Summary
כאן, אנחנו תיאר שיטה הדמיה גבוהה-תוכן לכמת התעבורה של מוטציות אופסין # רודופסין הקשורים עם רטיניטיס פיגמנטוזה. ניתוח התוצאות מרובות באורך הגל שימש לכמת אופסין # רודופסין החלבון על פני התא או את כל התא.
Abstract
אופסין # רודופסין מוטציות misfolding להוביל למוות קולט אור רוד, הבא לידי ביטוי כמו אוטוזומלית דומיננטית רטיניטיס פיגמנטוזה (RP), מתקדמים מסנוור מחלות חסר טיפול יעיל. אנו משערים כי ניתן להקל את cytotoxicity של המוטציה misfolded אופסין # רודופסין על-ידי פרמקולוגית ייצוב החלבון המוטנטי אופסין # רודופסין המוטציה P23H, בין שאר Class II אופסין # רודופסין מוטציות, מקודד חלבון מוטנט יציב מבחינה מבנית אופסין # רודופסין המצטבר בתוך-פלזמית (ER), ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג מועבר קרום פלזמה ב מידע יונקים תאים. אנו בעבר ביצע מסך תפוקה גבוהה המבוססת על הפריה חוץ גופית (HTS), זיהה קבוצת מלווים תרופתי הציל הובלת P23H אופסין # רודופסין מ אר אל קרום פלזמה. כאן, אנחנו באמצעות שיטת immunostaining ואחריו ניתוח ההדמיה גבוהה-תוכן, לכמת את כמות חלבון מוטציה אופסין # רודופסין את כל התא ועל קרום פלזמה. בשיטה זו הוא אינפורמטיבי ויעיל לזהות פגיעות נכון מכל תוצאות חיוביות שגויות בעקבות HTS. בנוסף, הניתוח גבוהה-תוכן התמונה אפשרה לנו לכמת פרמטרים מרובים מניסוי יחיד כדי להעריך את תכונות פרמקולוגיות של כל המתחם. שימוש assay הזה, ניתחנו את ההשפעה של תרכובות שונות 11 לכיוון שש המוטציות אופסין # רודופסין RP הקשורים, קבלת פרופיל תרופתי דו-ממדי עבור הבנה כמותיים ואיכותיים ביציבות הקונסטרוקטיבית של המוטנטים האלה אופסין # רודופסין והיעילות של תרכובות שונות כלפי המוטנטים האלה.
Introduction
חלבון misfolding מעורב ב ניוון שרירים, degenerations עצבית, כמו גם מחלות מסנוור, כולל רטיניטיס פיגמנטוזה (RP)1. RP היא תורשתית ומתקדמת ניוון הרשתית המשויך מוטציות בגנים מעל 60 המשפיעים על תפקוד על הומאוסטזיס של רוד photoreceptors או2,epitheliums פיגמנט הרשתית (RPEs)3. אין טיפול יעיל זמין כעת עבור RP. אופסין # רודופסין מוטציות בחשבון כ 25-30% אוטוזומלית דומיננטית (ad) מקרים RP. בין יותר מ-150 אופסין # רודופסין מוטציות4 (האדם גנים מוטציה מסד נתונים, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), מוטציות Class II לגרום לחוסר יציבות מבנית את החלבון אופסין # רודופסין תורם למוות קולט אור רוד, חזון הפסד5,6,7,8. P23H הוא המוטציה אופסין # רודופסין בתדירות הגבוהה ביותר בצפון אמריקה, שהוא גם דוגמה טיפוסית של9,10מוטציות אופסין # רודופסין Class II. עקב יציבות מבנית, הטבועה שלה אופסין # רודופסין misfolded שנצבר ב רשתית תוך-פלזמית (ER) בתאי יונקים, ואילו אופסין # רודופסין פראי סוג ממוקם על קרום פלזמה5. אופסין # רודופסין P23H המוצגים מוטציה דומיננטית שלילי cytotoxicity ואינו haploinsufficiency, אך קשורה את ההפעלה של ER misfolded קשורה חלבון השפלה מסלול וארגון החיצוני קטע קטע מוט. כדי להקל על מוט מתח התא קולט אור, אסטרטגיה אחת היא לייצב קיפול מקורית של מוטציה אופסין # רודופסין באמצעות מלווה תרופתי.
כדי להשיג מטרה זו, ביצענו עם מסך מבוססי תאים תפוקה גבוהה (HTSs)11,12,13 שימוש assay קומפלמנטציה פרגמנט β-galactosidase לכמת אופסין # רודופסין P23H המוטציה מועבר על מסך הפלזמה ממברנה. פרוטוקול פשוט ועמיד assay HTS זו אפשרה לנו לבחון את הפעילות של מולקולות קטנות בערך 79,000 על כל מסך. עם זאת, מכיוון assay HTS הזה קורא אותות הפריה חוץ גופית, תוצאות חיוביות שגויות, כולל את מעכבי β-גל, תרכובות בצבע או ציטוטוקסיות כלולים ברשימת החיסול מחכה להיות מזוהה על ידי assay המשני.
Immunostaining המסורתי של שיטות הדמיה פלורסצנטיות שימשו במשך שנים ללמוד התעבורה אופסין # רודופסין תאים בתרבית של5,14,15,16. עם זאת, השיטות המקובלת לא ניתן להשתמש כדי לכמת תרופתי אפקטים של יותר מ- 10 תרכובות לכיוון אופסין # רודופסין התחבורה כי ניתוח ההדמיה אמין דורש מספר רב של תמונות לפי תנאי מאוד עקבית, אשר לא amendable על ידי שיטות הדמיה קונבנציונלי. . הנה, פיתחנו פרוטוקול הדמיה של high-תוכן immunostaining מבוסס כמו assay המשני לכמת התעבורה פני שטח התא של אופסין # רודופסין misfolded מוטציות11,13,17. להוספת תווית אופסין # רודופסין על קרום פלזמה, דילגנו השלב של קרום התא permeabilization ו- immunostained המוטנטים אופסין # רודופסין מאת monoclonal (B6-30) נגד אופסין # רודופסין לזהות את epitope N-מסוף של אופסין # רודופסין לצד חוץ-תאי של התא 18. כדי להמחיש את המוטציות אופסין # רודופסין התא כולו, אנחנו התמזגו אופסין # רודופסין עם החלבון זריחה נוגה. מאת כימות של עוצמות קרינה פלואורסצנטית בערוצים שונים פלורסצנטיות, אנו מסוגלים לקבל פרמטרים מרובים מהניסוי בודד אחד, כולל עוצמת אופסין # רודופסין הכולל כל התא, על פני השטח של התא, ואת היחס של אופסין # רודופסין זריחה על פני התא לזה התא כולו. יישום שיטה זו יציב התאים לבטא סכום כולל של 6 misfolded אופסין # רודופסין מוטציות, אנחנו ניתן להפיק פרופיל תרופתי של משגיחים מרובים מולקולה קטנה לכיוון המוטנטים האלה. ב פרוטוקול זה, כל התאים immunostained בצלחת 384-. ובכן, עם תמונה באמצעות מערכת הדמיה אוטומטית בתנאי הדמיה מאוד עקבי. ניתוח התמונה מתבצע כדי כל טוב, המכיל תמונות של יותר מ-600 תאים כדי להפחית וריאציה בשל הטרוגניות התאים עם משתנה צורת התא ורמת ביטוי חלבון. זרימת העבודה של פרוטוקול זה מסוכם באיור1. היתרון של שיטה זו הוא כי אנו משיגים תמונות ברזולוציה גבוהה, כמו גם פרמטר מרובה quantifications מניתוח המבוססת על תמונה. באופן כללי, פרוטוקול זה יכול להיות שונה ומוחלים לכמת את התעבורה של כל חלבון ממברנלי misfolded של עניין.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו.
1. הכנה של התרבות תאים
- להחיות את השמורה הקפאה U2OS יציב תאים המבטאים את סוג בר (WT) או בעכבר מוטנט אופסין # רודופסין-ונוס פיוז'ן חלבונים. להפשיר את התאים ב 37 ° C עד רק גבישי קרח קטנים הם עזבו בבקבוקון.
הערה: התאים U2OS נמצאים בשימוש פרוטוקול זה כי שם אין תור תא קולט אור זמין עבור מחקרים במבחנה , ביוסינטזה ciliary מראש של אופסין # רודופסין מוסדר על ידי המנגנונים המולקולריים דומה בתאי יונקים. בנוסף, התאים U2OS לצרף בחוזקה בתחתית הלוח, ויש גופים תא גדול, אז הם אידיאליים עבור וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין. שבע U2OS יציב תאים המבטאים את WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N ו- P267L מוטציות אופסין # רודופסין משמשים כאן כדוגמה להראות את האיכות והאמינות של וזמינותו. תאים יציב מוטאנטים אחרים אופסין # רודופסין או חלבונים אחרים קרום יכול לשמש, בהתאם למטרה של וזמינותו. יציב התאים לבטא אופסין # רודופסין האנושי יכול לשמש assay הזה אם הוא זמין. אופסין # רודופסין העכבר שימש כאן כי העכבר וחלבונים אופסין # רודופסין האנושי לחלוק הומולוגיה 95%, וכן תרכובות המזוהה על-ידי assay הזה יהיה שנבדקו אין ויוו באמצעות מודל adRP של העכבר נושא את המוטציה P23H8אופסין # רודופסין. התאים יציבה נוצרו כפי שתואר לעיל19. WT של מוטציה אופסין # רודופסין התמלילים היו לכמת על ידי q-PCR, השיבוטים של תאים יציב לבטא רמות דומות של WT וגיליון הציונים מוטציה אופסין # רודופסין נבחרו עבור זה וזמינותו. הביטוי של חלבונים אופסין # רודופסין אושר ע י immunoblot ו- immunostaining. המעבר של תאים המשמשים assay הזה צריך להיות נמוך מ- 20. - העברת כל שורה של תאים לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל המכיל 10 מ"ל של מדיום הגידול (של גלוקוז גבוהות Dulbecco שונה של הנשר בינוני (DMEM) עם 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 5 µg/mL Plasmocin).
- Centrifuge הצינור ב 200 x גרם במשך 5 דק. להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר תא עם 5 מ של התא מדיום הגידול עבור כל קו תא. העברת כל שורה של השעיה תא לתוך תבשיל תרביות רקמה 60 מ מ, דגירה ב 37 ° C עם 5% CO2.
- תת-תרבות התאים כאשר המנה תרביות רקמה מגיע למפגש 90% כפי שמתואר הפניה12.
2. זריעת תאים-תאים 5,000 לכל טוב
הערה: בצע את ההליכים הבאים בשכונה תרביות רקמה.
- פנקו את הצלחת עם פולי-ליזין.
- יום אחד לפני זריעת תאי, מתייחסים שחור-קיר ונקה את הצלחת התחתונה 384-טוב עם µL 20/טוב של פולי-ליזין פתרון במשך 30 דקות.
- וארוקן את הנוזל, לאפשר כל בארות להתייבש במשך ה 1 להחזיר את המכסה צלחת ולאחסן את הצלחת ב 4 ° C בלילה עבור תא זריעה.
- להכין את התליה תא.
- תרבות כל שורה תא במדיום הגידול בצלחת תרביות רקמה 100 מ מ עד 90% הנהרות.
- לשטוף כל מנה עם פוספט buffered תמיסת מלח (PBS) ולנתק את התאים עם 1 מ"ל של 0.05% טריפסין ב 37 º C.
- Resuspend כל שורה של תאים ב- 10 מ"ל assay בינוני (DMEM high-גלוקוז 10% FBS, 100 יחידות/mL פניצילין, סטרפטומיצין μg/מ ל).
- לספור את התאים, לדלל כל שורת התאים עד 1.25 x 105 תאים למ"ל עם המדיום וזמינותו.
- הזרע התאים.
- להשתמש על פיפטה רב-ערוצי אלקטרונית או מתקן מגיב אוטומטית כדי לוותר על µL 40/טוב של התליה תא כדי שלוש עמודות לכל תא קו ומילוי עמודות 1-21 של צלחת 384-טוב (איור 2).
- להוסיף µL 40/טוב של U2OS (P23H-אופסין # רודופסין-ונוס) עמודים 22-23, µL 40/טוב של U2OS (אופסין # רודופסין-ונוס) לעמודה 24, כפי שולטת.
- Centrifuge את הצלחת ב x 300 גרם ל 30 s כדי להפיל את כל התאים לחלק התחתון של הלוח 384-. טוב.
הערה: למנוע זעזועים פיזיים לצלחת לאחר תא זריעה. אחרת, התאים תימחץ בפינה אחת של כל טוב, הצלחת לא יהיה מתאים עבור הדמיה גבוהה-תוכן. - דגירה לצלחת 384-ובכן ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור h 3 עבור התאים לצרף תחתית הצלחת.
3. טיפול תאי עם תרכובות
- צור מפת צלחת עם תנאי הטיפול כפי שמוצג באיור2.
- להכין µL 300 של 5 x פתרונות עבודה של עד 15 תרכובות בצלחת 96-ובכן.
- לדלל cps 1 עד 15 עם המדיום assay כדי חמש פעמים של ריכוזים הסופי שלהם בבארות A1 ל G2 של 96-ובכן צלחת (איור 2 א). להוסיף 300 µL assay בינוני באזור H2 היטב.
הערה: הריכוז הסופי של כל המתחם משמש-הריכוז היעיל ביותר שהצלת הובלת אופסין # רודופסין P23H12,HTS13. - להוסיף µL 100 לכל טוב של 2% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו- 25 מיקרומטר 9 -cis-רשתית כי הם מעורבבת עם המדיום assay לעמודות 11 ו- 12, בהתאמה. להוסיף 9 -cis-רשתית באור עמום.
- לדלל cps 1 עד 15 עם המדיום assay כדי חמש פעמים של ריכוזים הסופי שלהם בבארות A1 ל G2 של 96-ובכן צלחת (איור 2 א). להוסיף 300 µL assay בינוני באזור H2 היטב.
- הוספת µL 10 לכל טוב של 5 x עובד פתרונות לצלחת 384-ובכן תרבותי עם תאי (איור 2B).
- להשתמש על פיפטה רב ערוצית אלקטרונית כדי להוסיף תרכובות 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 ו- 15 שורות A, C, E, G, אני, K, M ו- O מעמודות 1 עד 21 (איור 2). להוסיף תרכובות 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 ו- M שורות B, D, F, H, J, L, N ו- P מעמודות 1 עד 21.
- להוסיף 10 µL לכל טוב של 2% דימתיל סולפוקסיד עמודות 22 ו-24. להוסיף 10 µL לכל טוב של מיקרומטר 25 9 -cis-רשתית לעמודה 23.
הערה: דימתיל סולפוקסיד משמש כפקד הרכב כי כל תרכובות הם בתחילה מומס דימתיל סולפוקסיד מניות. טור 22 המכיל תאים דימתיל סולפוקסיד מטופלים לבטא את P23H אופסין # רודופסין משמש את הפקד 0%. 9 -Cis-תאים ברשתית שטופלו לבטא את אופסין # רודופסין P23H משמש את הפקד 100%.
- מכסה את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה.
4. Immunostaining ללא קרום Permeabilization כתם אופסין # רודופסין החלבון על פני התא.
הערה: להימנע חומרי ניקוי בתהליך כולו immunostaining לשמור על קרום התא ללא פגע.
- להכין 4% paraformaldehyde (PFA) על ידי דילול של 16% מחברים עם PBS על יחס נפח של 1:4 בשכונה fume כימי. העברה של % 4 מחברים מאגר מגיב.
- להוציא לצלחת 384-ובכן בחדר חשוך עם האור האדום העמום. שימוש ערוץ 8 ליניקת מחובר בקבוק ואקום אוסף לרוקן בעדינות את המדיום. להשתמש על פיפטה רב-ערוצי אלקטרונית כדי להוסיף µL 20 לכל טוב של טריות 4% PFA לצלחת 384-ובכן כולו דגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. כדי למנוע ניתוק התא, תמיד הצבע קצות העצמות באותו הצד של כל טוב במהלך שאיפות. אל תגעו האזור התחתון האמצעי של כל טוב. בעת לקיחת תמונות, בחר את השדות כדי למנוע את האזור נגע העצמות. עבור incubations יותר מ- 10 דקות, לכסות את הצלחת 384-ובכן עם המכסה שלה כדי למנוע התאיידות.
הערה: תאים קבועים בחדר חשוך כדי להימנע photobleaching של isorhodopsin regenerated ישפיעו על התוצאה של פקד ה-100%. לאחר קיבוע, ניתן לקחת את הצלחת. ובכן 384 תאורה רגילה. - השתמש העצמות של ערוץ 8 וארוקן את כדורגלן היטב כל ולהשתמש על פיפטה רב ערוצית אלקטרונית כדי להוסיף μL 50 לכל טוב של PBS. חזור עוד פעמיים כדי לבצע שלושה שוטף עם PBS.
התראה: הפסולת PFA המכיל נוזל נאספים בבקבוק רצ'ט, היא להיות מסולק כפסולת כימיים מסוכנים לאחר הניסוי. - לחסום את התאים על-ידי הוספת µL 20 לכל טוב של סרום עיזים 5% הצלחת 384-ובכן, דגירה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- וארוקן את הנסיוב עיזים 5% ולהוסיף µL 15 לכל טוב של 20 µg מ ל-1 B6-30 נוגדן אנטי אופסין # רודופסין בנסיוב עז 1% שורות A או להוסיף 15 µL לכל טוב של 1% נסיוב עז שורה P עבור קבוצת הביקורת נוגדן בלבד משני.
- דגירה את הצלחת 384-ובכן בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. מכסים את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, כדי למנוע photobleaching של fluorophores.
- לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 50 µL לכל טוב של PBS.
- האחות PBS ולהוסיף µL 15 לכל טוב של 5 µg מ ל-1 עז Cy3 מצומדת אנטי-העכבר IgG נוגדן. מכסה את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 1 h או ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לשטוף את הצלחת 3 פעמים עם 50 µL לכל טוב של PBS. הוסף µL 50 לכל טוב של PBS המכיל 1 µg מ ל-1 Hoechst 33342 כתם גרעינים בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות.
- חותם את הצלחת 384-ובכן עם סרט שקוף לפני הדמיה. לכסות את הצלחת 384-היטב ברדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך שבוע, אם תמונות נלקחים באופן מיידי.
5. הדמיה.
הערה: הליך הדמיה גבוהה-תוכן זה מותאם למערכת הדמיה המופיעים בטבלה של חומר. הליכים יכול להיות שונה אם באמצעות מערכות הדמיה אחרות גבוהה-תוכן.
- הסר את המכסה, מכניסים את הצלחת 384-ובכן םלצה גבוהה-תוכן עם A1 ממוקם בפינה השמאלית העליונה של הצלחת.
- פתח את התוכנה רכישת התמונה כדי להגדיר את הפרמטרים עבור ייבוא תמונות.
- פתח חלון הגדרת רכישת צלחת, ליצור הגדרה חדשה או לטעון את קובץ ההתקנה קיים.
- בחר את המטרה 20 x והגדר להגדיר פיקסל binning כ- 2 כך גודל פיקסל מכוילת הוא 0.80 x 0.80 מיקרומטר. הקווים סריקה 2,000, את גודל התמונה (W x H) 1,000 x 1000 פיקסלים (800.00 x 800.00 מיקרומטר) לכל אתר.
- בחר את סוג הצלחת לדימות. השתמש במידע המסופקים על ידי היצרן של צלחת 384-טוב כדי למלא את הממדים צלחת.
- בחר הבארות לדימות עבור לוח 384-. טוב.
- בחר ארבעה אתרים לדימות לכל טוב. למנוע את הצד של נגע היטב על ידי העצות השאיפה.
- בחר עירור לייזרים 405, 488, 561 ננומטר. בחר פליטה מסננים עבור ערוצי דאפי, FITC ואדום טקסס. למטב את עוצמת הלייזר, רווחים של כל ערוץ כדי להבטיח את הבהירות של תמונות שנלקחו הבארות בקרה חיובית פחות לסף רוויה.
- בחר טוב-כדי-טוב מוקד פוקוס אוטומטי. בחר את הבאר הראשונה לרכוש כ הראשונית טוב למציאת דגימות. הגדר אתר פוקוס אוטומטי לכל האתרים.
- בחר 4 ממוצעים לכל שורה לכל ערוץ. למטב את ערך היסט ה-Z לכל ערוץ.
- מבחן 2-3 בארות בפינות אלכסוני של צלחת טוב 384 כדי לוודא שהתמונות הן על המוקד עבור כל בארות שנבדקו, תמונות מכל אתרי לכל טוב יש תאים עם יותר מ- 40% הנהרות, ועוצמות קרינה פלואורסצנטית של כל הערוצים כמחצית רוויים 100% לשלוט בארות.
- שמור את שיטת רכישת התמונה.
- הפעל את הצלחת כולה. Watch םלצה עד שהוא מסיים לכידת תמונות מהעמודה הראשונה של צלחת לבדוק את איכות התמונה לפני שעזב םלצה. להוציא לצלחת 384-ובכן ולאחסן ב 4 ° C לשימוש עתידי.
הערה: בהתאם למספר אתרים שנבחרו לפי טוב, הערוצים נלקח, אורכת 40 דקות 3 h לסיים הדמיה לוח 384-טוב אחד.
6. תמונות ניתוח.
- משוך החוצה את נתוני התמונה באמצעות תוכנת ניתוח גבוהה-תוכן התמונה. בחר באחת הבארות 100% שליטה (עמודה 23) כדי להגדיר את הפרמטרים.
- בחר את אורך הגל רב תא הבקיע כמו שיטת הניתוח ולהתחיל קביעת התצורה של הגדרות.
- הגדר את הגרעינים באמצעות תמונות מערוץ דאפי. הצג בתצוגה מקדימה כדי לוודא גרעין מוגדר הצורות בפריט הנבחר טוב משתלב היטב התמונות גרעינים.
- להגדיר את הצורה של התא בערוץ FITC איפה אופסין # רודופסין-ונוס עם תמונה.
- הגדרת האזורים הכתם פני שטח התא אופסין # רודופסין בערוץ טקסס אדום.
- בדיקת האלגוריתם הנוכחי בבארות 5 כדי לקבוע אם ההגדרות מיטביות. לשמור את ההגדרות ולסגור את החלון תצורה .
- הפעל את כל הבארות עם שיטת הניתוח ממוטבת.
- לייצא אובייקט מספר הנייד ללא פגע. לייצא את העוצמה הממוצעת של הערוץ FITC עוצמת אופסין # רודופסין-נוגה (ונוס אופסין # רודופסין-INT). לייצא בעוצמה ממוצעת של הערוץ האדום טקסס אופסין # רודופסין בעוצמה על פני התא (INT אופסין # רודופסין על פני התא).
- לפתוח את הנתונים המיוצאים תוכנת הגיליון האלקטרוני. מתחלק עוצמת אופסין # רודופסין על פני התא אופסין # רודופסין-ונוס INT כמו יחס MEM-כדי-סיכום. לחשב את Z'-גורמים לכל פרמטר להעריך את איכות וזמינותו. Z′ = 1−3X (STD100% שליטה+סטיית תקן0% שליטה) / | זאת אומרת100% שליטה−Mean0% שליטה|.
הערה: Z'-מקדם גבוה יותר מאשר 0 מציין assay מתון מספיק עבור מסך גבוהה-תוכן, ו- Z' פקטור בטווח של 0.5 עד 1 מרמז על assay מצטיינים הדרושים עבור תפוקה גבוהה מסך20,21. - להשתמש את תוכנת הגיליון האלקטרוני כדי ליצור מפת החום שני צבעים עבור כל פרמטר. לארגן את השם של שורות תאים בציר ה-x ואת תרכובות בציר ה-y.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אנחנו מאופיין התעבורה אופסין # רודופסין עם שלושה פרמטרים: עוצמת אופסין # רודופסין-ונוס התא כולו (INT אופסין # רודופסין-ונוס), את עוצמת immunostaining של אופסין # רודופסין על קרום פלזמה (INT אופסין # רודופסין על פני התא), ואת היחס של אופסין # רודופסין כתם על פני התא כדי אופסין # רודופסין-ונוס בעוצמה התא כולו (MEM-סיכום יחס). תוצאה נציג של אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו מוצג איור 3 ו- 4 איור. באמצעות דימתיל סולפוקסיד ו- 9 -cis-רשתית שטופלו התאים לבטא את P23H אופסין # רודופסין-ונוס-כמו של 0 ופקדי 100%, בהתאמה, ז '-גורמים אלה שלושה פרמטרים נמצאים בטווח של בין 0 ל 0.5, רומז כי וזמינותו יש איכות בינונית, מספיק גבוהה-תוכן הדמיה21. למרות ז ממוטבת '-גורמים נמוכים מ- 0.5 עקב שלה הליכים מורכבים יחסית בהשוואה וזמינותו השודדים, assay הזה הוא עדיין עמיד ואמין עבור ניתוח המבוסס על תמונות. מתחם פעיל שמצילה של אופסין # רודופסין misfolded צריך להראות ערכים גבוהים יותר של אופסין # רודופסין INT על פני התא, יחס MEM-סיכום מאשר דימתיל סולפוקסיד, עם ערך P נמוך מ- 0.05. שלוש מפות חום דו-ממדיים נוצרו מתוך אלה שלושה פרמטרים להשוות את הסכום הממוצע אופסין # רודופסין לוקליזציה בכל תא (איור 4). לחזור על triplicates, WT ו שש המוטציות אופסין # רודופסין מפורטים בצורה אופקית, ההשפעות של טיפולים מורכבים מושווים אנכית. מסכים עם מחקרים קודמים, אופסין # רודופסין INT על פני השטח של התא, היחס MEM-סיכום של נמוכים עבור המוטציות שישה בהשוואה של אופסין # רודופסין WT שטופלו דימתיל סולפוקסיד (איור 4C)5,22,23. אופסין # רודופסין INT על פני השטח של התא, היחס MEM-כדי-סיכום הם גדלו ב 9 -cis-טיפול ברשתית T4R, P23H, D190N, P267L, אבל לא P53R או C110Y המוטנטים, רומז 9 -cis-רשתית מצילה הובלת T4R, מוטציות אופסין # רודופסין P23H, D190N ו- P267L. כל cps הראו רמות משתנות של עלייה INT אופסין # רודופסין על פני תא T4R, P23H ו D190N. Cps 3, 4, 5, 7, 8 ו-11 גדל של INT אופסין # רודופסין-ונוס אבל לא היחס MEM-כדי-סיכום של המוטנטים האלה אופסין # רודופסין, רומז כי תרכובות אלו רק הגביר את הסכום אופסין # רודופסין. Cps 1, 2, 6 ו- 9 הגדילה משמעותית את יחס MEM-כדי-סיכום של מוטציות אופסין # רודופסין T4R, P23H, D190N, P267L, רומז כי תרכובות אלו להציל את התעבורה של המוטנטים האלה אופסין # רודופסין כדי קרום פלזמה. הפרופילים דו-ממדיים לספק סקירה מקיפה של אופסין # רודופסין בתחבורה מושפעות על ידי מוטציות adRP הקשורים אלה הם חמאני טיפול תרופתי שונה.
איור 1: זרימת העבודה של אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו. נהלי צביעת משטח תאים של אופסין # רודופסין ללא קרום permeabilization עבור וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: איורים עבור הכנת 5 x פתרונות עבודה, העברת נוזלי מהצלחת 96-ובכן לצלחת 384-ובכן. (א) 96-ובכן צלחת הפריסה של 5 x פתרונות עבודה. וולס A1 עד G2 יש 300 µL לאדם טוב של עד 15 5 x פתרונות עבודה ואת וזמינותו בינוני (ז) כמופיע בעמודות 1 ו- 2. תרכובות 14 ו-15 2% דימתיל סולפוקסיד הינם מיקרומטר 25 9 -cis-רשתית, בהתאמה, על הטיפול לקווי תא שבע לבטא WT ו אופסין # רודופסין מוטציה. בנוסף, העמודות 11 ו- 12 יש 100 µL לכל טוב של דימתיל סולפוקסיד 2% ו- 25 מיקרומטר 9 -cis-רשתית שולט, בהתאמה, התייחסו אל התאים לבטא את אופסין # רודופסין P23H לחישוב Z'-גורמים. (ב) לפריסה 384-ובכן צלחת עבור סוג התא ותנאי הטיפול. תאי U2OS לבטא את WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N ו- P267L אופסין # רודופסין-ונוס הם נזרע כמופיע באיור. טיפול בתנאים מסומנות בכחול. טיפים ורוד וכחול מדגימים את העברת נוזלי טוב-כדי-טוב מהצלחת 96-ובכן לצלחת 384 באמצעות פיפטה רב-ערוצי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: נציג תמונות ו- quantifications עבור הפקדים של אופסין # רודופסין תחבורה וזמינותו. (א) ונוס קרינה פלואורסצנטית (ירוק) immunostaining פני שטח התא (אדום) של תאים U2OS לבטא אופסין # רודופסין-ונוס WT או P23H שטופלו דימתיל סולפוקסיד או 5 מיקרומטר 9 -cis-רשתית. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (B) A העמודה מגרש בעוצמה ונוס כלומר בכל תא המייצג סכום אופסין # רודופסין התא כולו (אופסין # רודופסין-ונוס INT). p< 0.0001. Z'-פקטור מוצג מתחת לקו השחור. ערך העמודה ובר שגיאה הם ממוצע, סטיית תקן (ש) של משכפל 16, בהתאמה. (ג) העמודה חלקת מתכוון Cy3 בעוצמה בכל תא המייצג את אופסין # רודופסין צבעונית על פני התא (INT אופסין # רודופסין על פני התא). (ד) העמודה מגרש של היחס בין עוצמת cy3 הממוצע בכל תא להביע ונוס בעוצמה בכל תא המייצג את היחס בין רמת אופסין # רודופסין על פני התא רמתו שלם-תא (MEM-כדי-סיכום יחס). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ניתוח תוכן גבוהה נציג של וזמינותו תחבורה אופסין # רודופסין שמוצג כמו 2-צבע חום מפות- (א) מפת החום מתכוון ונוס בעוצמה בכל תא המייצג את רמת שלמה-תא אופסין # רודופסין (אופסין # רודופסין-ונוס INT). כל בלוק מייצג נקודת נתונים, כל תנאי נבדקה דולר. האגדה צבע מוצגת בצד השמאל. Cp, תרכובת. (ב) על מפת החום מתכוון Cy3 בעוצמה בכל תא המייצג את אופסין # רודופסין צבעונית על פני התא (INT אופסין # רודופסין על פני התא). (ג) המפה חום של הממוצע Cy3 בעוצמה לכל תא הממוצע ונוס בעוצמה בכל תא המייצג את היחס בין רמת אופסין # רודופסין על פני התא רמתו שלם-תא (MEM-כדי-סיכום יחס). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
. הראנו assay הדמיה של high-תוכן המשמש אפיון בנפילות שאותרו מן HTS. אוטומציה היחידה מעורב פרוטוקולים אלה הוא הצלם גבוה-תוכן. Immunostaining ואת פלורסצנטיות הדמיה של אופסין # רודופסין היו בשימוש נפוץ לאפיין הלוקליזציה של אופסין # רודופסין5,14,15,16. עם זאת, כימות של תמונות שצולמו על ידי שיטות הדמיה מוגבל על ידי חוסר של תמונות תא מספיקות לכל מצב, קיבולת נמוכה של תמונות לכל ניסוי, ואת חוסר פרמטר בקרת איכות. אנו הותאם פרוטוקול immunostaining מסורתיים לתבנית 384-ובכן, מוחלף ההדמיה המסורתיים הדמיה גבוהה-תוכן. שימוש בפרוטוקול הדמיה זו גבוהה-תוכן, אנו בהצלחה שנבחרו, אפיינו את הפעילות של בנפילות שאותרו על ידי השודדים11,13,17. בהשוואה immunostaining מסורתיות ושיטות הדמיה, פרוטוקול זה גדל באופן משמעותי את consistence של תנאים הדמיה, הדמיה קיבולת כוח ניתוח התמונה, שאיפשר לנו להשוות באופן כמותי את ההשפעות תרופתי תרכובות 11 לכיוון הובלת adRP 6 קשורה אופסין # רודופסין מוטציות.
השינויים העיקריים של פרוטוקול זה בהשוואה הפרוטוקולים השתמשו בעבר עבור אופסין # רודופסין immunostaining ודימות הם: (1) תאי גידול ו immunostaining בצלחת 384-ובכן ברור-התחתון; (2) הדמיה תאים באמצעות imager גבוהה-תוכן; (3) וניתוח נתונים עם תוכנת ניתוח גבוהה-תוכן התמונה. עקב שינויים אלו לאופטימיזציה הראשונית נדרש כדי למצוא את הטוב ביותר תא זריעה, ריכוז נוגדן, תנאים הדמיה ומספר תמונות ניתוח אלגוריתמים.
השלבים הקריטיים של הפרוטוקול כוללים: (1) זריעת תאי לאפשר זרימה 50-70% לפני קיבוע; (2) שאיפות זהירות כדי למנוע ניתוק התא; (2) הדמיה את כמה בארות על פני צלחת מלאה לוודא שהתמונות על המוקד ואת לזרוח של כל הערוצים אינו עולה על מחצית סף םלצה בשביל הבארות בקרה חיובית לפני הדמיה צלחת מלאה; (3) מחזיק את Z'-מקדם גבוה יותר מאשר 0 כדי להבטיח את אמינות וזמינותו.
הבעיות הנפוצות ביותר יכול להיות נתקל עבור פרוטוקול זה הן ניתוק התא ו- Z נמוך "-גורמים. כדי למנוע את הגיליון הראשון, pretreat 384-ובכן לצלחת עם פולי-L-ליזין כדי להקל על הקובץ המצורף תא וכדי להימנע משימוש שורות תאים המנתקים בקלות כגון התאים Hek293. בנוסף, להגביל את הטיפ השאיפה כדי לגעת רק צד אחד של כל טוב בזמן השאיפה ולבחור בצד השני של כל טוב עבור הדמיה. כדי לשפר את Z'-פקטור ואת איכות assay, למטב את התא זריעה פרמטרים ניתוח תמונה ומספר כדי לוודא תא הצורה או צורה גרעינים שהוגדרו על-ידי התוכנה מתאימה היטב עם כל אובייקט בכל אחד מהערוצים זריחה.
לעומת שיטות אחרות כדי לכמת אופסין # רודופסין תחבורה, כגון אליסה פני השטח של התא, או קטע β-galactosidase קומפלמנטציה assay, אשר לחשב את רמת חלבון המטרה על פני התא בתאים כל, מכמת שיטה הדמיה זו גבוהה-תוכן רמת חלבון הממוצע לכל תא; תכונה ייחודית זו מונע, גורם קריטי וריאציה, מספר הטלפון הנייד, אשר משפיע על הקריאות הסופי בשיטות אחרות. בנוסף, עקב מספר גדול של תאים עם תמונה ו לכמת בשיטת הדמיה גבוהה-תוכן, הפרמטרים בממוצע מכל התאים לכל טוב הראה נמוכה וריאציה בין משכפל, ובכך מוסיף את האמינות של וזמינותו.
מגבלה אחת של פרוטוקול זה היא כי הם לא מבחני הטוב ביותר עבור. השודדים, בשל הליך מסובך יחסית שלה ואת ה 2 לכל צלחת הדמיה זמן. לפיכך, אנו ממליצים על מבחני כתב חלופי לסינון ספריות גדולות מולקולה קטנה עם יותר מ 5,000 תרכובות, להשתמש בפרוטוקול הדמיה זה גבוה-תוכן עבור מבחני האפיון ממוקד מוגבל לפחות מ- 100 תרכובות. המגבלה השנייה של פרוטוקול זה הוא העדר תקנים כדי להראות אם קרינה פלואורסצנטית את ונוס או עוצמות קרינה פלואורסצנטית immunostaining נמצא מתאם ליניארי עם הכמות של אופסין # רודופסין כמות חלבון בכל תא. כדי להימנע הרוויה על ידי immunostaining, אנו ממליצים בדיקות התוויית עוצמות immunostaining של תאי הדגירה עם ריכוזים שונים של נוגדנים ראשיים ומשניים. בחר את ריכוז נוגדן בטווח ליניארי של שינוי florescence.
הרחבת מהיישום הנוכחי, אנו לכמת אופסין # רודופסין תחבורה מתמונות של תאים transiently transfected עם 28 מוטציות שונות אופסין # רודופסין תחת טיפול עם עד 10 תרכובות כדי ליצור מסד נתונים תרופתי של תרכובות אלו פעילות עבור הדרכה של טיפולים פוטנציאליים לחולים adRP נושאת מוטציות אופסין # רודופסין אלה. פרוטוקול זה ניתן גם בקלות להתאים את מבחני טרנסלוקציה של כל חלבון ממברנלי עניין זה יהיה שימושי עבור גילויים סמים אחרים החלבון misfolding מחלות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ד ר מארק אי Schurdak, גילוי תרופות אוניברסיטת פיטסבורג מכון למתן imager גבוהה-תוכן והדרכה ראשונית. ד ר קז'ישטוף Palczewski (Case Western Reserve University) משותף בנדיבות את 4 1D ונוגדנים אנטי אופסין # רודופסין B630. פלסמיד המכיל את cDNA של העכבר אופסין # רודופסין-ונוס לבנות היה משותף על ידי ד ר נבין למברט (אוניברסיטת Augusta). עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי של בריאות גרנט EY024992 שיקו לוי, P30EY008098 של אוניברסיטת פיטסבורג החזון לחקר הליבה גרנט.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
