Summary
Her vi beskriver en metode for å vurdere lunge uttrykk av miRNAs som er spådd for å regulere inflammatorisk gener bruker mus utsatt for ozon eller filtrert luft på ulike stadier av estrous syklusen.
Abstract
MicroRNA (miRNA) profilering blitt interesse forskerne arbeider i ulike forskningsområder av biologi og medisin. Aktuelle studier viser en lovende fremtid for å bruke miRNAs i diagnostikk og av lungesykdommer. Her definerer vi en protokoll for miRNA profilering for å måle den relative overfloden av en gruppe miRNAs spådd for å regulere inflammatorisk gener i lungevev fra et ozon-indusert airway betennelse mus modell. Fordi det har vist at sirkulerende sex hormonnivået kan påvirke regulering av lunge medfødt immunitet hos kvinner, er formålet med denne metoden å beskrive en inflammatorisk miRNA profilering protokollen i kvinnelige mus, hensyntatt estrous syklusen scenen av hvert dyr samtidig med ozon eksponering. Vi også ta gjeldende bioinformatikk tilnærminger til miRNA oppdagelse og målet identifikasjonsmetoder benytter limma, en R/Bioconductor programvare, og funksjonell analyseprogramvare å forstå biologisk sammenheng og veier knyttet differensial miRNA uttrykk.
Introduction
microRNAs (miRNAs) er kort (19 til 25 nukleotider), naturlig forekommende, ikke-koding RNA molekyler. Sekvenser av miRNAs er evolusjonære bevart over arter, tyder betydningen av miRNAs i å regulere fysiologiske funksjoner1. microRNA expression profilering har vist seg for å være nyttig for å identifisere miRNAs som er viktige i regulering av en rekke prosesser, inkludert immunforsvar, celledifferensiering, utviklingsprosesser og apoptose2. Nyligere har miRNAs blitt anerkjent for deres mulige bruk i sykdom diagnostikk og therapeutics. For forskere studere mekanismer av genet, kan måle miRNA uttrykk opplyse systemer nivå modeller av regulatoriske prosesser, spesielt når miRNA informasjonen flettes med mRNA profilering og andre genomet-skalaen data3. På den annen side, miRNAs har også vist seg å være mer stabilt enn mRNAs i en rekke prøven typer og er også målbar med større følsomhet enn proteiner4. Dette har ført til betydelig interesse for utvikling av miRNAs som biomarkers for ulike molekylær diagnostiske programmer, inkludert lungesykdommer.
I lungene spille miRNAs viktige roller i utviklingsprosesser og vedlikehold av homeostase. Videre har deres unormale uttrykk vært knyttet til utvikling og progresjon av ulike lungesykdommer5. Inflammatorisk lungesykdommer forårsaket av luftforurensning har vist større alvorlighetsgrad og dårligere prognose i kvinner, som indikerer at hormoner og estrous syklusen kan regulere lunge medfødt immunitet og miRNA uttrykk i reaksjoner på miljørelaterte utfordringer 6. i denne protokollen, bruker vi ozon eksponering, som er en viktig komponent av luftforurensning, for å indusere en form for lungebetennelse i kvinnelige mus som oppstår i fravær av adaptiv immunitet. Ved hjelp av ozon, er vi indusere utviklingen av luftveiene hyperresponsiveness som er tilknyttet airway epithelial celleskader og en økning i nøytrofile og inflammatoriske mediatorer i proksimale airways7. Foreløpig er det ikke godt beskrevet protokoller for å karakterisere og analysere miRNAs over estrous syklusen i ozon-eksponerte mus.
Nedenfor beskriver vi en enkel metode for å identifisere estrous syklus faser og miRNA uttrykk i lungevev av kvinnelige mus utsatt for ozon. Vi også ta effektive bioinformatikk tilnærminger til miRNA oppdagelsen og target identifikasjon, med vekt på beregningsorientert biologi. Vi analyserer microarray dataene med limma, en R/Bioconductor programvare som tilbyr en integrert løsning for å analysere data gen uttrykk eksperimenter8. Analyse av PCR matrisedata fra limma har en fordel i forhold til makt over t-test basert prosedyrer når bruk av matriser/prøver for å sammenligne uttrykk. For å forstå biologisk sammenheng med miRNA uttrykk resultater, brukt vi så funksjonell analyseprogramvare. For å forstå mekanismene regulere transcriptional endringer og forutse sannsynlig utfall, kombinerer programvaren miRNA uttrykk datasett og kunnskap fra litteratur9. Dette er en fordel når sammenlignet med programvare som bare se for statistiske berikelse i overlappende til sett med miRNAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Penn State University.
1. vurdering av Estrous syklus scenen
- Skal holde en kvinnelig C57BL/6 mus (8 – 9 uker gamle) bruker én hånd musen tilbakeholdenhet teknikken beskrevet i Machholz et al.10.
- Fyll den sterile plastikk pipe med 10 μL ultra rent vann.
- Innføre spissen av plastikk pipe i skjeden.
- Forsiktig flush væsken 4-5 ganger å samle prøven.
- Plass siste flush med vaginal væske på et glass lysbilde.
- Observere unstained kvinne vaginal flush under lys mikroskop med en 20 x mål.
Merk: Dyr som ikke viser vanlige sykluser på grunn av pseudopregnancy eller andre årsaker må utelates fra eksperimentet. Det anbefales å utføre daglige vaginale sekreter for minst tre påfølgende sykluser å bekrefte cyclicity.
2. eksponering for ozon
- Sett maksimum 4 mus i to 1,2 L Glassbeholdere med ledning maske lokk og vann ad lib.
- Sette en glassbeholder i ozon kammeret og den andre i filtrert luft eksponering kammeret.
- Justere ozon konsentrasjonen for 2 ppm og overvåke ozonnivåer regelmessig.
Merk: Ozon apparatet leverer en regulert luftstrømmen (> 30 luft endringer/h) med kontrollert temperatur (25 ° C) og relativ luftfuktighet (50%). Systemet genererer ozon med en elektrisk utladning ozonizer, som er overvåket og kontrollert av en ultrafiolett ozon analyserer og masse flow kontrollere, som beskrevet tidligere11. - Fjerne Glassbeholdere etter 3t ozon/filtrert luft eksponering. Returnere dyr bur med sengetøy, mat og vann ad lib.
3. lunge samling
- 4 h etter eksponering, bedøve dyr med en intraperitoneal injeksjon av en ketamin/xylazine cocktail (90 mg/kg Ketamin, 10 mg/kg xylazine).
Merk: For å bekrefte riktig nivå for anestesi, sjekk musen for en pedal refleks (fast tå knip) og justere anesthetic etter behov. - Fukt huden musen med 70% etanol.
- Gjøre en 2 cm midtlinjen snitt med et drifts saks og kirurgisk pinsetter for å avsløre vena cava.
- Ofre mus for transection vena cava og aorta. Eventuelt inn en 21 G gauge nål vena cava over nyre årer å samle blod før exsanguination. Du kan også samle blod via hjertet punktering etter standardprotokoller.
- Bruk en kirurgisk saks klippes bukhulen og fjerne hud/øvre muskler, flytte oppover mot ribbeina.
- Bruk en kirurgisk saks for å punktere mellomgulvet.
Merk: Lungene vil kollapse fra membranen. - Klippe bort brystkasse med en kirurgisk saks for å avsløre hjertet og lungene.
- Ved hjelp av pinsett, ta en 1,5 mL RNase gratis microcentrifuge rør og senk den i flytende nitrogen å fylle røret.
Merk: Bruk vernebriller og vernehansker for å håndtere flytende nitrogen. - Fjerne lungene, plassere dem i RNase-gratis microcentrifuge 1,5 mL rør fylt med flytende nitrogen til snapin-fryse vevet og vent noen sekunder til væsken fordamper.
- Lukk tube lokket og lagre vev ved-80 ° C før bruk.
4. RNA forberedelse
- Pulverisere hele lungene bruker et rustfritt stål vev pulverizer.
Merk: Vev pulverizer må plasseres i flytende nitrogen før å bruke. Rengjør pulverizer etter hver bruk med RNAse løsning. - Delt pulverisert lungene og plasser i to 1,5 mL rør (halv lunge hver).
- Legg 500 µL av guanidinium thiocyanate per eksempel rør og bland. Homogenize hvert utvalg med 18 G, 21 G og 23 G nåler, henholdsvis.
Merk: Eksempler kan være tilsatt 5.6 x 108 kopier av en liten RNA spike-i kontroll (fra en annen art) før du fortsetter med utvinning. - Legge 500 µL av etanol til hver prøve og vortex 15 s.
- Legg blandingen i en spinn kolonne i en samling rør og sentrifuger 12.000 x g i 1 kast gjennomflytsenhet.
-
For DNase jeg behandling (i-kolonnen).
- Legge til 400 µL av RNA Wash Buffer og sentrifuger 12.000 x g for 1 min.
- I en RNase-fri rør, legge 5 µL av DNase jeg og 75 µL av 1 x DNA fordøyelsen buffer og bland. Legg blandingen direkte til kolonnen matrisen.
- Inkuber ved romtemperatur i 15 min.
- Gjenta dette trinnet legge 400 µL av RNA prewash løsning til kolonnen og sentrifuger 12.000 x g i 1 kast gjennomflytsenhet.
- Legge til 700 µL av RNA vaskebuffer kolonnen og sentrifuger 12.000 x g i 1 kast gjennomflytsenhet.
- Sentrifuge 12.000 x g i 2 minutter å fjerne resterende buffer. Overføre kolonnen til en RNase-fri rør.
- For å elute RNA, legger du til 35 µL av DNase/RNase-fritt vann direkte til kolonnen matrise og sentrifuge 12.000 x g for 1,5 min.
- Måle totale RNA konsentrasjon (260 nm) og renhet bruker et spektrofotometer. Følg instruksjonene for å utføre RNA kvantifisering i en 1,5 µL prøve aliquot. Tomme instrumentet med DNase/RNase-fritt vann brukes for elueringsrør.
Merk: 260/280 forholdet ~2.0 er generelt akseptert som "ren" for RNA. Typisk RNA konsentrasjon spenner vanligvis mellom 750 og 2500 ng/µL. - Butikken på-80 ° C.
5. miRNA Profiling
-
Retro-transkribere små RNAs, bruk 200 ng av totalt.
- Forberede omvendt-transkripsjon reaksjonen blanding på is (totalt volum per reaksjon er 20 µL). For hver reaksjon, legge 4 µL av 5 x buffer, 2 µL av 10 x nukleotider mix, 2 µL av revers transkriptase og 2 µL RNase uten vann. Bland alle komponentene og aliquot i 600 µL RNAse uten plast rør (10 µL av blanding per reaksjon).
Merk: Omvendt-transkripsjon master blandingen inneholder alle komponentene som kreves for første-strand cDNA syntese unntatt mal RNA.
Merk: Beregne overflødig volum (10%) når forberede master mix. - Legge til malen RNA (200 ng i 10 µL) til hver tube med omvendt-transkripsjon master mix. Mix, sentrifuge for 15 s 1000 x g, og lagre dem på is til å plassere i thermocycler eller tørr blokker.
- Inkuber for 60 min på 37 ° C.
- Inkuber i 5 min på 95 ° C og plassere rør på is.
- Fortynne cDNA ved å legge til 200 µL av RNase-fritt vann hver 20 µL omvendt-transkripsjon reaksjon.
- Forberede omvendt-transkripsjon reaksjonen blanding på is (totalt volum per reaksjon er 20 µL). For hver reaksjon, legge 4 µL av 5 x buffer, 2 µL av 10 x nukleotider mix, 2 µL av revers transkriptase og 2 µL RNase uten vann. Bland alle komponentene og aliquot i 600 µL RNAse uten plast rør (10 µL av blanding per reaksjon).
-
Utføre sanntid PCR bruker musen inflammatorisk respons og autoimmunitet miRNA PCR matrise.
- Forberede en reaksjonen blanding (totalt volum 1100 µL): For hver reaksjon, legge 550 µL av 2 x PCR master mix, 110 µL av 10 x universell primer blanding, 340 µL RNase uten vann og 340 µL av malen cDNA (utvannet reaksjon fra trinn 5.1.5).
- Tilsett 10 µL av reaksjonen blanding hver brønn av forhåndslastet miRNA PCR matrise analyser.
- Forsegle miRNA PCR matrise plate med optisk selvklebende folien.
- Sentrifuge platen i 1 min 1000 x g ved romtemperatur å fjerne bobler.
- Programmet sanntid cycler, PCR første aktiveringen i 15 min på 95 ° C, 3-trinns sykling inneholder rødsprit 15 s på 94 ° C, annealing for 30 s ved 55 ° C og utvidelse for 30 s ved 70 ° C i 40 sykluser tall.
Merk: Følg produsentens sykling forhold å sette opp i sanntid cycler. Utfør dissosiasjon kurve trinn bygget inn i sanntid cycler programvaren. - Analysere data.
6. dataanalyse
- Pakk ut Ct verdier fra sanntid PCR programvaren for hvert utvalg i en analyseprogramvare.
Merk: En Ct verdien av 34 regnes som cut-off. Hvis prøver inneholder spike-i kontroll (f.eks, cel-mir-39), normalisere Ct verdier til topp i kontroll for hvert utvalg. Terskelverdier må angis manuelt. Opprinnelige verdier angis automatisk. - Normalisere Ct verdier til gjennomsnittlig Ct seks miRNA housekeeping kontroller: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, ved hjelp av følgende ligning:
ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping) - Endre beregninger for fold, beregne ΔΔCt verdier med et bestemt utvalg som kontrollen ved hjelp av den relative uttrykk ligning12:
miRNA relative uttrykk:
2-∆∆Ct, der - ∆∆Ct =-[∆Ct test - ∆Ct kontroll]
Merk: Endre brett 200 regnes som cut-off. - Eksportere fold endre uttrykket verdier for å utføre statistiske analyser på R bruke limma pakken i Bioconductor8.
- Korrigere for flere sammenligninger når du bruker Benjamini-Hochberg metoden13.
Merk: En kopi av skriptet R er tilgjengelig på: http://psilveyra.github.io/silveyralab/. Datasett og analysert data er også tilgjengelig på Gene Expression Omnibus under nummer GSE111667, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.
7. dataanalyse: Funksjonell analyseprogramvare
- Ordne datasettet. Inkluder miRNAs med sine respektive uttrykk Logg forholdstall og p-verdier. Se tabell 1 for bestemte dataset formatering.
- Åpne funksjonsanalyse programvare (versjon 01-10).
- Laste opp dataset med følgende format: filformat: "Fleksibel Format", inneholder kolonneoverskrift: "Ja", Velg identifikator: "miRBase (modne)", matrise plattform brukes for eksperimenter: velge matrise plattform.
Merk: Akseptert formatene er txt (tabulatordelt tekstfiler), XLS (excel-filer), og .diff (cuffdiff filer). - Velg "Antyde observasjoner" og kontroller at forsøksgruppen merkingen er riktig.
- Gå til "Datasett Sammendrag" å revidere den totale mengden tilordnede og ikke-tilordnede miRNAs.
-
Klikk på "ny"-knappen øverst til venstre i programmet. Velg "Nytt MicroRNA målet Filter" og sende microRNA dataset.
- Sett: TarBase, oppfinnsomhet eksperter funnene, miRecords.
- Angi tillit til: eksperimentelt observerte eller høy (spådd).
- Velg "Legg til kolonner" med en rekke biologiske informasjon om målene som arter, sykdommer, vev, veier og mer.
- For å fokusere på mål som endret uttrykk i eksperimentet, velg "Legg til / Erstatt mRNA dataset". Bruk "Uttrykk sammenkobling" for å finne microRNAs med samme eller forskjellige nivåer.
Merk: Filteret analysen vil gi microRNA navn og symboler, mRNA mål, kilden som beskriver målet forholdet og konfidenskoeffisienten spådd forholdet (figur 2).
- Klikk "Legg til mine veien" å sende den filtrerte datasettet til en sti lerret og utforsk mer biologiske forhold.
- Bruk banen Designer til å opprette en publikasjon kvalitet modell av microRNA effekter.
-
En annen alternativ er å opprette en kjernen analyse.
- Hvis kjernen analyse, merker du "Uttrykk analyse".
- Hvis målingen, merker du "Uttr Logg Ratio".
- Analyse Filter Sammendrag: vurdere bare molekyler og/eller relasjoner der: (art = musen) og (tillit = eksperimentelt observert) og (datakilder = "Oppfinnsomhet Expert funn", "Oppfinnsomhet ExpertAssist funn", "miRecords", "TarBase", eller " TargetScan menneskelige").
- Velg en cutoff av p-verdien = 0,05.
- Kjør analysen.
Merk: Rapporten inkluderer: kanoniske veier, oppstrøms regulatorer analyse, sykdommer og funksjoner, regulator effekter, nettverk, molekyler og mer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De ulike celletyper i utstryk brukes til å identifisere musen estrous syklus scenen (figur 1). Disse identifiseres av celle morfologi. Under proestrus er cellene nesten utelukkende klynger av rund-formet, velformet kjerne epitelceller (figur 1A). Når musen er estrus, er cellene cornified plateepitel epitelceller, finnes i tettpakkede klynger (figur 1B). Under metestrus, cornified epitelceller og polymorfonukleære leukocytter er sett (figur 1 c). I diestrus er leukocytter (små celler) generelt mer utbredt (figur 1 d).
Vi hentet RNA fra fire musen lungene følger protokollen beskrevet tidligere. Nukleinsyre konsentrasjonen (ng / µL) varierte mellom 1197.9 og 2178.1 med et gjennomsnitt på 1583.1 ± 215 (tabell 1). Gjennomsnittlig A260/A280 forholdet svingt fra 2.010 til 2.020 med et gjennomsnitt på 2.016 ± 0,002. På den annen side, observerte A260/A230 forholdstallene oscillated mellom 2.139 og 2.223 med et gjennomsnitt på 2.179 ± 0.018.
Tabell 2 viser differensial uttrykk resultatene med limma på R. Vi beregnet topp ulikt uttrykt miRNAs mellom mus utsatt for ozon eller filtrert luft i proestrus (med kommandoen toptable)14. Den første kolonnen gir verdien av log2 ganger fold i miRNA uttrykk mellom ozon og filtrert luft utsatt dyr. Kolonnen t representerer moderat t-statistikken beregnes for hver miRNA i sammenligningen. Kolonnene p.value og adj.p.value representerer tilhørende p-verdien for hver sammenligning før og etter flere tester justering, henholdsvis. Justering for flere sammenligninger ble gjort med Benjamini og Hochbergs metode for å kontrollere false oppdagelsen rate15. Kolonne B representerer Logg-oddsen på at miRNA er ulikt uttrykt8.
Vi utførte miRNA målet filter og kjernen analyse som omfatter berikelse sti analyse. Etter laster opp en liste over 14 miRNAswith betydelige uttrykket Logg forholdet og p-verdien, var alle av dem tilordnet av miRNA målet filteret (tabell 3). Resultatene var filtreres og sorteres for å komme til visse pathways, i dette tilfellet "Mobilnettet immunforsvaret". Kjernen analyse gitt informasjon om kanoniske veier, sykdommer og funksjon, regulatorer og nettverk (Tabell 4). Funksjonell analyseprogramvare produsert en nettverk analyse som viser forholdet mellom miRNAs av interesse og andre molekyler (Figur 3).
Figur 1: identifisering av estrous syklus faser. (A) Proestrus (hovedsakelig kjerne epitelceller); (B) estrus (hovedsakelig anucleated cornified celler); (C) metestrus (alle tre typer celler); og (D) diestrus 2 (flertallet av leukocytter). Skala bar = 100 µm. forstørrelse = 20 x. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: funksjonell programvare representant analyseresultater: miRNA målet filteret. Omfattende profilen til miRNAs på ulike stadier av estrous syklusen. Etter utfører miRNA filter, gir programvaren detaljert oppføringer av gener og forbindelser involvert i sykdommer og andre fenotyper, som kan filtrere og sortere å komme til visse pathways, i dette tilfellet "Mobilnettet immunforsvaret". Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: funksjonell programvare representant analyseresultater: nettverk. Sammenligning av nettverk av filtrert luft eller ozon eksponering i kvinner på ulike stadier av estrous syklusen. Diagram av biologiske nettverk tilknyttet miRNAs i lungene av kvinnelige mus utsatt for filtrert luft vs ozon i proestrus (A) eller ikke-proestrus stadier (B). Dette tallet er endret fra Fuentes et al.6. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| ID | Nukleinsyre (ng/µL) | A260/A280 | A260/A230 |
| Eksempel 1 | 1197.930 | 2.015 | 2.192 |
| Eksempel 2 | 1355.703 | 2.018 | 2.223 |
| Eksempel 3 | 2178.104 | 2.020 | 2.163 |
| Eksempel 4 | 1600.837 | 2.010 | 2.139 |
| Gjennomsnitt | 1583.144 ± 215 | 2.016 ± 0,002 | 2.179 ± 0.018 |
Tabell 1: eksempel på RNA konsentrasjoner og absorbansen forholdstall på 260, 230 og 280 nm fra renset lunge vevsprøver fra fire mus. Konsentrasjoner ble målt med et spektrofotometer.
| logFC | t | P.Value | adj. P.Val | B | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 4.071 | 0.000153 | 0.009514 | 0.759 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 3.916 | 0.000254 | 0.009514 | 0.289 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 3.106 | 0.003014 | 0.075361 | -1.982 |
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 2.891 | 0.005516 | 0.103424 | -2.526 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 2.699 | 0.009243 | 0.138649 | -2.987 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 2.563 | 0.013169 | 0.164609 | -3.299 |
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | -2.412 | 0.019278 | 0.206547 | -3.632 |
Tabell 2: Limma analyse resultater for ulikt uttrykt miRNAs i kvinner utsatt for ozon vs . filtrert luft proestrus stadium.
| miRNAs-ID | Observasjon 1 | Observasjon 1 | Observasjon 2 | Observasjon 2 |
| Uttr Logg forholdet | P-verdi | Uttr Logg forholdet | P-verdi | |
| MMU-miR-694 | 1.492 | 0.000153 | 0.543319208 | 0.0021385 |
| MMU-miR-9-5 p | 0.836 | 0.000254 | 0.677595421 | 0.004997439 |
| MMU-miR-221-3 p | 0.385 | 0.003014 | ||
| MMU-miR - 181d - 5p | 0.597 | 0.005516 | 0.342276659 | 0.106467657 |
| MMU-miR-98-5 p | 0.558 | 0.009243 | 0.455392799 | 0.034724699 |
| MMU-miR-712-5 p | 0.667 | 0.013169 | ||
| MMU-miR-106a - 5p | -0.528 | 0.019278 |
Tabell 3: eksempel format for flere observasjon opplasting av datasett funksjonsanalyse programvare. Flere eksperimentelle differensial uttrykk kan grupperes i et enkelt regneark og lastet opp, og du kan legge til så mange observasjoner etter behov. Kolonner: 1) miRNAs-ID. 2) observasjon 1: Uttr Logg Ratio; 3) observasjon 1: P-verdien. 4) observasjon 2: Uttr Logg Ratio; 5) observasjon 2: P-verdi.
| Ikke-proestrus | Proestrus | ||||
| A. gener målrettet av ulikt uttrykt miRNAs | |||||
| CAMK2N1 | PAFAH1B2 | SEC23A | ABCB9 | FGD4 | SLC25A27 |
| BILER | PDE4B | SNX5 | APOO | FRMD4B | SLC38A1 |
| CYP24A1 | PDE7A | SYT4 | ARHGEF38 | GPR137B | TMCC1 |
| DBF4 | PGM3 | THAP12 | AVEN | HMBS | TRIM71 |
| HMGN2 | PNP | TMED7 | CASP3 | METAP1 | XKR8 |
| KMT5A | REV1 | TNFAIP2 | CCNJ | MITF | ZCCHC11 |
| LRRC17 | RPS19BP1 | TNFRSF10C | CMTR2 | MYC | ZIM3 |
| MDH2 | RRAD | TP53 | CNMD | RGMB | ZNF181 |
| MIS18A | SEC62 | UBE2V2 | DSCR8 | SLC14A1 | |
| ZNF420 | |||||
| B. forskjeller i top sykdommer og biofunctions | |||||
| Sykdommer og lidelser | P -verdi | Sykdommer og lidelser | P -verdi | ||
| Inflammatorisk sykdom | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Organismebiologi skader og unormalt | 4.96E-02 - 2.77E-14 | ||
| Inflammatorisk respons | 3.84E-02 - 3.84E-05 | Reproduktive system sykdommen | 2.15E-02 - 2.77E-14 | ||
| Organismebiologi skader og unormalt | 4.17E-02 - 4.17E-05 | Kreft | 4.96E-02 - 1.27E-10 | ||
| C. topp molekylære og cellulære funksjoner | |||||
| Molekylære og cellulære funksjoner | P Verdi | Molekylære og cellulære funksjoner | P Verdi | ||
| Mobilnettet utvikling | 2.05E-02 - 5.26E-07 | Mobilnettet bevegelse | 3.77E-02 - 4.47E-07 | ||
| Mobilnettet kompromiss | 3.75E-04 - 3.75E-04 | Mobilnettet død og overlevelse | 4.91E-02 - 5.61E-06 | ||
| Cellen syklus | 2.62E-03 - 2.62E-03 | Mobilnettet utvikling | 4.97E-02 - 1.38E-06 | ||
| D. topp fysiologiske systemutvikling og funksjon | |||||
| Utvikling og funksjon | P Verdi | Utvikling og funksjon | P Verdi | ||
| Organismebiologi utvikling | 4.17E-02 - 1.31E-03 | Embryonale utvikling | 3.30E-02 - 2.12E-05 | ||
| Embryonale utvikling | 1.29E-02 - 1.29E-02 | Bindevev utvikling og funksjon | 1.79E-02 - 6.10E-05 | ||
| Bindevev utvikling og funksjon | 1.93E-02 - 1.93E-02 | Vev morfologi | 7.88E-05 - 7.88E-05 | ||
| E. toppen forbundet nettverksfunksjoner | |||||
| Forbundet nettverksfunksjoner | Poengsum | Forbundet nettverksfunksjoner | Poengsum | ||
| Mobilnettet utvikling, inflammatorisk sykdom, inflammatorisk respons | Organismebiologi skader og unormalt, reproduktive system sykdommer, kreft | ||||
| 6 | 19 | ||||
Tabell 4: funksjonell analyseprogramvare Sammendrag av kvinner utsatt for ozon i den ikke-proestrus vs proestrus stadier. Funksjonell analyseprogramvare tillater analyse av topp kanoniske veier, oppstrøms regulatorer, sykdommer og funksjoner, topp funksjoner, regulator effekt nettverk og mer. Denne tabellen er endret fra Fuentes et al.6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MicroRNA profilering er en fordelaktig teknikk for både sykdom diagnose og mekanistisk forskning. I dette manuskriptet definert vi en protokoll for å evaluere uttrykk for miRNAs som er spådd for å regulere inflammatorisk gener i lungene av kvinnelige mus utsatt for ozon i forskjellige estrous syklus faser. Metoder for fastsettelse av estrous syklusen, som visuelle oppdagelse metode, har vært beskrevet16. Men disse avhengige engangs målinger, og derfor er upålitelige. For å nøyaktig identifisere alle estrous syklus faser i kvinner som regelmessig sykle, anbefales metoden beskrevet her. Dessuten, kan denne enkle protokollen også brukes til å beregne indirekte daglige hormonelle svingninger i mus. For å unngå aktivering av uønskede inflammatorisk svar på grunn av vaginal irritasjon, prøvetaking må utføres én gang daglig. På grunn av variasjon i hvor syklus og boliger påvirkninger, er det viktig å utføre protokollen for to til tre komplett sykluser før dyr i et eksperiment vurderer syklus scenen.
For vellykket utvinning av RNA fra lungevev er et nøyaktig prosedyren kritiske. Denne protokollen beskriver en dag metode for å isolere RNA fra lungevev som gir høy kvalitet RNA. Endringer til produsentens protokollen ble pålagt å effektivt pakke RNA fra lungene. Vi lagt til en ekstra sentrifugering trinn etter vaskebuffer fjerne så mye buffer som mulig. Vi har også elut RNA med 35 µL DNase/RNase-gratis vann, sentrifugering kolonnen for 1,5 min å sikre høy konsentrasjon nivåer. Spectrofluorometer resultater bekreftet effektiviteten av våre RNA utvinning protokollen. Forholdet mellom absorbans ved 260 og 280 nm (A260/280 ratio) brukes ofte til å vurdere renheten av RNA forberedelser. Maksimal absorbansen for nukleinsyrer er 260 og 280 nm, henholdsvis. Det er akseptert som "ren" for RNA hvis forholdet er ca 2.017. Likeledes for A260/A230 forurensning absorbansen forholdet er verdiene for renhet i størrelsesorden 2.0-2.218. I denne studien var gjennomsnittlig A260/A280 og A260/A230 forholdstallene observert 2.016 ± 0,002 og 2.179 ± 0.018, henholdsvis (tabell 1). Derfor var våre RNA utvinning protokollen vellykket. En annen fordel av protokollen som brukes er tillegg av DNAse behandling. Dette er viktig å unngå genomisk-DNA forurensning19. En begrensning av denne RNA isolasjon protokollen er bruken av rensing kolonner forkaste avfall gjennom nedbør med alkohol fordi noen lunge rusk kan hindre membranen enten delvis eller helt, noe som resulterer i lav avkastning. Også hvis homogenisering trinnet ikke utføres nøye, kan store mengder lunge RNA lett tapt eller forringes. Hvis du er lav RNA avkastning, kan RNA re renset og elut i et mindre volum. Alternativt kan RNA være utfelt overnatting følgende publiserte protokoller20.
Microarray teknologier brukt miRNA profilering er lovende verktøy i mange forskningsfelt. I vår studie brukte vi PCR matriser, som gir fordelen av høyere oppdagelsen terskel og normalisering strategier for påvisning av ulikt uttrykt miRNAs vs andre teknologier som probe-baserte miRNA matriser21. En begrensning av denne protokollen er at det krever et minimum av RNA materiale, og tilgjengeligheten av bestemte sett med primere for miRNAs av interesse, i motsetning til andre tilgjengelige teknikker som RNAseq. En annen fordel med PCR-baserte matriser er bruke non miRNA referanse gener for qPCR normalisering (som små nucleolar RNAs eller SNORDs) til å beregne differensial uttrykk for miRNAs. Til slutt gir bruker PCR matriser flere alternativer for dataanalyse, alt fra nettverktøy produsentene, konvensjonelle metoder å oppdage differensial uttrykk om Real-Time PCR. Statistisk analyse med limma passer for både microarrays og PCR-baserte matriser og bruker empirisk Bayes moderert f- statistikk22. Her viser vi at både p- og q-verdier (justert for flere tester) kan fås med kommandoen toptable justere false oppdagelsen rate terskelen og identifisere ulikt uttrykt miRNAs.
Funksjonsanalyse programvaren er en web-basert applikasjon for dataanalyse i veien sammenheng. Programvaren gir forskere søke evner som kan bidra ramme datasett eller konkrete mål i sammenheng, i et større bilde av biologisk betydning. Selv om programvare miljøet er fleksibelt til ulike typer analyse (dvs. metabolomics, SNPs, Proteomikk, microRNA, toksikologi, etc.), vårt mål er å markere aspekter av miRNA analyse. Etter laster opp en liste over 14 miRNAs med betydelige uttrykket Logg-forholdstall og p-verdier, var alle tilordnes av programvaren. Vi utførte miRNA målet filter og kjernen analyse, som inkluderer berikelse sti analyse. Men vurdere slike analyser gener som de 14 miRNAs er spådd til målet og ikke miRNAs seg. Resultatinndelingen viser utganger som: kanoniske veier, sykdommer og funksjon, gener målrettet av ulikt uttrykt miRNAs, fysiologiske systemutvikling, regulatorer og nettverk (Tabell 4). Pathway visualisering vises under nettverkskategorien der miRNAs og molekyler er vist som klikkbare noder som er koblet med informasjon knyttet til genet av interesse (Figur 3). En fordel med funksjonell analyseprogramvare er høy kvalitet miRNA-relaterte funn, inkludert både eksperimentelt validert og spådd interaksjoner. Funksjonell analyse programvare databasene inkluderer: eksperimentelt godkjent microRNA-mRNA interaksjoner databaser23,24, spådde microRNA-mRNA interaksjon database med lav-tillit interaksjoner utelukket (f.eks Målet skanning)25, eksperimentelt validert menneske, rotte, og musen microRNA-mRNA interaksjoner databaser (f.eks miRecords)26og litteratur funn (f.eks, microRNA-relaterte funn manuelt kuratert fra publisert litteratur av vitenskapelige eksperter). Andre studier som sammenlikner effektiviteten og brukervennlighet av Bioinformatikk verktøy for å analysere trasé forbundet med miRNA uttrykket bekrefte effektiviteten av denne programvare27. Samlet, beregningsorientert metoder er kostnadseffektiv og mindre tidkrevende, og lett kan valideres av genetiske metoder. Med konstant vekst og akkumulering av biomedisinsk data blir bioinformatikk metoder stadig kraftigere i oppdagelsen av miRNA-medierte mekanismer av biologiske og sykdom prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av tilskudd fra NIH K01HL133520 (PS) og K12HD055882 (PS). Forfatterne takker Dr. Joanna Floros for hjelp med ozon eksponering eksperimenter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7 mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10x and 20x objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10 mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21 G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1 mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14 cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50 mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μL reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
References
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression? Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatics. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User's Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J.
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
