Summary
在这里, 我们描述了一种高含量的成像方法来量化与视网膜色素变性相关的视紫红质突变体的转运。采用多波长评分分析法对细胞表面或整个细胞的视紫红质蛋白进行了定量。
Abstract
罗丹辛错折变导致棒光感受器死亡, 表现为常染色体显性视网膜色素变性 (rp), 一种渐进的致盲疾病, 缺乏有效的治疗。我们假设通过药理稳定突变体视紫红质蛋白, 可以缓解错折视紫红质突变体的细胞毒性。p23h 突变, 在其他 ii 类视紫红质突变中, 编码了一种结构不稳定的视紫红质突变蛋白, 该突变蛋白存在于内质网 (er) 中, 而野生型视紫红质突变蛋白则被输送到哺乳动物的质膜上细胞。我们以前进行了基于发光的高通量屏幕 (hts), 并确定了一组药理伴侣, 拯救了 p23h 视紫红素从 er 到质膜的运输。在这里, 我们使用免疫染色方法, 然后进行高含量的成像分析, 我们量化了整个细胞和质膜上的突变性视紫红素蛋白的数量。该方法信息丰富, 有效识别 hts 后误报的真实命中。此外, 高含量图像分析使我们能够量化一个单一实验的多个参数, 以评估每种化合物的药理特性。利用该方法, 我们分析了11种不同化合物对 6个 rp 相关视紫红质突变体的影响, 获得了一个二维药理谱, 对这些视紫红质突变体的结构稳定性有了定量和定性的了解以及不同化合物对这些突变体的功效。
Introduction
蛋白质错误折叠与肌肉萎缩症、神经消融以及致盲疾病有关, 包括视网膜色素变性 (rp)1。rp 是一种遗传和进行性视网膜变性, 与60多个基因的突变有关, 这些基因影响棒光感受器或视网膜色素上皮 (rpes)2,3的功能和稳态。目前没有有效的 rp 治疗方法。罗丹辛突变约占常染色体显性 (ad) rp 病例的25-30。在 150多种视紫红质突变4 (人类基因突变数据库,/www.hgmd.cf.ac.uk/) 中, ii 类突变导致导致棒光感受器死亡的视紫红质蛋白的结构不稳定,视力下降5,6,7,8。p23h 是北美最常见的视紫红质突变, 也是 ii 类视紫红质突变9,10的典型例子。由于其固有的结构不稳定性, 错折叠的视紫红质在哺乳动物细胞内质网 (er) 中积累, 而野生型视紫红质位于质膜5上。错误折叠的视紫红质 p23h 突变体表现出显性的负细胞毒性, 不是由于单倍体不足, 而是与 er 相关蛋白降解途径的激活和中断的棒外段组织有关。为了减轻棒光感受器细胞的压力, 一种策略是使用药理伴侣来稳定突变体视紫红质的原生折叠。
为了实现这一目标, 我们使用β-半乳糖苷酶片段互补试验进行了基于细胞的高通量筛选 (11,12 , 13), 以量化在血浆中运输的 p23h 视后质突变体膜。这种高温超导分析的稳健而简单的协议使我们能够探索每个屏幕大约 79, 000个小分子的活性。然而, 由于此 hts 检测读取发光信号, 包括β-gal 抑制剂、有色或细胞毒性化合物在内的误报被列入必以二次检测的命中名单。
传统的免疫染色和荧光成像方法已被用于研究哺乳动物细胞中的视紫红质转运 5,14,15,16。然而, 这些常规方法不能用来量化10种以上化合物对视紫红质运输的药理作用, 因为可靠的成像分析需要在高度一致的条件下拍摄大量图像, 即不能用传统的成像方法来修正。在这里, 我们开发了一个基于免疫染色的高含量成像协议作为二次检测, 以量化错误折叠的视紫红质突变体11,13,17的细胞表面传输。为了在质膜上贴上视紫红质的标签, 我们跳过了细胞膜渗透的步骤, 并通过单克隆 (b6-30) 反视紫红质在细胞外侧识别视紫红质 n-末端表位的免疫抑制视紫红质突变体膜18。为了想象整个细胞中的突变视紫红质, 我们将视紫红质与金星荧光蛋白融合在一起。通过对不同荧光通道中荧光强度的定量, 我们可以从一个实验中获得多个参数, 包括整个细胞、细胞表面的总视紫红质强度和视紫红质荧光在细胞表面到整个细胞。将该方法应用于表达共6个错误折叠的视紫红质突变体的稳定细胞, 我们可以生成多个小分子伴侣对这些突变体的药理特征。在该协议中, 所有细胞都在384孔板中进行免疫保留, 并在高度一致的成像条件下使用自动成像系统进行成像。对每口井进行图像分析, 包含600多个细胞的图像, 以减少因细胞形状和蛋白质表达水平不同的细胞的异质性而产生的变异。图 1总结了此协议的工作流。该方法的优点是通过基于图像的分析获得高分辨率图像和多参数量化。一般来说, 该协议可以修改和应用, 以量化任何错误折叠的膜蛋白的运输感兴趣。
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Protocol
注: 视紫红质转运试验.
1. 细胞的制备和培养
- 恢复低温保存的 u2os 稳定细胞表达野生类型 (wt) 或突变小鼠罗多普辛-金星融合蛋白。在37°c 下解冻细胞, 直到小瓶中只留下小冰晶。
注: u2os 细胞在本协议中的使用, 因为没有可用于体外研究的光感受器细胞系, 并通过哺乳动物细胞中类似的分子机制调节视紫红质的导线前生物合成。此外, u2os 细胞紧紧地附着在板的底部, 并有很大的细胞体, 因此它们是视紫红质转运试验的理想选择。以 7个 u2os 稳定细胞表达 wt、t4r、p23h、p53r、c110y、d1900 和 p267l 视紫红质突变体为例, 以证明检测的质量和可靠性。表达其他视紫红质突变体或其他膜蛋白的稳定细胞可以使用, 这取决于检测的目标。在本试验中, 如果有的话, 可以使用表达人视紫红质的稳定细胞。小鼠视紫红质在这里使用, 因为小鼠和人视紫红质蛋白共享95% 同源性, 该方法鉴定的化合物将在体内使用携带视紫红质 p23h 突变8的小鼠 adrp 模型进行体内检测。稳定细胞是按照前面的第19段所述生成的。用 q-pcr 对 wt 和突变体视紫红质转录体进行了定量, 并选择了表达 wt 水平相似的稳定细胞克隆和突变视紫红质转录体。免疫印迹和免疫染色证实了视紫红质蛋白的表达。本试验中使用的细胞通道应低于20。 - 将每束细胞转移到含有10毫升生长介质的15毫升锥形锥形管中 (高葡萄糖 dulbecco 的改良鹰培养基 (dmem), 含有10% 的胎儿牛血清 (fbs) 和5μgml 血浆)。
- 以 200 x g离心管 5分钟, 丢弃上清液, 并在每个细胞系用5毫升细胞生长介质重新悬浮细胞颗粒。将每系细胞悬浮液转移到60毫米组织培养盘中, 并在37°c 下孵育, 使用5% 的 co2。
- 如参考12所述, 当组织培养盘达到90% 融合时, 细胞就会亚培养。
2. 每井 5, 000个种子细胞
注: 在组织培养罩中执行以下过程。
- 用聚赖氨酸治疗盘子。
- 播种细胞前一天, 用20μl·井多赖氨酸溶液处理黑壁和清底384井板, 用30分钟。
- 将液体吸干, 使所有水井干燥 1小时. 将板盖放回原盖, 并将其存放在4°c 过夜, 以便进行细胞播种。
- 准备细胞悬浮液。
- 在100毫米组织培养皿中培养生长介质中的每个细胞系, 直到90% 的融合。
- 用磷酸盐缓冲盐水 (pbs) 清洗每道菜, 并在37°c 下用0.05% 胰蛋白酶的1毫升分离细胞。
- 在测定介质中的10毫升中重新复制每条细胞线 (高血糖 dmem 与10% 的 fbs、100 unitsl 青霉素和100μgml 链霉素)。
- 用检测介质对细胞进行计数, 并将每一行细胞稀释到 1.25 x10 5细胞。
- 给细胞播种。
- 使用电子多通道移液器或自动试剂分配器将细胞悬浮液的40μl/井分配到每个细胞系的三列, 并填充384孔板的1-21 列 (图 2)。
- 在 u2os (rhodopsin-vus) 的 22-23 和 40μl/well 列中添加 40μl/well u2os (rhodopsin-vus) 到第24列中作为对照。
- 以 300 x g离心板 30秒, 将所有细胞带到384孔板的底部。
注: 细胞播种后, 避免对板材造成物理冲击。否则, 细胞将被粉碎到每口井的一个角落, 板材将不适合高含量成像。 - 在37°c 下, 用 5% co2 将384孔板培养 3小时,使电池附着在板的底部。
3. 用化合物治疗细胞
- 生成具有处理条件的板图, 如图 2所示。
- 在96孔板中制备多达15个化合物的 500μl 5倍工作解决方案。
- 在96孔板 a1 至 g2 井中, 用检测介质稀释1至15的 cps 1 至 15 (图 2a)。在 h2 井中加入300μl 的检测培养基。
注: 每种化合物的最终浓度以最有效的浓度用于拯救 hts12,13所运输的 p23h 视紫红质。 - 每井添加100μl 的2% 二甲基亚硫酸盐 (dmso) 和 25μm 9-cis-视网膜, 分别在检测介质中稀释至第11列和第12列。在昏暗的灯光下加入9-cis-视网膜。
- 在96孔板 a1 至 g2 井中, 用检测介质稀释1至15的 cps 1 至 15 (图 2a)。在 h2 井中加入300μl 的检测培养基。
- 在用细胞培养的384孔板上加入 10μl/5 x 工作溶液 (图 2b)。
- 使用电子多通道移液器将化合物1、3、5、7、9、11、13和15添加到 a、c、e、g、i、k、m 和 o 列从1列添加到21列 (图 2)。将化合物2、4、6、8、10、12、14和 m 添加到第1列到21列的行 b、d、f、h、j、l、n 和 p。
- 在第22和24列中添加 10μl, 每口井 2% dmso。在23色柱中加入 10μl, 每口25μm 9-cis-视网膜。
注: dmso 被用作车辆控制, 因为所有化合物最初都作为库存溶解在 dmso 中。以含有表达 p23h 视紫红质的 dmso 处理细胞的第22列作为0% 对照。9-cis-视网膜处理细胞表达 p23h 视紫红质被用于100% 对照。
- 用铝箔覆盖384孔板, 在37°c 下孵育板24小时。
4. 在无膜渗透性的情况下对细胞表面的抑制红素蛋白进行免疫染色。
注: 在整个免疫染色过程中避免使用任何洗涤剂, 以保持细胞膜的完整。
- 在化学烟罩中, 用 pbs 稀释16% 的 pfa, 以1:4 体积比的比例, 制备4% 的甲醛 (pfa)。将4% 的 pfa 转移到试剂库中。
- 在昏暗的红灯下, 在黑暗的房间里拿出384井的盘子。使用连接到真空收集瓶的8通道吸气器轻轻吸气介质。使用电子多通道移液器, 在整个384孔板中加入每口新鲜制备的 4% pfa 的 20μl, 并在室温下孵育20分钟。为了避免细胞分离, 在愿望过程中, 总是把吸气人的提示指向每口井的同一侧。不要触摸每口井的中间底部区域。拍摄图像时, 选择字段以避免被吸气器触及的区域。对于超过10分钟的孵育, 用盖子覆盖384孔板, 以避免蒸发。
注: 细胞被固定在黑暗的房间中, 以避免再生异裂酶的光漂白, 这将影响100% 控制的结果。固定后, 384 孔板可以在正常光线下取出。 - 使用8通道吸气器在每口井中吸气 pfa, 并使用电子多通道移液器为每口 pbs 添加50μl。再重复两次, 使用 pbs 执行三次清洗。
注意: 含有 pfa 的废液被收集在瓶盖瓶中, 并在实验结束后作为危险化学废物进行处理。 - 在整个384孔板中加入每口血清 20μl, 每井添加 20μl, 并在室温下孵育30分钟。
- 将5% 山羊血清吸泡, 在1% 山羊血清中每井添加 15μl, 每 20μg ml-1 b6-30 抗凝血酶抗体进入 a 至 o 行, 为继发抗性对照组添加15μl 每份 1. 1.
- 在室温下或在4°c 下连夜培育384孔板90分钟。用铝箔覆盖384井板, 以避免荧光的光漂白。
- 用每口 pbs 50μl 清洗板3次。
- 吸动 pbs, 每孔添加 15μl 5μg ml-1 cy3 共轭山羊抗小鼠 igg 抗体.用铝箔覆盖384孔板, 在室温下孵育1小时或在4°c 下过夜。
- 用每口 pbs 50μl 清洗板3次。每井添加 50μl, 其中含有 1μg ml-1 hoechst 33342, 在室温下染色细胞核15分钟。
- 在成像前, 用透明的薄膜密封384孔板。用铝箔覆盖384井板, 如果立即拍摄图像, 则在4°c 下存放长达一周。
5. 成像.
注: 此高含量成像程序适用于"材料表" 中列出的成像系统。如果使用其他高含量成像系统, 则过程可能会有所不同。
- 取下盖子, 将384孔板放入高含量成像仪中, a1 位于板的左上角。
- 打开图像采集软件, 设置图像采集参数。
- 打开 "板块采集设置" 窗口, 创建新设置或加载现有安装文件。
- 选择20x 目标并将像素绑定设置为 2, 使校准的像素大小为 0.80 x 0.80 微米, 将扫描线设置为 2, 000, 将图像大小 (w x h) 设置为 1, 000 x 1, 000 像素 (80000x000. 00-00 微米)。
- 选择要映像的板类型。使用384孔板制造商提供的信息来填充板材尺寸。
- 选择384井板的井。
- 选择每个井要成像的四个站点。避免被吸气提示所触及的一侧。
- 选择激发激光器为405、405和561纳米。选择 dapi、fitc 和德州红色通道的排放过滤器。优化每个通道的激光功率和增益, 以确保从正控制井拍摄的图像亮度小于饱和阈值。
- 为自动对焦选择良好到良好的焦点。选择第一个获得的井作为用于查找样品的初始井。将站点自动对焦设置为所有站点。
- 为每个通道选择每行四个平均值。优化每个通道的 z 偏移值。
- 在384井板的对角线角测试2-3 口井, 以确保所有测试井的图像都集中在焦点上, 每个井的所有部位的图像都有超过40% 汇流的细胞, 所有通道的荧光强度大约为100% 的一半饱和 控制井。
- 保存图像采集方法。
- 运行整个盘子。观察成像仪, 直到它完成从板的第一列捕获图像, 以仔细检查图像质量, 然后离开成像仪。将384孔板取出, 存放在 4°c, 以备将来使用。
注: 根据每个井选择的站点数量和所采取的通道, 完成一个384孔板的成像需要40分钟到3小时。
6. 图像分析。
- 使用高含量图像分析软件提取图像数据。从100% 控制井中选择一个 (第23列) 以设置参数。
- 选择多波长单元评分作为分析方法, 然后开始配置设置。
- 使用来自 dapi 通道的图像定义原子核。预览以确保所选油井中定义的原子核形状与原子核图像很吻合。
- 定义 fitc 通道中的细胞形状, 在那里有罗多普辛-维纳斯的成像。
- 定义德州红通道中的视紫红质细胞表面染色区域。
- 在5口井中测试当前算法, 以确定设置是否经过优化。保存设置并关闭"配置"窗口。
- 用优化的分析方法运行所有的井。
- 导出对象编号作为完整的单元格号。导出 fitc 通道的平均强度为罗多芬-金星强度 (罗多普-金星 int)。导出德州红色通道的平均强度作为视紫红质强度在细胞表面 (红质 int 在细胞表面)。
- 在电子表格软件中打开导出的数据。将细胞表面的视紫红质强度除以罗多普辛-维纳斯 int 作为 mem-总额比。计算每个参数的 z '-因子, 以评估检测质量。Z′=1−3X(STD100% 控制+std0% 控制)/平均100% 控制-平均0% 控制。
注: 大于0的 z '-因子表示中等检测对于高含量屏幕来说是足够的, 0.5 和1之间的 z ' 因子表示高通量筛网20、21所需的未完成的检测。 - 使用电子表格软件为每个参数生成双色热图。排列 x 轴上的细胞系名称和 y 轴上的化合物。
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Representative Results
我们用三个参数来描述视紫红质的迁移: 整个细胞中的视紫红素-金星强度 (rhodopsin-vin送入 int)、视膜上的视紫红质的免疫染色强度 (细胞表面的 rhodopsin int) 和细胞表面的视紫红质染色到整个细胞的视紫红素-金星强度 (mem-总比)。视紫红素输运试验的一个代表性结果如图 3和图 4所示。使用 dmso 和9-cis-视网膜处理细胞, 分别表达 p23h-罗多普辛-金星作为0和100% 对照, 这三个参数的 z '-因子在0到0.5 之间, 表明该检测具有中等质量,足以实现高含量成像21。尽管与高温超导分析相比, 优化后的 z '-因子由于其相对复杂的过程而低于 0.5, 但这种检测对于基于图像的分析来说仍然是可靠和可靠的。一种用于抢救错折叠的视紫红质的活性化合物应在细胞表面显示较高的 rhopsin int 值和 mem-总比, p值低于0.05。从这三个参数中生成了三个二维热图, 用于比较每个细胞的平均视紫红素量和定位 (图 4)。在三文数中反复列出 wt 和6个视紫红质突变体, 并对复合治疗的效果进行了纵向比较。与以往的研究一致, 与 dmso (图 4c)治疗的 wt 视紫红素相比, 6个突变体的细胞表面视紫红质 int 和 mem-全部比率较低。t4r 细胞表面的视紫红质 int 及其 mem 与总比增加了9-cis-视网膜处理, p23h, d190n 和 p267l, 但不是 p53r 或 c110y 突变体, 这表明 9-cis-视网膜拯救 t4r 的运输,p23h、d190n 和 p267l 视紫红质突变体。所有的 cps 显示了不同程度的增加在 Rhodopsin int 在细胞表面对 t4r, p23h 和 d190n。cps 3、4、5、7、8和11增加了这些视紫红质突变体的视紫红素-维纳斯 int, 但没有增加其 mem-tol-总体比率, 这表明这些化合物只增加了视紫红质的含量。cps 1、2 6 和9显著增加了 t4r、p23h、d190n 和 p267l 视通物质突变体的 m-总量比, 这表明这些化合物拯救了这些视紫红质突变体对质膜的迁移。二维剖面提供了一个全面的概述视紫红质运输受这些 adrp 相关突变的影响, 通过不同的药物治疗减轻。
图 1: 视紫红素输运分析的工作流程.视紫红质细胞表面染色无膜渗透法的程序。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 用于制备5倍工作溶液和从96孔板向384井板的液体转移的说明.(a) 5倍工作解决方案的96孔板布局。血井 a1 至 g2 每口有 300μl, 最高可达 15个5倍工作溶液和检测介质 (m), 如第1栏和第2栏所示。化合物14和15分别为 2% dmso 和 25μm 9-cis-视网膜, 用于治疗表达 wt 的7个细胞系和突变视紫红质。此外, 11 列和12列具有100μl 每井 2% dmso 和 25μm 9-cis-视网膜控制, 分别处理给表达 p23h 视蛋白酶的细胞, 以计算 z '-因子。(b) 384 孔板布局, 适用于细胞类型和处理条件。所图文并茂的 u2os 细胞表达了 wt、t4r、p23h、p53r、c110y、d190n 和 p267l 罗多辛-金星。治疗条件用蓝色标记。粉红色和蓝色的尖端显示了利用多通道移液器从96孔板向384板的井到井液体转移。请点击这里查看此图的较大版本.
图 3: 控制视紫红素输运试验的代表性图像和定量.(a) 用 dmso 或 5μm 9-cis-视网膜处理的表达 wt 或 p23h 罗多普辛-金星的 u2os 细胞的金星荧光 (绿色) 和细胞表面免疫染色 (红色)。刻度柱 = 200μm (b) 代表整个细胞中的视紫红质含量的每个细胞平均金星强度的柱状图 (rhodopsin-v指 int)。p& lt;0.0001。z '-因子显示在黑线下。列值和误差条分别为16个副本的平均值和标准偏差 (s. d.)。(c) 代表在细胞表面染色的视紫红质的每个细胞的平均 cy3 强度的柱状图 (细胞表面的罗多普辛 int)。(d) 每个细胞的平均柏树强度与每个细胞的平均金星强度之比的柱图, 表示细胞表面视紫红质水平与其整个细胞水平的比率 (mem 与总比率)。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4: 具有代表性的高含量分析的视紫红质转运分析显示为2色热图.(a) 代表全细胞视紫红质水平 (rhodopsin-v那特 int) 的每个细胞平均金星强度的热图。每个块表示一个数据点, 每个条件都经过了一式三份的测试。颜色图例显示在左侧。cp, 复合。(b) 代表在细胞表面染色的视紫红质的每个细胞的平均 cy3 强度的热图 (细胞表面的罗多普辛 int)。(c) 每个细胞的平均 cy3 强度与每个细胞的平均金星强度的热图, 表示细胞表面视紫红质水平与其整个细胞水平的比率 (mem 与总比率)。请点击这里查看此图的较大版本.
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Discussion
在这里, 我们展示了一种高含量的成像检测方法, 用于描述从高温超导中识别的命中。这些协议中涉及的唯一自动化是高含量成像仪。视紫红质的免疫染色和荧光成像已被广泛用于表征视紫红质 5,14,15,16的定位。然而, 由于每个条件缺乏足够的细胞图像, 每次实验的图像容量较低, 以及缺乏质量控制参数, 传统成像方法所拍摄的图像的量化受到限制。我们将传统的免疫染色协议调整为384孔格式, 并以高含量成像取代了传统的成像。使用这种高含量的成像协议, 我们成功地选择并描述了由 hts11、13、17识别的命中活动。与传统的免疫染色和成像方法相比, 该方案显著提高了成像条件、成像能力和图像分析能力的一致性, 使我们能够定量地比较药理作用为运输 6个 adrp 相关的视紫红质突变体的11种化合物。
与以前使用的视紫红质免疫染色和成像协议相比, 该协议的主要变化是: (1) 在一个清晰的底部384孔板中生长和免疫染色细胞;(2) 使用高含量成像仪的成像单元;(3) 使用高含量图像分析软件分析数据。由于这些变化, 需要进行初步优化, 以找到最佳的细胞播种数、抗体浓度、成像条件和图像分析算法。
该方案的关键步骤包括: (1) 种子细胞, 允许50-70 的融合前固定;(2) 谨慎的愿望, 避免细胞脱离;(2) 在对整个板材进行成像之前, 对整个板材的几口井进行成像, 以确保图像聚焦, 所有通道的荧光不超过正控制井成像仪阈值的一半;(3) 使 z '-因子高于 0, 以确保检测的可靠性。
该协议最常见的问题是细胞分离和低 z '-因子。为了避免第一个问题, 用聚 l-赖氨酸对384井板进行预处理, 以促进细胞附着, 并避免使用容易分离的细胞系, 如 hek293 细胞。此外, 限制吸气尖在吸气过程中只接触每口井的一侧, 并选择每口井的另一侧进行成像。为了提高 z '-因子和检测质量, 优化细胞播种数和图像分析参数, 确保软件定义的细胞形状或细胞核形状与每个荧光通道中的每个对象都很吻合。
与其他量化视紫红质转运的方法 (如细胞表面 elisa 或β-半乳糖酶片段互补法) 相比, 该方法计算了所有细胞细胞表面的目标蛋白水平, 这种高含量的成像方法量化了。每个细胞的平均蛋白质水平;并且, 这个独特的功能避免了一个关键的变化因素, 细胞数, 影响最终读数在其他方法。此外, 由于高含量成像方法对大量细胞进行成像和量化, 因此每个井的所有细胞的平均参数在复制之间的差异较低, 从而提高了检测的可靠性。
该协议的一个局限性是, 由于其相对复杂的程序和每板成像时间 2小时, 它们不是 hts 的最佳检测方法。因此, 我们建议采用替代记者检测方法来筛选含有超过5000种化合物的大型小分子库, 并使用这种高含量成像协议进行重点表征检测, 其重点表征方法仅限于少于100种化合物。该协议的第二个局限性是缺乏标准来显示金星荧光或免疫染色荧光强度是否与每个细胞的视紫红质蛋白量呈线性关系。为了避免饱和度通过免疫染色, 我们建议测试和绘制不同浓度的原代和二级抗体培养的细胞的免疫染色强度。选择花期变化线性范围内的抗体浓度。
从目前的应用范围扩大, 我们将量化视紫红质输运从细胞的图像瞬时转染与28个不同的视紫红质突变体正在处理中的多达10种化合物, 以生成这些化合物的药理数据库 '为携带这些视紫红质突变的 adrp 患者提供潜在治疗指导的活动。该协议还可以很容易地适应任何膜蛋白的移位检测, 这将是有用的药物发现的其他蛋白质错误折叠疾病。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 mark e. schurdak 博士和匹兹堡大学药物发现研究所提供的高含量成像仪和初步培训。krzysztof palczewski 博士 (凯斯西储大学) 慷慨地分享了1d4 和 b630 抗罗道肽抗体。nevin lambert 博士 (奥古斯塔大学) 分享了含有小鼠罗多辛-金星结构 cdna 的质粒。这项工作得到了国家卫生研究所向 EY024992 向 yc 提供的赠款和匹兹堡大学视觉研究核心赠款 p30ey008098 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
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- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
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