Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Reproduktive teknikker til overvågning og kontrol af æggestokkene i padde

Published: May 12, 2019 doi: 10.3791/58675
Automatic Translation
1,2, 3, 2, 2, 4
1Reproductive Sciences, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 2Recovery Ecology, San Diego Zoo Institute for Conservation Research, 3Menagerie du Jardin des Plantes, Museum National d'Histoire Naturelle, 4Cincinnati Zoo & Botanical Garden, Center for Conservation and Research of Endangered Wildlife

Summary

Studiet af amfibie biologi giver værdifulde oplysninger om de reproduktive, fysiologiske, embryologiske og udviklingsmæssige processer, der drev organismer i mange taksonomiske grupper. Her præsenterer vi en omfattende vejledning om forskellige metoder, der kan bruges til at studere ovarie kontrol og overvågning i padder.

Abstract

Ovarie kontrol og monitorering i padder kræver en mangesidet tilgang. Der er flere applikationer, der med succes kan fremkalde reproduktive adfærd og erhvervelse af kønsceller og embryoner til fysiologisk eller Molekylær forskning. Padder bidrager til en-12:45-tredjedel af hvirveldyr forskning, og af interesse i denne sammenhæng er deres bidrag til det videnskabelige samfunds viden om reproduktive processer og embryo logisk udvikling. Men det meste af denne viden er afledt af et lille antal arter. I den seneste tid, decimering af padder over hele kloden har krævet øget intervention af konservationister. Den bundne genopretning og sikkerhed kolonier, der fortsætter med at dukke op som reaktion på udryddelse risiko gøre eksisterende forskning og kliniske anvendelser uvurderlige for overlevelse og reproduktion af amfibier holdes under menneskelig pleje. Succes for enhver bundet befolkning er baseret på dens sundhed og reproduktion og evnen til at udvikle levedygtige afkom, der viderefører den mest forskelligartede genetiske repræsentation af deres arter. For forskere og dyrlæger er evnen til at overvåge og kontrollere ovarie udvikling og sundhed derfor bydende nødvendig. Fokus i denne artikel er at fremhæve de forskellige assisteret reproduktionsteknikker, der kan anvendes til at overvåge og, hvor det er relevant eller nødvendigt, kontrollere ovariefunktionen i padder. Ideelt set bør alle reproduktive og sundhedsmæssige spørgsmål reduceres gennem korrekt fangenskab, men som med ethvert dyr, er spørgsmål om sundhed og reproduktive patologier uundgåelige. Ikke-invasive teknikker omfatter adfærdsmæssige vurderinger, visuel inspektion og palpering og morphometriske målinger til beregning af krops tilstands indekser og ultralyd. Invasive teknikker omfatter hormonelle injektioner, blodprøvetagning, og kirurgi. Ovarie kontrol kan udøves på en række måder afhængigt af den ønskede applikation og arter af interesse.

Introduction

Amfibier har længe været anerkendt som vigtige biologiske og medicinske modeller af en bred vifte af forskningsdiscipliner. Data indhentet ved at studere særlige arter såsom Xenopus laevis og X. tropicalis, Leopard Frog (Lithobates (tidligere Rana) Pipiens) og Axolotler (Ambystoma mexicanum) er blevet anvendt til en række andre hvirveldyr, herunder mennesker. De veterinære, husdyrhold og assisteret reproduktive teknikker, der er opstået ved at studere disse og andre padder yde bistand til dem, som har til opgave at udvikle vellykket pleje, vedligeholdelse og bæredygtighed af sjældnere populationer i fangenskab 1 , 2 , 3 , 4.

Interessen er stigende for den samtidige brug af in og ex situ bevarings baserede tilgange til at vende strømmen af udryddelse for mange i fare amfibie arter1,2. Denne artikel indeholder de metoder, der i øjeblikket er tilgængelige til at overvåge og kontrollere amfibie ovariefunktionen i model arter af Anuraner og hale. Desuden, eksisterende teknikker til at løse en fælles reproduktive patologi af ægopbevaring er præsenteret.

Som i mange taksonomiske grupper involverer Padde Ovarie kontrol en række tæt synkroniserede interaktioner mellem miljø og fysiologi. Temperatur og fotoperioden (kendt som nærtmere signaler) afkodes af øjet og hjernen, hvor de hurtigt omdannes til genetiske, hormonelle og cirkadiske processer (ultimative signaler)3,4. Metoderne til overvågning og kontrol af ovariefunktionen, der er omfattet af denne artikel, omfatter invasive og ikke-invasive teknikker. Institutionel dyrepleje-og anvendelses udvalg (IACUC) forsknings-og undervisnings krav definerer ikke-invasive teknikker som dem, der vil forårsage minimal til ingen fysisk smerte eller psykisk lidelse og kræver ingen smertestillende medicin5. Her omfatter ikke-invasive teknikker visuel inspektion og palpation, adfærdsmæssige observationer, morphometriske vurderinger og ultralyd. Tværtimod, de teknikker til blod opsamling, hormon administration og kirurgi (ovariektomi og fjernelse af opbevarede æg) er klassificeret som invasive, da de kan resultere i nogle smerter eller ubehag og kræver anæstesi eller post-proceduremæssig lægemiddelbehandling.

Ikke-invasive ovarie overvågningsteknikker kan nemt inkorporeres i den daglige pleje rutine for de fleste fanget padder. Afhængig af arten, æggestokkene graviditet kan ofte bestemmes ved simpel visuel inspektion (glas Frog). I andre tilfælde kan palpering indikere, om en kvindelig er gravid. Forskellige krops tilstands indekser (BCI) såsom vægt, snude urostyle længde (Sul), snude-vent længde (SVL) og standard Mass Index (SMI) er til rådighed for at forudsige tilstedeværelsen eller fraværet af æg4,6,7, 8,9. Dog bør man være forsigtig med fortolkningen af resultaterne, da de fleste ikke betragter alder, kropsform eller sammensætning (f. eks. vand tilbageholdt versus ovarie masse eller fedt)6. Definitive reproduktive diagnoser kan opnås via ultralyd med mere dybtgående viden om ægudvikling og iscenesættelse af æggestokkene cyklus4,7. Ultralyd giver også et middel til at bekræfte og overvåge reproduktive patologier og tilknyttede fysiologiske forhold4,8.

Ud over at give oplysninger om helbredstilstand, kan blodprøvetagning anvendes til at måle reproduktive hormoner. Hvis hormon profilering er det endelige mål, det er vigtigt at undgå stress-relaterede påvirkninger, der kan tolerere systemiske steroid data. Mens et potentielt kraftfuldt overvågningsværktøj, der er endnu ikke at være en undersøgelse viser medfødte Endokrinologiske reaktioner på eksogene hormon administration i nogen amfibie arter. Blod kan sikkert tages fra flere steder; i frøer dette omfatter ventrale abdominal vene, linguale plexus, femoral vene og hjerte9,10. I Caudates opsamles blod fra den ventrale hale vene. Graden af invasivitet, mængden af tilbageholdenhed kræves, behovet for bedøvelsesmiddel, delikatesse af organet er målrettet, og størrelsen af dyret er faktorer, der skal overvejes, når du vælger en samling teknik til amfibie patienten. Denne artikel vil præsentere teknikken til blod opsamling fra ansigtet maxillær eller musculocutaneous vene af frøer som oprindeligt beskrevet af Forzan et al.9.

Ovarie kontrol er artsspecifik og, som sådan, hormon protokoller bør testes og optimeres. Bortset fra sæsonudsving og det tilhørende cirkulerende hormon miljø kan ovarie kontrol også være tæt knyttet til alder, tid i fangenskab og udsættelse for gentagen hormon administration, hvor der kun er få oplysninger i litteraturen11 , 12 , 13. gennemførelsen af hormon behandlinger for at fremkalde reproduktiv adfærd, gamet produktion, modning og oviposition er blevet en meget rapporteret tilgang til at løse fælles reproduktive problemer forbundet med fangenskab4, 8,14,15,16. Da mekanismerne til kontrol af reproduktion i hvirveldyr er stærkt bevaret, findes der en række hormoner, neuropeptider og kommercielt tilgængelige lægemidler, der anvendes terapeutisk i andre taksonomiske grupper, som også kan anvendes pålideligt i en række amfibie arter (tabel 1). Gonadotropin releasing hormon (GnRH) og humant choriongonadotropin (HCG) (eller variationer heraf, dvs. PMSG og EKG)17,18, enten individuelt eller i kombination, har været anvendt i udstrakt grad i amfibie bundne avlsprogrammer, herunder: det sydlige Rocky Mountain Boreal (anaxyrus Boreas Boreas)4,19,20; TOAD, Dusky Gopher Frog, Rana sevosa (Langhorne et al., ikke offentliggjort)7; Gulf Coast waterdog, Necturus beyeri20; Wyoming TOAD, Anaxyrus baxteri18; Bullfrog, Rana Rana21; den amerikanske TOAD, Anaxyrus americanus22; græs frøen, Lymnodyaster tasmaniensis23; Coqui, Eleutherodactylus Coqui24; Xenopus, xenopus laevis25; Gunthers toadlet, Pseduophryne guentheri26; den nordlige Leopard Frog, Lithobates pipiens; den argentinske horned-Frog, Ceratophrys udsmykkede; cranwell's hornede frø, C. cranwelli; den amerikanske jord-Frog, odontophrynus americanus27; og branden Salamander (Salamandra)228. Steroid hormoner, ligesom progesteron (P4), er mindre almindeligt rapporterede, men har vist god effekt i eliciterer ægløsning og oviposition i nogle arter af padder16,18,29. Prostaglandiner (især prostaglandin 2-alpha (PGF2α)) er involveret i ægløsning sammen med kortikosteroider30,31,32,34 og når høje niveauer under den ovulatoriske fase31.

I in vitro undersøgelser, PGF2α er en potent induktor af ægløsning31, mens in vivo det kan inducere oviposition af opbevarede æg i Rana muscosa4,30,32. Hypofyse ekstrakter er også effektive induktorer af ægløsning15,16,34; bekymringer vedrørende biosikkerhed og potentialet for sygdomsoverførsel er imidlertid ofte afskrækkende for avls kolonier i fangenskab, når de overvejer denne fremgangsmåde35.

Den sidste del af denne artikel detaljer kirurgiske procedurer og giver alternative tilgange til at udvide æggestokkene undersøgelser eller støtte med opløsningen af reproduktive patologier. Ovariectomies udføres oftest i padder for at få oocytter til embryo logisk forskning. Men, det kan også give et middel mod lagrede æg, når en anden muligheder mislykkes. Selv om denne procedure er invasiv, kræver fuld anæstesi og indsnit til at udsætte ægge masserne, det kræver ikke eutanasi. Desuden, efter partiel ovariektomi, dyr kan gøre en fuld helbredelse og fortsætte med at være reproductivt aktivpost-kirurgi8,36.

Protokollerne beskrevet nedenfor skitserer invasive og ikke-invasive metoder til ovarie kontrol og monitorering i Anuraner og hale. De specifikke arter, der udvælges til at illustrere teknikker i Anurans omfatter R. slimhinde og X. laevis. Necturus maculosus, n. beyeri, n. alabamensis, og A. mexicanum omfatter de arter, der anvendes til tilsvarende beskrive teknikker i caudates.

Protocol

Salamander procedurer blev godkendt af Cincinnati Zoo & botanisk have (CZBG) institutionelle pleje og brug udvalg (IACUC) protokoller 11-106, 13-110, 14-133, og 15-138. Alle Frog og TOAD procedurer blev godkendt af San Diego Zoo global (SDZG), institutionel pleje og brug Komité (IACUC) protokoller: 15-001, 16-005 og 18-003.

Pasning og behandling af dyr blev godkendt af det etiske udvalg for National Museum of Natural History (Paris) (Museum national d'Histoire Naturelle-Ménagerie du Jardin des Plantes (MNHN)), i overensstemmelse med de institutionelle og nationale retningslinjer (Kommissionen de génie Génétique, retning départementale des services vétérinaires, den Europæiske Unions direktiv 2010/63/EU, aftale afgørelse nr. C75-05-01-2 for den europæiske konvention om hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål. Alle de protokoller, der blev anvendt i dette studie, blev godkendt under referencenummeret 68-037.

1. ikke-invasive ovarie overvågningsteknikker

  1. Visuel inspektion og palpering
    1. Hold den kvindelige Anuran på en af de tre måder, der er beskrevet nedenfor.
      1. Fastgør frøen eller toad's ben med ringen og lille finger, støtte Rygsiden (maven) af frøen krop med indekset og den midterste finger og den ventrale side med tommelfingeren (figur 1a).
      2. Hold frøen eller tudse i den dominerende hånd med en tommelfinger på maven og resten af fingrene sikre bagsiden af dyret. Brug den ikke-dominerende hånd til at palpere dyrets mave, føler, hvis der er subdermal ujævnhed (figur 1b).
      3. Hvil frøen eller toads mave på håndfladen, front arme draperet over pegefingeren og en tommelfinger på dens øvre ryg.
    2. Da hale er fuldt akvatiske i naturen, udføre visuel inspektion af en af to metoder, der er beskrevet nedenfor.
      1. Flyt dyret til en separat 4 L beholder, der indeholder tank vand. Hold beholderen (låget sikret) op og skinne lommelygte på undersiden for at visualisere tilstedeværelsen/fravær af æg.
      2. Anesthetize i MS222 (0,5 g/L; Tricain methanesulfonat, bufferet med 0,5 M NaHCO3). Efter induktion, rotere dyret på ryggen og undersøge maven.
  2. Morphometriske vurderinger
    1. Padder
      Bemærk: anæstesi er ikke påkrævet.
      1. Brug kalibre, måle dyret fra spidsen af munden, langs midten af kroppen til spidsen af halen for at opnå SUL og SVL (figur 2a, B).
      2. Tara en plastikbeholder på en digital præcisions skala. Dyret placeres i en tareret beholder og vejes (figur 2c).
      3. For større dyr, som bullfrogs, eller når der opnås vægte i marken, bruge en hængende skala (figur 2D).
      4. Som i mange og arter, skelne R. muscosa voksne hunner fra mænd ved deres større størrelse og manglen på ægteskabs (tommelfinger) puder på hænderne (figur 3).
      5. Beregn kroppens tilstand, som en grundlæggende vurdering af den generelle sundhed ved følgende formel:
        Fulton's indeks: K = masse ÷ længde3
        Bemærk: Fulton's index bruger en dimensionel balance af volumen relateret til masse og længde, hvor 3 er den skaleringseksponent, der relaterer masse og længde isometrisk.
    2. Caudates
      1. Tara skala med en tom pose, før du placerer ikke-bedøvet dyr indeni. Pas på ikke at indføre overskydende vand (figur 2D) og handle hurtigt som dyr udskiller Slim som en stress respons på at blive tilbageholdende.
      2. Få voksne foranstaltninger ved at immobilisere enkeltpersoner i en lige position i bunden af en genforseglbar plastikpose eller i en separat plastikbeholder, der kan rumme ekspanderede kalibre.
      3. Mål kropslængden med kalibre (figur 2E).
      4. Mål hale fra spids af snude til spids af halen (SVL) for at overvåge væksten.
  3. Adfærdsmæssige observationer
    1. Fysisk observere dyr i realtid eller bruge et videokamera til at optage adfærd.
    2. Optag observationer af dyr kategorisere adfærd og konstruere en ethogram (figur 4).
    3. Klassificere reproduktions adfærd
      Bemærk: figur 4 eksemplificerer en type reproduktions adfærd observeret i anurans.
  4. Ultralyd
    Bemærk: ultralydstransducer valg, i dette tilfælde, 7,5 mHz lineær eller en multi-frekvens (10-6 mHz) mikro-konvekse, anbefales til Necturus og en 10 MHz sonde og vandopløselig, salt-fri gel til R. muscosa. Udførelse af ultralyd på salamandre kan kræve anæstesi (Se afsnit 1,5 for instruktioner).
    1. Padder
      1. Udfør ultralyd på R. muscosa ved hjælp af to personer (figur 5a).
      2. Første person: hold dyret med den dominerende hånd og anvende den vandopløselige, salt fri gel til dyrets abdomen.
      3. Anden person (Ultra-sonographer): Tag 10 MHz-sonden i den dominerende hånd, og Anvend den på maven og sørg for at gøre god kontakt mellem sonden og gelen.
      4. Skub indad fra lige under armpit mod midten af dyrets abdominale midterlinje for at visualisere hele æggestokkene.
      5. Ultra-sonographer: Brug ikke-dominerende hånd til at fryse ramme og fange de ønskede billeder på ultralyd.
      6. Kategorisere stadiet af ovarie cyklussen med det klassificeringssystem, der er fastsat for slægten4 (tabel 2, figur 5b-F).
      7. Skyl eventuelt gel fra dyret ved afslutningen af proceduren.
    2. Caudates
      1. Overfør ikke-bedøvet Necturus til 4 l rektangulær beholder fyldt med 2 liter tank vand.
      2. Minimer dyrs bevægelse ved at slukke for rummet lys og/eller kop en hånd overhovedet af dyret.
      3. Placer transduceren i en afstand af 1-2 cm fra kropsvæg.
      4. Find hjertet på det ventrale midterlinje niveau til forbimene, og flyt derefter transduceren fikseres og Undersøg æggestokkene7.
      5. Kategoriser hunnerne efter klassificeringssystem, der er fastsat for slægten4 (figur 6a, B, C).
      6. Opnå nøjagtige målinger af æg i midten til slutningen gravid fase ved at optage billeder, når dyrets krop er i en vinkel til transduceren (dvs. ikke lineær, men let bue; Figur 6b). Ellers gør overlappende follikler det vanskeligt at differentiere individuelle ægstørrelser.
  5. Anæstesi induktion og nyttiggørelse
    1. Padder
      1. Anesthetize i MS222 (0,5 g/L; Tricain methanesulfonat Buffered (0,5 M NaHCO3) som tidligere beskrevet.
      2. Brug den opretterende refleks som en primær indikator for, i hvor høj grad dyret er blevet bedøvet. Komplet tab af refleks viser en tilstand af dyb anæstesi.
      3. Fjern dyret fra vandet-bad-baseret anæstesi (MS-222), når den opretterende refleks er tabt.
      4. Placer dyret på en våd (med anæstetikfri de-chlorerede vand) håndklæde.
      5. Sørg for at holde dyret fugtig under hele operationen.
      6. Intubate små padde med røde gummi katetre, uncuffed rør eller klassiske cuffed endotracheal tubus rør uden oppustethed manchetten.
      7. Give en lav strøm af ilt (0,5-0,75 L/min) med 0,5-1% isofluran.
      8. Stop isofluran efter proceduren, men holdstrømmen af ilt i 1 minut.
      9. Dyrt dyret, og skyl dyret grundigt med bedøvelses frit dechloreret vand i 2 minutter.
      10. Sæt dyret i en overfladisk mængde af de-chlorerede vand eller på et vådt håndklæde.
      11. Evaluer dyrets restitution ved forsigtigt at trække på en bagarm for at forlænge den. Enhver responderende sammentrækning af lemmer indikerer tilbagetræknings refleks.
      12. Overvåge andre indikatorer for nyttiggørelse såsom gular respirationer (hals bevægelse) og den opretnings refleks.
      13. Overvej amfibie genvundet, når alle reflekser er vendt tilbage, og hjerte og respiration satser er vendt tilbage til præ-bedøvelses værdier.
    2. Caudates
      1. Anesthetize Necturus og Ambystoma i MS222 (0,5 g/L tricain methanesulfonat, bufferet med 0,5 M NaHCO3, (MS222) i en 4 L rektangulær tank.
      2. Placer en luft sten (1 tommer) og luftpumpe i tanken og drej den til en konstant strøm for at give tilstrækkelig iltning.
      3. Når lemmer funktion og den oprette refleks er tabt, fjerne dyret fra vandet-bad-baseret anæstesi (MS-222) og sætte dyret på en våd (med bedøvelses-fri de-chlorerede vand) håndklæde.
      4. Oprethold hud og Gill fugt med en klemme flaske af tank vand.
      5. For at genvinde dyret, forsigtigt placere det ventrale side ned i en 4 L plastikbeholder fyldt med 2 L af tanken vand med en luft sten.
        Bemærk: Recovery starter med Gill blinkende, efterfulgt af evnen til at flytte sin hale og fremdrive og endelig funktionelle bevægelse af lemmer.
      6. Returner dyret til dets oprindelige husets beholder og overvåger det nøje over de næste 24 timer.
        Bemærk: andre metoder til bedøvelse for padder findes, og disse er beskrevet i Wright og Whitaker8.

2. invasive ovarie overvågning og kontrolteknikker

Bemærk: denne procedure er blevet tilpasset fra Forzán et al.10.

  1. Hold frøen i den dominerende hånd, og dup tør venippunktur siden af Frøens ansigt med en steril serviet eller gaze.
  2. Tør ansigtet for at undgå, at blodet spredes for meget på tværs af huden.
  3. Indfør nålen (26 G 1/2 "og 27 G 1/2"), med facet opad, gennem huden, hvor den hævede hud omkring øjet og overkæbe ryggen mødes for at danne et punkt i en trekant (gul kontur) (figur 7a) adgang til Vena facialis nær Vena orbitalis posterior.
  4. Punktering ansigtet vene under det højre øje og over overkæbe ryggen, startende mellem 1-2 mm tilbage fra midterlinjen i øjet (figur 7a).
    Bemærk: for mindre frøer (under 20 g) skal du flytte indsætningspunktet tættere på en position direkte under øjets midterlinje.
  5. Vinkel microhematocrit røret nedad for at muliggøre tyngdekraften til at hjælpe blodtilførslen ind i røret. Blod skal flyde umiddelbart efter punktering (figur 7b, C).
  6. Ved det første tegn på blodgennemstrømning, Placer spidsen af microhematocrit røret på punkturstedet og indsamle 1-2 fuld microhematocrit rør af blod og placere rør i egnede beholdere til indsamling (figur 7b, C).
  7. Hvis blodet ikke flyder let, eller lydstyrken er meget lav, skal du flytte kanylen lidt eller sætte nålen ind i den anden side af ansigtet.
  8. Stop blødning ved at trykke gaze fast til punkturstedet for mindst 20 s.
  9. Efterlad Frog ud af vandet i 10 minutter for at bekræfte punkturstedet ikke genåbne.
  10. Brug en ny nål og nye microhematocrit rør til hver frø udtaget.

3. hormon induktion

  1. Hormonbehandling
    1. Forbered hormon injektioner umiddelbart før brug for at sikre maksimal effekt.
    2. Vælg et hormon fra det valg, der er anført i tabel 1.
    3. Bestem koncentrationen af hormonet, der skal injiceres ved hjælp af en μL eller mL/g legemsvægt16.
    4. Fortynd hormonet i en af følgende: vand, fosfat bufferet saltvandsopløsning (PBS), saltvandsopløsning amfibie Ringer's Solution (SARS) eller saltopløsning.
    5. Må ikke overskride en Injektionsvolumen på 200 μL for frøer, som vejer 30-70 g og 300 μL for frøer, som vejer 80-110 g (personlig observation)16.
    6. For korrekt opbevaring af et dyr under hormon administration af ethvert dyr, der spænder fra 10-100 g, skal du bruge en af de relevante metoder til opbevaring beskrevet i punkt 1,1.
  2. Padder
    1. Beregn den krævede koncentration pr. individ ved hjælp af et gram pr. legemsvægt beregning (g/legemsvægt).
    2. Lige før administration, rekonstruere i en steril fortynder valg.
    3. Sørg for, at der ikke er bobler tilbage i sprøjten før injektion.
    4. Hold dyret forsvarligt i den ikke-dominerende hånd, og Injicer injektionen med en dominerende hånd.
    5. Injicer injektion efter hormon specifikationer. De mest almindeligt forekommende injektioner i padder er subkutane, intra peritonealdialyse eller intra muskuløs (figur 8).
    6. Administrere IP-injektioner i den nedre del af maven eller i den nedre sektion af ryggens side af kroppen nær bagbenet (figur 9).
    7. Indgiv intra-muskuløse injektioner fortrinsvis i bagbenene.
  3. Hale (Necturus)
    1. Rekonstruere hormon valg i sterilt vand i henhold til gram per kropsvægt metode beskrevet ovenfor.
    2. I tilfælde af Necturus anvendes doser på 1,7-2,3 μg GnRH/g legemsvægt.
    3. Fjern Necturus fra bedøvelse kammer og sted på en 45 ° overflade dækket med kirurgisk Drape.
    4. Placer dyret med hovedet pegende nedad.
    5. Nærmer sig posterior kvadrant af maven (hale af bageste ben) i en 15-20 ° vinkel. Vær omhyggelig med ikke at indføre luft i sprøjten.
    6. Injicer (IP) ved hjælp af en insulin sprøjte og 27-30 G nål.
    7. Injicer hormonet ved hjælp af en insulin sprøjte og 27-30 G nål.

4. kirurgi

  1. Generel kirurgisk forberedelse og procedure
    1. For at opretholde aseptiske procedurer skal du bruge klare sterile plastik gardiner til at isolere operationsstedet. Reducer fordampning ved at holde den omgivende hud fugtig.
    2. Fugt alle materialer, der vil kontakte dyrets hud med sterilt vand. Lav hud indsnit med en nummer 15 eller nummer 11 skalpel klinge.
      Bemærk: en kombination af kold stål, radio kirurgi eller Diode Laser. Hæmostase i mild hæmoragisk procedure kan opnås ved elektrocauter eller Diode Laser.
    3. Brug bomulds tippet spyd eller applikatorer til at tillade anvendelse af lokaliserede tryk til små fartøjer holde styr på blodtab.
    4. Brug bomulds tippet Spears eller applikatorer til at styre små lukkede rum i stedet standard gaze firkanter.
    5. Brug mikro-instrumenter, ligesom oftalmologiske instrumenter, med fine, små spidser, når de udfører kirurgi på dyr, der vejer mindre end 1 kg.
    6. Brug plastik, selv opgående retraktorer (f. eks. Lone Star retractor) til at passe til forskellige størrelser af indsnit.
    7. Brug øjenlåg retraktorer til at trække coelomic incisioner.
    8. Brug forstørrelses instrumenter, hvor det er nødvendigt for at udføre kirurgi på mindre patienter.
      Bemærk: Analgesia er påkrævet med enhver kirurgisk procedure i padder. Manglende administration af tilstrækkelig analgesi under operationen har været forbundet med forsinket tilbagevenden af normale funktioner. Desuden, analgesi potenserer virkningerne af bedøvelsesmidler (tabel 3)34.
  2. Padder
    1. Når X. laevis er blevet bedøvet som beskrevet i trin 1.5.1, skal dyret positionere sig i ryggens fordybelighed (figur 10A, C).
    2. Forbered kirurgisk felt aseptisk ved at tørre fugtig steril gaze med fortyndet povidon-jod opløsning (1/10) på stedet for 10-15 s eller 0,75% chlorhexidin opløsning på operationsstedet i mindst 10 min før operationen35.
    3. Lav en 3 mm paramedian hud indsnit i midten coelom (mellem skuldrene og cloaca) med en fed slagtilfælde efterlader et rent snit ved hjælp af en no. 15 eller No. 11 skalpel.
      Bemærk: man kan bruge en Diode Laser også til hud incisioner.
    4. Løft abdominal membranen, lav og indsnit og dissekere omhyggeligt ved hjælp af en no. 15 eller No. 11 skalpel. (Figur 10b, D).
    5. Trække de coelomic indsnit med øjenlåg retraktorer (eller passende udstyr).
    6. Punktafgiftspligtige en del af ægmassen uden at ligere blodkarrene.
    7. For komplet ovariektomi, ætse omgivende blodkar ved elektro kautery eller laser Diode (Figur 11).
    8. Ved hjælp af Monofilament sutur, tæt celiotomi indsnit med en afbrudt, everting sutur mønster.
  3. Caudates
    1. Once A. mexicanum er blevet bedøvet, placere det i den rigtige laterale recumbency, med venstre bækken lemmer simpelthen placeret mod halen base.
    2. Forbered det kirurgiske felt aseptisk ved at placere fugtig steril gaze med fortyndet povidon-jod-opløsning (1:10) på stedet for 10-15 s. Alternativt kan du bruge steril gaze gennemblødt i 0,75% chlorhexidin opløsning og placere på operationsstedet i mindst 10 min før operationen (figur 12a)36,37 .
    3. Tegn en linje mellem skulderen og bagbenene for at opdele kroppen i tre lige store dele (figur 12B).
    4. Gør incisionsstedet mellem den anden og tredje del.
    5. Tag fat i den underliggende muskel og løft væk fra den coelomic Viscera.
    6. Forsigtigt tvinge små produkter gennem den coelomic muskulatur og ind i det coelomic hulrum.
    7. Træk de coelomic indsnit med øjenlåg retraktorer (eller eventuelt passende materiale) tilbage (figur 12C).
    8. For komplet ovariektomi, ætse omgivende blodkar ved elektro kautery eller laser Diode (figur 12D).
    9. Ved hjælp af Monofilament sutur, tæt celiotomi indsnit med en afbrudt, everting sutur mønster.

Representative Results

Morphometri og reproduktion

Visualisering af kvindelig reproduktiv status i paddearter varierer afhængigt af arten. Den mest effektive metode er ultralyd; nogle arter kan dog udvise varierende grader af gennemsigtighed i deres hud (figur 13a, B, C). Visuel inspektion kan ofte tydeligt illustrere forskellene mellem en gravid og ikke-gravid kvinde, når huden er semi-gennemsigtigt som observeret i n. alabamensis og n. maculosus (figur 13a, B); eller gennemskinnelige som illustreret af glas frøen (figur 13C). Den mørke plettede hud farvning på maven af N. beyeri forbyder denne vurdering, der skal foretages. I R. muscosa, huden er ikke gennemskinnelige, men mærkbare forskelle kan påvises mellem kvinder, der er gravid sammenlignet med dem, der for nylig har oviposited fordi huden er slap, og dyret ser tyndere (gul linje) sammenlignet med en kvinde, der er gravid (blå linje) (figur 13D). Med erfaring handleren kan stifte bekendtskab med forskellen mellem en stor kvindelig og en gravid en men bekræftelse af gravid scenen vil kræve ultralyd. Body Mass indekser i padder kan beregnes ved hjælp af en række formler, men deres anvendelse som et prædiktivt værktøj til reproduktion er diskutelig. I sagen om R. muscosaer korrelationen mellem fulton's indeks, sundhed og reproduktive status fortsat uklar.

Reproduktiv adfærd og ultralyd

Vores resultater viser, hvordan man karakteriserer reproduktiv adfærd i R. muscosa for forudsigelse af oviposition (figur 4). Flere etaper, der varer fra et par timer til flere uger omfatter, bejle hvor en mandlig aktivt jager en kvinde (figur 4a), den mandlige mounts og fastspænder på kvindens ryg, kaldet amplexus (figur 4b). Når amplexed, parret kan forblive i amplexus for 1 – 5 uger og parret vil vise andre adfærd i tillæg til amplexus. Amplexus er en meget aktiv adfærd, der omfatter den mandlige klemme kvinden i en blød pumpning måde (figur 4c); kvinden bevæger sig rundt og begynder at vise hånd-stand adfærd intermitterende (figur 4d, E); og tættere på tidspunktet for oviposition, den kvindelige, i en hånd-stand, vil læne sig op mod overflader, som hun kan holde æg på, mens de mandlige pumper hendes mave kraftigt (i dette tilfælde er det muligt også at observere den kvindelige gnide hendes mave nedad fra under hendes arm Gruber mod cloaca. Dette kan være en mekanisk måde til at skubbe æg ned ovikanalerne) (figur 4F, G).

Denne undersøgelse illustrerer, hvordan ultralyd kan give oplysninger til at fastslå reproduktiv status i kvindelige R. muscosa og necturus. Fire udviklingsstadier er repræsenteret i R. muscosa (figur 5c, D, E, F) og er ligeledes karakteriseret i necturus4 (figur 6a, B, C). Desuden kan resterende æg ikke udvises, hvilket fører til ægretention (figur 5g, figur 15a, B). Stage 1 viser en æggestok umiddelbart efter oviposition, hvor follikler er svære at visualisere (figur 5c). Stage 2 repræsenteres af udseendet af ekko geniske prikker (hvide pletter) spredt over æggestokkene (figur 5D). Fase 2 og 3 er repræsenteret af større, afrundede ekko generede prikker med mørke centre, der repræsenterer hammel medium til store follikler (figur 5e, F). Fra 2013-2017, fangenskab kvindelige Necturus blev undersøgt ved ultrasonografi på månedsbasis. Under hver eksamen blev enkeltpersoner tildelt en karakter score i henhold til de reproduktive kriterier, der er fastsat for slægten (tabel 2). Procentdelen af kvinder, som udvikler nye æg hvert år i gennemsnit 88,2 ± 3,01% (tabel 5). Mens ægudviklingen var høj, var oviposition ikke sikret (Figur 16). Et flertal af kvinder, der gennemgik oviposition deponeret den fulde supplement af æg, mens nogle individer deponerede kun en brøkdel af de æg, der udviklede. Disse R. muscosa og necturus hunner med opbevarede æg samtidig med væske øgning i kroppens hulrum blev udadtil visuelt forstørret med røde pletter på huden i overensstemmelse med brast blodkar (figur 14a, B ) . Graden af væskeophobning kan vurderes yderligere via ultralyd (figur 15B). I begge arter gennemgik de opbevarede æg atresi eller indtog et mere ekko fremkaldende udseende (figur 14C, D, figur 15a).

Hormon administration

Afhængigt af dybden af typen af injektion vil vinklen og dybden af nålen variere. For de fleste injektioner behøver dybden af nålen ikke være mere end 1 -2 mm dyb, når du arbejder med arter som R. muscosa , men vil variere i vinklen af penetration. Prostaglandin injektioner krævede en intra-muskuløs (im) nål indsættelse vinklet ved 90 °, ind i bagben af R. muscosa mens intra-peritoneale (IP) injektioner, med en lignende dybde til intra-muskuløse injektioner, blev administreret i området af til en 45 ° (figur 10). Administration af Amphiplex havde ingen signifikant effekt i at øge antallet af æg deponeret af hormon behandlede hunner sammenlignet med kontrol (P = 0,547), og der var heller ingen forskelle i antallet af embryoner, der spaltet (P = 0,673) eller overlevede til Tadpole (P = 0,629) (tabel 4). Generelt faldt andelen af hundyr ovipositing fra 80% i 2011 til 28% i 2014. Antallet af hundyr ovipositing i 2015 var signifikant højere end 2013 (P = 0,0002), 2013 (P = 0,0001) og 2014 (P = 0,0026), men ikke 2011 (P = 0,0885), hvilket bekræfter idéen om, at kvinder af denne art ikke må opdrætte årligt, og at hormonelle protokoller kræver refi nement. For R. muscosa hunner med tegn på ægopbevaring, intra-muskuløse injektioner af PGF2α havde en 60% succesrate i inducerende udvisning af degenererede æg. Men, i 1 af de 5 kvinder injiceres, PGF2α var ikke tilstrækkelig til at forårsage fuldstændig udvisning og nogle æg forblev inde i den kvindelige indtil følgende ynglesæson. 17 Necturus hunner fik LHRH/(GnRH) og 13 fik en fingeret injektion af sterilt vand til at fungere som kontrol (tabel 5). I alt, syv kvindelige Necturus (n = 4 alabamensis, n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) gik videre til oviposit elleve fuld koblinger, der blev tilskrevet både GnRH behandlet (n = 6) og kontrol (n = 5) individer. Tre kvinder (n = 2 beyeri, n = 1 maculosus) oviposited fem Partiklaser (Figur 13). Dette fænomen synes ikke at være forbundet med eksogen hormonbehandling, da tre kontrol hunner på samme måde deponerede delvise koblinger (tabel 5). Oviposition forekom over en 37-dages (3/31-5/7) tidsramme i løbet af fem år (tabel 5). Der var ingen forskel (P = 0,194) i ovipositions rater mellem LHRH/GnRH behandlet (41 ± 13,08%, interval 17-67%) og kontrol (66,75 ± 11,79%, interval 50-100%) Kvinder. LHRH/GnRH-behandlede hunner deponerede æg i gennemsnit 7,44 ± 1,41 (interval 3-13) dage efter injektion. I betragtning af den fulde akvatiske natur af arterne og manglende evne til manuelt at begrænse uden anæstesi var det nødvendigt at sikre et passende niveau af sedation før udførelse af IP-hormon injektioner (Se afsnit 3,2 for instruktioner om anæstesi).

Blod opsamling, anæstesi og kirurgi

Den blodprøvetagning teknik i denne artikel blev taget fra Forzan et al. 201310 og har vist sig en effektiv måde at indsamle blod fra R. muscosa med minimal invasivitet og stress. Ved brug af microhematocrit-rør kan der opsamles ca. 35-45 μl plasma eller serum pr. 70 μL fuldblod (figur 7). Maksimal indsamlings volumen i R. muscosa var 1 fuld microhematocrit tube pr 10 g frøen, op til 4 rør pr. frø for frøer 40 g og større. Dette var en konservativ indsamlings volumen på 0,7 mL pr. 100 g, 70% af den maksimale anbefaling på 1,0 mL pr. 100 g (tilpasset fra Allender og Fry, 2008)13.

Anæstesi og kirurgi i padder er sjældent rapporteret, men det er vigtigt at bemærke, at doser og effektivitet vil variere i en Arts-specifik måde. I Bombina orientalis for eksempel, MS222 har en meget lav effekt, selv med høje doser (1 g/L) mens der i boreale toads, Anaxyrus Boreas, 1 g/L er hurtig (spørgsmål om minutter) og langtidsholdbare (3 + h) (Calatayud, personlig observation). I R. muscosa, anæstesi kræver doser rapporteret for A. Boreas Boreas og har lignende virkning og inddrivelse gange. Faste padder før anæstesi er normalt ikke påkrævet, da deres strubehoved forbliver tæt lukket selv under generel anæstesi. Men hvis det skønnes nødvendigt, især hvis anæstesi proceduren er at omfatte celomic kirurgi, dyr kan fastede 24 h før anæstesi.

Under operationen er den opretterende refleks den primære indikator for, at dyret er blevet bedøvet. Den oprettelighed refleks er evnen og graden af lethed, hvormed et dyr kan vende tilbage til en oprejst position efter at være blevet placeret på ryggen. Tab af refleks tyder på en lys fase af anæstesi. Et kirurgisk plan er indikeret ved tab af tilbagetræknings refleks, som omfatter let træk på lemmen for at rette det, og dyret ikke længere er i stand til at trække det tilbage7. Reproduktiv kirurgi har ingen overvældende forhindringer og amfibie patienter hovedsageligt helbrede godt tolererer blodtab mere end højere hvirveldyr. Kirurgi bør gå hurtigt, varig ca 15 minutter fra start til. Trin skal timet omtrent som følger: < 1 minut for den oprindelige indsnit og < 2 minut for celiotomi og retraktor indsættelse, < 2-3 minutter for isolation pr ovarier og < 1 minut for fartøj sutur eller kauterisation og hud sutur < 4 minutter. Den samlede restituerende tid efter operationen med MS222 protokoller er ca. 45 minutter, men dette kan være artsspecifikt. I A. Boreas Boreas og R. muscosa inddrivelse gange kan være længere, op til 1 – 2 h. Når du udfører kirurgi, skal der udvises forsigtighed for at undgå punktering af lungerne, mave-tarmkanalen eller en udspilet blære, og ikke for at beskadige de makroskopiske kirtler, lymfe hjerter og blodkar, især Mid-ventral vene. Afhængigt af sæsonen, tilstedeværelsen af store fedt legemer kan gøre visualisering af andre organer vanskeligt. Når det er synligt vågen, et dyrs respons på lemmer stimulation, såsom modstand mod en blid strækning af en ryg lemmer eller blinker, når området omkring øjet stimuleres (personlig observation), er klassificeret som tilbagetrækning svar. Den stabilite refleks sammen med andre genopretnings indikatorer, herunder abstinens reflekser og gular bevægelser, er vigtige indikatorer for genopretning.

Administration
Almindeligt navn Arter Hormon Procedure Priming sammensatte Priming dosis rapporteret Antal priming doser Timing (hr før ægulerende dosis) (E) forbindelse (er) administreret til endelig ægulerende/oviposition Doser Reference
Puertoricansk Crested TOAD Peltophryne lemur GnRH & hCG Ip Hcg 1,5 IE/g 2 hCG-48 GnRH HCG GnRHa + hCG 0,2 μg; 4 IE; 0,5 μg + 4 IE Calatayud et al. ikke offentliggjort
Bjerg gul-benet frø Rana muscosa Amphiplex, lut Ip GnRHa (des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9-GnRH) 0,4 μg/g 1 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g Calatayud et al., 2018
PGF2α Im PGF2α 5 ng/g 1 48 PGF2α 5 ng/g
Southern Rocky Mountain Boreal TOAD Anaxyrus Boreas Boreas hCG, GnRH Ip Hcg 3,7 IE/g 2 96, 24 hCG + GnRHa 13,5 IE/g + 0,4 μg/g Calatayud et al., 2015
Northern cricket Frog Acris crepitan Amphiplex tilsat vand (10 mL) Ingen Ingen 0 Na GnRH + MET 0,17 μg + 0,42 μg/μl Snyder et al., 2012
Northern Leopard Frog Lithobates pipiens Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g Trudeau et al., 2010
Argentinsk horned Frog Ceratophyrs ornata Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Cranwell horned Frog Ceratophrys cranwelli Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Amerikansk jord Frog Amerikansk amerianus Amphiplex Ip Ingen Ingen 0 24 GnRH + MET 1 x 0,4 μg/g + 10 μg/g
Dusky Gopher Frog Rana sevosa hCG, GnRH Ip Hcg 3,7 IE/g 2 96, 24 GnRH + hCG 1 x 0,4 μg/g + 13,5 IE/g Graham et al., 2018
Almindelig Coqui Eleutherodactylus Coqui Fisk, aviær, pattedyr & GnRH (D-ALA, des-Gly, ETH LHRH), hCG Sc mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa Hcg Ingen 0 Na mLHRH;  aLHR; fLHRH; GnRHa Hcg 7μg, 33 μg; 28μg; 7μg, 20μg; 5, 10, 15, 20 μg 165 IE Michael et al 2004
Gunthers toadlet Pseudophryne guentheri Gnrh GnRHa 0,4 μg/g 1 26 GnRHa med eller uden Prime 0,4 μg/g Silla 2010
Behersker af frø Pseudophryne bekræfter Lucrin Sc Lucrin 1 μg 1 26 Lucrin 5 μg Byrne & Silla, 2010
Nordlige understøttende ee Frog Pseudophryne pengilleyi GnRHa GnRH (D-ALA, des-Gly, ETH LHRH) Ta Ingen Ingen 0 Na GnRHa 0,5-2,0 μg/g Silla et al., 2017
Gulf Coast waterdog Necturus beyeri [des-Gly10, D-Ala6]-LhRH-RH-ethylamid acetat salt hydrat Ip Ingen Ingen 0 Na Lhrh 100 μg/500 μL Stoops et al., 2014
Sydlige klokke frøen/growling græs frø Litoria raniformis des-Gly10, D-Ala6-[LHRH] Sc Ingen Ingen 0 Na des-Gly10, D-Ala6-[LHRH] 50 μg Mann et al., 2010
Fowler's TOAD Anaxyrus Fowleri GnRH, hCG, P4 Ip Hcg 3,7 IE/g Browne et al., 2006
Axolotl (mexicansk Salamander) Ambystoma mexicanum Follikelstimulerende hormoner Im Ingen Ingen 0 Na Fsh 400IU Trottier og Armstrong, 1974
Afrikansk clawed Frog Xenopus laevis hCG & P4 tilsat vand; Ip PMSG, hCG Marcec, 2016
Tiger Salamander Ambystoma tigrinum hCG, LH
Wyoming TOAD Anaxyrus baxteri hCG, GnRHa, P4 Ip hCG + GnRHa 100 IE + 0,8 μg 1 72 hCG + GnRHa 100 IE + 0,8 μg Browne et al., 2006
Northern Leopard Frog Lithobates pipiens Hypofyse ekstrakt (PE), P4, testosteron (T), kortikosteron [C], Amphiplex, Domperidon (D) SC, IP Ingen Ingen 0 Na PE, PE + T, PE + P4, PE + C; Amphiplex, GnRH + D ~ 100 IE (LHRH) i 1 mL; PE + 0,002 μg/μL PE + 0,01 mg/50mL; PE + 0,1 mg/50mL; 0,4 μg/g + 10 μg/g;  0,4 μg/g + D Wright af 1961; Fort, 2000; Trudeau et al., 2013
Jord frøen Har du ikke mere at Hypofyse ekstrakter, hCG, GnRHa, PZ Ip GnRHa 0,9-1,2 μg/g + PZ 10 μg/g 1 20 PE PE + hCG; GnRH + PZ PE vol; PE vol + 100 IE hCG; GnRH (0,9-1,2 μg/g) + PZ (10μg/g) Clulow et al., 2018
Grøn og gylden klokke frøen Litoia Aurea Gnrh Ip GnRHa 10 μg 1 72 GnRHa + hCG 20 μg + 300 IE Clulow et al., 2018
Stor spærret frø Mixophyes fasciolatus hCG & PMSG Sc PMSG, hCG 50 IE & 25 IE; 1x100 IE 2 2 PMSG-144 & 96;  hCG-24 Hcg 100 IE Clulow et al., 2012
For flere hormon protokoller og arter Se Wright og Whitaker, 2001

Tabel 1: amfibie arter og nogle af de eksogene hormoner testet på dem som rapporteret i litteraturen. Humant choriongonadotropin gonadotropin (HCG); Gonadotropin releasing-hormon (GnRH); Lutenizing hormon-releasing hormon (LHRH); bogstaverne m, a og f repræsenterer» pattedyr «,» aviær «og» fisk «. gravid Mare serum gonadotropin (PMSG); progesteron (P4); Follikelstimulerende hormon FSH); hypofyse ekstrakt (PE); testosteron (T); kortikosteron (C). Dopamin antagonister opført omfatter: Domperidon (D); Pimozid (P); Metoclopramid (MET). Amphiplex er navngivet til en forbindelse, der består af GnRH og Metoclopramide27. Lucrin er en kommercielt tilgængelig GnRH agonist, hvor det aktive stof er leuprorelin acetat. 4 , 7 , 17 , 18 , 19 , 20 , 26 , 27 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44 , 45

Grade Reproduktiv status Beskrivelse
0 Ikke-gravid Ingen æg synlige.
1 Early gravid Æg synlige (1-2mm i størrelse) ingen distinkt ekkogen linje forbundet med æg.
2 Mid gravid Æg 2-3mm i størrelse, særskilte ekko geniske linje (r) forbundet med hvert æg.
3 Late gravid Æg 4-5mm i størrelse, ekko geniske linjer stadig synlige, markant stigning i afskærmet rum udseende af æg.
4 Opbevarede æg Varierende grader af ekkogen materiale til stede i interne ægstruktur, tage på amorfe form. Nogle kan blive meget ekko fremkaldende og forbundet med væskeophobning i kroppens hulrum.

Tabel 2: klassificeringssystem, der anvendes til at score den reproduktive tilstand af fangenskab kvindelige Necturus og Rana muscosa ved ultrasonografi.

Stof Dosering og rute Bemærkninger-reference
Buprenorphin 50 mg/kg (intracelomic) Eksperimentel undersøgelse i en østlig rød-plettet Newt (Notophthalmus viridescens). Analgesia skal gives før operationen. (Koeller, 2009)
Butorphanol 1 – 10 mg/kg (IM eller intracelomic) Der er forskellige specifikke respons. Det tilrådes at starte ved 1 mg/kg.
Butorphanol 0,5 mg/L (bad) Eksperimentel undersøgelse i en østlig rød-plettet Newt (Notophthalmus viridescens). (Koeller, 2009)
Fentanyl 1 mg/kg Analgesi > 4 h, antagoniseret af naltreen (Stevens, 1997)
Meloxicam 0,1 til 0,2 mg/kg (IM) (Minter, 2011)

Tabel 3: protokoller for analgesi i padde.

Rana muscosa
År 2014 2015
No. ♀ 18 18
Æg udvikling 61% 94%
Kontrol ♀ 4 6
Amphiplex ♀ 4 7
Gennemsnitlig dag post Amphiplex til oviposit 10,5 10,9
Ovipositions rate (Amphiplex) 22,20% 33,33%
Ovipositions-hastighed (kontrol) 22,20% 38,88%

Tabel 4: en sammenligning af reproduktive parametre mellem amphiplex-behandlet sammenlignet med kontrol fangenskab kvinde Rana muscosa i 2014 og 2015.

Necturus Sp.
År 1 2 3 4 5
No. ♀ 6 7 7 7 7
Æg udvikling 83% 100% 86% 86% 86%
LHRH ♀ 3 5 3 6 0
Kontrol ♀ 2 2 3 0 6
Dag efter LHRH til Oviposit 5 7 5,5 (interval 3-8) 13 Nielsen
Ovipositions rate (LHRH) 60% 20 67% 17 Nielsen
Ovipositions-hastighed (kontrol) 50% 50% 100% Nielsen 67%
* n = 1 ♀ ingen ægudvikling

Tabel 5: sammenligning af reproduktive parametre mellem LHRH (GnRH) -behandlede og kontrol (sterilt vand) fangenskab kvinde Necturus fra tre arter over en 5-årig periode (2012-2017).

Figure 1
Figur 1: tre metoder til at holde en frø. A) procedure 1. B) procedure 2. C) procedure 3. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Morphometriske vurderinger. (A, B) SVL/SUL (C, D). vægt, i R. muscosa og D. necturus. (E). størrelses måling med kalibre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: seksuel dimorfi er kendetegnet ved ægteskabs tommelfinger Pads på voksne R. muscosa mænd sammenlignet med kvinder. (A) kvindelig (B) mand. Det nederste panel viser længden af mandlige vs kvinde. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: karakterisering af reproduktions adfærd, som fører op til oviposition i R. muscosa (A) bejdning. (B) amplexus. (C) mand klemme kvindelige mens i amplexus. (D, E) Amplexed kvinde i en hånd-stativ. (F, G) Abdominal sammentrækninger og oviposition. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: ultralyd udført på R. muscosa A-B med reproduktiv status i henhold til udviklingsmæssige fase4. (A, B) udfører ultralyd på Rana muscosa. C) lønklasse 0. D) grad 1. E) grad 2. F) grad 3. G) grad 4 (ægulerede og opbevarede æg) Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: ultralyd billeder af Necturus. A) lønklasse 1. B) grad 2. C) klasse 3-æg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: blod opsamling i R. muscosa. (A) blod opsamling ved at punktere Vena orbitalis posterior facial vene lige overkæbe linjen i midten af kredsløbet. (B, C) Blodet frigives på hudens overflade og opsamles med et hepariniseret kapillar rør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 8
Figur 8: injektionsmetoder i amfibier. Afhængigt af dybden af typen af injektion vil vinklen og dybden af nålen variere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 9
Figur 9: hormonel injektion i R. muscosa. Induktion af oviposition ved hormonal behandling i Rana muscosa hunner injiceres med amphiplex intra-peritoneally. Æggestokke kan findes i den coelomic hulrum Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 10
Figur 10: forberedelse før operationen. A) aseptisk klargøring af operationsområdet ved anvendelse af fortyndet povidon-jod-opløsning (1/10), Trachycephalus resinifictrix. (B) ren skalpel indsnit i en xenopus laevis eller, (C) laser-diode hud indsnit, Lithobates catesbeianus. D) undgå at beskadige Mid ventral vene, Trachycephalus resinifictrix. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 11
Figur 11: Ovariektomi i Xenopus laevis. A) udsætte og flytte store fedt legemer for at afdække ægmassen. B) punktafgiftspligtige en del af ægmassen uden at ligere blodkarrene. (C) cauterize omgivende blodkar ved elektro kautery for komplet ovariektomi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 12
Figur 12: præ-kirurgisk præparat og ovariektomi i A. mexicanum. A) steril gaze gennemblødt, 0,75% chlorhexidinopløsning anvendt på operationsstedet (B). En linje mellem skulderen og bagbenene opdeler dyret i tre lige store dele, og den blå plet markerer stedet på incision. (C) trække de coelomic indsnit med øjenlåg retraktorer. (D) for komplet ovariektomi, ætse de omgivende blodkar ved elektro kautery. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 13
Figur 13: visuel vurdering af reproduktions stadier. (A, B) Visuel vurdering af reproduktions stadiet gennem semi-gennemskinnelig hud, Necturus. (C) gennemskinnelige hud, Hyalinobatrachium (glas Frog). D) visuel vurdering af R. muscosa før (højre, blå linje) og efter oviposition (venstre-gul linje). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 14
Figur 14: ægretention. (A, B) Kvindelige Rana muscosa med svær tilfælde af ægretention. (C) ultralyd viser gamle degenererede, æg (top) og større æg (midterste og nederste panel) ovulerede og fanget i coelom. D) lagrede æg, som er hentet ved manuel stripning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 15
Figur 15: ultralydsbilleder af opbevarede æg i Necturus , som (a) blev ekko fremkaldende i udseende (cirkel) og var forbundet med (B) væskeophobning i kroppens hulrum (pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 16
Figur 16: procentdel af det bundne kvindelige Necturus , som oviposited fuld eller delvis koblinger (2013-2017) sammenlignet med dem, der ikke oviposit. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Direkte håndtering, visuel observation og morphometriske foranstaltninger giver ikke-invasive teknikker og er de første vurderingskriterier for bestemmelse af kvindelig reproduktionsfase. Denne undersøgelse viser dog, at gravid ovarier ikke altid kan identificeres pålideligt ved palpation. Afhængigt af arten kan gravid æggestokke undertiden påvises visuelt gennem semi-gennemskinnelig (figur 13a, B) eller fuldstændig gennemsigtig hud på den ventrale side af dyret (figur 13c). Kvinder, der har afsluttet oviposition kan vise tydelige ændringer i deres udseende sammenlignet med gravid kvinder (f. eks løs hud og tab af op til 30% af deres kropsmasse, figur 13D). Under avl, hanner og hunner vil vise visse adfærd, der giver oplysninger om nærhed til ægløsning og oviposition. I tilfælde af R. muscosa indikationer på, at en kvindelig er tæt på oviposition begynde med den kvindelige ind i hånd stande.

Anvendelsen af ultralyd teknologi til Anurans og Caudates tillader diagnosticering af tilstedeværelse eller fravær af æg og om oviposition var forbundet med fuldstændig eller delvis frigivelse af udviklede æg. Således giver denne metode en mere fuldstændig og præcis vurdering af reproduktiv status uden at være begrænset til bestemmelse gravid/ikke-gravid status via en visualisering teknik, der varierer efter abdominal hud gennemsigtighed, eller epidermal konsistens blandt de forskellige amfibie arter. Ultralyd kan udføres med relativ lethed og med lidt stress til dyrene (figur 5 og Figur 13) og kan bruges til at karakterisere reproduktive cyklusser og til at bestemme reproduktions status4. Det er afgørende at blive fortrolig med arterne; denne undersøgelse viste imidlertid, at Necturus og R. muscosa har fælles udviklingsmæssige tegn i deres reproduktions mønstre, der giver mulighed for en tilsvarende klassificering af reproduktions stadiet (figur 5). Gennem denne teknologi er der nu beviser for, at ægudvikling er høj i fangenskab Necturus og R. muscosa , og at begge disse arter følger en sæsonbestemt mønster. Selv om årsagerne til disse fænomener er ukendte og kræver yderligere undersøgelse, uden brug af ultralyd, flere områder af æggestokkene dysfunktion, såsom æg retention og delvis oviposition, ville have gået uopdaget. Fremtidige anvendelser til denne teknik vil blive brugt til at afgøre, om kvinder skal udvælges til avl i et givet år, og om oviposition er komplet.

En blod indsamlings protokol, som den, der præsenteres i R. muscosa, som er både effektiv og forårsager minimal lidelse for dyret, er optimal til at studere hormon profiler i fangenskab og Vildtfangede anuraner (Calatayud, ikke offentliggjort). Til dato foreligger der ingen oplysninger om de årlige hormon profiler af captive R. muscosa og derfor ingen viden om, hvordan hormoner påvirker deres helbred og reproduktion. Desuden, med bevis for, at kvinder af denne art ikke kan være årlige opdrættere, hormonelle profilering vil være en anden metode til sporing af æggestokkene cyklusser. Sammen med ultralyd, hormon analyse kan føre til bedre forudsigelse af, hvad kvinder vil være klar til oviposition. Desuden er to tilfælde af interkønnet i den bundne R. muscosa -population blevet dokumenteret i det forløbne år. Desuden er udviklingen af tommelfinger Pads blevet noteret på nogle af de ældre stiftende kvinder. Årsagerne til dette er i øjeblikket under undersøgelse, men de første resultater tyder på, at det kan vedrøre ændringer i testosteronniveauer (Calatayud, ikke offentliggjort). Kræsne hormonelle cyklusser hos kvinder i forskellige aldre vil hjælpe os med at forstå, hvorfor kvinder kan udvikle mand-associerede sekundære seksuelle karakteristika, og om dette forventes i en aldrende befolkning.

Udefrakommende hormonbehandling er blevet brugt til at overvinde reproduktive dysfunktioner ofte stødt på fangenskab amfibier. Men for både R. muscosa og necturus populationer i denne undersøgelse, ingen signifikante forskelle i oviposition mellem hormon-behandlede og kontrol hunner blev påvist over en 2 og 5-årig periode, hhv. Dette kan indikere, at hormon administration protokol, doser, priming og hormon kombination anvendes ikke var tilstrækkelig for arten. En nærmere analyse af de enkelte kvindelige reproduktions historier antyder, at R. muscosa ikke kan opleve en årlig avl, hvilket også kan være en følge af den manglende hormonelle virkning hos behandlede kvinder. Fordi en vis procentdel af kvinder konsekvent sprunget avl hvert år, forstå den naturlige historie af arterne kan hjælpe med at afgøre, om der er behov for udefrakommende hormoner, og når de kan være mest effektive. De procedurer, der er skitseret i denne artikel kan anvendes på en række arter, (tabel 1) og er for anurere spænder fra 5 g til 150 g; større dyr kan kræve forskellige sprøjter og nåle målere. Injektionsstedet varierer med nogle hormoner, der kræver intra-muskuløs, intra-peritoneal, subkutan eller intradermal injektion (figur 7).

Kirurgi med henblik på ovariektomi er en almindelig metode, der anvendes i forskellige amfibie arter for at opnå oocytter til embryologiske undersøgelser. Ovariektomi kan også være indiceret til populations kontrol og medicinske spørgsmål såsom ægretention. I tilfælde af partielle ovariectomier, hvor der udføres oocyt-høst til forskningsformål, skal operationen sikre, at dyret forbliver reproduktions ligt. Administration af PGF2α har vist nogle løfte om at løse ægretention i kvindelige R. muscosa. I flere individer fremkaldte PGF2α fuldstændig deposition af tidligere opbevarede æg, men i andre var der kun delvis aflejring, som krævede manuel stripping for at fjerne alle æggene. Mens PGF2α kan tjene som et alternativ til kirurgi for Ægretention i R. muscosa, dens evne til at afhjælpe lignende patologiske tilstande i andre padder vil kræve artsspecifik validering. Når kirurgisk indgreb er bemyndiget til Anuran eller hale patient, er det nødvendigt at sikre et passende plan for anæstesi, før indsnit er lavet. Astute observation færdigheder er nødvendige for at vurdere og overvåge de normative induktion og nyttiggørelse svar som skitseret i denne undersøgelse for hver af taxa. Når man er fortrolig med den specifikke anatomi, en passende kirurgisk tilgang, hæmostase, blid vævs manipulation og passende postoperative forvaltning, reproduktive operationer udgør ingen overvældende forhindringer.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Natalie Calatayud vil gerne takke Dr. Barbara Durrant for uddannelse og assistance med ultralyd og Exploradora de Immuebles, S.A. (EISA) for tildeling af økonomisk støtte til min forskning Associate position på SDZG. Tak til Dr. Kylie Cane for kommentarer til manuskriptet samt til de officielle anmeldere (hvem de end måtte være). Tak til Jonathan Dain vores 2018 sommer stipendiat, San Diego Zoo Institut for bevaring forskning for at give billeder (figur 1a, B). Monica stoops udvider påskønnelse til sammenslutningen af zoologiske haver og akvarier Conservation fond og Disney verdensomspændende bevarings fond for at yde økonomisk støtte til at etablere den bundne Necturus befolkning. Desuden blev støtten også modtaget via private donationer fra padde Advocate MS. iris de la Motte. Tak, er givet til hr. Christopher DeChant og Dr. Mark Campbell for deres betydelige bidrag til forskningen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems GE medical systems GE logiq Book XP Ultrasound
Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex GE medical systems 8C-RS (10 MHz) Ultrasound probe
BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle) Mettler Electronics Corp CA Sonigel Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
Hormone
Gonadotropin releasing hormone BACHEM 4012028 synonym: [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate
abbreviation: GnRH
Lutenizing hormone releasing hormone BACHEM, Sigma-Aldrich 4033013;     L1898 synonym: Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2 acetate salt;
[D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate
abbreviation: LHRH
Human chorionic gonadotropin BACHEM, Sigma-Aldrich 4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10 synonym: Chorionic gonadotropin-β (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)
abbreviation: hCG
Prostaglandin 2α Sigma-Aldrich P40424; synonym: (5Z,9α,11α,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2α−Tris;
abbreviation: PGF2α
Follicle-stimulating hormone Sigma-Aldrich F4021, F8174 synonym: porcine, sheep
abbreviation: FSH
Progesterone Sigma-Aldrich 46665;      P7556 synonym: Vetranal; P4 water soluble
abbreviation: P4
Pituitary extract na synonym: Check papers for amphibian species derivation
abbreviation: PE
Pregnant Mare Serum Gonadotropin Prospec;       Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich HOR-272;    493-10; 9002-70-4 synonym: Pregnant Mare Serum Gonadotropin
abbreviation: PMSG
Metaclopromide Sigma-Aldrich M0763 synonym: 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide
abbreviation: MET
Lucrin BACHEM; Sigma-Aldrich 4033014;   L0399 synonym: Leuprorelin acetate
abbreviation: Lucrin
Lutalyse Pfizer synonym: PGF2α - Dinoprost tromethamine
abbreviation: Lut
Pimozide Sigma-Aldrich P1793 synonym: 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one
abbreviation: PZ
Amphiplex see above synonym: Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide
abbreviation: GnRH + MET
Ovopel Ovopel na synonym: GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg)
abbreviation: Ovo
Ovaprim Pentair aquatic eco-systems Ova10 synonym: Salmon gonadotropin + domperidone
abbreviation: Ova
Domperidone Sigma-Aldrich D122 synonym: 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine
abbreviation: DOM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conde, D. A., Flesness, N., Colchero, F., Jones, O. R., Scheuerlein, A. An emerging role of zoos to conserve biodiversity. Science. 331 (6023), 1390-1391 (2011).
  2. Conde, D. A., et al. Zoos through the Lens of the IUCN Red List: A Global Metapopulation Approach to Support Conservation Breeding Programs. PLoS ONE. 8 (12), e80311 (2013).
  3. Morrison, C., Hero, J. -M. Geographic variation in life-history characteristics of amphibians: a review. Journal of Animal Ecology. 72 (2), 270-279 (2003).
  4. Calatayud, N. E., Stoops, M., Durrant, B. S. Ovarian control and monitoring in amphibians. Theriogenology. , 70-81 (2018).
  5. National Research Council. Institutional Animal Care and Use Committee Guidebook. , (2010).
  6. Peig, J., Green, A. J. New perspectives for estimating body condition from mass/length data: the scaled mass index as an alternative method. Oikos. 118 (12), 1883-1891 (2009).
  7. Graham, K. M., Langhorne, C. J., Vance, C. K., Willard, S. T., Kouba, A. J. Ultrasound imaging improves hormone therapy strategies for induction of ovulation and in vitro fertilization in the endangered dusky gopher frog (Lithobates sevosa). Conservation Physiology. 6 (1), coy020 (2018).
  8. Wright, K. M., Whitaker, B. R. Amphibian Medicine and Captive Husbandry. , Krieger Publishing Company. (2001).
  9. Forzán, M. J., Vanderstichel, R. V., Ogbuah, C. T., Barta, J. R., Smith, T. G. Blood collection from the facial (maxillary)/musculo-cutaneous vein in true frogs (family Ranidae). Journal of Wildlife Diseases. 48 (1), 176-180 (2012).
  10. Allender, M. C., Fry, M. M. Amphibian hematology. Veterinary Clinics of North America: Exotic Animal Practice. 11 (3), 463-480 (2008).
  11. Green, S. L., Parker, J., Davis, C., Bouley, D. M. Ovarian hyperstimulation syndrome in gonadotropin-treated laboratory South African clawed frogs (Xenopus laevis). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 46 (3), 64-67 (2007).
  12. Jorgensen, C. B. External and internal control of patterns of feeding, growth and gonadal function in a temperate zone anuran, the toad Bufo bufo. Journal of Zoology. 210 (2), 211-241 (1986).
  13. Jørgensen, C. B. Growth and reproduction. Environmental Physiology of the Amphibians. , 439-466 (1992).
  14. Vu, M., Trudeau, V. L. Neuroendocrine control of spawning in amphibians and its practical applications. General and Comparative Endocrinology. 234, 28-39 (2016).
  15. Clulow, J., Trudeau, V. L., Kouba, A. J. Amphibian declines in the twenty-first century: why we need assisted reproductive technologies. Reproductive Sciences in Animal Conservation. , 275-316 (2014).
  16. Kouba, A., et al. Assisted reproductive technologies (ART) for amphibians. Amphibian Husbandry Resource Guide. 2, 60-118 (2012).
  17. Clulow, J., et al. Optimisation of an oviposition protocol employing human chorionic and pregnant mare serum gonadotropins in the Barred Frog Mixophyes fasciolatus (Myobatrachidae). Reproductive Biology and Endocrinology. 10 (1), 60 (2012).
  18. Browne, R. K., Seratt, J., Vance, C., Kouba, A. Hormonal priming, induction of ovulation and in-vitro fertilization of the endangered Wyoming toad (Bufo baxteri). Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 34 (2006).
  19. Calatayud, N. E., et al. A hormone priming regimen and hibernation affect oviposition in the boreal toad (Anaxyrus boreas boreas). Theriogenology. 84 (4), 600-607 (2015).
  20. Stoops, M. A., Campbell, M. K., Dechant, C. J. Successful captive breeding of Necturus beyeri through manipulation of environmental cues and exogenous hormone administration: a model for endangered Necturus. Herpetological Review. 45 (2), 251-256 (2014).
  21. Mc Creery, B. R., Licht, P. Induced ovulation and changes in pituitary responsiveness to continuous infusion of gonadotropin-releasing hormone during the ovarian cycle in the bullfrog, Rana catesbeiana. Biology of Reproduction. 29 (4), 863-871 (1983).
  22. Johnson, C. J., Vance, C. K., Roth, T. L., Kouba, A. J. Oviposition and ultrasound monitoring of American toads (Bufo americanus) treated with exogenous hormones. Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 299, 301 (2002).
  23. Herbert, D. Studies of assisted reproduction in the spotted grass frog Limnodynastes tasmaniensis: ovulation, early development and microinjection (ICSI). , (2004).
  24. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2, 6 (2004).
  25. Ogawa, A., Dake, J., Iwashina, Y., Tokumoto, T. Induction of ovulation in Xenopus without hCG injection: the effect of adding steroids into the aquatic environment. Reproductive Biology and Endocrinology. 9 (1), 11 (2011).
  26. Silla, A. J. Effects of luteinizing hormone-releasing hormone and arginine-vasotocin on the sperm-release response of Günther’s Toadlet, Pseudophryne guentheri. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 139 (2010).
  27. Trudeau, V. L., et al. Hormonal induction of spawning in 4 species of frogs by coinjection with a gonadotropin-releasing hormone agonist and a dopamine antagonist. Reproductive Biology and Endocrinology. 8 (1), 36 (2010).
  28. Krause, E. T., von Engelhardt, N., Steinfartz, S., Trosien, R., Caspers, B. A. Ultrasonography as a minimally invasive method to assess pregnancy in the fire salamanders (Salamandra salamandra). Salamandra. 49, 211-214 (2013).
  29. Browne, R. K., Li, H., Seratt, J., Kouba, A. Progesterone improves the number and quality of hormone induced Fowler toad (Bufo fowleri) oocytes. Reproductive Biology and Endocrinology. 4 (1), 3 (2006).
  30. Bramucci, M., et al. Different modulation of steroidogenesis and prostaglandin production in frog ovary in vitro by ACE and ANG II. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 273 (6), R2089-R2096 (1997).
  31. Gobbetti, A., Zerani, M. Possible roles for prostaglandins E2 and F2α in seasonal changes in ovarian steroidogenesis in the frog (Rana esculenta). Journal of Reproduction and Fertility. 98 (1), 27-32 (1993).
  32. Gobbetti, A., Zerani, M., Carnevali, O., Botte, V. Prostaglandin F2α in female water frog, Rana esculenta: Plasma levels during the annual cycle and effects of exogenous PGF2α on circulating sex hormones. General and Comparative Endocrinology. 80 (2), 175-180 (1990).
  33. Guillette, L. J. Jr, Dubois, D. H., Cree, A. Prostaglandins, oviducal function, and parturient behavior in nonmammalian vertebrates. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 260 (5), R854-R861 (1991).
  34. Clulow, J., Mahony, M., Browne, R., Pomering, M., Clark, A. Applications of assisted reproductive technologies (ART) to endangered anuran amphibians. Declines and Disappearances of Australian Frogs'. Campbell, A. , 219-225 (1999).
  35. Browne, R. K., Wolfram, K., García, G., Bagaturov, M. F., Pereboom, Z. Zoo-based amphibian research and conservation breeding programs. Amphibian and Reptile Conservation. 5 (3), 1-14 (2011).
  36. Chai, N. Surgery in amphibians. Veterinary Clinics: Exotic Animal Practice. 19 (1), 77-95 (2016).
  37. Gentz, E. J. Medicine and surgery of amphibians. Ilar Journal. 48 (3), 255-259 (2007).
  38. Snyder, W. E., Trudeau, V. L., Loskutoff, N. M. 168 a noninvasive, transdermal absorption approach for exogenous hormone induction of spawning in the northern cricket frog, Acris crepitans: a model for small, endangered amphibians. Reproduction, Fertility and Development. 25 (1), 232-233 (2012).
  39. Kouba, A. J., et al. Emerging trends for biobanking amphibian genetic resources: the hope, reality and challenges for the next decade. Biological Conservation. 164, 10-21 (2013).
  40. Michael, S. F., Buckley, C., Toro, E., Estrada, A. R., Vincent, S. Induced ovulation and egg deposition in the direct developing anuran Eleutherodactylus coqui. Reproductive Biology and Endocrinology. 2 (1), 6 (2004).
  41. Fort, D. J. Frog reproduction and development study 2000 rana pipiens reproduction and development study. , Environmental Protection Agency. (2003).
  42. Clulow, J., et al. Differential success in obtaining gametes between male and female Australian temperate frogs by hormonal review: A Review. General and Comparative Endocrinology. 265, 141-148 (2018).
  43. Trottier, T. M., Armstrong, J. B. Diploid gynogenesis in the Mexican axolotl. Genetics. 83 (4), 783-792 (1976).
  44. Marcec, R. M. Development of assisted reproductive technologies for endangered North American salamanders. , Mississippi State University. (2016).
  45. Wright, M. L. Melatonin, diel rhythms, and metamorphosis in anuran amphibians. General and Comparative Endocrinology. 4, (2002).

Tags

Biologi Circadian ægretention celiotomi eksogene hormoner ultralyd og ovariektomi.
Reproduktive teknikker til overvågning og kontrol af æggestokkene i padde
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, … More

Calatayud, N. E., Chai, N., Gardner, N. R., Curtis, M. J., Stoops, M. A. Reproductive Techniques for Ovarian Monitoring and Control in Amphibians. J. Vis. Exp. (147), e58675, doi:10.3791/58675 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter