Summary
Измерение сократительной функции грызунов скелетных мышц является полезным инструментом, который может использоваться для отслеживания прогрессирования заболевания, а также эффективность терапевтического вмешательства. Здесь мы описываем неинвазивный, в естественных условиях оценки dorsiflexor мышц, которые могут быть повторены со временем в том же мышь.
Abstract
Оценки сократительной функции скелетных мышц-это важный показатель для обоих клинических и научных целях. Многочисленные условия может негативно повлиять на скелетных мышц. Это может привести к потере мышечной массы (атрофия) и/или потери качества мышц (снижение силы на единицу мышечной массы), оба из которых являются распространенными в хроническое заболевание, мышцы конкретных заболеваний, иммобилизации и старения (саркопения). Функцию скелетных мышц у животных могут оцениваться по целому ряду различных тестов. Все тесты имеют ограничения, связанные с физиологической среды тестирования, и выбор конкретного теста часто зависит от характера экспериментов. Здесь мы описываем метод неинвазивные в естественных условиях, , с участием полезный и простой оценки силы частота-кривой (FFC) у мышей, которые могут быть выполнены на то же самое животное с течением времени. Это позволяет осуществлять мониторинг прогрессирования заболевания и/или эффективности потенциальных терапевтического лечения.
Introduction
Скелетных мышц является важным метаболических ткани, которая включает около 40% от общего веса тела. Она играет решающую роль в элементе управления энергии метаболизма и гомеостаза1. Скелетная мышечная масса поддерживается прекрасный баланс между ставками для синтеза и деградации белка1. Многочисленные болезни условия влияют на эти процессы в скелетных мышц, приводит к чистой потери мышечной массы (атрофия). Они включают, но не ограничиваются, рак, СПИД, старение, постом и конечностей иммобилизации2,3. Старение населения, потеря прочности не связан с потери мышечной массы и является показателем смертности все дело4. В этом контексте оценка функции мышц обеспечивает важной мерой при определении эффективности терапевтических стратегий борьбы и/или предотвратить тратить скелетных мышц и потери функции.
Исследователи использовали множество различных подходов и Животные модели, чтобы понять молекулярные пути мышечной атрофии5,6 и последствия этих механизмов на мышцы сократительная функция2,3 ,7. Таким образом корреляция изменения на молекулярном уровне различия в функции мышц важно в понимании как молекулярные изменения уровня может повлиять на функциональность мышц.
Функцию скелетных мышц, особенно в мелких грызунов, обычно осуществляется с помощью трех хорошо описанные процедуры8,9 обнаружить нарушение силой производства и/или контролировать прогрессирование болезни. (1) ex vivo; где мышцы удаляется от животных и инкубировали в растворе Рингера ванна для оценки функции мышц, используя поле стимуляции10. (2) на местах; где проксимальной прикрепления мышц остается в животное и дистального сухожилия соединен датчик силы, позволяя мышечной функции выполняться путем прямого нерва стимуляции11. (3) в естественных условиях; где электроды расположены подкожно добиваться вызывали нерва мышц силу производство9,12. Хотя эти три процедуры используются для различных целей, они каждый имеют преимущества и недостатки. Таким образом важно выбрать подходящий метод, основанный на цель исследования. Основное ограничение с ex vivo экспериментов является удаление мышц от своей обычной среды и использование поля стимуляции. На месте метод поддерживает нормальное кровоснабжение и использует стимуляции через нерв, но нормальная анатомия изменяется и характер эксперимента терминала; Таким образом это делает последующие мышечной функции измерения невозможно. В естественных условиях метод, описанный здесь наиболее тесно имитирует нормальной физиологии, анатомии спокойно, нервно расслоение остается неизменным, и эксперимент не терминала, позволяя последующих мер в рамках же животное за время8.
Здесь мы описываем в естественных условиях процедура, которая позволяет несколько измерений функции мышц в то же самое животное с течением времени. Эта процедура предполагает оценку мышц голеней передний отсек — включая tibialis anterior(TA), Лонг разгибатель пальцев (EDL) и hallicus Лонг (ИГП) разгибателей, ответственных за dorsiflexion — в неинвазивная процедура малоберцовой (также известный как малоберцового) нерва стимуляция. TA обеспечивает большую часть сил для лодыжки dorsiflexion13, с только минимальный вклад EDL и ЭГЛ, контролировать движение пальцев. Этот протокол-терминал гарантирует сохранение нерва и крови. Это позволяет для расследования случаев заболевания эволюции и эффективность лечения со временем в наиболее физиологической среде в настоящее время доступна в животной модели.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были утверждены Комитетом Deakin университета животных этики (проект #G19/2014).
1. Оборудование для установки
- Убедитесь, что все машины подключены правильно.
- Включите компьютер, мощный стимулятор Би фаза и рычаг двойного режима системы.
- Настройка мыши колена зажим на платформе, а также мыши подножку на transductor.
- Включите Отопление платформы до 37 ° C.
- Откройте программное обеспечение управления динамической мышц на рабочем столе.
Примечание: Это программное обеспечение, необходимое для выполнения функционального тестирования.
2. программное обеспечение и Настройка модели
- После того, как программа открыт (рис. 1), калибровки датчика и выберите установки | Мои инструменты | Калибровки.
- На кнопку «Настройка», выберите InstantStim и измените параметры «Время выполнения» на 120 s (рис. 1A).
Примечание: Оптимального напряжения можно также добиться путем выполнения одного дергается, настройки или вручную начиная InstantStim как столько раз, сколько необходимо. - В окне Тип состоянии с надписью «Автосохранение база» для ввода имени auto сохраните местоположение файла (например, mouse1-Дата timepoint1). Установите флажок слева от окна «Автосохранение база» и измените его на Включить автосохранение.
- В верхней части элемента управления DMC экрана перейдите на программы Sequencer, который откроет новое всплывающее окно. Выберите Открыть последовательность и готовые протокол быть использованы (рис. 1B). Выберите последовательность загрузки | Закрыть окно.
Примечание: Этот шаг используется для создания теста частоты кривой (FFC) силы (1, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 250 Гц). - Установите ручку «Диапазон» на 10 мА на Би фаза стимулятор.
Примечание: Убедитесь, что кнопка «Настроить» (рядом внизу) на ноль. Это тонкая настройка позволяет программе установки электродов.
3. Настройка мыши
Примечание: Все силы измерения проводились на мужской мышах одичал тип (C57BI/6) в возрасте 12 недель.
- Место каждой мыши в анестезии камеру с расходом кислорода 1 Л/мин с 5% изофлюрановая (через вдыхание ураном) до тех пор, пока указатель мыши теряет сознание. Подтвердите адекватной анестезии через потеря ноги рефлекс.
- Удалите все волосы на правой ноге мыши после бритья с электрическим стрижки.
- Поместите животное в лежачем положении на подогретую платформу и очистите правую ногу (может использоваться любой стороны) с 70% спирта и йода. На данный момент Отрегулируйте изофлюрановая до 2% (с кислородом потока в 1 Л/мин) и применить проводящего геля на кожу, где будут размещены электроды.
Примечание: Используйте датчик ректальной температуры контролировать температуру тела во время процедуры и применять глазную мазь для предотвращения сухости и/или повреждения глаз. - Поместите ноги на педаль и прикрепить с помощью медицинской ленты. Фиксатор колена для стабилизации и иммобилизации ногу во время процедуры.
Примечание: Некоторые исследования описал с помощью очень тонкой спицей, вставленные проксимального отдела голени (задняя dorsiflexors мышцы)12 для обеспечения стабилизации. Этот протокол выбирает струбциной, как это обеспечивает достаточную стабилизации без ненужных сжатия/повреждения колена. Зажим также позволяет избежать потенциальных воспаление, которое может создать транс костные pin, то же время позволяя точной оценки сократимости мышц. Кроме того мышь колена зажим был успешно используется14. - На данный момент используйте ручки на платформе для позиционирования мыши задних конечностей, так что есть под углом 90° на лодыжке (рис. 2).
4. Оптимизация положения электродов
- Когда указатель мыши помещается на платформе, положение электродов под кожу (подкожная) в правую ногу.
Примечание: Это решающий шаг, и некоторые репозиционирования может потребоваться получить желаемое положение во время установки в шаге 4.4. - Место электроды на боковой стороне правой ноги; Разместите один возле головы малоберцовой кости и другой электрод более дистально на боковой стороне ноги (рис. 2).
Примечание: По индивидуальному заказу электрод система призвана оптимизировать этот шаг. Однако этот тест может выполняться с электродов иглы, предоставляемых производителем в этой системе. - После того, как достигаются эти шаги, на мощный стимулятор Би фаза отрегулируйте ручку, как необходимо получить стимуляции малоберцового нерва, что приводит к dorsiflexion максимальный крутящий момент с надписью «Настроить».
Примечание: Для взрослых мышах одичал типа, этот диапазон является менее чем 2 мА; Однако это может быть зависит от размера, возраста и пола животного. Производственные силы (вершины кривых) должно быть увеличено медленно, пока не будет достигнута максимальная сила. - Во время стимуляции поверните датчика по часовой стрелке давать отрицательные значения (рис. 3), которые имеют важное значение для обеспечения что электроды стимулируют только dorsiflexor мышцы малоберцового нерва. После того, как достигается этот шаг, стабилизируйте с помощью струбцины, предотвращая любые движения во время процедуры электроды.
Примечание: Вершины будет постепенно увеличивать масштабы, и максимальная сила тока определяется как уровень, на котором три или более последовательных стимуляцию привести к идентичным сократимости. Сопротивляться, поворачивая ампераж, выше, чем необходимо; Максимальная сила тока будет стимулировать соседних и потенциально антагонист мышцы контракта, вызывая совместного сжатия, который может генерировать вершины положительных значений. - Остановите мгновенные СТИМ на программное обеспечение.
- На главном экране включите кнопку с надписью «Начать последовательность», чтобы начать предыдущей последовательности установки (как описано в шаге 2.4).
5. прекращение процедуры
- По окончании измерения силы удалить электродов, отпустите зажим колена и удалите ленту ног.
- Выключить изофлюрановая и поддерживать доставки кислорода на несколько минут, пособничество животных восстановления. Как только начинает двигаться и/или приходит в сознание и может самостоятельно правой мыши, возвращение мыши в своей клетке.
Примечание: Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) могут быть вводят подкожно (1 мг/кг Мелоксикам) для предотвращения любой дискомфорт и/или болезненность после процедуры.
6. анализ данных
- Откройте программное обеспечение для анализа данных.
- Перейти к Высокой пропускной способности (сверху слева на экране). Выберите Частоту силы для анализа выше описывается последовательность установки.
- Выберите вручную и изменить значение «Конец курсора» 3. Также выберите Удалить.
- Нажмите на Выбрать файлы для доступа к процедуре ранее и нажмите кнопку анализ. На данный момент результат можно получить на экране или экспортировать в электронную таблицу для дальнейшего анализа и/или расчеты.
Примечание: Данные были измерены в mN; Однако крутящий момент может рассчитываться путем умножения значения силы Длина рычага (абсолютная сила). При необходимости (конкретные силы), нормализация крутящий момент могут быть нормированы веса тела, или терминала эксперименты для сбора мышечной массы соответствует возрасту.
Representative Results
Кривая силы частот это полезный тест, в котором мышцы может стимулироваться низших и высших частот различать неоптимальной и оптимальной силы реакции15. Сил на более низких частотах может стимулировать один дергаться, активизируя все меньше и меньше мотор единиц, и на более высоких частотах достигается стабильное пик, где изолированные дергается наплавочные (столбняка), достигнув максимальной силы путем активации всех двигательных единиц16 . В тест представлен, столбнячной кривой начинается с ~ 60 Гц, где могут быть визуализированы потенцирование (рис. 4A) и максимальная сила определяется на ~ 150 Гц (рис. 4B), когда плато достигается с завершенных плавленого кривой9, 16.
Любое изменение этих результатов может указывать, что мышцы не будучи стимулируются должным образом электродов. Размещение электродов является важным шагом в подготовке этой процедуры, как электрическая стимуляция должна быть правильно иннервируют малоберцового нерва и таким образом полностью активировать мышцы dorsiflexion, которые он поставляет (TA, EDL и ИГП). Правильное позиционирование электрода приводит к генерации отрицательных пиков (рис. 3) во время этого процесса, в то время как смещения электродов или высокий ампераж может привести к стимуляции окружающих мышц, вызывая сокращение сотрудничества соседние мышцы и антагониста мышцы, которые в свою очередь генерирует вершины положительных значений.
Рисунок 5A показывает данные представителя силы кривая частот от мыши во времени, где процедура повторяется один раз в неделю до 5 timepoints были завершены. Эти наблюдения показали последовательную силы производства ценностей во всем timepoints и/или замечания измеряется. Эта процедура также показал согласовываться между измерениями мышей, как показывает Рисунок 5B представитель, что площадь под кривой ФСГ стимулирует более 5 различных наблюдений в 6 мышей, проверку раз в неделю.
Рисунок 1 : Программное обеспечение системы. (A) контролировать программное обеспечение иллюстрации шагов по настройке параметров «Мгновенный Stim». На фоне фото, нажмите установки | Мгновенное СТИМ. На небольших выскочил окно (передние фото), настроить параметры. (B) Иллюстрация вида установки «Sequencer». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Мыши установки. Обзор положения наркотизированных животного. В правом колене зажим размещается так, чтобы колени под углом 90° и так, что ноги и лодыжки находятся под углом 90° (пунктирной белой линии). Сокращение мышц dorsiflexors достигается путем стимуляции малоберцового нерва, который расположен прямо под (дистальнее) руководитель малоберцовой кости. Мы используем специально разработанных электродов (вставка); Однако электроды иглы, которые предоставляются с группой, или отдельно, также являются достаточными. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Выход от размещения электродов. После того как электроды расположены под кожу и инициируется напряжения, наблюдаются пики с отрицательными значениями. На данный момент достигнув отрицательные значения (зеленые линии) является важным шагом в убедившись, что стимуляция достигается в dorsiflexor мышцы только (TA, EDL и ИГП). Реальном времени измерения указывается между двумя красными линиями. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Представитель кривые. (A) образец кривой силы при 60 Гц (мышь #06). (B) образец столбнячной кривой на 150 Гц (мышь #03). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Представитель силу кривая частот (FFC) и площадь под кривой данных. (A) более 5 различных ФСГ (ось x) timepoints (1, 2, 3, 4 и 5 недель) в образце мышь (#05). (B) площадь под кривой (AU, ось y) ФСГ над 5 различных timepoints (мышь #01, 02, 03, 04, 05 и 06, соответственно; оси x). Результаты выражаются как среднее ± среднеквадратическая ошибка измерения (SEM) пяти timepoints (тесты) в 6 мышей и были проанализированы односторонний дисперсионный анализ тест (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Измерение максимального мышцы сократительной функции в повторяемые и точно имеет решающее значение для прогрессивного оценки генетических, метаболические и мышц условия17. Аналогичным образом в естественных условиях мышцы сократительная функция позволяет для оценки новых процедур и терапии для изнурительных условиях мышц. Мы демонстрируем здесь измерения силы производства dorsiflexor мышц нижних задних конечностей мыши через процедуру в естественных условиях.
Коммерческие аппараты являются эффективным и полезным в выполнении этой неинвазивной процедуры. Этот тест дает важные преимущества, связанные с оценкой сократительной функции мышц при сохранении родной физиологической среде, в которой кровь снабжения и иннервации остаются нетронутыми. С другой стороны ее недостатки связаны с нормализации силы на единицу площади поперечного сечения мышцы (конкретные силы), которое может быть установлено только в изолированных мышцы, которые собирают после экспериментов. Однако неинвазивный тест позволяет несколько измерений сократительной функции мышц сгибателей в то же самое животное с течением времени, обусловило сокращение числа подопытных животных требуется, особенно если цель заключается в том, чтобы оценить относительные изменения ( изменения в абсолютной силы со временем).
Имеются важные шаги, которые должны рассматриваться в ходе этой процедуры для достижения соответствия данных над timepoints. Во-первых следует пытаться стандартизировать животных позиционирования, когда это возможно. Во-вторых во время создания его важно соответствовать позиционирование электрода, так что оптимальной стимуляции можно добраться через стимулирование малоберцового нерва. Расположение электродов должны быть на боковой стороне (в этом случае справа) ноги, недалеко от головки малоберцовой кости и другие дальше вниз боковые стороны ноги (рис. 2). Основываясь на этом, заказные электроды предназначены как таковой что оба могут быть помещены в том же месте каждый раз. Однако достаточно стимуляции также может быть достигнуто с помощью электродов иглы с коммерческой аппаратуры. В-третьих крайне важно для достижения отрицательных пиков во время установки напряжения, повернув по часовой стрелке преобразователей, подключенных к подножку. Правильное позиционирование мыши ноги электродов с максимального напряжения установки показывает технику, которая может выполняться на том же мыши с течением времени.
Способность оценивать и отслеживать функции мышц на различные timepoints на то же самое животное представляет собой важную оценку для характеристики различных мышечных заболеваний, а также их прогрессии. Кроме того это измерение dorsiflexion мышц у мышей может быть инструментом для оценки эффективности потенциальных лечения в родной физиологической среде с минимальным метаболический стресс12. Таким образом он обеспечивает методику оценки мышечной болезни, ее прогрессии и возможности лечения.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Финансирование этого проекта был из школы упражнений и питания наук, Университет Дикин. Авторы хотели бы поблагодарить г-н Эндрю Howarth за его обширную работу по оптимизации электродами устройства.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1300A: 3-in-1 Whole Animal System – Mouse | Aurora Scientific Inc. | 305C-LR: Dual-Mode Footplate; 605A: Dynamic Muscle Data Acquisition And Analysis System; 701C: Electrical Stimulator and 809C: in-situ Mouse Apparatus | Complete muscle function system |
| Conductive gel | Livingstone | ECGEL250 | conductive gel used in the mice |
| Eye ointment | Alcon | Poly Visc | pharmaceutic product (ophthalmic use) |
| nonsteroidal anti-inflammatory drug (NSAID) | Ilium | Metacam | veterinary medicine (injectable 5mg/ml) |
| Isoflurane | Zoetis | Isoflo | veterinary inhalation Anaesthetic |
References
- Frontera, W. R., Ochala, J. Skeletal muscle: a brief review of structure and function. Calcified Tissue International. 96 (3), 183-195 (2015).
- Gerlinger-Romero, F., Guimaraes-Ferreira, L., Yonamine, C. Y., Salgueiro, R. B., Nunes, M. T. Effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) on the expression of ubiquitin ligases, protein synthesis pathways and contractile function in extensor digitorum longus (EDL) of fed and fasting rats. The Journal of Physiological Sciences. 68 (2), 165-174 (2018).
- Pinheiro, C. H., et al. Metabolic and functional effects of beta-hydroxy-beta-methylbutyrate (HMB) supplementation in skeletal muscle. European Journal of Applied Physiology. 112 (7), 2531-2537 (2012).
- Metter, E. J., Talbot, L. A., Schrager, M., Conwit, R. Skeletal muscle strength as a predictor of all-cause mortality in healthy men. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 57 (10), B359-B365 (2002).
- Foletta, V. C., White, L. J., Larsen, A. E., Leger, B., Russell, A. P. The role and regulation of MAFbx/atrogin-1 and MuRF1 in skeletal muscle atrophy. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 461 (3), 325-335 (2011).
- Zacharewicz, E., et al. Identification of microRNAs linked to regulators of muscle protein synthesis and regeneration in young and old skeletal muscle. PLoS One. 9 (12), e114009 (2014).
- Ryan, M. J., et al. Suppression of oxidative stress by resveratrol after isometric contractions in gastrocnemius muscles of aged mice. The Journal of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 65 (8), 815-831 (2010).
- Iyer, S. R., Valencia, A. P., Hernandez-Ochoa, E. O., Lovering, R. M. In Vivo Assessment of Muscle Contractility in Animal Studies. Methods in Molecular Biology. 1460, 293-307 (2016).
- Mintz, E. L., Passipieri, J. A., Lovell, D. Y., Christ, G. J. Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair. Journal of Visualized Experiments. (116), e54487 (2016).
- Hakim, C. H., Wasala, N. B., Duan, D. Evaluation of muscle function of the extensor digitorum longus muscle ex vivo and tibialis anterior muscle in situ in mice. Journal of Visualized Experiments. (72), e50183 (2013).
- Moorwood, C., Liu, M., Tian, Z., Barton, E. R. Isometric and eccentric force generation assessment of skeletal muscles isolated from murine models of muscular dystrophies. Journal of Visualized Experiments. 71, e50036 (2013).
- Lovering, R. M., Roche, J. A., Goodall, M. H., Clark, B. B., McMillan, A. An in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery. Journal of Visualized Experiments. (51), e50036 (2011).
- Corona, B. T., Ward, C. L., Baker, H. B., Walters, T. J., Christ, G. J. Implantation of in vitro tissue engineered muscle repair constructs and bladder acellular matrices partially restore in vivo skeletal muscle function in a rat model of volumetric muscle loss injury. Tissue Engineering Part A. 20 (3-4), 705-715 (2014).
- Collins, B. C., et al. Deletion of estrogen receptor alpha in skeletal muscle results in impaired contractility in female mice. Journal of Applied Physiology (1985). 124 (4), 980-992 (2018).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. The Journal of Physiology. 535 (Pt 2), 591-600 (2001).
- Vitzel, K. F., et al. In Vivo Electrical Stimulation for the Assessment of Skeletal Muscle Contractile Function in Murine Models. Methods in Molecular Biology. 1735, 381-395 (2018).
- Jackman, R. W., Kandarian, S. C. The molecular basis of skeletal muscle atrophy. American Journal of Physiology Cell Physiology. 287 (4), C834-C843 (2004).
