Summary
Måling af gnaver skeletmuskulatur kontraktile funktion er et nyttigt værktøj, der kan bruges til at spore sygdomsprogression samt effekten af terapeutisk intervention. Her beskriver vi de non-invasiv, i vivo vurdering af dorsiflexor muskler, der kan blive gentaget over tid i samme mus.
Abstract
Vurdering af skeletmuskulatur kontraktile funktion er en vigtig måling for både kliniske og forskningsmæssige formål. Mange forhold kan have en negativ indflydelse skeletmuskulatur. Dette kan resultere i et tab af muskelmasse (atrofi) og/eller tab af muskel kvalitet (nedsat kraft pr. enhed af muskel masse), som begge er fremherskende i kronisk sygdom, muskel-specifik sygdom, immobilisering og aldring (sarcopenia). Skeletmuskulatur funktion i dyrene kan blive evalueret af en række forskellige tests. Alle tests har begrænsninger vedrører den fysiologiske test miljø, og udvælgelsen af en specifik test ofte afhænger af arten af eksperimenterne. Her, beskriver vi en in vivo, ikke-invasiv teknik der involverer et nyttigt og let vurdering af force frekvens-kurve (FFC) i mus, der kan udføres på den samme dyr over tid. Dette tillader overvågning af sygdomsprogression og/eller effekt af en potentiel terapeutisk behandling.
Introduction
Skeletmuskulatur er en vigtig metaboliske væv, der består af ca. 40% af den samlede kropsvægt. Det spiller en afgørende rolle i kontrollen af energi metabolisme og homøostase1. Skeletmuskulatur masse vedligeholdes af en fin balance mellem satserne for protein syntese og nedbrydning af1. Adskillige sygdomstilstande påvirker disse processer i skeletmuskulatur, fører til et nettotab i muskelmasse (atrofi). Disse omfatter, men er ikke begrænset til, kræft, AIDS, aldring, fastende, og lemmer immobilisering2,3. I den aldrende befolkning, tab af styrke er forbundet med tab af muskel masse og er en prædiktor for all-sag dødelighed4. I denne sammenhæng giver vurdering af muskelfunktion en vigtig foranstaltning, når bestemmelse af effektiviteten af terapeutiske strategier til at bekæmpe og/eller forhindre skeletmuskulatur spild og tab af funktion.
Forskere har brugt mange forskellige tilgange og dyremodeller til at forstå de molekylære veje af muskel atrofi5,6 og konsekvenserne af disse mekanismer på muskel kontraktile funktion2,3 ,7. Derfor er korrelerede ændringer på det molekylære niveau til forskelle i muskelfunktion afgørende i forståelsen, hvordan molekylære niveau ændringer kan påvirke muskel funktionalitet.
Skeletmuskulatur funktion, især i små gnavere, udføres typisk ved hjælp af tre velbeskrevne procedurer8,9 at påvise svækket kraft produktion og/eller overvåge sygdomsprogression. (1) ex vivo; hvor musklen fjernes fra dyret og inkuberes i en ringetone bad løsning at vurdere den muskelfunktion ved hjælp af feltet stimulation10. (2) In situ; hvor den proksimale udlæg i musklen forbliver i dyret og distale senen er forbundet med en krafttransducer, tillader muskelfunktion skal udføres af direkte nerve stimulation11. (3) In vivo; hvor elektroder er placeret subkutant for at opnå nerve-fremkaldte muskel kraft produktion9,12. Mens disse tre procedurer bruges til forskellige formål, besidder de enkelte, fordele og ulemper. Det er derfor vigtigt at vælge en passende metode baseret på formålet med undersøgelsen. Den største begrænsning med ex vivo eksperimenter er fjernelse af muskel fra dens normale miljø og brugen af feltet stimulation. Metoden in situ vedligeholder en normal blodforsyning og bruger stimulering gennem nerve, men normale Anatomi er ændret og karakteren af forsøget er terminal; således, dette gør opfølgende muskel funktion målinger umuligt. Metoden in vivo beskrevet her tættest efterligner normale fysiologi, anatomi er uforstyrret, den neuromuskulære bundt forbliver intakt, og eksperimentet er ikke terminal, så opfølgende foranstaltninger inden for samme dyr over tid8.
Her, beskriver vi en in vivo-procedure, der tillader flere målinger af muskelfunktion i samme dyr over tid. Denne procedure indebærer vurdering af musklerne i den forreste crural rum — herunder tibialis anterior(TA), extensor digitorum longus (EDL) og extensor hallicus longus (EHL) muskler, ansvarlig for dorsiflexion — i en non-invasiv procedure af fibular (også kendt som peroneal) nervestimulation. TA leverer de fleste af gældende for ankel dorsiflexion13, med kun minimale bidrag af EDL og EHL denne kontrol bevægelse af tæer. Denne ikke-terminal protokollen sikrer bevarelsen af nerve og blod levering. Dette giver mulighed for undersøgelse af sygdom evolution og behandling effekt over tid i den mest fysiologiske miljø i øjeblikket tilgængelig i en dyremodel.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev godkendt af Deakin University dyr etiske komité (Project #G19/2014).
1. udstyr Setup
- Sikre, at alle maskiner er tilsluttet korrekt.
- Tænd computeren, high-power bi-fase stimulator og dual-mode løftestang system.
- Konfigurere musen knæ klemme på platformen, som musen fodpladen på transductor.
- Tænd den varme platform til 37 ° C.
- Åbn den dynamiske muskel kontrol software på skrivebordet.
Bemærk: Dette er den nødvendige software for at udføre funktionskontrol.
2. software og Model Setup
- Når programmet er åbnet (figur 1), kalibrere transduceren og vælg Setup | Min instrumenter | Kalibrere.
- På knappen "Setup" Vælg InstantStim og ændre parametrene "Operationstid" til 120 s (figur 1A).
Bemærk: Optimale spænding kan også opnås ved udførelse enkelt ryk, manuelt konfigurere eller starter InstantStim så mange gange som nødvendigt. - I vinduet type-stand mærket "Autosave Base" for at indtaste navnet på auto gem filplacering (f.eks., mouse1-dato-timepoint1). Klik på afkrydsningsfeltet til venstre for vinduet "Autosave Base" og ændre det til Aktiverer automatisk lagring.
- På toppen af kontrolelementet DMC skærmen gå til Sequencer, som vil åbne et nyt pop op-vindue. Vælg Åben sekvens og vælg premade protokollen skal bruges (figur 1B). Klik på belastning sekvens | Luk vinduet.
Bemærk: Dette trin bruges til at generere en force frekvens-kurve (FFC) test (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Hz). - Indstil "RANGE" knop til 10 mA på den bi-fase stimulator.
Bemærk: Sikre, at "Justere" knop (lige næste nederst) er på nul. Denne finindstilling tillader opsætning af elektroderne.
3. mus opsætning
Bemærk: Alle gældende målinger blev udført på mandlige wild-type mus (C57BI/6) på 12 ugens i alder.
- Placer hver musen ind i anæstesi salen med en ilt flow 1 L/min. med 5% isofluran (via nosecone indånding) indtil musen mister bevidstheden. Bekræfte passende anæstesi via tab af foden refleks.
- Fjern alle hår på højre ben med musen ved barbering med elektrisk hårklippere.
- Placere dyret i en liggende stilling på den opvarmede platform og rense det højre ben (begge sider kan anvendes) med 70% alkohol og jod. På dette tidspunkt, justere isofluran til 2% (med ilt flow 1 L/min.) og anvende den ledende gel på huden, hvor elektroderne skal placeres.
Bemærk: Bruge en rektal temperatur sonde til at overvåge kropstemperaturen under proceduren og anvende øjet salve for at forhindre enhver tørhed og/eller skader på øjet. - Placer foden op på fodpladen og fastgør ved hjælp af medicinsk tape. Klemme i knæet for at stabilisere og immobilisere benet under proceduren.
Bemærk: Nogle undersøgelser har beskrevet ved hjælp af en meget tynd pin indsat gennem den proksimale tibia (posterior til dorsiflexors musklerne)12 til at levere stabilisering. Denne protokol vælger en klemme, da dette giver tilstrækkelig stabilisering uden unødvendige kompression/skader på knæet. Klemmen undgår man også potentielle betændelse, som en trans-ossøse pin kan oprette, mens det stadig tillader nøjagtig vurdering af muskel kontraktilitet. Derudover er mus knæ klemme blevet med held brugt14. - På dette tidspunkt bruge knapperne på platformen til at placere mus hindlimb, så der er en 90° vinkel på ankel (figur 2).
4. optimering af elektroder Position
- Når musen er placeret på platformen, skal du placere elektroder under huden (subkutan) i højre ben.
Bemærk: Dette er et afgørende skridt, og nogle repositionering kan være nødvendigt at få den ønskede position under installationen i trin 4.4. - Placer elektroderne på den laterale side af højre ben; Placer en i nærheden af lederen af fibula og anden elektroden mere distalt på den laterale side af benet (figur 2).
Bemærk: En skræddersyet elektrode system er designet til at optimere dette trin. Dog kan denne test udføres med elektrode nåle fra fabrikanten i dette system. - Når disse trin er opnået, high-power bi-fase stimulator justere knop mærket "Juster" som nødvendig for at opnå en stimulation af peroneal nerve, der resulterer i maksimal dorsiflexion drejningsmoment.
Bemærk: For voksne wild-type mus, dette interval er mindre end 2 mA; Dette kan dog afhængig af størrelse, alder og køn dyret. Kraft produktion (toppene af kurver) bør øges langsomt, indtil den maksimale kraft er nået. - Under stimulation, drej transduceren uret at give negative værdier (figur 3), som er vigtigt at sikre, at elektroderne stimulerende kun dorsiflexor musklerne af peroneal nerve. Når dette trin er opnået, stabilisere elektroderne ved hjælp af en klemme, forhindre enhver bevægelse under proceduren.
Bemærk: Toppene vil langsomt stige i størrelsesorden, og den maksimale strømstyrke bestemmes som det niveau, hvor tre eller flere på hinanden følgende stimulering resultere i identiske kontraktilitet. Modstå dreje den strømstyrke højere end nødvendigt; den maksimale strømstyrke vil stimulere den tilstødende og potentielt antagonist muskler til kontrakten, forårsager Co sammentrækning, som kan generere toppene af positive værdier. - Stop den Instant Stim på software.
- På hovedskærmen, drej på knappen mærket "Start sekvens" for at starte den foregående opsætning sekvens (som beskrevet i trin 2.4).
5. afslutning af proceduren
- Når force målingerne er færdig, fjerne elektroderne, frigive knæ klemmen og fjerne foden tape.
- Slukke for isofluran og vedligeholde ilt levering i et par minutter medvirken animalske inddrivelse. Når musen starter bevæger sig og/eller genvinder bevidstheden og kan selv lige, returnere musen til sit bur.
Bemærk: Et non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) kan injiceres subkutant (1 mg/kg meloxicam) at undgå ethvert ubehag og/eller ømhed efter indgrebet.
6. dataanalyse
- Åbne data analyse software.
- Gå til High Throughput (øverst til venstre på skærmen). Vælg Kraft frekvens til at analysere det ovenstående beskrevet setup sekvens.
- Vælg Manual og ændre værdien "Slutningen markør" til 3. Også vælge Fjern Baseline.
- Klik på Vælge filer til at få adgang til de tidligere udførte procedure og derefter klikke på analyser. På dette tidspunkt kan resultatet tilgås på skærmen eller eksporteres til et regneark for yderligere analyse og/eller beregninger.
Bemærk: Dataene blev målt i mN; drejningsmomentet kan imidlertid beregnes ved at multiplicere værdien kraft af længden af løftestang arm (absolut kraft). Hvis normalisering er påkrævet (specifikke kraft), drejningsmoment kan blive normaliseret for kropsvægt, eller terminal eksperimenter kan udføres for at indsamle muskelmasse af alder-matchede.
Representative Results
Kraft-frekvens kurve er en nyttig test, hvor musklerne kan blive stimuleret ved lavere og højere frekvenser at skelne suboptimal og optimal kraft svar15. Kraft ved lavere frekvenser kan stimulere en enkelt spjæt, aktivering færre og mindre motoriske enheder, og ved højere frekvenser en stabil toppen er nået, hvor isolerede sitren sammenvokset (stivkrampe), at nå maksimal kraft gennem aktivering af alle motoriske enheder16 . I testen præsenteret, den tetanic kurve starter ved ~ 60 Hz, hvor potensering kan visualiseres (figur 4A) og den maksimale kraft bestemmes ved ~ 150 Hz (figur 4B), når plateauet nås med en afsluttet sammenvoksede kurve9, 16.
Alle varianter af disse resultater kan indikere, at musklerne ikke korrekt stimuleres af elektroderne. Elektrode placering er et vigtigt skridt i forberedelsen af denne procedure, som den elektriske stimulation skal placeres korrekt for at innerverer den peroneal nerve og dermed fuldt aktivere musklerne i dorsiflexion, som det leverer (TA, EDL og EHL). Korrekte elektrode placering resulterer i generation af negative toppe (figur 3) under denne proces, forskydning af elektroder eller højere strømstyrke kan medfoere, at stimulation af omkringliggende muskler, forårsager Co sammentrækning af den omkringliggende muskler og antagonist muskler, som gengæld genererer toppene af positive værdier.
Fig. 5A viser repræsentativ kraft frekvens-kurve data fra en mus i en periode, hvor proceduren blev gentaget en gang om ugen indtil 5 timepoints var afsluttet. Disse observationer har vist konsekvent kraft produktionsværdier i hele timepoints og/eller observationer målt. Denne procedure har også vist sig for at være overensstemmelse mellem mus målinger, som figur 5B viser repræsentant arealet under kurven for FFC stimuleret over 5 forskellige observationer i 6 mus testet en gang om ugen.
Figur 1 : Softwaresystem. (A) kontrollere software illustration af trin for at konfigurere parametrene "Instant Stim". Klik på foto baggrund opsætningen | Instant Stim. På lille dukkede op vindue (forreste foto), angive parametrene. (B) Illustration af visningen "Sequencer" setup. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Mus opsætning. Oversigt over placeringen af de bedøvede dyr. Den højre knæ klemme er placeret så knæet er på 90°, og så foden og anklen er på 90° vinkler (stiplede hvid linje). Sammentrækning af dorsiflexors muskler er opnået ved stimulation af det peroneal nerve, som ligger lige under (distalt for) lederen af fibula. Vi bruger specialdesignet elektroder (indsatser); nål elektroder, der leveres med enheden, eller købes separat, er imidlertid også tilstrækkelig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Output fra placering af elektroderne. Når elektroderne er placeret under huden og spændingen, der er indledt, overholdes toppe med negative værdier. På dette tidspunkt, er at nå frem til negative værdier (grøn linje) et afgørende skridt i at sikre at stimulering opnås i de dorsiflexor muskler eneste (TA EDL og EHL). Real-time måling er angivet mellem de to røde streger. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Repræsentant kurver. (A) udsnit af force kurven ved 60 Hz (mus #06). (B) udsnit af den tetanic kurve på 150 Hz (mus #03). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Repræsentant tvinge frekvens kurve (FFC), og arealet under kurven data. (A) FFC (x-aksen) over 5 forskellige timepoints (uge 1, 2, 3, 4 og 5) i en prøve mus (#05). (B) arealet under kurven (AU, y-aksen) af FFC over 5 forskellige timepoints (mus #01, 02, 03, 04, 05 og 06, henholdsvis x-aksen). Resultaterne udtrykkes som gennemsnit ± standardafvigelse af måling (SEM) af fem timepoints (test) i 6 mus og blev analyseret af en-vejs ANOVA test (p < 0,05). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Måling af maksimal muskel kontraktile funktion i nøjagtige og repeterbare er afgørende for den progressive bedømmelse af genetiske, metaboliske og muskel betingelser17. På samme måde, i vivo kontraktile muskelfunktion giver mulighed for vurdering af nye behandlinger og lægemidler til invaliderende muskel betingelser. Vi demonstrere heri måling af kraft produktionen af dorsiflexor musklerne i musen lavere hindlimb gennem en in vivo procedure.
Kommercielle apparater er effektive og hjælpsomme i at udføre denne non-invasiv procedure. Denne test giver vigtige fordele relateret til vurdering af kontraktile muskelfunktion samtidig bevare en native fysiologiske miljø, hvor blodet levering og innervation forbliver intakt. På den anden side er dens ulemper relateret til normalisering af kraft pr. enhed af tværsnitsareal af muskel (specifikke force), som kun kan konstateres i en isoleret muskel, der er høstet efter eksperimenter. Men den non-invasiv test tillader flere målinger af kontraktile funktion af fleksor musklerne i samme dyr over tid, hvilket resulterer i reducerede antallet af forsøgsdyr stilles, især hvis målet er at vurdere relative ændringer ( ændringer i absolut kraft over tid).
Der er vigtige skridt, der skal overvejes under denne procedure for at opnå konsistente data over timepoints. Først bør man forsøge at standardisere dyr placering så vidt muligt. Andet er under indstillingen op det vigtigt at være i overensstemmelse med elektrode placering således at optimal stimulation kan nås via stimulation af peroneal nerve. Placering af elektroderne skal være på den laterale side af (i dette tilfælde højre) ben, tæt til hovedet af fibula og andre længere nede den laterale side af benet (figur 2). Baseret på dette, er custom-made elektroderne designet som sådan at både kan være placeret på samme position hver gang. Dog kan tilstrækkelig stimulation også opnås ved hjælp af elektrode nålene leveres med de kommercielle apparater. For det tredje er det afgørende at opnå negative toppe under opsætningen af spændingen ved at dreje med uret transduceren tilsluttet fodpladen. Korrekt positionering af musen ben elektroder med maksimal spænding setup har vist sig for at være en teknik, der kan udføres på den samme mus over tid.
Evnen til at vurdere og spore muskelfunktion på forskellige timepoints på de samme dyr er en vigtig vurdering at karakterisere forskellige muskel sygdomme samt deres progression. Desuden, denne måling af muskel dorsiflexion i mus kan være et redskab til at vurdere effektiviteten af potentielle behandlinger i en native fysiologiske miljø, med minimum metabolisk stress12. Således, det giver en teknik i vurderingen af muskel sygdom, dens progression og potentiel behandling.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Finansiering fra dette projekt var fra skolen af motion og ernæring videnskaber, Deakin University. Forfatterne vil gerne takke Mr. Andrew Howarth for hans omfattende arbejde i at optimere elektroder enhed.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus | Complete muscle function system |
| Conductive gel | Livingstone | ECGEL250 | conductive gel used in the mice |
| Eye ointment | Alcon | Poly Visc | pharmaceutic product (ophthalmic use) |
| nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) | Ilium | Metacam | veterinary medicine (injectable 5mg/ml) |
| Isoflurane | Zoetis | Isoflo | veterinary inhalation Anaesthetic |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Gerlinger-Romero, F., Guimaraes-Ferreira, L., Yonamine, C. Y., Salgueiro, R. B., Nunes, M. T. Effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) on the expression of ubiquitin ligases, protein synthesis pathways and contractile function in extensor digitorum longus (EDL) of fed and fasting rats. The Journal of Physiological Sciences. 68 (2), 165-174 (2018).
- Pinheiro, C. H., et al. Metabolic and functional effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) supplementation in skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 112 (7), 2531-2537 (2012).
- Metter, E. J., Talbot, L. A., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal muscle strength as a predictor of all-cause mortality in healthy men. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (10), B359-B365 (2002).
- Foletta, V. C., White, L. J., Larsen, A. E., Leger, B., Russell, A. P. The role and regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 461 (3), 325-335 (2011).
- Zacharewicz, E., et al. Identification of microRNAs linked to regulators of muscle protein synthesis and regeneration in young and old skeletal muscle. PLoS One. 9 (12), e114009 (2014).
- Ryan, M. J., et al. Suppression of oxidative stress by resveratrol after isometric contractions in gastrocnemius muscles of aged mice. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65 (8), 815-831 (2010).
- Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernandez-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In Vivo Assessment of Muscle Contractility in Animal Studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. 71, e50036 (2013).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e50036 (2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 705-715 (2014).
- Collins, B. C., et al. Deletion of estrogen receptor alpha in skeletal muscle results in impaired contractility in female mice. Journal of Applied Physiology (1985). 124 (4), 980-992 (2018).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. The Journal of Physiology. 535 (Pt 2), 591-600 (2001).
- Vitzel, K. F., et al. In Vivo Electrical Stimulation for the Assessment of Skeletal Muscle Contractile Function in Murine Models. Methods in Molecular Biology. 1735, 381-395 (2018).
- Jackman, R. W., Kandarian, S. C. The molecular basis of skeletal muscle atrophy. American Journal of Physiology Cell Physiology. 287 (4), C834-C843 (2004).
