypsine tot uitgebreide verlies van GAGs leidt. Hoewel trypsine niet GAGs klieven doet, kan de reden voor het verlies van GAGs de opening van het weefsel kraakbeen door trypsine splijten van eiwitten die verankeren of kapselen GAGs worden. ECM componenten zoals GAGs zijn belangrijk voor het behoud van water in articulair kraakbeen, en daarom een belangrijke rol spelen in de biomechanische veerkracht van het weefsel4. Protocollen die gericht zijn op het verminderen van het verlies van GAGs tijdens het decellularization-proces beïnvloedt de grondigheid van het proces van decellularization.
Na decellularization, zijn cel integratie en functie aangetoond in cel-geplaatste steigers. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat matrix productie door chondrocyten op deze steiger is onbevredigend, vooral in vergelijking met de overvloedige matrix afzetting door mesenchymale stromale cellen11. Zoals kraakbeen-achtig weefsel wordt gestort op de steiger, wordt deze nieuwe matrix over het algemeen eerst gestort in de periferie van de steiger voordat ze een invasie van de rest van de steigers. Dit kan duidelijk worden waargenomen op de histologische segmenten waar een cel-rijke periferie, in plaats van een cel-rijke center, vaak is gezien (Figuur 6). Dit effect kan echter worden verminderd bij het gebruik van perfusie bioreactoren voor cel zaaien en aan uitwisseling van voedingsstoffen. Als matrix afzetting optreedt, is de steigers krijgt ook een glanzender verschijning, steeds meer mechanisch consistent en minder breekbaar. Als zodanig, kunnen zij worden gemakkelijk snijden met behulp van een scalpel zonder uit elkaar te vallen. De eigenschappen van de nieuw gevormde matrix kunnen worden geëvalueerd met behulp van zowel histologische technieken en kwantitatieve tests. Geen GAGs zijn verlaten na het decellularization-proces, zullen alle van de GAGs die kwantitatief meetbaar zijn een product van neosynthesis.
De steigers geproduceerd met behulp van dit protocol decellularization zorgen voor een gebruiksklare oplossing en zonder de noodzaak van cel-zaaien vóór implantatie kunnen worden geïmplanteerd. Echter, wanneer toegepast als een behandeling voor (osteo) chondrale gebreken, de biomechanische eigenschappen moet worden verbeterd om te verminderen de kans op inspringing van de constructie in de vroege fasen van articulaire laden. Co implantatie met beschermende lagen op de boven-, of andere versterking strategieën mogelijk moet worden uitgevoerd. In de toekomst kan verdere verfijning van het protocol versterken het regeneratieve potentieel van de steiger. Bijvoorbeeld, de bewaring van GAGs, het behoud van het collageen vezels geaardheid, of de combinatie met andere biomaterialen te versterken deze steigers voordelig kan zijn met het oog op een verbeterde en soepel geregenereerde articulaire oppervlak. Daarom deze steigers kunnen een rol spelen als onderdelen van de volgende generatie van regeneratieve transplantaties voor de behandeling van (osteo) chondrale gebreken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
De auteurs wil erkennen van W. Boot voor hulp bij de productie van de steigers. K.E.M. Benders wordt ondersteund door de Alexandre Suerman Stipendium van het universitair medisch centrum. R. Levato en J. Malda worden ondersteund door de Stichting van de artritis (subsidieovereenkomsten CO-14-1-001 en LLP-12, respectievelijk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cadaveric joint | This can be obtained as rest material from the local butcher or veterinary center. | ||
| Sterile phosphate-buffered saline (PBS) | |||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| Amphotericin B | Thermo Fischer Scientific | 15290026 | |
| Liquid nitrogen | |||
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Thermo Fischer Scientific | 25200072 | |
| Tris-HCl pH 7.5 | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | |
| Triton X-100 (octoxynol-1) | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Papain | Sigma-Aldrich | P3125 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S4641 | |
| Alginate | Sigma-Aldrich | 180947 | |
| Formalin | |||
| CaCl2 | |||
| Ethanol | |||
| Xylene | |||
| Paraffin | |||
| Ethylene oxide sterilization | Synergy Health, Venlo, the Netherlands | ||
| Multipotent Stromal cells/chondrocytes from equine donors | MSCs and chondrocytes can be isolated from donor joints that are rest material, coming from the local butcher or veterinary center. | ||
| MEM alpha | Thermo Fischer Scientific | 22561 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| DMEM | Thermo Fischer Scientific | 41965 | |
| Heat inactivated bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | 10735086001 | |
| Fibroblast growth factor-2 (FGF-2) | R & D Systems | 233-FB | |
| DNA quantification kit (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent) | Thermo Fischer Scientific | P7581 | |
| 1,9-Dimethyl-Methylene Blue zinc chloride double salt | Sigma-Aldrich | 341088 | |
| Freeze-dryer | SALMENKIPP | ALPHA 1-2 LD plus | |
| Analytical mill | IKA | A 11 basic | |
| mortar/pestle | Haldenwanger 55/0A | ||
| Roller plate | CAT | RM5 | |
| Centrifuge (for 50 mL tubes) | Eppendorf | 5810R | |
| Capsule (cylindric mold) | TAAB | 8 mm flat | |
| Superlite S UV | Lumatec | 2001AV | |
| Incubator | |||
| Microtome | |||
| Sieve (mesh size 0.71 mm) | VWR | 34111229 | |
| Scalpel | |||
| Scalpel holder | |||
| Small laddle |
References
- Dunlop, D. D., et al. Risk factors for functional decline in older adults with arthritis. Arthritis and rheumatism. 52 (4), 1274-1282 (2005).
- Fitzpatrick, K., Tokish, J. M. A military perspective to articular cartilage defects. The journal of knee surgery. 24 (3), 159-166 (2011).
- Flanigan, D. C., Harris, J. D., Trinh, T. Q., Siston, R. A., Brophy, R. H. Prevalence of chondral defects in athletes' knees: a systematic review. Medicine and science in sports and exercise. 42 (10), 1795-1801 (2010).
- Martel-Pelletier, J., Boileau, C., Pelletier, J. P., Roughley, P. J. Cartilage in normal and osteoarthritis conditions. Best practice & research. Clinical rheumatology. 22 (2), 351-384 (2008).
- Vinatier, C., et al. Cartilage tissue engineering: towards a biomaterial-assisted mesenchymal stem cell therapy. Current stem cell research & therapy. 4 (4), 318-329 (2009).
- Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J.
- Vashi, C. Clinical Outcomes for Breast Cancer Patients Undergoing Mastectomy and Reconstruction with Use of DermACELL, a Sterile, Room Temperature Acellular Dermal Matrix. Plastic Surgery International. 2014 (704323), 1-7 (2014).
- Satterwhite, T. S., et al. Abdominal wall reconstruction with dual layer cross-linked porcine dermal xenograft: the "Pork Sandwich" herniorraphy. Journal of plastic, reconstructive & aesthetic surgery : JPRAS. 65 (3), 333-341 (2012).
- Martinello, T., et al. Successful recellularization of human tendon scaffolds using adipose-derived mesenchymal stem cells and collagen gel. Journal of tissue engineering and regenerative medicine. 8 (8), 612-619 (2014).
- Benders, K. E., et al. Extracellular matrix scaffolds for cartilage and bone regeneration. Trends in biotechnology. 31 (3), 169-176 (2013).
- Benders, K. E., et al. Multipotent Stromal Cells Outperform Chondrocytes on Cartilage-Derived Matrix Scaffolds. Cartilage. 5 (4), 221-230 (2014).
- Gawlitta, D., et al. Decellularized cartilage-derived matrix as substrate for endochondral bone regeneration. Tissue engineering. Part A. 21 (3-4), 694-703 (2015).
- Yang, Z., et al. Fabrication and repair of cartilage defects with a novel acellular cartilage matrix scaffold. Tissue engineering. Part C, Methods. 16 (5), 865-876 (2010).
- Pittenger, M. F., et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science. 284 (5411), 143-147 (1999).
- Meyer, S. R., et al. Decellularization reduces the immune response to aortic valve allografts in the rat. The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 130 (2), 469-476 (2005).
- Brown, B. N., Valentin, J. E., Stewart-Akers, A. M., McCabe, G. P., Badylak, S. F. Macrophage phenotype and remodeling outcomes in response to biologic scaffolds with and without a cellular component. Biomaterials. 30 (8), 1482-1491 (2009).
- Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
- Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
- Malda, J., et al. Of mice, men and elephants: the relation between articular cartilage thickness and body mass. PloS One. 8 (2), e57683 (2013).
- Malda, J., et al. Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles. Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).
- Gilbert, T. W. Strategies for tissue and organ decellularization. Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).
