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Genetics

Murine ब्राउन वसा ऊतक के क्रोमेटिन Immunoprecipitation

Published: November 21, 2018 doi: 10.3791/58682
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Biochemistry Department, Boston University School of Medicine, 2Bioinformatic Hub, Boston University

Summary

यहाँ हम कुशल क्रोमेटिन immunoprecipitation के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन (चिप) ब्राउन वसा ऊतक के उच्च प्रवाह डीएनए अनुक्रमण (चिप-seq) द्वारा पीछा किया (बैट) एक माउस से पृथक. इस प्रोटोकॉल दोनों मानचित्रण हिस्टोन संशोधनों और vivo मेंब्याज की गैर हिस्टोन प्रोटीन के जीनोम व्यापक स्थानीयकरण की जांच के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

सबसे सेलुलर प्रक्रियाओं विशिष्ट जीन कार्यक्रमों के transcriptional मॉडुलन द्वारा विनियमित रहे हैं । इस तरह मॉडुलन प्रतिलेखन कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला के संयुक्त कार्यों के माध्यम से हासिल की है (TFs) और cofactors मध्यस्थता transcriptional सक्रियण या दमन क्रोमेटिन संरचना में परिवर्तन के माध्यम से. क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) एक उपयोगी हिस्टोन संशोधनों मानचित्रण और प्रतिलेखन कारकों/cofactors डीएनए के लिए बाध्यकारी, इस प्रकार गतिशील परमाणु विभिंन के दौरान होने वाले परिवर्तन का एक स्नैपशॉट प्रदान करने के लिए आणविक जीवविज्ञान दृष्टिकोण है जैविक प्रक्रियाओं ।

वसा ऊतक, में से व्युत्पंन नमूनों में transcriptional विनियमन का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो सेल संस्कृतियों का अमरता या प्राथमिक सेल लाइनों अक्सर क्योंकि सामग्री शुरू करने और कम जैविक परिवर्तनशीलता की बहुतायत की चिप परख में इष्ट हैं । हालांकि, इन मॉडलों के रहने वाले जीवों में वास्तविक क्रोमेटिन राज्य के एक सीमित स्नैपशॉट का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस प्रकार, वहां अनुकूलित प्रोटोकॉल के लिए एक महत्वपूर्ण की जरूरत है वसा ऊतक पशु मॉडलों से व्युत्पंन नमूनों पर चिप प्रदर्शन ।

यहां हम हिस्टोन संशोधनों और भूरे वसा ऊतक (चमगादड़) एक माउस से अलग में गैर हिस्टोन प्रोटीन के कुशल चिप-seq के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन । प्रोटोकॉल एक आकृति विज्ञान और वसा डिपो के बीच शारीरिक रूप से अलग ऊतक है जो बल्ले में ब्याज और epigenetic मार्करों के प्रोटीन के जीनोम व्यापक स्थानीयकरण की जांच के लिए अनुकूलित है ।

Introduction

जबकि सफेद वसा ऊतक (वाट) ऊर्जा भंडारण के लिए विशेष है, ब्राउन वसा ऊतक (बैट) गर्मी के रूप में ऊर्जा के अपव्यय को तापीय ऊर्जा में कार्बोहाइड्रेट और लिपिड mitochondrial uncouplन1 के माध्यम से परिवर्तित करने की क्षमता के कारण । इस विशेष समारोह के कारण, चमगादड़ डिपो शारीरिक स्थितियों में शरीर के तापमान के रखरखाव के लिए और ठंड जोखिम के जवाब में आवश्यक है । जबकि जीन भेदभाव के दौरान अभिव्यक्ति परिवर्तन और thermogenic तनाव पर बड़े पैमाने पर vivo में अध्ययन किया गया है और इन विट्रो में, इन परिवर्तनों अंतर्निहित आणविक तंत्र ज्यादातर अमर कोशिका लाइनों और प्राथमिक में विच्छेदित किया गया है पूर्व adipocytes, vivo अध्ययन में कई के अपवाद के साथ2,3,4,5.

transcriptional विनियमन के माध्यम से विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रमों के विनियमन विभिन्न प्रतिलेखन कारकों और सह कारकों क्रियाओं के माध्यम से क्रोमेटिन संरचना में समंवित परिवर्तन द्वारा हासिल की है । क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) डीएनए के लिए इन कारकों की भर्ती की जांच करने के लिए और क्रोमेटिन परिदृश्य में जुड़े परिवर्तनों की रूपरेखा के लिए एक मूल्यवान आणविक जीवविज्ञान दृष्टिकोण है । चिप प्रयोगों की सफलता के लिए मुख्य कारक crosslinking स्थितियों और विभिन्न नमूनों भर में क्रोमेटिन बाल काटना निरंतरता का अनुकूलन, पर्याप्त प्रारंभिक सामग्री की उपलब्धता, और, सबसे विशेष रूप से, एंटीबॉडी की गुणवत्ता शामिल हैं. जब पूरे ऊतकों से चिप प्रदर्शन कर, यह भी नमूनों की विविधता पर विचार करने के लिए महत्वपूर्ण है और नाभिक अलगाव की दक्षता में सुधार करने के लिए प्रोटोकॉल का अनुकूलन, बाद एक विशेष रूप से संवेदनशील कदम जा रहा है जब वसा के कारण ऊतक के साथ काम करने के साथ ऊंचा लिपिड सामग्री । वास्तव में, पूरे वसा डिपो से आणविक अलगाव की तकनीक ट्राइग्लिसराइड्स के उच्च स्तर की उपस्थिति से जटिल हैं, और प्रोटोकॉल क्रोमेटिन अलगाव की मात्रा में वृद्धि करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए. अंत में, जब उच्च-प्रवाह अनुक्रमण चिप-डीएनए अलगाव के बाद किया जाता है, sequencing गहराई आत्मविश्वास से पता लगाया है कि चोटियों की संख्या निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

यहां, हम काम कर रहे मानकों और चिप के लिए सामांय दिशा निर्देशों का उल्लेख seq प्रयोग सांकेतिक शब्दों में बदलना और modENCODE consortia6 द्वारा अनुशंसित सर्वोत्तम प्रथाओं के लिए, और हम एक कदम पर ध्यान केंद्रित एक चिप-बल्ले से seq के लिए अनुकूलित प्रोटोकॉल के कदम का विवरण । वर्णित प्रोटोकॉल वसा ऊतक से क्रोमेटिन के कुशल अलगाव के लिए अनुमति देता है के साथ डीएनए बाध्यकारी कारकों के लिए जीनोम व्यापक अनुक्रमण प्रदर्शन अच्छी तरह से परिभाषित चोटियों के साथ ही अधिक फैलाना संकेतों के साथ हिस्टोन निशान ।

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Protocol

पशु प्रोटोकॉल के हैंडलिंग कदम बोस्टन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है ।

1. Day 1: विच्छेदन और क्रोमेटिन Immunoprecipitation (चिप) के लिए बैट की तैयारी

  1. Euthanize एक कार्बन डाइऑक्साइड (CO2) चैंबर का उपयोग चूहों, और विच्छेदन तुरंत बाद में प्रदर्शन करते हैं । चीरा से पहले ७०% इथेनॉल के साथ स्प्रे माउस फर । इसके पीछे का सामना करना पड़ के साथ माउस प्लेस, तो गर्दन के साथ त्वचा खुला काट । कंधों के बीच त्वचा के नीचे सीधे बल्ले का पता लगाएँ (interscapular; यह दो पालियों के रूप में प्रकट होता है, तितली के आकार का, सफेद वसा की एक पतली परत है कि सावधानी से निकाला जा करने की जरूरत के साथ7).
    नोट: के लिए एक 3 महीने पुराने C57BL/6J माउस कि एक नियमित रूप से चाउ आहार खिलाया (27 और 30 के बीच इस उंर पर्वतमाला में माउस वजन) है, प्रत्येक चमगादड़ पालि लगभग 1 सेमी लंबा है । चमगादड़ डिपो का कुल वजन पुरुष और मादा दोनों चूहों में लगभग ०.१५ ग्राम है.
  2. 3 चिप्स के लिए 1 चमगादड़ पैड का प्रयोग करें । एकाधिक बैट पैड एक साथ sonication तक संसाधित किया जा सकता है ।
  3. Crosslink प्रत्येक बैट पैड के 10 मिलीलीटर में फास्फेट-बफर खारा (पंजाब) के लिए 1% formaldehyde युक्त 15 मिनट के कमरे के तापमान पर १५० rpm पर घूर्णन (आरटी) ।
  4. 5 मिनट के लिए १२५ मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए २.५ मीटर glycine जोड़कर crosslinking बुझाने, आरटी पर १५० rpm में घूर्णन ।
  5. hypotonic lysis बफर के ५०० µ एल चमगादड़ पैड स्थानांतरण (10 मिमी HEPES, १.५ मिमी MgCl2, 10 मिमी KCl, ०.५ मिमी डीटीटी, ०.२ मिमी PMSF) और 2 स्टेनलेस स्टील मोती (आकार: ३.२ मिमी व्यास, सामग्री की तालिकादेखें) प्रत्येक बल्ले पैड के लिए जोड़ें । ऊतक टुकड़ा करने के लिए एक मनका आधारित ऊतक homogenizer ( सामग्री की तालिकादेखें) का प्रयोग करें ।
  6. अधिकतम शक्ति में 5 मिनट के साथ शुरू करो । यदि आवश्यक हो, ऊतक homogenized है जब तक समय का विस्तार और एकल कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं. एक नई ट्यूब में नमूनों स्थानांतरण और 4 ° c पर १६,००० x g पर 10 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
  7. केंद्रापसारक के बाद, एक नया ट्यूब में supernatant हस्तांतरण और बर्फ पर सेल गोली रखो । 4 ° c पर supernatant में १६,००० x g पर 10 मिनट के लिए फ्लोटिंग कोशिकाओं के नुकसान को रोकने के लिए । अंतिम supernatant छोड़ें और एसडीएस lysis बफ़र (एसडीएस 1% के ३०० µ l में एक साथ दोनों कक्ष छर्रों resuspend करें; EDTA 10 मिमी; Tris-एचसीएल पीएच 8, ५० मिमी) 1x को छेड़ने वाला अवरोधक के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें). 10 मिनट के लिए बर्फ पर मशीन ।
  8. Sonicate lysates डीएनए टुकड़े उत्पंन करने के लिए 200-500 आधार जोड़े लंबे समय । sonication के बाद, 10 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर १६,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा मलबे को हटाने और एक 1% agarose जेल पर डीएनए ट्रो के माध्यम से sonication की सफलता की जांच करें । एक मध्यम आकार के जेल के लिए, १२० V पर चला; एक अच्छा जुदाई ४५ मिनट के बाद हासिल की है ।
    नोट: टुकड़ों का उचित आकार प्राप्त करने के लिए Sonication अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है । चुना sonicator के साथ ( सामग्री की तालिकादेखें), इस पर 2 बार की आवश्यकता है ३२० W उत्पादन शक्ति और 20 KHz आवृत्ति 10 मिनट के लिए, 30 एस के चक्र का उपयोग कर/
  9. पतला supernatant अंश 10 गुना (अंतिम मात्रा प्रत्येक बल्ले पैड के लिए 3 मिलीलीटर है) चिप कमजोर पड़ने बफर में (एसडीएस ०.०१%; ट्राइटन १.१%; EDTA १.२ मिमी; Tris-एचसीएल नं० ८, १६.७ मि. मी.; 1x को छेड़ने वाले अवरोधक के साथ NaCl १६७ mM) । इस क्रोमेटिन समाधान के 1% अलग रखें (3 एमएल के लिए 30 µ एल के बराबर) चिप इनपुट के रूप में । 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आदानों रखें (२.४ कदम तक) ।
    नोट: उपरोक्त अंश immunoprecipitation करने से पहले प्रत्येक नमूने में मौजूद डीएनए की मात्रा की तुलना में immunoprecipitated सामग्री के सापेक्ष ठहराव के लिए इनपुट संदर्भ प्रदान करेगा ।
  10. चिप एंटीबॉडी जोड़ें (एक उदाहरण के रूप में यहां इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के लिए सामग्री की तालिका देखें) क्रोमेटिन समाधान के 1 मिलीलीटर और रोटेशन के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी । इसी पूर्व प्रतिरक्षा आईजीजी के साथ समानांतर immunoprecipitation प्रदर्शन, यदि उपलब्ध है, या एक ही प्रजाति के सामांय आईजीजी (जैसे, नियमित रूप से खरगोश आईजीजी अगर एंटीबॉडी एक खरगोश में उत्पादन किया है) । वैकल्पिक रूप से, एक no-एंटीबॉडी नियंत्रण के लिए क्रोमेटिन समाधान की 1 मिलीलीटर सहेजें ।
    नोट: एंटीबॉडी के इष्टतम राशि प्रत्येक नए एंटीबॉडी के लिए प्रयोगात्मक निर्धारित किया जाना चाहिए, अगर एंटीबॉडी एकाग्रता ज्ञात नहीं है । अंयथा, एंटीबॉडी के 2 – 5 µ g का उपयोग करने के लिए एक उचित प्रारंभिक राशि है । चिप ग्रेड एंटीबॉडी का प्रयोग करें जब भी संभव हो, या एंटीबॉडी कि immunoprecipitation के लिए मान्य किया गया है.

2. दिन 2: प्रतिरक्षा परिसरों का संग्रह

  1. प्रोटीन की ५० µ एल जोड़ें प्रतिरक्षा परिसरों के लिए एक Agarose ५०% घोल और 1 के लिए मशीन 4 डिग्री सेल्सियस पर रोटेशन के साथ १५० rpm पर ।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर १०० x g पर 1 मिनट के लिए केंद्रापसारक द्वारा मोती गोली । stringency बढ़ाने के बफ़र्स के साथ मोतियों की अनुक्रमिक बहाकर प्रदर्शन करते हैं ।
    1. सबसे पहले, कम नमक धोने बफर के साथ धो (१५० mM NaCl; Tris-एचसीएल नं० ८, २० मि. मी.; EDTA 2 मिमी; ट्राइटन-X 1%; एसडीएस ०.१%), तो उच्च नमक धोने बफर के साथ (५०० mM NaCl; Tris-एचसीएल नं० ८, २० मि. मी.; EDTA 2 मिमी, ट्राइटन-X1%; एसडीएस ०.१%), तो LiCl वॉश के साथ (०.२५ मी LiCl; Tris-एचसीएल नं० ८, १० मि. मी.; EDTA 1 मिमी; Igepal 1%; deoxicholate 1%), और अंत में 1x ते के साथ (Tris-HCl pH 8, 10 mM; EDTA) ।
    2. ०.४५ µm PVDF केंद्रापसारक फ़िल्टर कॉलम (सामग्री की तालिका) पर सभी बहाकर पहले कॉलम में मोतियों को स्थानांतरित द्वारा ५०० कम नमक धोने बफर के µ एल का उपयोग करते हुए । २,५०० एक्स जीमें 3 मिनट के लिए कॉलम में मोतियों की गोली प्रवाह के माध्यम से त्यागें और चरण 2.2.1 में सूचीबद्ध सभी धोने बफ़र्स के लिए 1 बार दोहराएँ ।
  3. बहाकर पूरी हो जाने के बाद, elute के ३०० µ l को जोड़कर इम्यून कॉम्प्लेक्स को 1% एसडीएस, ०.१ एम NaHCO3) को कॉलम में गोली मारकर मोतियों को. ४०० rpm पर एक शेखर पर 30 मिनट के लिए आर टी पर मशीन । एक ताजा ट्यूब में २,५०० x जी में 3 मिनट के लिए नीचे कताई कॉलम द्वारा eluate लीजिए ।
  4. eluate और ६५ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात कदम १.९ में एकत्र आदानों की मशीन द्वारा crosslinks रिवर्स ।

3. Day 3: Phenol/क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण के साथ डीएनए की वसूली

  1. जोड़ें ३०० µ एल के phenol: क्लोरोफॉर्म: आईएए, 1:1 eluate और आदानों के लिए । भंवर 10 एस के लिए ।
  2. २१,००० x gपर 15 मिनट के लिए 4 ° c पर स्पिन supernatant एक ताजा ट्यूब के लिए स्थानांतरण । ग्लाइकोजन के 3 µ एल, 3 एम सोडियम एसीटेट के 30 µ एल, और ठंड १००% इथेनॉल के ७५० µ एल जोड़ें । 10 एस के लिए भंवर में-८० ° c 2 एच के लिए स्टोर
  3. 20 मिनट के लिए 4 ° c पर २१,००० x g पर नीचे स्पिन, गोली रखने के लिए, और supernatant त्यागें । ठंडा ७०% ेतोः के 1 मिलीलीटर के साथ गोली धो, तो 5 मिनट के लिए 4 ° c पर २१,००० x g पर नीचे स्पिन । supernatant और हवा सूखी गोली त्यागें ।
  4. DNAse-मुफ्त पानी की ७० µ एल में गोली resuspend ।
  5. मात्रात्मक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (qPCR) द्वारा विशिष्ट जीनोमिक क्षेत्रों पर क्रोमेटिन अधिभोग के परीक्षण के लिए 4 कदम या sequencing के लिए नमूनों को तैयार करने के लिए 5 कदम के लिए आगे बढ़ें ।

4. चिप का विश्लेषण qPCR का उपयोग (एकल/

  1. एक मानक संदर्भ वक्र उत्पंन करने के लिए ३.४ कदम से इनपुट डीएनए पतला । 1/10, 1/100 के सीरियल कमजोर पड़ने, और 1/1000 आम तौर पर रैखिक सीमा पर कब्जा करने के लिए पर्याप्त हैं, लेकिन आगे कमजोर पड़ने और अधिक केंद्रित नमूनों के लिए आवश्यक हो सकता है.
  2. प्रत्येक प्राइमर जोड़ी के लिए (यहां, हम NDUFV1 और TOMM20 प्रमोटरों लक्ष्यीकरण प्राइमरों का इस्तेमाल किया है), qPCR प्रतिक्रियाओं के दो सेट तैयार: ४.१ कदम से पतला इनपुट नमूनों का उपयोग कर, और डीएनए के साथ एक दूसरे के नमूने immunoprecipitation से कदम से अलग ३.४ । तपसिल में प्रत्येक प्रतिक्रिया करते हैं ।
    नोट: प्रतिक्रियाओं एकाधिक ९६-या ३८४-अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग कर जीन के लिए समानांतर में स्थापित किया जा सकता है ।
  3. 5 2x पीसीआर मिश्रण (सामग्री की तालिका), प्राइमरी मिश्रण के 1 μL (1 माइक्रोन आगे प्राइमर और 1 माइक्रोन रिवर्स प्राइमर) के साथ अच्छी तरह से प्रति 10 μL की प्रतिक्रिया मात्रा सेट करें, और 4 डीएनए के μL से चिप (या इनपुट नियंत्रण) ।
  4. संक्षेप में प्लेट नीचे स्पिन ।
  5. एजेंट का पता लगाने (सामग्री की तालिका) के लिए निर्माता द्वारा अनुशंसित प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक वास्तविक समय पीसीआर प्रणाली पर qPCR प्रतिक्रियाओं भागो । यहाँ हम निम्नलिखित शर्तों का उपयोग किया है: 1) 1s पर 95 ° c 1 चक्र के लिए; 2) ९५ डिग्री सेल्सियस पर 1 एस ६० डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के बाद ४५ चक्र के लिए; 3) 15 एस ९५ ° c पर ६० एस द्वारा पीछा किया ६० ° c के बाद 15 एस के द्वारा ९५ ° c 1 चक्र के लिए ।
    नोट: पृथक्करण वक्र की जांच करें: थर्मल पृथक्करण साजिश में एक चोटी की उपस्थिति से पता चलता है एक एकल amplicon पीसीआर प्रतिक्रिया से उत्पंन होता है । यदि एक से अधिक पीक visualized है, यह संभावित रूप से एकाधिक, गैर-विशिष्ट amplicons का संकेत है; जो मामले में, हम वैकल्पिक प्राइमरी जोड़े के डिजाइन की सिफारिश ।
  6. चरण ४.१ में पतला जीनोमिक डीएनए की श्रृंखला का उपयोग मानक वक्र की गणना द्वारा निर्धारित प्रत्येक प्राइमर के लिए पीसीआर प्रतिक्रिया के घातीय प्रवर्धन के रैखिक चरण का निर्धारण । सीटी (सायकल थ्रेसहोल्ड) मान के अनुसार.
  7. अगर चिप और इनपुट नियंत्रण से डीएनए की सीटी मूल्य सीटी मूल्य के रैखिक सीमा के भीतर हैं, इनपुट के सापेक्ष चिप से डीएनए की समृद्धता की गणना, डीएनए के कमजोर कारक के अनुसार चिप और इनपुट नियंत्रण से कदम ४.१ में ।

5. उच्च प्रवाह अनुक्रमण (जीनोम चौड़ा Readout) के लिए चिप से डीएनए का प्रवर्धन

नोट: अनुक्रमण क्षमताओं घर में उपलब्ध नहीं हैं, जब यह कदम एक अकादमिक कोर सुविधा या वाणिज्यिक अनुक्रमण कंपनी को आउटसोर्स किया जा सकता है ।

  1. एक उचित चिप पुस्तकालय तैयारी किट के साथ निकाले डीएनए से एक डीएनए पुस्तकालय तैयार ( सामग्री की तालिकादेखें) निर्माता के निर्देशों का पालन ।
  2. readout ( सामग्री की तालिकादेखें) के रूप में ५० bp एकल-अंत का उपयोग करते हुए, एक उच्च-प्रवाह sequencing सिस्टम पर लायब्रेरी अनुक्रम ।
    नोट: के अनुसार चिप-seq6, १०,०००,००० पढ़ता की एक ंयूनतम द्वारा सुझाए गए दिशा निर्देशों स्तनधारी जीनोम के लिए सिफारिश की है ।

6. रॉ डेटा विश्लेषण

  1. FastQC8का उपयोग करके अपुष्ट sequencing पढ़ता पर गुणवत्ता नियंत्रण निष्पादित करें ।
    नोट: सामान्य sequencing गुणवत्ता मेट्रिक्स प्रति आधार अनुक्रम गुणवत्ता, प्रति अनुक्रम GC सामग्री, अनुक्रम लंबाई, और अनुक्रम डुप्लिकेशन स्तर प्रतिशत शामिल हैं । आम तौर पर, एक पढ़ने के गुणवत्ता स्कोर क्यू > 30 प्रत्येक आधार स्थिति के पार उच्च गुणवत्ता अनुक्रमण परिणाम का संकेत है । सभी पढ़ता भर में जीसी सामग्री का वितरण मोटे तौर पर एक सामांय वितरण के समान होना चाहिए, एक चोटी के साथ ' प्रजातियों वास्तविक जीनोमिक GC सामग्री प्रतिशत के आसपास केंद्रित ।
  2. किसी भी sequencing एडेप्टर दूषण और कम-गुणवत्ता पठन ट्रिमिंग सुविधा Trimmomatic9के माध्यम से पढ़ता है निकालें ।
    नोट: लागू किए गए डिफ़ॉल्ट पैरामीटर्स के लिए प्लेटफ़ॉर्म निर्भर एडेप्टर निकालना, अग्रणी और पीछे आने वाले कम गुणवत्ता वाले आधारों को हटाने, और एक 4-आधार चौड़ी स्लाइडिंग विंडो का उपयोग करने के लिए ट्रिम कर दीजिए जब आधार प्रति औसत गुणवत्ता एक निर्दिष्ट थ्रेशोल्ड नीचे गिरता है निर्दिष्ट करें ।
  3. संसाधित संरेखित करने के लिए माउस MM10 संदर्भ जीनोम10 Bowtie2 संरेखण11 डिफ़ॉल्ट पैरामीटर का उपयोग कर के साथ पढ़ता है ।
  4. Bowtie2 मैपिंग गुणवत्ता स्कोर (MAPQ) से कम 10 Samtools12का उपयोग कर के साथ उन को निकाल कर संरेखित करें फ़िल्टर पढ़ता है ।
  5. विभिंन पोस्ट-संरेखण गुणवत्ता मेट्रिक्स जैसे प्रतिशत के रूप में निर्धारित करें मैप किया गया, किनारा क्रॉस-सहसंबंध, संचई पढ़ें कवरेज, और नमूना प्रतिकृति reproducibility ।
    नोट: एसपीपी13, ChIPqc14, और Deeptools15 सहित विभिंन संकुल इन गुणवत्ता मेट्रिक्स की गणना करने के लिए उपलब्ध हैं ।
  6. डिफ़ॉल्ट पैरामीटर के साथ mac एल्गोरिथ्म (MACS2)16 का उपयोग करके इनपुट नियंत्रण या उपयुक्त KO नमूने के साथ पीक कॉलिंग विश्लेषण निष्पादित करें ।
  7. किसी भी कहा जाता चोटियों कि Bedtools18का उपयोग mm10 एनोटेशन से ज्ञात ब्लैकलिस्टेड क्षेत्रों17 के साथ ओवरलैप निकालें ।
    नोट: ब्लैकलिस्टेड क्षेत्रों जीनोम है कि उच्च संकेत है या पढ़ने के लिए सेल लाइन या अनुक्रमण तकनीक के स्वतंत्र गिनती में दिखाया गया है में क्षेत्रों रहे हैं । ये क्षेत्र कार्यात्मक जीनोमिक अनुक्रमण प्रयोगों से बाहर फ़िल्टर किया जा सकता है कि जीनोम के कुछ क्षेत्रों में कृत्रिम रूप से उच्च विरूपण साक्ष्य संकेतों को प्रदर्शित करते हैं । सभी प्रतिकृति पाइपलाइन के माध्यम से स्वतंत्र रूप से संसाधित किया जाना चाहिए और उसके बाद irreproducibility खोज दर (IDR) के लिए उपयोग किया जा सकता है । IDR ली, ब्राउन, हुआंग, और Bickel19,20द्वारा वर्णित के रूप में विधि के माध्यम से दोहराने के बीच निष्कर्षों के reproducibility को मापने के लिए कार्यरत है । IDR विधि मात्रात्मक रूप से प्रतिकृति के बीच संगतता का आकलन है और उनके चिप-seq दिशानिर्देशों के भाग के रूप में एन्कोड और modENCODE द्वारा अनुशंसित है ।
  8. इस तरह के जीन आंटलजी21,22, संवर्धन, या आकृति विश्लेषण23के रूप में विभिंन बहाव विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय महत्वपूर्ण चोटियों का प्रयोग करें ।

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Representative Results

Figure 1
चित्रा 1: qPCR द्वारा चिप सत्यापन । प्रतिनिधि GPS2 लक्ष्य जीनों का चिप-qPCR विश्लेषण NDUFV1 (बाएँ) और TOMM20 (दाएँ) WT और GPS2-एको चूहों के बल्ले में, H3K9 मिथाइल और GPS2 और Pol2 बाइंडिंग के स्तर में सापेक्षिक परिवर्तन दिखाते हुए. बार रेखांकन का प्रतिनिधित्व 3 का नमूना माध्य * p < ०.०५ और * * p < ०.०१ के साथ प्रतिकृति के रूप में छात्र का t-परीक्षण के साथ परिकलित । यह आंकड़ा Cardamone एट अल.2से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

WT या GPS2-एको चूहों से पृथक बैट का प्रयोग चिप-qPCR के उदाहरण चित्रा 12में दिखाया गया है। कर पाया कि GPS2 अलग सेल लाइनों2में परमाणु इनकोडिंग mitochondrial जीन की अभिव्यक्ति के लिए आवश्यक था, हम दो विशिष्ट परमाणु mitochondrial जीन, NDUFV1 और TOMM20, में इनकोडिंग पर GPS2 की भर्ती का परीक्षण एक उच्च mitochondria में समृद्ध ऊतक के एक उदाहरण के रूप में चूहों से चमगादड़ । हम पहले GPS2-एको चूहों और जंगली प्रकार littermates में GPS2 प्रमोटर अधिभोग की तुलना में, GPS2-एको चूहों से बल्ले में चयनात्मक लक्ष्य जीन पर GPS2 बंधन में एक उम्मीद की कमी देख. यहां वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम भी आरएनए पोलीमरेज़ 2 (Pol2) और प्रेसर हिस्टोन मार्क H3K9me3 के बल्ले से GPS2-एको चूहों के रूप में जंगली प्रकार littermates की तुलना में वृद्धि की बाध्यकारी दर्ज की गई । सभी एंटीबॉडी के लिए, बाध्यकारी पृष्ठभूमि संकेत की तुलना में आईजीजी नियंत्रण नमूने में मनाया के रूप में महत्वपूर्ण था. इन परिणामों के चयनित परमाणु इनकोडिंग mitochondrial जीन पर GPS2 की भर्ती की पुष्टि करें और पता चलता है कि GPS2 H3K9me3 के संचय को रोकने के लिए आवश्यक है, और इस प्रकार लक्ष्य प्रवर्तकों पर Pol2 transcriptional गतिविधि की दुकान के लिए आवश्यक है । एंटीबॉडी के बारे में अधिक जानकारी के लिए सामग्री की तालिका और अतिरिक्त डेटा और इन परिणामों के2के अधिक व्यापक चर्चा के लिए मूल प्रकाशन देखें ।

Figure 2
चित्रा 2: कच्चे अनुक्रमण से गुणवत्ता स्कोर के भूखंड बल्ले से अलग पढ़ता है । (A) गुणवत्ता स्कोर आधार-कॉलिंग के दौरान किसी त्रुटि की प्रायिकता का पूर्वानुमान प्रतिबिंबित करता है । यह आमतौर पर एक पूर्णांक मान के रूप में व्यक्त किया जाता है, Q =-10log10 (p), जिसमें P आधार-कॉलिंग में कोई त्रुटि की प्रायिकता है । ऊपर दिखाया गया है एक आधार अनुक्रम गुणवत्ता FastQC द्वारा उत्पंन भूखंड पर आधारित कच्चे, unprocessed अनुक्रमण बल्ले से उत्पंन पढ़ता है । (ख) एडेप्टर हटाने के बाद पढ़ता है और बल्ले के नमूनों से ट्रिमिंग पढ़ने के जीसी सामग्री वितरण । जीसी सामग्री मोटे तौर पर एक सामांय वितरण प्रजातियों के आसपास केंद्रित ' gc जीनोमिक सामग्री के वास्तविक अंश के साथ समान होना चाहिए । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 2में, अनुक्रमण गुणवत्ता स्कोर एक प्रति आधार स्तर पर दिखाए जाते हैं, और पढ़ता है और किसी भी अवशिष्ट अनुकूलक संदूषण trimming द्वारा संसाधित किया जा सकता है और जहां एक फिसलने खिड़की के पार औसत गुणवत्ता स्कोर एक नीचे गिर जाता है निर्दिष्ट थ्रेशोल्ड । भी दिखाया गया है GC सामग्री वितरण एडेप्टर हटाने के बाद पढ़ता है और ट्रिमिंग पढ़ें भर में । अनुक्रम गुणवत्ता और GC सामग्री वितरण गणना विश्लेषण किया जाता है से पहले अगली पीढ़ी sequencing डेटा का मूल्यांकन करने के लिए दो व्यापक रूप से इस्तेमाल मीट्रिक हैं. इन परिणामों को प्रदर्शित करता है कि प्रोटोकॉल उच्च गुणवत्ता क्रोमेटिन के बल्ले से अलग है कि बहाव अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों के साथ संगत है की एक पर्याप्त राशि पैदा करता है ।

Figure 3
चित्रा 3: WT और GPS2-एको चूहों के बल्ले से चिप-seq डेटा से उत्पन्न सामान्यीकृत bigwig फ़ाइलें. यह आंकड़ा Slc25a25 जीन लोकस के साथ सामान्यीकृत पढ़ा कवरेज से पता चलता है एक महत्वपूर्ण प्रमोटर क्षेत्र में चोटी के साथ बुलाया । GPS2 के लक्ष्य जीन प्रवर्तकों के क्रोमेटिन राज्य में फेरबदल करके परमाणु इनकोडिंग mitochondrial जीनों की अभिव्यक्ति को विनियमित करने के लिए दिखाया गया था. ये परिणाम एक प्रतिनिधि परमाणु इनकोडिंग mitochondrial जीन पर एक महत्वपूर्ण कहा चोटी के दृश्य प्रदर्शित करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

चित्रा 3 में दिखाया गया है bigWig WT और GPS2-एको संरेखित BAM फ़ाइलों की पटरियों 1x गहराई को सामान्यीकृत (जीनोम कवरेज प्रति पढ़ता है) के रूप में deepTools में कार्यांवित किया । दिखाया mitochondrial जीन Slc25a25के प्रवर्तक क्षेत्र में स्थित एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण चोटी की उपस्थिति है । सामान्यीकृत ट्रैक्स नामक चोटी और GPS2-एको चूहों जंगली-प्रकार littermates के सापेक्ष के बल्ले में इस स्थान पर पढ़ता की कमी करने के लिए इसी को पढ़ता के संवर्धन के दृश्य की अनुमति देते हैं ।

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Discussion

प्रोटोकॉल यहां वर्णित murine ऊतकों से चिप प्रदर्शन के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है, विशेष रूप से भूरे रंग के वसा ऊतक के लिए अनुकूलित । ऊतक से चिप प्रदर्शन में अधिक से अधिक चुनौतियों में से एक नमूना तैयार करने के दौरान कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या को ठीक कर रहा है । कैंची एक ऊतक homogenizer एक विहित गिलास के बजाय स्टेनलेस स्टील मोतियों के साथ युग्मित ब्लेंडर का उपयोग करना काफी खल कोशिकाओं की संख्या टूट ऊतक के कारण खो कम कर देता है । इसके अलावा, एक hypotonic बफर में सीधे ऊतक अनुमन्य है कि फिर आसानी से अलग किया जा सकता है और उच्च गति केंद्रापसारक के माध्यम से नाभिक से हटा सकते है लिपिड की रिहाई में मदद करता है ।

उचित sonication भी संगत और reproducible चिप परख प्रदर्शन के लिए महत्वपूर्ण है । एक पानी स्नान अल्ट्रा sonicator का उपयोग कई नमूनों की एक साथ प्रसंस्करण के लिए अनुमति देता है, इस प्रकार क्रोमेटिन बाल काटना के reproducibility में सुधार और नमूना पार-संदूषण के जोखिम को कम करने । इसके अलावा, एक तापमान नियंत्रित sonication सिस्टम का उपयोग नमूनों की overheating कम कर देता है, जो नमूना गिरावट और एंटीबॉडी द्वारा epitope मांयता की हानि को रोकने के लिए बचा जाना चाहिए (विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) ।

एक और चुनौतीपूर्ण कदम immunoprecipitated परिसरों की वसूली है । चुंबकीय मोती अक्सर इस कदम के लिए पसंद कर रहे है क्योंकि वे तेजी से और अधिक प्रभावी बहाकर जब एक चुंबकीय रैक के साथ एक साथ इस्तेमाल के लिए अनुमति देते हैं । हालांकि, वे एक Agarose प्रोटीन की तुलना में डीएनए वसूली की एक कम दर है, जो एक गंभीर सीमा जब शुरू सामग्री की छोटी राशि के साथ काम किया जा सकता है । हम पाते है कि प्रोटीन के संयोजन PVDF ०.४५ µm केंद्रापसारक फिल्टर कॉलम के साथ एक Agarose घोल एक महान समाधान के लिए ंयूनतम धोने समय और उच्च reproducibility के साथ अधिकतम डीएनए उपज प्राप्त है ।

डीएनए अलगाव के बारे में, कॉलम के बहुत आधारित डीएनए अलगाव किट का इस्तेमाल किया जा सकता है । हमारे अनुभव में, इस दृष्टिकोण की एक सीमा से डीएनए वसूली की उपज पर एक प्रभाव है कॉलम की क्षमता है । समस्या को दूर करने के लिए, हम डीएनए निष्कर्षण के लिए phenol/क्लोरोफॉर्म के रूप में एक अधिक परंपरागत विधि का उपयोग करना पसंद करते हैं ।

सूचीबद्ध चिप-seq पाइपलाइन अगली पीढ़ी अनुक्रमण प्रयोगों के लिए व्यापक रूप से स्वीकृत उपकरण और उपयोगिताओं की एक संख्या शामिल है । संक्षेप में, पढ़ता FastQC और Trimmomatic का उपयोग कर बुनियादी गुणवत्ता नियंत्रण के अधीन हैं, तो Bowtie2 का उपयोग कर माउस MM10 जीनोम के लिए गठबंधन कर रहे हैं. जीवित पढ़ता MACS2 एल्गोरिथ्म के माध्यम से बुला पीक के लिए इस्तेमाल किया जा रहा से पहले मानचित्रण गुणवत्ता से फ़िल्टर कर रहे हैं । हालांकि, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि अंय उपलब्ध और मांय उपकरण भी प्रयोग की प्रकृति और उत्पंन किया जा रहा डेटा के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है । पूर्व-प्रोसेसिंग, संरेखण, या पीक कॉलिंग के दौरान किसी भी अनुकूलित पैरामीटर्स का उपयोग करना भी उचित हो सकता है ।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bullet Blender Tissue Homogenizer  Next Advence  BBX24
Stainless Steel Beads 3.2 mm Diameter Next Advence  SSB32
Bioruptor Sonicator Diagenode
1.5 mL Micro Tube TPX Plastic  Diagenode C30010010-5
Complete-Protease inhibitor Roche  11836145001
Protein A Agarose Slurry  Invitrogen  101041
GPS2 antibody In house Rabbit polyclonal, Ct antibody (Cardamone et al., Mol Cell 2018)
Pol2 antibody  Diagenode C15100055
h3K9me3 antibody Millipore  05-1242
Fast Syber Green Master Mix Aplied Biosytem 4385612
ViiA7 Aplied Biosytem
TruSeq ChIP Library Preparation Kit Illumina  IP-202-1012
HiSeq 2000  Illumina 

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References

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आनुवंशिकी अंक १४१ क्रोमेटिन immunoprecipitation ब्राउन वसा ऊतक अगली पीढ़ी sequencing माउस वसा
Murine ब्राउन वसा ऊतक के क्रोमेटिन Immunoprecipitation
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Cardamone, M. D., Orofino, J.,… More

Cardamone, M. D., Orofino, J., Labadorf, A., Perissi, V. Chromatin Immunoprecipitation of Murine Brown Adipose Tissue. J. Vis. Exp. (141), e58682, doi:10.3791/58682 (2018).

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