Summary
Vi beskrivit här, en hög-innehåll bildgivande metod för att kvantifiera transport av rhodopsin mutanter är associerad med retinitis pigmentosa. En multipel-våglängd scoring analys användes för att kvantifiera rhodopsin protein på cellens yta eller i hela cellen.
Abstract
Rhodopsin felveckning mutationer leder till rod ljusmätare döden som manifesteras som autosomalt dominerande retinitis pigmentosa (RP), en progressiv bländande sjukdom som saknar effektiv behandling. Vi hypotes att cytotoxiciteten felveckning rhodopsin muterade kan lindras genom att farmakologiskt stabilisera proteinet mutant rhodopsin. P23H mutationen, bland andra klass II rhodopsin mutationer, kodar ett strukturellt instabil rhodopsin mutant protein som ackumuleras i det endoplasmatiska retiklet (ER), medan den vilda typen rhodopsin transporteras till plasmamembranet i däggdjursceller celler. Vi har tidigare utfört en luminescence-baserade hög genomströmning skärm (HTS) och identifierade en grupp av farmakologiska chaperones som räddade transport av den P23H rhodopsin från ER till plasmamembranet. Här, kvantifieras med hjälp av immunfärgning metod följt av en hög-innehåll bildanalys, vi mutant rhodopsin protein mängden i hela cellen och plasmamembranet. Denna metod är informativ och effektivt att identifiera sanna träffar från falska positiva efter HTS. Dessutom, aktiverat den hög-innehåll bildanalys oss att kvantifiera flera parametrar från en enda experiment för att utvärdera de farmakologiska egenskaperna hos varje förening. Med denna analys, analyserade vi effekten av 11 olika föreningar mot sex RP associerade rhodopsin mutanter, erhålla en 2D-farmakologisk profil för en kvantitativ och kvalitativ förståelse om den strukturella stabiliteten i dessa rhodopsin mutanter och effekt av olika föreningar mot dessa mutanter.
Introduction
Protein Skellefteåsjukan är involverad i muskeldystrofi, neurala degeneration, samt förblindande sjukdomar, inklusive retinitis pigmentosa (RP)1. RP är en ärftlig och progressiv näthinneförtvining associerad med mutationer i över 60 gener som påverkar funktion och homeostas av rod fotoreceptorer eller retinal pigmenterad epitheliums (RPEs)2,3. Ingen effektiv behandling finns för närvarande för RP. Rhodopsin mutationer står för ca 25-30% av autosomalt dominant (ad) RP fall. Bland de mer än 150 rhodopsin mutationer4 (Human Gene Mutation databas, http:/ www.hgmd.cf.ac.uk/), klass II mutationer orsaka strukturella instabiliteten av rhodopsin protein som bidrar till rod ljusmätare döden och Vision förlust5,6,7,8. P23H är mest frekventerar rhodopsin mutationen i Nordamerika, vilket är också ett typiskt exempel av klass II rhodopsin mutationer9,10. På grund av dess inneboende strukturella instabilitet ackumuleras den felveckning rhodopsin i det endoplasmatiska retiklet (ER) i däggdjursceller, medan den vilda typen rhodopsin ligger på plasmamembranet5. Den felveckning rhodopsin P23H mutant utställningar dominerande negativa cytotoxicitet som beror inte på haploinsufficiency, men är relaterad till aktivering av ER associerade protein nedbrytningsvägen och avbrutna staven yttre segmentet organisationen. För att lindra rod ljusmätare cell stress, är en strategi att stabilisera den infödda vikningen av den muterade rhodopsin som använder en farmakologisk förkläde.
För att uppnå detta mål, utfört vi en cellbaserade hög genomströmning skärmen (HTSs)11,12,13 med en β-galaktosidas fragment komplettering analys för att kvantifiera P23H rhodopsin mutant transporteras på plasma membran. Det robusta och enkla protokollet denna HTS analys aktiverat oss att utforska verksamhet ca 79.000 små molekyler för varje skärm. Men eftersom denna HTS analys läser luminiscens signaler, ingår falska positiva inklusive de β-gal-hämmare, färgade eller cytotoxisk föreningar i träfflistan väntar på att identifieras genom en sekundär analys.
Den traditionella immunfärgning och fluorescens avbildningsmetoder har använts i åratal för att studera rhodopsin transport i däggdjursceller5,14,15,16. Dock inte kan dessa konventionella metoder användas för att kvantifiera farmakologiska effekter av mer än 10 föreningar mot rhodopsin transport eftersom en tillförlitlig bildanalys kräver ett stort antal bilder som tagits under en mycket konsekvent villkora, som är inte ändras av de konventionella avbildningsmetoder. Här utvecklade vi en immunfärgning baserat protokoll hög-innehåll avbildning som en sekundär analys att kvantifiera cell surface transport av felveckning rhodopsin mutanter11,13,17. Etikettera rhodopsin på plasmamembranet, hoppade vi steget i cellmembranet permeabilisering och immunostained rhodopsin mutanter av en monoklonal anti (B6-30)-rhodopsin som erkänner den N-terminala epitop av rhodopsin på den extracellulära sidan av cellen membranet18. För att visualisera den muterade rhodopsin i hela cellen, smält vi rhodopsin med Venus fluorescens proteinet. Genom kvantifiering av fluorescens stödnivåerna i olika fluorescens kanaler har vi möjlighet att erhålla flera parametrar från en enda experiment inklusive totala rhodopsin intensiteten i hela cellen, på cellytan och förhållandet mellan rhodopsin fluorescens på cellytan som i hela cellen. Tillämpa denna metod för att stabila celler som uttrycker sammanlagt sex felveckning rhodopsin mutanter, kan vi generera en farmakologisk profil av flera småmolekylära chaperones mot dessa mutanter. I detta protokoll, alla celler är immunostained i en plattan med 384 brunnar och avbildas med hjälp av ett automatiserat imaging system under ett mycket konsekvent imaging tillstånd. En bildanalys utförs i varje brunn, som innehåller bilder av mer än 600 celler att minska variation på grund av heterogenitet av celler med olika form och protein uttryck cellnivå. Arbetsflödet i detta protokoll sammanfattas i figur 1. Fördelen med denna metod är att vi får högupplösta bilder samt multi-parameter kvantifieringar från image-baserad analys. I allmänhet, kan detta protokoll ändras och används för att kvantifiera transport av någon felveckning membranprotein av intresse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: Rhodopsin transport analysen.
1. beredning och kultur av celler
- Återuppliva cryo-bevarade U2OS stabil celler som uttrycker den vildtyp (WT) eller muterade musproteiner rhodopsin-Venus fusion. Tina cellerna vid 37 ° C tills endast små iskristaller är kvar i injektionsflaskan.
Obs: De U2OS cellerna används i detta protokoll eftersom det finns ingen ljusmätare cell linje för in vitro- studier och pre ciliär biosyntesen av rhodopsin regleras av liknande molekylära mekanismer i däggdjursceller. Dessutom U2OS cellerna fäster tätt till botten av plattan och har stora cell organ, så de är idealiska för rhodopsin transport analysen. Sju U2OS stabil celler som uttrycker den WT T4R, P23H, P53R, C110Y, D190N och P267L rhodopsin mutanter används här som ett exempel att Visa kvalitet och tillförlitlighet i analysen. Stabil celler som uttrycker andra rhodopsin mutanter eller andra membranproteiner kan användas, beroende på målet med analysen. Stabil celler som uttrycker människors rhodopsin kan användas i denna analys om tillgängliga. Mus rhodopsin användes här eftersom musen och mänskliga rhodopsin proteiner delar 95% homologi, och de föreningar som identifierats av denna analys kommer att testas i vivo med hjälp av en musmodell adRP bär rhodopsin P23H mutation8. Stabil cellerna genererades som tidigare beskrivits19. De WT och muterade rhodopsin avskrifter kvantifierades genom q-PCR och klonerna av stabil celler som uttrycker liknande nivåer av WT och muterade rhodopsin avskrifter valdes för denna analys. Uttrycket av rhodopsin proteiner bekräftades av immunoblot och immunfärgning. Passage av celler som används i denna analys bör vara lägre än 20. - Överföra varje rad av celler till en 15 mL koniska rör innehållande 10 mL odlingsmedium (hög glukos Dulbeccos modifierad örnens medium (DMEM) med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 5 µg/mL Plasmocin).
- Centrifugera röret vid 200 x g i 5 min. Kassera supernatanten och återsuspendera cellpelleten med 5 mL odlingsmedium cell för varje cellinje. Överföra varje rad av cellsuspensionen i en 60 mm vävnadsodling skålen och inkubera vid 37 ° C med 5% CO2.
- Subkultur cellerna när vävnadsodling skålen når 90% sammanflödet som beskrivs i referens12.
2. sådd celler på 5 000 celler per brunn
Obs: Utför följande procedurer i vävnadsodling huva.
- Behandla plattan med poly-lysin.
- En dag före sådd cellerna, behandla en svart-vägg och avmarkera 384-väl bottenplatta med 20 µL per brunn av poly-lysin lösning för 30 min.
- Aspirera vätska och tillåta alla brunnar torka för 1 h. sätt tillbaka plattan locket och förvara plattan vid 4 ° C över natten för cell sådd.
- Förbered cellsuspensionen.
- Kultur varje cellinje i odlingsmedium i ett 100 mm vävnadsodling skålen tills 90% sammanflödet.
- Tvätta varje maträtt med fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och lossa cellerna med 1 mL 0,05% Trypsin vid 37 ° C.
- Återsuspendera varje rad av celler i 10 mL av analyssubstratet (hög-glukos DMEM med 10% FBS, 100 enheter/mL penicillin och 100 μg/mL streptomycin).
- Räkna cellerna och späd varje rad av celler till 1,25 x 105 celler/mL med analyssubstratet.
- Utsäde cellerna.
- Använd en elektronisk multikanalspipett eller en automatiserad reagens dispenser avstå från 40 µL per brunn av cellsuspensionen till tre kolumner per cell linje och fyllning kolumner 1-21 av plattan med 384 brunnar (figur 2).
- Lägga till 40 µL per brunn av U2OS (P23H-Rhodopsin-Venus) till kolumner 22-23 och 40 µL per brunn av U2OS (Rhodopsin-Venus) till kolumn 24, som kontroller.
- Centrifugera plattan vid 300 x g i 30 s för att få ner alla celler till botten av plattan med 384 brunnar.
Obs: Undvik stötar till plattan efter cell sådd. Annars celler kommer att krossas till ett hörn av varje brunn och plattan kan inte lämpar sig för hög-innehåll imaging. - Inkubera 384-väl plattan vid 37 ° C med 5% CO2 för 3 h för cellerna att bifoga till botten av plattan.
3. behandling av cellerna med föreningar
- Generera en tallrik karta med behandling villkor som visas i figur 2.
- Förbereda 300 µL av 5 x fungerande lösningar av upp till 15 föreningar i en plattan med 96 brunnar.
- Späd cps 1 till 15 med analyssubstratet till fem gånger av sin slutliga koncentrationer i brunnar A1 till G2 av 96-brunnen tallrik (figur 2A). Tillsätt 300 µL av analyssubstratet i väl H2.
Obs: Varje förening slutliga koncentration används på den mest effektiva koncentrationen till undsättning transport av den P23H rhodopsin av HTS12,13. - Tillsätt 100 µL per brunn av 2% dimetyl sulfoxid (DMSO) och 25 µM 9 -cis-retinal som späds i analysmediet till kolumner 11 och 12, respektive. Lägga till 9 -cis-retinal i svagt ljus.
- Späd cps 1 till 15 med analyssubstratet till fem gånger av sin slutliga koncentrationer i brunnar A1 till G2 av 96-brunnen tallrik (figur 2A). Tillsätt 300 µL av analyssubstratet i väl H2.
- Lägga till 10 µL per brunn 5 x arbetar lösningar på den plattan med 384 brunnar odlade med celler (figur 2B).
- Använd en elektronisk flerkanalig pipett att lägga till föreningar 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 och 15 rader A, C, E, G, I, K, M och O från kolumner 1 till 21 (figur 2). Lägg till föreningar 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 och M till rader B, D, F, H, J, L, N och P från kolumner 1 till 21.
- Tillsätt 10 µL per brunn 2% DMSO till kolumner 22 och 24. Tillsätt 10 µL per brunn 25 µm 9 -cis-retinal till kolumn 23.
Obs: DMSO används som en kontroll av fordon eftersom alla föreningarna löses först i DMSO som lager. Kolumnen 22 innehållande DMSO behandlade celler uttrycker P23H rhodopsin används som 0% kontroll. 9 -Cis-retinal behandlade celler som uttrycker den P23H rhodopsin används som 100% kontroll.
- Täcka plattan med 384 brunnar med aluminiumfolie och inkubera plattan vid 37 ° C under 24 h.
4. immunfärgning utan membran vilket att färga Rhodopsin proteiner på cellytan.
Obs: Undvik alla rengöringsmedel i hela immunfärgning processen att hålla cellmembranet intakt.
- Förbered 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) genom att späda ut de 16% PFA med PBS i volymförhållandet 1:4 i kemiska dragskåp. Överföra de 4% PFA i en reagens reservoir.
- Ta ut plattan med 384 brunnar i ett mörkt rum med svagt rött ljus. Använda en 8-kanals hygienfilter ansluten till en vakuum samling flaska för att aspirera försiktigt medium. Använd en elektronisk flerkanalspipett för att Tillsätt 20 µL per brunn av nylagade 4% PFA till den hela plattan med 384 brunnar och inkubera i 20 min i rumstemperatur. För att undvika cell avlossning, alltid peka tips av Sugenheten på samma sida av varje brunn under ambitioner. Vid inte området mitten längst ned i varje brunn. När du tar bilder, markera fält att undvika regionen rörd av Sugenheten. För inkubationer längre än 10 min, täcka plattan med 384 brunnar med lock för att undvika avdunstning.
Obs: Celler är fasta i ett mörkt rum att undvika fotoblekning av den regenererade isorhodopsin som kommer att påverka resultatet av 100% kontroll. Efter fixering, kan plattan med 384 brunnar tas under normala ljus. - Använda en 8-kanals hygienfilter att aspirera på PFA i varje brunn och använda en elektronisk flerkanalig pipett för att tillsätt 50 μl per brunn PBS. Upprepa två gånger att utföra tre tvättar med PBS.
FÖRSIKTIGHET: Avfallet flytande innehållande PFA samlas i en förslutna flaskan och att kasseras som farliga kemiska avfall efter experimentet. - Blockera cellerna genom att lägga till 20 µL per brunn av 5% get serum den hela plattan med 384 brunnar och odla i rumstemperatur i 30 min.
- Aspirera 5% get serumet och Lägg till 15 µL per brunn 20 µg mL-1 B6-30 anti rhodopsin antikroppar i 1% get serum rader A till O. lägga 15 µL per brunn 1% get serum till rad P för sekundär antikropp-bara kontrollgruppen.
- Inkubera 384-väl plattan under 90 minuter i rumstemperatur eller vid 4 ° C över natten. Täcka 384-väl plattan med aluminiumfolie att undvika fotoblekning av fluorophores.
- Tvätta plattan 3 gånger med 50 µL per brunn PBS.
- Aspirera PBS och tillsätt 15 µL per brunn av 5 µg mL-1 Cy3-konjugerad get antimus IgG-antikropp. Täcka plattan med 384 brunnar med aluminiumfolie och inkubera i rumstemperatur i 1 h eller vid 4 ° C över natten.
- Tvätta plattan 3 gånger med 50 µL per brunn PBS. Tillsätt 50 µL per brunn PBS med 1 µg mL-1 Hoechst 33342 att färga kärnor i rumstemperatur i 15 min.
- Försegla 384-väl plattan med en genomskinlig film innan imaging. Täcka plattan med 384 brunnar med aluminiumfolie och förvaras vid 4 ° C i upp till en vecka om bilderna tas omedelbart.
5. imaging.
Obs: Denna hög-innehåll tänkbar procedur är anpassad till imaging system som förtecknas i Tabell av Material. Förfaranden kan vara olika om du använder andra hög-innehåll bildsystem.
- Ta bort locket och sätta plattan med 384 brunnar i hög-innehåll kameran med A1 placerad på det övre vänstra hörnet av plattan.
- Öppna programvaran bild förvärv att ställa in parametrar för bild förvärv.
- Öppna fönstret plattan förvärv och skapa ny inställning eller läsa in en befintlig setup-fil.
- Välj syftet 20 x och Ställ in pixel binning som 2 så kalibrerad pixelstorleken är 0,80 x 0,80 µm. Ange skanningslinjer som 2,000 och Bildstorlek (W x H) som 1,000 x 1,000 pixel (800.00 x 800.00 µm) per webbplats.
- Välj vilken tallrik att avbildas. Använda den information som tillhandahålls av tillverkaren av plattan med 384 brunnar för att fylla i plattan dimensioner.
- Välj brunnarna till avbildas för plattan med 384 brunnar.
- Välj fyra platser till avbildas per brunn. Undvika sidan av den väl rörd av aspiration tips.
- Välj excitation lasrar som 405, 488 och 561 nm. Välj utsläpp filter för DAPI, FITC och Texas röd kanaler. Optimera lasereffekten och vinster för varje kanal för att se till att ljusstyrkan för bilder tagna från de positiva kontrollbrunnarna är mindre än tröskelvärdet för mättnad.
- Välj väl-att-bra fokus för autofokus. Välj den första brunnen som förvärvats som inledande väl för att hitta prover. Ange webbplats autofokus till alla platser.
- Välj fyra medelvärden per rad för varje kanal. Optimera värdet för Z-förskjutning för varje kanal.
- Test 2-3 brunnar i diagonal hörnen av 384 väl plattan så att bilderna är i fokus för alla testade brunnar, bilder från alla webbplatser per brunn har celler med mer än 40% sammanflödet och fluorescens intensiteter av alla kanaler är ungefär hälften mättade i 100% kontrollbrunnar.
- Spara bilden förvärvsmetoden.
- Kör hela plattan. Titta på kameran tills den är klar att fånga bilder från den första kolumnen i plattan att dubbelkolla bildkvaliteten innan du lämnar kameran. Teckna plattan med 384 brunnar och förvaras vid 4 ° C för framtida bruk.
Obs: Beroende på antalet platser som markerat per väl och de kanaler som tagit, det tar 40 min-3 h att avsluta imaging en plattan med 384 brunnar.
6. bildanalys.
- Dra ut bilddata med en hög-innehåll bild analys programvara. Välj en av 100% kontrollbrunnarna (kolumn 23) att ställa in parametrar.
- Välj Flera våglängder Cell Scoring som analysmetoden och börjar konfigurera inställningar.
- Definiera atomkärnor med hjälp av bilder från kanalen DAPI. Förhandsgranska för att kontrollera att definierade atomkärnor formerna i den valda väl passar väl med kärnor bilder.
- Definiera formen på cellen i FITC kanalen där rhodopsin-Venus är avbildade.
- Definiera områdena rhodopsin cell surface fläcken i Texas röd kanal.
- Testa den nuvarande algoritmen i 5 brunnar att avgöra om inställningarna optimeras. Spara inställningarna och stänga fönstret konfiguration .
- Kör alla brunnarna med den optimera analysmetoden.
- Exportera Objektnummer som intakt cell nummer. Exportera Genomsnittliga intensitet av FITC kanalen som Rhodopsin-Venus intensitet (Rhodopsin-Venus INT). Exportera Genomsnittliga intensitet av Texas röd kanal som rhodopsin intensitet på cellytan (Rhodopsin INT på cellytan).
- Öppna den exporterade data i ett kalkylprogram. Dela upp rhodopsin intensiteten på cellytan av rhodopsin-Venus INT som baserat på MEM-till-summa. Beräkna Z'-faktorer för varje parameter att utvärdera analysens kvalitet. Z′ = 1−3X (STD100% kontroll+STD0% kontroll) / | Menar100% kontroll−Mean0% kontrollen|.
Obs: En Z'-faktor högre än 0 indikerar en måttlig analysen som är tillräcklig för en hög-innehåll-skärm och en Z' faktor mellan 0,5 och 1 antyder ett utestående test som krävs för en hög genomströmning skärmen20,21. - Använd programmet kalkylblad för att generera en tvåfärgad värmekarta för varje parameter. Ordna namn cellinjer på x-axeln och föreningarna som på y-axeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi kännetecknas rhodopsin transport med tre parametrar: rhodopsin-Venus intensiteten i hela cellen (Rhodopsin-Venus INT), immunfärgning intensiteten av rhodopsin på plasmamembranet (Rhodopsin INT på cellens yta), och förhållandet mellan rhodopsin fläcken på cellytan till rhodopsin-Venus intensitet i hela cellen (MEM-totalt Ratio). Representativa resultat av rhodopsin transport analysen visas i figur 3 och figur 4. Med hjälp av DMSO och 9 -cis-retinal behandlade celler som uttrycker P23H-rhodopsin-Venus som 0 och 100% kontroller, respektive, Z'-faktorer för dessa tre parametrar är i intervallet mellan 0 och 0,5, vilket tyder på att analysen har måttlig kvalitet, tillräckligt hög-innehåll imaging21. Även om den optimera Z'-faktorer är lägre än 0,5 på grund av dess relativt komplexa förfaranden jämfört med en HTS-analysen, denna analys är fortfarande robust och tillförlitlig för en image-baserad analys. En aktiv förening som räddar en felveckning rhodopsin bör visa högre värden av Rhodopsin INT på cellytan och MEM-totalt förhållande än DMSO, med ett P -värde lägre än 0,05. Tre 2-D värmekartor genererades från dessa tre parametrar att jämföra genomsnittliga rhodopsin belopp och lokalisering per cell (figur 4). Upprepas i exemplar, WT och sex rhodopsin mutanter listas horisontellt, och effekterna av sammansatta behandlingar jämförs vertikalt. Överens med tidigare studier, rhodopsin INT på cellytan och MEM-totalt förhållandet är lägre för sex mutanter jämfört med de WT rhodopsin behandlas med DMSO (figur 4 c)5,22,23. Rhodopsin INT på cellens yta och dess baserat på MEM-till-totalt ökar med 9 -cis-retinal behandling för T4R, P23H, D190N och P267L, men inte P53R eller C110Y mutanter, tyder på att 9 -cis-retinal räddar transport av T4R, P23H, D190N och P267L rhodopsin mutanter. Alla cps visade varierande nivåer av ökning i Rhodopsin INT på cellytan för T4R, P23H och D190N. CPS 3, 4, 5, 7, 8 och 11 ökat rhodopsin-Venus INT men inte MEM-till-totalt förhållandet mellan dessa rhodopsin mutanter, vilket tyder på att dessa föreningar bara ökat mängden rhodopsin. CPS 1, 2-6 och 9 ökat betydligt MEM-till-totalt förhållandet mellan T4R, P23H, D190N och P267L rhodopsin mutanter, vilket tyder på att dessa föreningar rädda transporten av dessa rhodopsin mutanter till plasmamembranet. 2D-profilerna ger en omfattande översikt av rhodopsin transporter påverkas av dessa adRP associerade mutationer som mildras av olika farmakologisk behandling.
Figur 1: arbetsflödet rhodopsin transport analysens. Förfaranden för cell surface färgning av rhodopsin utan membran vilket för rhodopsin transport analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: illustrationer för beredning av 5 x fungerande lösningar och flytande överföring från plattan med 96 brunnar till plattan med 384 brunnar. (A) plattan med 96 brunnar layouten av 5 x fungerande lösningar. Wells A1 till G2 har 300 µL per brunn på upp till 15 5 x fungerande lösningar och analyssubstratet (M) som illustreras i kolumnerna 1 och 2. Föreningar 14 och 15 är 2% DMSO och 25 µM 9 -cis-retinal, respektive, för att behandlingen ska de sju cellinjer som uttrycker WT och muterade rhodopsin. Dessutom kolumner 11 och 12 har 100 µL per brunn av 2% DMSO och 25 µM 9 -cis-retinal kontrollerar, respektive behandlas till de celler som uttrycker den P23H rhodopsin för beräkning av Z'-faktorer. (B) plattan med 384 brunnar layout för cellen villkor för typ och behandling. De U2OS-celler som uttrycker den WT T4R, P23H, P53R, C110Y, är D190N och P267L rhodopsin-Venus seedade som illustreras. Behandling villkor är märkta i blått. Rosa och blå tips visar väl-att-väl flytande överföring från plattan med 96 brunnar till 384 plattan med hjälp av en flerkanalspipett. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: representativa bilder och kvantifieringar av kontrollerna av rhodopsin transport analysens. (A) Venus fluorescens (grön) och cell surface immunfärgning (röd) av U2OS celler som uttrycker WT eller P23H rhodopsin-Venus behandlas med DMSO eller 5 µM 9 -cis-retinal. Skalstapeln = 200 µm. (B) A kolumn tomt på genomsnittlig Venus intensitet per cell som representerar rhodopsin i hela cellen (Rhodopsin-Venus INT). p< 0,0001. Z'-faktorn visas under den svarta linjen. Kolumnen värde och fel bar är medelvärde och standardavvikelse (SD) på 16 replikat, respektive. (C) A kolumn tomt menar Cy3 intensitet per cell som representerar den rhodopsin som målat på cellytan (Rhodopsin INT på cellytan). (D) en kolumn tomt förhållandet mellan genomsnittlig cy3 intensitet per cell att betyda Venus intensitet per cell som representerar förhållandet mellan rhodopsin nivå på cellytan till sin helhet-cell nivå (MEM-till-totalt ratio). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: en representativ hög-innehållsanalys rhodopsin transport analysens visas som 2-färg värmekartor. (A) värmekarta över menar Venus intensitet per cell som representerar hela-cell rhodopsin nivån (Rhodopsin-Venus INT). Varje block representerar en datapunkt och varje villkor testades i tre exemplar. Färg legenden visas till vänster. CP, sammansatta. (B) värmekarta över menar Cy3 intensitet per cell som representerar den rhodopsin som målat på cellytan (Rhodopsin INT på cellytan). (C) värme karta över medelvärdet Cy3 intensitet per cell till medelvärdet Venus intensitet per cell som representerar förhållandet mellan rhodopsin nivå på cellytan till sin helhet-cell nivå (MEM-till-totalt ratio). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här, visade vi en hög-innehåll imaging test används för att karakterisera träffar identifierade från en HTS. Den enda automationen inblandade i dessa protokoll är hög-innehåll kameran. De immunfärgning och fluorescens avbildning av rhodopsin har använts allmänt att karakterisera localizationen av rhodopsin5,14,15,16. Kvantifiering av bilder tagna av de traditionella avbildningsmetoder begränsas emellertid av bristen på tillräcklig cell bilder per skick, låg kapacitet bilder per experiment och avsaknaden av en kvalitetskontroll parameter. Vi anpassade traditionella immunfärgning protokollet till formatet 384-väl och ersatt den traditionella imaging med hög-innehåll imaging. Med denna hög-innehåll imaging protokollet, vi framgångsrikt valt och kännetecknas av hits som identifieras av en HTS11,13,17verksamhet. Jämfört med traditionella immunfärgning och avbildningsmetoder, ökat detta protokoll betydligt konsistens av imaging villkoren, imaging kapacitet och bild analys makt, som gjorde det möjligt för oss att kvantitativt jämföra de farmakologiska effekterna av 11 föreningar mot transport av sex adRP associerade rhodopsin mutanter.
De stora förändringarna i detta protokoll jämfört med de tidigare använda protokollen för rhodopsin immunfärgning och imaging är: (1) växer och immunfärgning celler i en tydlig-384-väl bottenplatta; (2) imaging celler som använder en hög-innehåll imager; och (3) analysera data med en hög-innehåll bild analys programvara. På grund av dessa förändringar krävs en initial optimering att hitta den bästa sådd mobilnummer, antikropp koncentrationer, imaging villkoren och bild analys algoritmer.
De kritiska steg i protokollet inkluderar: (1) sådd celler som tillåter 50-70% sammanflödet före fixering; (2) noggrann ambitioner att undvika cell avlossning; (2) imaging flera brunnar över hela plattan att kontrollera bilderna är på fokus och fluorescerar i alla kanaler överstiger inte hälften av tröskelvärdet på kameran för de positiva kontrollbrunnarna innan imaging hela plåten; och (3) hålla Z'-faktor högre än 0 att säkerställa tillförlitligheten i analysen.
De vanligaste problemen som kan uppkomma för detta protokoll är cell lösgörande och låg Z'-faktorer. För att undvika den första frågan, förbehandla 384-väl plattan med poly-L-lysin att underlätta cell fastsättning och undvika att använda cellinjer som kopplar loss enkelt såsom de Hek293 cellerna. Dessutom begränsa aspiration tipset att beröra endast ena sidan av varje brunn under aspiration och välj andra sidan av varje brunn för avbildning. Att förbättra Z'-faktor och analysens kvalitet, optimera cellen sådd nummer och bild analysparametrar att kontrollera att cellen formen eller kärnor form definieras av programvaran passar bra med varje objekt i varje fluorescens-kanal.
Jämfört med andra metoder för att kvantifiera rhodopsin transporter, till exempel en cell surface ELISA eller en β-galaktosidas fragment komplettering analys, som beräknar protein målnivån på cellytan i alla celler, kvantifierar denna hög-innehåll bildgivande metod genomsnittliga proteinnivå per cell; och den här unika funktionen undviker en kritisk variation faktor, mobilnummer som påverkar de slutliga utläsningar i andra metoder. Dessutom, på grund av det stora antalet celler avbildas och kvantifieras enligt metoden hög-innehåll imaging, parametrarna Medelvärde från alla celler per väl visade låg variation mellan replikat, således att lägga till analysens tillförlitlighet.
En begränsning i detta protokoll är att de inte är de bästa analyserna för HTS, på grund av dess relativt komplicerad procedur och 2 h per platta imaging tid. Således, vi rekommenderar alternativa reporter analyser för screening stora småmolekylär bibliotek med fler än 5 000 föreningar, och använda detta high-innehåll imaging protokoll för fokuserad karakterisering analyser begränsad till mindre än 100 föreningar. Den andra begränsningen av detta protokoll är dess brist på standarder att Visa huruvida Venus fluorescensen eller immunfärgning fluorescens stödnivåerna är en linjär korrelation med mängden rhodopsin protein belopp per cell. För att undvika mättnad av immunfärgning, rekommenderar vi testning och plottning immunfärgning stödnivåerna cellerna inkuberas med olika koncentrationer av primära och sekundära antikroppar. Välj de antikropp koncentrationerna inom det linjära området flourescens förändring.
Expanderande från det aktuella programmet, kommer vi kvantifiera rhodopsin transport från bilder av celler normalnivå transfekterade med 28 olika rhodopsin mutanter under behandling med upp till 10 föreningar att generera en farmakologisk databas av dessa föreningar' aktivitet för vägledning av potentiella behandlingar till adRP patienter bär dessa rhodopsin mutationer. Detta protokoll kan också enkelt anpassas till flyttning analyserna av någon membranprotein av intresse som kommer att vara användbart för drogen upptäckter av andra protein Skellefteåsjukan sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Mark E. Schurdak och University of Pittsburgh Drug Discovery Institute för att tillhandahålla hög-innehåll imager och inledande träningar. Dr. Krzysztof Palczewski (Case Western Reserve University) delade generöst 1 d 4 och B630 anti rhodopsin antikroppar. Plasmiden som innehåller cDNA för mus rhodopsin-Venus construct delades av Dr Nevin Lambert (Augusta University). Detta arbete stöddes av National Institute of Health grant EY024992 till YC och P30EY008098 från University of Pittsburgh Vision forskning Core grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| U2OS (rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (T4R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P23H-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P53R-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (C110Y-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (D190N-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| U2OS (P267L-rhodopsin-Venus) cells | NA | NA | Stable cells generated from U2OS cells |
| DMEM high glucose | Genesee Scientific | 25-500 | With L-Glutamine, sodium pyruvate |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16140071 | Heat inactivated |
| Plasmocin | InvivoGen | ant-mpt | Mycoplasma elimination reagent |
| Penicillin-Streptomycin (100X) | Gibco | 15140122 | 100X concentrated antibiotic solutions to prevent bacteria contamination of cell cultures |
| Trypsin-EDTA | Genesee Scientific | 25-510 | 0.25%, 1mM EDTA in HBSS without calcium and magnesium |
| Poly-L-lysine solution | Sigma-Aldrich | P4707-50ML | Mol wt 70,000-150,000, 0.01%, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
| CellCarrier-384 Ultra Microplates | PerkinElmer | 6057300 | 384-well tissue culutre-treated microplates with black well walls and an optically -clear cyclic olefin bottom for imaging cells in high content analysis |
| Sterile 96-well plate | Eppendorf | 30730119 | Tissue culture treated with lid flat bottom, sterile, free of detectable pyrogens, Rnase, DNase and DNA. Non-cytotoxic |
| Phosphate Buffered Sailine (PBS) | Invitrogen | AM9625 | 10 x PBS Buffer, pH 7.4 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D4540 | >99.5%, cell culture tested |
| 9-cis-retinal | Sigma-Aldrich | R5754 | |
| Compounds tested | Selleckchem/Life Chemicals/Custom synthesized | NA | Compounds were purchased from different vendors or custom synthesized |
| B6-30 anti-rhodopsin antibody | Novus | NBP2-25160 | Gift from Dr. Krzysztof Palczewski |
| Cy3-conjugated goat anti-mouse secondary antibody | Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc | 115-165-146 | |
| 16% paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 28908 | Methanol-free |
| 10% Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 50062Z | Blocking buffer |
| Hoechst 33342, Trihydroch | Invitrogen | H3570 | Nuclear staining solution |
| High-content imager | Molecular Devices | ImageXpress | ImageXpress® Micro Confocal High-Content Imaging System |
| MetaXpress high-content image acquisition and analysis software | Molecular Devices | MetaXpress | High-content image acquisition and analysis software |
| Multichannel pipette (0.5-10 µL) | Rainin | 17013802 | Manual 8-channel pipette, 0.5-10 µL |
| Multichannel pipette (0.5-10c | Rainin | 17013805 | Manual 8-channel pipette, 20-200 µL |
| Electronic multichannel pipette (10-200 μL) | Thermo Scientific | 14-3879-56BT | Electronic multichanenel pipette for 96- and 384-well microplate pipetting tasks |
| 50ml Reagent Reservoir | Genesee Scientific | 28-125 | Reagent reservior for multichannel pippte dispensing |
| 8-Channel aspirator | ABC Scientific | EV503 | 8-Channel stainless steel adaptor for aspirating liquids from 96- or 384-well plates |
| Excel spreadsheet software | Microsoft | Excel2016 | The spreadsheet software for data analysis and heatmap generation |
| Origin2018 scientific data analysis and graphing software | OriginLab | Origin2018 | The data analysis software for generating the dose response curves |
References
- Gregersen, N., Bross, P., Vang, S., Christensen, J. H.
- Daiger, S. P., Bowne, S. J., Sullivan, L. S. Perspective on genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Archives of Ophthalmology. 125 (2), 151-158 (2007).
- Daiger, S. P., Sullivan, L. S., Bowne, S. J. Genes and mutations causing retinitis pigmentosa. Clinical Genetics. 84 (2), 132-141 (2013).
- Stenson, P. D., et al. The Human Gene Mutation Database: towards a comprehensive repository of inherited mutation data for medical research, genetic diagnosis and next-generation sequencing studies. Human Genetics. 136 (6), 665-677 (2017).
- Sung, C. H., Schneider, B. G., Agarwal, N., Papermaster, D. S., Nathans, J. Functional heterogeneity of mutant rhodopsins responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (19), 8840-8844 (1991).
- Athanasiou, D., et al. The molecular and cellular basis of rhodopsin retinitis pigmentosa reveals potential strategies for therapy. Progress in Retinal and Eye Research. 62, 1-23 (2018).
- Chiang, W. C., et al. Robust Endoplasmic Reticulum-Associated Degradation of Rhodopsin Precedes Retinal Degeneration. Molecular Neurobiology. 52 (1), 679-695 (2015).
- Sakami, S., et al. Probing mechanisms of photoreceptor degeneration in a new mouse model of the common form of autosomal dominant retinitis pigmentosa due to P23H opsin mutations. Journal of Biological Chemistry. 286 (12), 10551-10567 (2011).
- Dryja, T. P., et al. Mutations within the rhodopsin gene in patients with autosomal dominant retinitis pigmentosa. New England Journal of Medicine. 323 (19), 1302-1307 (1990).
- Sohocki, M. M., et al. Prevalence of mutations causing retinitis pigmentosa and other inherited retinopathies. Human Mutation. 17 (1), 42-51 (2001).
- Chen, Y., et al. A novel small molecule chaperone of rod opsin and its potential therapy for retinal degeneration. Nature Communications. 9 (1), 1976 (2018).
- Chen, Y., Tang, H. High-throughput screening assays to identify small molecules preventing photoreceptor degeneration caused by the rhodopsin P23H mutation. Methods in Molecular Biology. 1271, 369-390 (2015).
- Chen, Y., et al. A High-Throughput Drug Screening Strategy for Detecting Rhodopsin P23H Mutant Rescue and Degradation. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (4), 2553-2567 (2015).
- Noorwez, S. M., et al. Pharmacological chaperone-mediated in vivo folding and stabilization of the P23H-opsin mutant associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Journal of Biological Chemistry. 278 (16), 14442-14450 (2003).
- Saliba, R. S., Munro, P. M., Luthert, P. J., Cheetham, M. E. The cellular fate of mutant rhodopsin: quality control, degradation and aggresome formation. Journal of Cell Science. 115, 2907-2918 (2002).
- Kaushal, S., Khorana, H. G. Structure and function in rhodopsin. 7. Point mutations associated with autosomal dominant retinitis pigmentosa. Biochemistry. 33 (20), 6121-6128 (1994).
- Chen, Y., Brooks, M. J., Gieser, L., Swaroop, A., Palczewski, K. Transcriptome profiling of NIH3T3 cell lines expressing opsin and the P23H opsin mutant identifies candidate drugs for the treatment of retinitis pigmentosa. Pharmacological Research. 115, 1-13 (2016).
- Adamus, G., et al. Anti-rhodopsin monoclonal antibodies of defined specificity: characterization and application. Vision Research. 31 (1), 17-31 (1991).
- Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (9), pdb prot5480 (2010).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Bray, M. A., Carpenter, A., et al. Advanced Assay Development Guidelines for Image-Based High Content Screening and Analysis. Assay Guidance Manual. Sittampalam, G. S., et al. , Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences. Bethesda (MD). (2004).
- Sung, C. H., Davenport, C. M., Nathans, J. Rhodopsin mutations responsible for autosomal dominant retinitis pigmentosa. Clustering of functional classes along the polypeptide chain. Journal of Biological Chemistry. 268 (35), 26645-26649 (1993).
- Krebs, M. P., et al. Molecular mechanisms of rhodopsin retinitis pigmentosa and the efficacy of pharmacological rescue. Journal of Molecular Biology. 395 (5), 1063-1078 (2010).
