Summary
We beschreven hier, een hoge-inhoud beeldvorming methode om te kwantificeren van het vervoer van rodopsine mutanten retinitis pigmentosa is gekoppeld. Een meerdere-golflengte scoren analyse werd gebruikt voor het kwantificeren van rodopsine eiwitten op het celoppervlak of in de hele cel.
Abstract
Rodopsine misfolding mutaties leiden tot de dood van rod fotoreceptor dat manifesteert zich als autosomaal dominante retinitis pigmentosa (RP), een progressieve ziekte die mist van effectieve behandeling verblindende. We veronderstellen dat de cytotoxiciteit van de mutant misfolded rhodopsine kan worden verlicht door het farmacologisch stabiliseren de mutant rhodopsine proteïne. De P23H mutatie, onder de andere klasse II rhodopsine mutaties, codeert een structureel unstable rhodopsine mutant eiwit dat is gecumuleerd in het endoplasmatisch reticulum (ER), overwegende dat de wild type rhodopsine wordt getransporteerd naar het plasmamembraan in zoogdieren cellen. Wij eerder uitgevoerd een scherm high-throughput luminescentie gebaseerde (HTS) en een groep van farmacologische chaperones die gered van het vervoer van de P23H rhodopsine van ER naar het plasmamembraan geïdentificeerd. Hier, met behulp van een methode van immunokleuring gevolgd door een hoge-inhoudsanalyse imaging, we de mutant rhodopsine eiwit bedrag in de hele cel en op het plasma-membraan gekwantificeerd. Deze methode is informatief en effectief te identificeren waar treffers van valse positieven na HTS. Bovendien, de hoge-inhoud beeldanalyse ons in staat gesteld te kwantificeren van meerdere parameters van een enkele experiment te evalueren van de farmacologische eigenschappen van elke stof. Met behulp van deze test, geanalyseerd wij het effect van 11 verschillende verbindingen naar zes RP verbonden rhodopsine mutanten, het verkrijgen van een 2D-farmacologische profiel voor een kwantitatieve en kwalitatieve inzicht over de structurele stabiliteit van deze rhodopsine mutanten en de werkzaamheid van verschillende verbindingen naar deze mutanten.
Introduction
Eiwit misfolding is betrokken bij spierdystrofie, neurale degenerations, evenals de verblindende ziekten, met inbegrip van retinitis pigmentosa (RP)1. RP is een overgenomen en Progressieve Retina degeneratie geassocieerd met mutaties in meer dan 60 genen beïnvloeden de functie en de homeostase van rod researchdieren of de retinale pigment epitheliums (RPEs)2,3. Geen effectieve behandeling is momenteel beschikbaar voor RP. Rodopsine mutaties zijn goed voor ongeveer 25-30% van autosomaal dominant (ad) RP gevallen. Onder de meer dan 150 rhodopsine mutaties4 (Human Gene Mutation Database, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), de klasse II-mutaties veroorzaken de structurele instabiliteit van de rhodopsine proteïne dat aan de staaf fotoreceptor dood bijdraagt en visie verlies5,6,7,8. De P23H is de meest voorkomende rhodopsine mutatie in Noord-Amerika, dat is ook een typisch voorbeeld van de klasse II rhodopsine mutaties9,10. Als gevolg van de inherente structurele instabiliteit, wordt de misfolded rhodopsine geaccumuleerd in het endoplasmatisch reticulum (ER) in zoogdiercellen, overwegende dat de wild type rhodopsine zich op het plasma-membraan5 bevindt. De misfolded rhodopsine P23H mutant exposities dominante negatieve cytotoxiciteit die is niet te wijten aan haploinsufficiency, maar is gerelateerd aan de activering van ER geassocieerde eiwit aantasting van het traject en de organisatie van de buitenste segment onderbroken staaf. Om te verlichten staaf fotoreceptor cel stress, is een strategie te stabiliseren de inheemse vouwen van de mutant rhodopsine met behulp van een farmacologische chaperon.
Om dit te bereiken, hebben we een cel-gebaseerde high-throughput scherm (HTSs)11,12,13 met behulp van een β-galactosidase fragment complementatie assay te kwantificeren van de P23H rhodopsine mutant vervoerd op het plasma uitgevoerd membraan. Het robuuste en eenvoudige protocol voor deze HTS-test konden we verkennen van de activiteiten van ongeveer 79.000 kleine molecules voor elk scherm. Echter omdat deze HTS-assay luminescentie signalen leest, zijn valse positieven, met inbegrip van de β-gal-remmers, gekleurde of cytotoxische stoffen opgenomen in de hit-lijst te wachten om te worden geïdentificeerd met een secundaire assay.
De traditionele immunokleuring en fluorescentie beeldvormende methoden zijn gebruikt voor jaren te bestuderen van het vervoer van rodopsine in zoogdiercellen5,14,15,16. Echter, deze conventionele methoden te kwantificeren farmacologische effecten van meer dan 10 verbindingen naar rhodopsine vervoer omdat een betrouwbare beeldvormende analyse vereist een groot aantal opnamen onder een zeer consistente voorwaarde, die kunnen niet worden gebruikt niet geamendeerd door de conventionele beeldvormende methoden. Hier, ontwikkelden we een immunokleuring gebaseerd high-inhoud imaging protocol als een secundaire assay te kwantificeren van de cel oppervlaktevervoer misfolded rhodopsine mutanten11,13,17. Om rhodopsine op het plasma-membraan van een label, overgeslagen we de stap van de celmembraan permeabilization en immunostained de mutanten rhodopsine door een monoclonal (B6-30) anti-rhodopsine herkennen van de N-terminale epitoop van rodopsine aan de extracellulaire kant van de cel membraan18. Om te visualiseren de mutant rhodopsine in de hele cel, gesmolten we rhodopsine met de Venus fluorescentie eiwit. Door de kwantificering van de intensiteit van de fluorescentie in verschillende fluorescentie kanalen zijn wij in staat om meerdere parameters van één enkele experiment met inbegrip van de totale rhodopsine intensiteit in de hele cel op het celoppervlak, en de verhouding van Rodopsine fluorescentie op het celoppervlak aan die in de hele cel. Toepassing van deze methode om stabiele cellen uiten van een totaal van zes misfolded rhodopsine mutanten, we kunnen het genereren van een farmacologisch profiel van meerdere kleine molecuul chaperones naar deze mutanten. In dit protocol, alle cellen zijn immunostained in een 384-well-plate en beeld met behulp van een geautomatiseerd imaging systeem onder een zeer consistente imaging voorwaarde. Een beeldanalyse wordt uitgevoerd aan elk putje, met beelden van meer dan 600 cellen om variatie als gevolg van de heterogeniteit van de cellen met verschillende celniveau vorm en eiwit expressie. De workflow van dit protocol is samengevat in Figuur 1. Het voordeel van deze methode is dat we hoge resolutie beelden evenals Multi-parameter ondermeer uit het beeld-gebaseerde analyse krijgen. In het algemeen, kan dit protocol worden aangepast en toegepast om te kwantificeren van het vervoer van een misfolded membraan eiwit van belang.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Opmerking: De rhodopsine vervoer assay.
1. voorbereiding en cultuur van cellen
- Blazen cryo-bewaard U2OS stabiele cellen uiten het wild type (WT) of de mutant muis rhodopsine-Venus fusion eiwitten. Ontdooi de cellen bij 37 ° C totdat alleen kleine ijskristallen in het flesje zitten.
Opmerking: De U2OS cellen worden gebruikt in dit protocol omdat er geen fotoreceptor cellijn beschikbaar voor in vitro studies is en de vooraf Ciliaire biosynthese van rodopsine wordt gereguleerd door soortgelijke moleculaire mechanismen in cellen van zoogdieren. Bovendien, de U2OS cellen strak hechten aan de onderkant van de plaat en hebben grote cel organen, zodat ze ideaal voor de rhodopsine vervoer assay zijn. Zeven U2OS stabiele cellen uiten de WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N en P267L rhodopsine mutanten worden gebruikt als een voorbeeld om te laten zien van de kwaliteit en betrouwbaarheid van de test. Stabiele cellen uiting van andere mutanten rhodopsine of andere membraaneiwitten kunnen worden gebruikt, afhankelijk van het doel van de test. Stabiele cellen uiten van menselijke rhodopsine kunnen in deze test worden gebruikt, indien beschikbaar. De muis rhodopsine werd hier gebruikt omdat muis en menselijke rhodopsine eiwitten 95% homologie delen en de verbindingen geïdentificeerd door deze test zal worden getest in vivo met behulp van een muismodel van het adRP met de rhodopsine P23H mutatie8uitvoering. De stabiele cellen werden gegenereerd, zoals eerder beschreven19. De WT en de mutant rhodopsine transcripties werden gekwantificeerd door q-PCR, en het klonen van stabiele cellen uiten van vergelijkbare niveaus van WT en mutant rhodopsine transcripties werden geselecteerd voor deze test. De expressie van rodopsine eiwitten werd bevestigd door de immunoblot en immunokleuring. De passage van de cellen die worden gebruikt in deze test moet lager zijn dan 20. - Breng elke regel van cellen in een conische tube van 15 mL, met 10 mL groeimedium (hoge glucose Dulbecco van gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale runderserum (FBS) en 5 µg Mn/mL Plasmocin).
- Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 5 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet cel met 5 mL cel groeimedium voor elke regel van de cel. Elke regel van de celsuspensie Breng in een schotel van 60 mm weefselkweek en Incubeer bij 37 ° C met 5% CO2.
- Subcultuur de cellen bij de weefselkweek schotel 90% samenvloeiing als bereikt in referentie12 beschreven.
2. het zaaien van cellen op 5.000 cellen per Well
Opmerking: Voer de volgende procedures in de kap van een weefselkweek.
- Behandelen van de plaat met poly-lysine.
- Één dag vóór het zaaien van de cellen, een zwart-muur behandelen en duidelijke 384-well bodemplaat met 20 µL per putje van poly-lysine oplossing voor 30 min.
- Gecombineerd de vloeistof en toestaan van alle putjes te drogen voor 1 h. uitgesteld de deksel van de plaat en de plaat bij 4 ° C's nachts voor het zaaien van de cel opslaan.
- Voorbereiden van de celsuspensie.
- Elke regel van de cel in groeimedium in een schotel van 100 mm weefselkweek cultuur tot 90% samenvloeiing.
- Elk gerecht met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) wassen en losmaken van de cellen met 1 mL van 0,05% trypsine bij 37 ° C.
- Resuspendeer elke regel van cellen in 10 mL assay voedingsbodem (hoge-glucose DMEM met 10% FBS, 100 eenheden/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine).
- Cellen tellen en elke regel van cellen naar 1.25 x 105 cellen/mL met het medium assay Verdun.
- Het zaad van de cellen.
- Gebruik een elektronische meerkanaalspipet of een geautomatiseerde reagens dispenser afzien van 40 µL per putje van de celsuspensie drie kolommen per cellijn- en opvulstijlen kolommen 1-21 van de 384-well plaat (Figuur 2).
- Voeg toe 40 µL per putje van U2OS (P23H-rhodopsine-Venus) naar kolommen 22-23 en 40 µL per putje van U2OS (rhodopsine-Venus) naar kolom 24, als besturingselementen.
- Centrifugeer de plaat bij 300 x g gedurende 30 s te brengen van alle cellen aan de onderkant van de plaat 384-well.
Opmerking: Vermijd fysieke schok aan de plaat na het zaaien van de cel. Anders, cellen naar een hoek van elk putje zal worden verpletterd, en de plaat zal niet geschikt voor hoge-inhoud imaging. - Incubeer de 384-well plaat bij 37 ° C met 5% CO2 voor 3 h voor de cellen om te koppelen aan de onderkant van de plaat.
3. behandeling van de cellen met de verbindingen
- Een overzicht van de plaat met de voorwaarden van de behandeling zoals getoond in Figuur 2gegenereerd.
- 300 µL van 5 x werkoplossingen voor maximaal 15 verbindingen in een 96-wells-plaat voor te bereiden.
- Verdun cps 1 tot en met 15 met de assay middellange tot vijfmaal van hun eindconcentraties in putten A1 naar G2 van de 96-wells-plaat (figuur 2A). Voeg 300 µL van assay medium in goed H2.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van elke verbinding wordt gebruikt op de meest effectieve concentratie voor de redding van het vervoer van de P23H rhodopsine door de HTS12,13. - Voeg 100 µL per putje van 2% dimethylsulfoxide (DMSO) en 25 µM 9 -cis-retinale die respectievelijk in de assay middellange tot kolommen 11 en 12, worden verdund. Voeg 9 -cis-netvlies in schemerige licht.
- Verdun cps 1 tot en met 15 met de assay middellange tot vijfmaal van hun eindconcentraties in putten A1 naar G2 van de 96-wells-plaat (figuur 2A). Voeg 300 µL van assay medium in goed H2.
- Het toevoegen van 10 µL per putje van 5 x werken oplossingen aan de plaat van de 384-well gekweekt met de cellen (figuur 2B).
- Gebruik een elektronische multi-kanaals Pipetteer verbindingen 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 en 15 toevoegen aan rijen A, C, E, G, I, K, M en O uit kolommen 1 tot en met 21 (Figuur 2). Toevoegen van verbindingen 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 en M naar rijen B, D, F, H, J, L, N en P uit kolommen 1 tot en met 21.
- Voeg toe 10 µL per putje van 2% DMSO aan kolommen 22 en 24. Voeg 10 µL per putje van 25 µM 9 -cis-netvlies naar kolom 23.
Opmerking: DMSO wordt gebruikt als een voertuig controle omdat alle de verbindingen in eerste instantie in DMSO als voorraden opgelost worden. Kolom 22 met DMSO behandeld cellen uiten de P23H rhodopsine wordt gebruikt als het besturingselement 0%. 9 -Cis-netvlies behandelde cellen, uiting geven aan de P23H rhodopsine wordt gebruikt als de 100%-controle.
- De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie en de plaat bij 37 ° C gedurende 24 uur uit te broeden.
4. immunokleuring zonder membraan Permeabilization om rhodopsine eiwitten op het celoppervlak vlek.
Opmerking: Vermijd een wasmiddel in het proces van de gehele immunokleuring celmembraan om intact te houden.
- 4% paraformaldehyde (PFA) bereid door verdunning van de 16% PFA met PBS in een 1:4-volumeverhouding in een chemische zuurkast. Overdracht van de 4% PFA in een reagens reservoir.
- Haal de 384-well-plaat in een donkere kamer met dim rood licht. Gebruik een 8-kanaals aspirator verbonden met een vacuüm collectie fles te zachtjes gecombineerd het medium. Gebruik van een elektronische meerkanaalspipet 20 µL per putje van vers bereide 4% toevoegen aan de gehele 384-well plaat PFA en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Om te voorkomen mobiele-detachement, altijd wijs de toppen van de aspirator dezelfde kant van elk putje tijdens aspiraties. Raak niet midden onder inzake elk putje. Bij het nemen van beelden, Selecteer velden om te voorkomen dat de regio geraakt door de aspirator. Voor de incubations langer dan 10 min, afdekplaat de 384-well met het deksel te voorkomen van verdamping.
Opmerking: Cellen worden opgelost in een donkere kamer te vermijden photobleaching van de geregenereerde isorhodopsin die invloed op het resultaat van de 100%-controle hebben zullen. Na fixatie, kan de 384-well plaat worden genomen onder normaal licht. - Gebruik een 8-kanaals aspirator gecombineerd de PFA in elk putje en gebruik van een elektronische multi-kanaals Pipet toe 50 μl per putje van PBS. Herhaal nog tweemaal uit te voeren drie wast met PBS.
Let op: De afvalstoffen vloeibaar met PFA worden verzameld in een afgetopte fles en is als een gevaarlijk chemisch afval worden verwijderd na het experiment. - Blokkeren van de cellen door 20 µL per putje van 5% geit serum toe te voegen aan de gehele 384-well-plaat en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- De 5% geit serum gecombineerd en 15 µL per putje van 20 µg mL-1 B6-30 anti-rhodopsine antilichaam in 1% geit serum toevoegen aan rijen A O. toevoegen 15 µL per putje van 1% geit serum naar rij P voor de secundaire antilichaam-alleen controlegroep.
- Incubeer de 384-well-plaat bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten of bij 4 ° C's nachts. De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie om te voorkomen dat photobleaching van de fluorophores.
- Het wassen van de plaat 3 keer met 50 µL per putje van PBS.
- PBS gecombineerd en voeg 15 µL per putje van 5 µg mL-1 Cy3-geconjugeerde geit anti-muis IgG antilichamen. De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie en bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, of bij 4 ° C na een nacht bebroeden.
- Het wassen van de plaat 3 keer met 50 µL per putje van PBS. Voeg 50 µL per putje van PBS met 1 µg mL-1 Hoechst 33342 om vlek kernen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Verzegel de 384-well-plaat met een transparante film voor imaging. De 384-well afdekplaat met aluminiumfolie en bewaren bij 4 ° C voor maximaal een week als beelden onmiddellijk worden genomen.
5. beeldvorming.
Opmerking: Deze beeldvormende procedure van hoge-inhoud is aangepast aan het imaging systeem vermeld in de Tabel van materiaal. Procedures kunnen verschillen als ze zijn met behulp van andere beeldvormingssystemen van hoge-inhoud.
- Verwijder het deksel en zet de 384-well-plaat in de hoge-inhoud imager met A1 op de linker bovenhoek van de plaat geplaatst.
- Open de afbeelding acquisitie software instellen van parameters voor Beeldacquisitie.
- De plaat overname Setup-venster te openen en nieuwe opgeven of een bestaande setup-bestand laden.
- Selecteer het doel 20 x en opzetten van pixel weggooien als 2 dus de geijkte pixelgrootte 0,80 x 0.80 is µm. Stel de scanlijnen als 2.000 en grootte van de afbeelding (W x H) als 1000 x 1000 pixels (800,00 x 800.00 µm) per site.
- Selecteer het type plaat aan het image worden gemaakt. Gebruik de informatie die door de fabrikant van de 384-well plaat te vullen in de afmetingen van de plaat.
- Selecteer de putjes te worden beeld voor de 384-well-plaat.
- Selecteer vier sites worden beeld per putje. Vermijd de kant van de goed getroffen door de aspiratie-tips.
- Selecteer excitatie lasers als 405, 488 en 561 nm. Emissie filters voor DAPI, FITC en Texas rood kanalen te selecteren. Optimaliseren van de kracht van de laser en winsten van elk kanaal om de helderheid van beelden uit de positieve controle putten lager dan de drempel van verzadiging.
- Selecteer goed-te-goed focus voor de autofocus. Selecteer de eerste put verworven als de initiële goed voor het vinden van de monsters. Bepaal site autofocus op alle sites.
- Selecteer vier gemiddelden per regel voor elk kanaal. Optimaliseren van de waarde van de Z-verschuiving voor elk kanaal.
- Test 2-3 putjes op de diagonale hoeken van de 384 goed plaat om ervoor te zorgen dat de beelden op focus zijn voor alle geteste putjes, images van alle sites per putje cellen met meer dan 40% samenvloeiing en intensiteit van de fluorescentie van alle kanalen hebben zijn ongeveer de helft verzadigd in de 100% controleputjes.
- Sla de afbeelding overname methode.
- Voer de volledige plaat. Bekijk de imager totdat het klaar is met het vastleggen van beelden uit de eerste kolom van de plaat om te controleren of de beeldkwaliteit vóór het verlaten van de imager. Neem de 384-well-plaat en bewaren bij 4 ° C voor toekomstig gebruik.
Opmerking: Afhankelijk van het aantal websites geselecteerd per goed en de kanalen genomen, duurt 40 min 3 h tot finish imaging een 384-well plaat.
6. beeldanalyse.
- De afbeeldingsgegevens met behulp van een high-inhoud afbeelding analysesoftware uitlichten. Selecteer een van de 100%-controleputjes (kolom 23) parameters instellen.
- Selecteer het Scoren van de cel van de multi golflengte als de analysemethode en beginnen met het configureren van de instellingen.
- Definieer de kernen met behulp van beelden van de DAPI-kanaal. Controleer of de gedefinieerde kernen vormen in de geselecteerde goed sluit goed aan bij de kernen beelden bekijken.
- De vorm van cel definiëren in de FITC-kanaal waar rhodopsine-Venus is beeld.
- De rhodopsine cel oppervlakte vlek gebieden definiëren in de Texas rood kanaal.
- Test het huidige algoritme in 5 putten om te bepalen als de instellingen zijn geoptimaliseerd. Sla de instellingen op en sluit het venster configuratie .
- Alle de putjes met de geoptimaliseerde analysemethode worden uitgevoerd.
- Objectnummer als intact celaantal exporteren. De Gemiddelde intensiteit van de FITC-kanaal als rhodopsine-Venus intensiteit (rhodopsine-Venus INT) exporteren. De Gemiddelde intensiteit van de Texas Red-kanaal als rhodopsine intensiteit op het celoppervlak (rhodopsine INT op het celoppervlak) exporteren.
- Open de geëxporteerde gegevens in een spreadsheet-software. Verdeel de rhodopsine intensiteit op het celoppervlak door de rhodopsine-Venus INT als MEM-naar-total verhouding. Berekenen van de Z'-factoren voor elke parameter om te evalueren van de kwaliteit van de test. Z′ = 1−3X (STD100% controle+STD0% controle) / | :100% controle−Mean0% controle|.
Opmerking: Een Z'-factor hoger dan 0 geeft aan een gematigde assay voldoende voor een hoge-inhoud-beeldscherm en een Z dat ' factor tussen 0,5 en 1 suggereert een uitstekende bepaling nodig is voor een scherm van hoge-doorvoer20,21. - Gebruik de spreadsheet-software voor het genereren van een twee-kleuren warmte-kaart voor elke parameter. De naam van de cellijnen op de x-as en de verbindingen op de y-as te regelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We gekenmerkt het rhodopsine vervoer met drie parameters: de intensiteit van rodopsine-Venus in de hele cel (rhodopsine-Venus INT), de intensiteit van immunokleuring van rodopsine op het plasma-membraan (rhodopsine INT op het celoppervlak), en de verhouding tussen Rodopsine vlek op het celoppervlak aan rhodopsine-Venus intensiteit in de hele cel (MEM-totaal Ratio). Een representatief resultaat voor de bepaling van rodopsine vervoer wordt weergegeven in Figuur 3 en Figuur 4. Met behulp van DMSO en 9 -cis-retinale behandeld cellen uiten van de P23H-rhodopsine-Venus als de 0 en 100% controle, respectievelijk de Z'-factoren voor deze drie parameters in het bereik zijn tussen 0 tot 0,5, wat suggereert dat de test heeft matige kwaliteit, voldoende voor hoge-inhoud imaging21. Hoewel de geoptimaliseerde Z'-factoren zijn lager dan 0,5 als gevolg van de relatief complexe procedures in vergelijking met een HTS-test, deze test is nog steeds robuust en betrouwbaar voor een analyse op basis van installatiekopieën. Een actieve verbinding die een misfolded rhodopsine redt moet hogere waarden van rodopsine INT Toon op het celoppervlak en MEM-totaal verhouding dan DMSO, met een P -waarde lager dan 0,05. Drie 2-D warmte kaarten werden gegenereerd op basis van deze drie parameters te vergelijken van de gemiddelde rhodopsine bedrag en localisatie per cel (Figuur 4). Triplicates worden herhaald, WT en zes rhodopsine mutanten horizontaal staan, en de effecten van samengestelde behandelingen verticaal worden vergeleken. In overeenstemming met eerdere studies, de rhodopsine INT op het celoppervlak en de verhouding van de MEM-totaal van zijn lager voor de zes mutanten in vergelijking met de WT rhodopsine behandeld met DMSO (figuur 4C)5,22,23. De rhodopsine INT op het celoppervlak en de verhouding tussen de MEM-naar-Total zijn stegen met 9 -cis-netvlies behandeling voor de T4R, P23H, D190N en P267L, maar niet de P53R of C110Y mutanten, suggereren dat 9 -cis-retinale redt het vervoer van de T4R, P23H, D190N en P267L rhodopsine mutanten. Alle de cps toonde uiteenlopende niveaus van verhoging in de rhodopsine INT op het celoppervlak voor de T4R, de P23H en de D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 en 11 verhoogd de INT rhodopsine-Venus, maar niet de MEM-naar-Total verhouding van deze rhodopsine mutanten, suggereren dat deze stoffen alleen maar de rhodopsine bedrag toegenomen. CPS 1, 2, 6 en 9 aanzienlijk verhoogd de MEM-naar-Total verhouding van T4R, P23H, D190N en P267L rhodopsine mutanten, suggereren dat deze stoffen het vervoer van deze mutanten rhodopsine aan het plasma-membraan redden. De 2-D-profielen zorgen voor een uitgebreid overzicht van rodopsine vervoer beïnvloed door deze adRP geassocieerd mutaties die worden verzacht door verschillende farmacologische behandeling.
Figuur 1: de workflow van de rhodopsine vervoer assay. Procedures voor de cel-oppervlakte verkleuring van rodopsine zonder membraan permeabilization voor de rhodopsine vervoer assay. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: illustraties voor de bereiding van 5 x werkoplossingen en de vloeibare overdracht van de 96-wells-plaat aan de plaat 384-well. (A) de indeling van de 96-wells-plaat van de 5 x werkende oplossingen. Wells A1 naar G2 hebben 300 µL per putje van maximaal 15 5 x werkoplossingen en assay medium (M), zoals geïllustreerd in de kolommen 1 en 2. Verbindingen 14 en 15 zijn 2% DMSO en 25 µM 9 -cis-netvlies, respectievelijk voor de behandeling van de zeven cellijnen WT en mutant rhodopsine uitspreken. Daarnaast kolommen 11 en 12 hebben 100 µL per putje van 2% DMSO en 25 µM 9 -cis-retinale controles, respectievelijk getrakteerd op de cellen, uiting geven aan de P23H rhodopsine voor de berekening van Z'-factoren. (B) de 384-well plaat lay-out voor de cel type en behandeling. De U2OS cellen uiten de WT, T4R, P23H, P53R, C110Y, zijn D190N en P267L rhodopsine-Venus bezaaid zoals geïllustreerd. Behandeling voorwaarden worden aangeduid in blauw. Roze en blauwe tips tonen de goed-te-goed vloeibare overdracht van de 96-wells-plaat aan de 384 plaat met behulp van een meerkanaalspipet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: representatieve beelden en ondermeer voor de besturingselementen van de rhodopsine vervoer assay. (A) Venus fluorescentie (groen) en cel oppervlakte immunokleuring (rood) van U2OS cellen uiten WT of P23H rhodopsine-Venus behandeld met DMSO of 5 µM 9 -cis-retinal. Schaal bar = 200 µm. (B) A kolom plot van gemiddelde Venus intensiteit per cel rhodopsine bedrag in de hele cel (rhodopsine-Venus INT). p< 0,0001. Z'-factor wordt weergegeven onder de zwarte lijn. Kolom waarde en fout bar zijn gemiddelden en standaarddeviatie (S.D.) van 16 replicaten, respectievelijk. (C) A kolom plot van betekenen Cy3 intensiteit per cel vertegenwoordigt de rhodopsine gekleurd op het celoppervlak (rhodopsine INT op het celoppervlak). (D) een kolom plot van de verhouding van de gemiddelde cy3 intensiteit per cel te betekenen Venus intensiteit per cel die de verhouding weergeeft van rodopsine niveau op het celoppervlak aan haar geheel-celniveau (MEM-naar-total ratio). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: een representatieve high-inhoudsanalyse van de rhodopsine vervoer assay weergegeven als 2-kleuren warmte kaarten. (A) de warmte kaart van betekent dat Venus intensiteit per cel die het geheel-cel rhodopsine niveau (INT rhodopsine-Venus) vertegenwoordigen. Elk blok vertegenwoordigt een gegevenspunt en elke voorwaarde werd getest in drievoud. De kleurenlegenda wordt weergegeven aan de linkerkant. CP, samengestelde. (B) de warmte kaart van betekenen Cy3 intensiteit per cel vertegenwoordigt de rhodopsine gekleurd op het celoppervlak (rhodopsine INT op het celoppervlak). (C) de warmte kaart van het gemiddelde Cy3 intensiteit per cel aan de gemiddelde intensiteit van de Venus per cel die de verhouding weergeeft van rodopsine niveau op het celoppervlak aan haar geheel-celniveau (MEM-naar-total ratio). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier, toonden we een hoge-inhoud imaging assay gebruikt voor het karakteriseren van hits geïdentificeerd van een HTS. De enige automatisering die betrokken zijn bij deze protocollen is de high-inhoud imager. De immunokleuring en fluorescentie beeldvorming van rodopsine zijn vaak gebruikt om het karakteriseren van de lokalisatie van rodopsine5,14,15,16. De kwantificering van de beelden genomen door de traditionele beeldvorming methoden wordt echter beperkt door het ontbreken van voldoende cel beelden per voorwaarde, lage capaciteit van beelden per experiment, en het ontbreken van een parameter van de kwaliteitscontrole. Wij het traditionele immunokleuring protocol naar de 384-well-indeling aangepast en vervangen de traditionele beeldvorming met hoge-inhoud beeldvorming. Met behulp van dit high-inhoud imaging protocol, we met succes geselecteerd en de activiteiten van hits geïdentificeerd door een HTS11,13,17gekenmerkt. Vergeleken met de traditionele immunokleuring en beeldvormende methoden, verhoogd dit protocol aanzienlijk de consistentie van imaging voorwaarden, imaging capaciteit en beeld analyse kracht, waardoor ons kwantitatief vergelijken de farmacologische werking geassocieerde rhodopsine mutanten van 11 verbindingen naar het vervoer van zes adRP.
De belangrijkste wijzigingen van dit protocol in vergelijking met de eerder gebruikte protocollen voor rhodopsine immunokleuring en imaging zijn: (1) groeien en immunokleuring cellen in een duidelijk-384-well bodemplaat; (2) imaging cellen met behulp van een high-inhoud imager; en (3) analyseren gegevens met een hoge-inhoud beeld analysesoftware. Als gevolg van deze wijzigingen is een eerste optimalisatie vereist voor het vinden van de beste seeding celaantal, antilichaam concentraties imaging voorwaarden en beeld analyse algoritmen.
De kritische stappen van het protocol opnemen: (1) zaaien van de cellen die het mogelijk maken van de samenvloeiing van de 50-70% voor fixatie; (2) voorzichtig aspiraties te voorkomen mobiele-detachement; (2) imaging verschillende putten over de gehele plaat om ervoor te zorgen dat er beelden zijn in focus en lichten van alle kanalen niet hoger is dan de helft van de drempel van de imager voor de positieve controle putten voor beeldvorming van de hele plaat; en (3) houden de Z'-factor hoger dan 0 om de betrouwbaarheid van de test.
De meest voorkomende problemen die zouden kunnen voor dit protocol oplopen zijn mobiele-detachement en lage Z'-factoren. Om te voorkomen dat het eerste nummer, voorbehandeling de 384-well plaat met poly-L-lysine om te vergemakkelijken de cel bijlage en Vermijd het gebruik van de cellijnen die loskoppelen gemakkelijk zoals de cellen van de Hek293. Bovendien beperken de aspiratie tip te raken slechts één zijde van elk putje tijdens aspiratie en selecteer de andere kant van elk putje voor imaging. Om de Z'-factor en de kwaliteit van de bepaling, optimaliseren van de cel nummer en beeld analyse gebruikte parameters om ervoor te zorgen dat de cel shape of kernen gedefinieerd door de software past goed bij elk object in elk kanaal van de fluorescentie te zaaien.
Vergeleken met andere methoden te kwantificeren van rodopsine vervoer, zoals een cel oppervlakte ELISA of een β-galactosidase fragment complementatie assay, waarin het streefniveau voor de eiwitten op het celoppervlak in alle cellen te berekenen, kwantificeert deze hoge-inhoud beeldvorming methode gemiddelde eiwit niveau per cel; en, dankzij deze unieke functie vermijdt een kritische variatie factor, cel nummer dat is van invloed op de uiteindelijke uitlezingen in andere methoden. Bovendien, als gevolg van het grote aantal cellen beeld en gekwantificeerd door de hoge-inhoud beeldvorming methode, de parameters gemiddeld uit alle cellen per goed bleek weinig variatie tussen replicaten, waardoor de betrouwbaarheid van de test.
Een beperking van dit protocol is dat ze niet het beste testen voor HTS, als gevolg van de relatief ingewikkelde procedure en de 2 h per plaat imaging tijd. Dus wij adviseren alternatieve verslaggever testen voor het screenen van grote kleine-molecuul bibliotheken met meer dan 5.000 verbindingen, en dit hoge-inhoud imaging protocol te gebruiken voor gerichte karakterisering tests beperkt tot minder dan 100 verbindingen. De tweede beperking van dit protocol is het gebrek aan normen te tonen of de fluorescentie van Venus of de intensiteit van de fluorescentie immunokleuring in een lineaire correlatie met de hoeveelheid rhodopsine eiwit bedrag per cel zijn. Om te voorkomen verzadiging door immunokleuring, raden we testen en uitzetten van de intensiteiten van immunokleuring van de cellen geïncubeerd met verschillende concentraties van primaire en secundaire antilichamen. Selecteer de antilichaam-concentraties binnen het lineaire bereik van bloeien veranderen.
Uitbreiden van het huidige programma, zullen we kwantificeren rhodopsine vervoer van beelden van cellen Transient transfected met 28 verschillende rhodopsine mutanten onder behandeling met maximaal 10 verbindingen voor het genereren van een farmacologische database van deze verbindingen activiteit voor begeleiding van potentiële behandelingen aan adRP patiënten uitvoering van deze mutaties van rodopsine. Dit protocol kan ook gemakkelijk worden aangepast aan de analyses van de translocatie van een membraan proteïne van belang die zal nuttig zijn voor drug ontdekkingen van andere misfolding ziekten eiwitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Dr. Mark E. Schurdak en de Universiteit van Pittsburgh drugontdekking Instituut voor het verstrekken van de hoge-inhoud imager en de eerste trainingen. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) deelden genereus de 1 d-4 en B630 anti-rhodopsine antilichamen. Het plasmide met cDNA voor muis rhodopsine-Venus construct werd gedeeld door Dr. Nevin Lambert (Augusta University). Dit werk werd gesteund door het Nationaal Instituut van gezondheid subsidie EY024992 YC en P30EY008098 van de Universiteit van Pittsburgh Vision onderzoek Core subsidie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
