Summary
Candida albicans 의 효율적인 게놈 엔지니어링 pathogenesis 및 치료제의 개발을 이해 하는 데 중요 하다. 여기, 우리는 신속 하 고 정확 하 게 편집 C. albicans 게놈 CRISPR를 사용 하 여 프로토콜을 설명. 프로토콜에는 다양 한 유전 수정 점 돌연변이, 삽입, 삭제 등을 소개 하는 조사 수 있습니다.
Abstract
이 메서드는 2 중 인간 곰 팡이 병원 체의 효율적인 CRISPR 중재 게놈 편집에 대해 설명 합니다 Candida albicans. Cas9, 요구 한다 CRISPR 중재 게놈 C. albicans 에서 편집 RNA, 안내 및 서식 파일을 복구. 플라스 미드 표현 하는 효 모 코 돈 최적화 Cas9 (CaCas9)가 생성 되었습니다. 시퀀스를 안내는 팸에서 직접 본 사이트 (NGG) Cas9 식 벡터에 복제 됩니다. 복구 서식 파일 다음 뇌관 연장에서 시험관에의해 이루어집니다. C. albicans 에 복구 템플릿 및 벡터의 cotransformation 게놈 편집 이끌어 낸다. 사용 된 복구 서식 파일에 따라 조사 뉴클레오티드 변경, 삽입 또는 삭제를 발생할 수 있습니다. C. albicans 는 2 중으로 변이 만들어집니다, 유전자의 두 대립 유전자에는 A 및 B 대립 유전자에 Snp를 대상으로 가이드와 함께 방해 또는 복구 템플릿 법인 항구 하지 않습니다. 모든 가족 구성원에 적합 한 보존된 시퀀스 있으면 소스의 유전자 가족 동시에 편집할 수 있습니다. C. albicans CRISPR 시스템 설명 FRT 사이트에 의해 형벌 이다 고 flippase를 인코딩합니다. Flippase의 유도 따라 항생제 마커 (CaCas9) 및 가이드 RNA 게놈에서 제거 됩니다. 게놈을 연속을 편집을 수행 하기 위해 탐정 수 있습니다. C. albicans CRISPR 강력한 곰 팡이 유전 공학 도구 이며 사소한 변경 설명된 프로토콜에 다른 균 종 등 C. glabrata, N. castellii, S. cerevisiae의 수정을 허용 합니다.
Introduction
Candida albicans 는 가장 널리 퍼진 인간 곰 팡이 병원 체1,2,3. C. albicans 및 포유류 분자 생물학의 이해 차이 항진균 치료제의 다음 세대의 개발에 매우 중요 하다. 신속 하 고 정확 하 게 유전자 조작 C. albicans수를 조사 해야 합니다.
C. albicans 의 유전자 조작 역사적으로 도전 하고있다. C. albicans 플라스 미드를 유지 하지 않습니다, 그리고 따라서 모든 구조는 게놈으로 통합 되어야 합니다. 또한, C. albicans 는 2 중; 따라서, 유전자 밖으로 노크 하거나 소개 하는 돌연변이, 그것 중요 한 경우 되도록 복사본 모두 변경된4되었습니다. 또한, 일부 C. albicans loci heterozygous, 더 복잡 한 유전 심문5있습니다. C. albicans유전자 조작 동종 재결합6의 여러 라운드를 수행 하는 일반적입니다. 그러나, 게놈 및 힘 드는 구조 개발의 2 중 특성이 만들었습니다이 잠재적으로 지루한 과정을, 특히 여러 변경이 필요한 경우. 이러한 제한 및 C. albicans 의 의학 중요성 조사 C. albicans 게놈 보다 쉽게 조작할 수 있도록 새로운 기술 개발을 요구 한다.
정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR) 클러스터-중재 게놈 편집 연구자는 게놈의 순서를 변경할 수 있는 강력한 도구입니다. CRISPR 세 가지 구성 요소가 필요 합니다: 대상 DNA 앞 1) Cas9 nuclease 2) 20 시퀀스, 관심의 대상으로 Cas9 가이드 RNA를 기반 및 3) 복구 템플릿 DNA 분열 사이트를 복구 하 고 만들어진된 변경7, 통합 하는 8. 일단 가이드 제공 대상 게놈 시퀀스 Cas9, Cas9 protospacer 인접 한 모티브 (PAM) 시퀀스 (NGG) 필요 직접 DNA9다니엘 가이드 시퀀스의 업스트림. 모두 20 기본 가이드 및 팸 시퀀스 특이성을 표적으로 하기의 높은 학위를 제공 하 고 제한 대상에서 분열.
CRISPR 시스템은 다양 한 생물의 게놈 편집과 다양 한 문제10태 클을 설계 되었습니다. 여기에 설명 된 관심사의 C. albicans 유전자를 편집 하기 위해 유연 하 고 효율적인 CRISPR 프로토콜이입니다. 실험 번역 종료를 일으키는 원인이 되는 유전자를 정지 codon를 소개 합니다. 다른 편집 도입 수리 템플릿에 따라 만들 수 있습니다. 조각 nourseothricin (Natr)로 표시 된 효 모에 포함 된 코 돈 최적화 된 Cas9 (CaCas9)과 가이드 RNA 중립 사이트에서 C. albicans 게놈으로 통합 됩니다. Cotransformation 복구 서식 파일 인코딩을 원하는 돌연변이와 동종 재결합 하 고 효율적인 게놈 편집 분열의 복구 이끌어 낸다. 아래에서 설명 하는 것은 TPK2, 하지만 모든 C. albicans 오픈 프레임 대상으로 지정할 수 여러 번 CRISPR에 의해 읽기의 편집 이다. CRISPR 시스템 FRT 사이트에 의해 형벌 이다 고 flippase CaCas9 식 플라스 미드에 인코딩된의 유도 의해 C. albicans 게놈에서 제거할 수 있습니다. C. albicans CRISPR 시스템에는 정확 하 고 빠르게 편집 C. albicans 게놈11,12조사 수 있습니다.
Protocol
1. 식별 및 가이드 RNA 시퀀스의 복제
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가이드 RNA 시퀀스의 식별
- 5'-NGG-3 식별 ' 정지 codon 삽입 되는 위치에 가까운 팸 시퀀스. (그림 1A) 표시 된 팸 시퀀스 모두에서 발견 된다 TPK2 (그림 1A)의 처음 100 기본적인 쌍.
참고: Http://osf.io/ARDTX 11,12각 C. albicans 열려있는 독서 프레임을 대상으로 하는 가이드 시퀀스를 찾을 수 있습니다. - 20 있을 것입니다 앞으로 가이드 Primer_3 시퀀스 식별 기지 직접 상류 NGG 팸의 사이트 및 5 개 이상 포함 되지 것입니다 연속에서 Ts. 직접 기초에 왼쪽 상류 끌어서 NGG의 커서 20 기초, 다음 추가 뇌관 뇌관 탭에 클릭.
- 앞으로 가이드 시퀀스에 보완 될 것입니다 반대로 가이드 Primer_3 시퀀스를 식별 합니다.
참고: PAM_3를 사용 하는 가이드는 표시 (그림 1B). - 뇌관을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 고 "뇌관 데이터 복사" 선택 합니다. 텍스트 편집 프로그램에는 시퀀스를 붙여 넣습니다.
- 5'-NGG-3 식별 ' 정지 codon 삽입 되는 위치에 가까운 팸 시퀀스. (그림 1A) 표시 된 팸 시퀀스 모두에서 발견 된다 TPK2 (그림 1A)의 처음 100 기본적인 쌍.
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(표 1, 그림 1B) 복제를 촉진 하기 위하여 앞으로 반전 가이드 oligos에 걸리다 시퀀스를 추가 합니다.
- 구입 하기 전에 앞으로 가이드 Primer_3의 5' 끝에 뉴클레오티드 순서 ATTTG를 추가 합니다.
- 구입 하기 전에 앞으로 가이드 Primer_3의 3' 끝에 G를 추가 합니다.
- 구입 하기 전에 반전 가이드 Primer_3의 5' 끝에 뉴클레오티드 순서 AAAAC를 추가 합니다.
- 구입 하기 전에 반전 가이드 Primer_3의 3' 끝에 C를 추가 합니다.
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BsmBI와 다이제스트 CaCas9 식 벡터 pV1524입니다.
참고: pV1524 포함는 암 피 실린 (앰프r)과 nourseothricin (Natr). Cas9 C. albicans코 돈 최적화 되었습니다.- 추가 하 여 플라스 미드를 소화: pv1524, 버퍼 x 10의 5 μ, BsmBI, 그리고 H의 1 μ의 2 μ g을 1.5 mL 튜브에 50 μ2O. 20 분 55 ° C에서 품 어 (또는, pv1524 Esp3I, 37 ° c.에 BsmBI의 isoschizomer와 함께 15 분 소화)
- 실내 온도 (RT) 고 스핀 30에 대 한 튜브의 하단에 응축을가지고 2,348 x g 에서 s. 1.4 단계로 진행 또는-20 ° c.에 소화 플라스 미드를 저장
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인산 가수분해 효소 소화 등뼈를 취급 합니다.
- 종 아리 장 인산 가수분해 효소 (CIP)의 1 μ 소화 혼합물에 추가 하 고 1 시간 동안 37 ° C에서 품 어.
- 상업적으로 사용할 수 있는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 정화 키트 (키트와 함께 제공 하는 지침)를 사용 하 여 소화 플라스 미드 정화 하 고 차입 버퍼 (EB)의 30 μ에 elute.
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Phosphorylate 고 anneal 가이드 Primer_3 앞으로 반전 가이드 Primer_3.
- 추가 앞으로 100 μ M의 0.5 μ 가이드 Primer_3, 100 μ M의 0.5 μ 가이드 Primer_3 역, 10 x T4 리가 버퍼의 5 μ, T4 polynucleotide 키의 1 μ 및 H2O를 PCR 튜브의 43 μ.
- 두 번째 PCR 튜브에서 10 x T4 리가 버퍼의 5 μ, T4 polynucleotide 키의 1 μ 그리고 분자 생물학 급 H2O의 44 μ를 추가 합니다.
참고: 이 부정적인 제어 될 것입니다. - 다음 5 분 동안 95 ° C에서 30 분 동안 37 ° C에서 thermocycler에서 반응 혼합물을 품 어.
- Anneal에 16 ° C에 느린 경사로 속도에 혼합물을 냉각, oligos. 다음 4 ° c.에 단련 된 oligo 혼합물을 놓습니다
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1.4.3 단계에서 소화 pv1524로 단련된 oligos를 선.
- PCR 튜브에 다음을 추가: 10 x T4 리가 버퍼, T4 DNA 리가의 0.5 μ, 단련된 올리고 믹스의 0.5 μ 1 μ CIP 처리 소화 플라스 미드 (20-40 ng) 및 H2O 10 μ 총 볼륨을 정화.
- PCR 튜브에 다음을 추가: 10 x T4 리가 버퍼, T4 DNA 리가의 0.5 μ의 1 μ 소화 CIP 처리 정화 벡터 (20-40 ng), 부정적인 컨트롤 혼합, 그리고 H2O 10 μ 총 볼륨 최대의 1 μ.
- 다음 10 분 동안 65 ° C에서 30 분, 16 ° C에서 thermocycler 두 튜브를 품 어 다음 25 ° c에 냉각
- 결 찰 혼합물의 5 μ를 화학적으로 유능한 병원 성 대장균 DH5α 표준 열 충격 변환 프로토콜을 사용 하 여 변환 합니다. LB 앰프/Nat 미디어 (200 μ g/mL 앰프, 50 μ g/mL Nat) 선택 합니다.
참고: PV1524와 더블 선택 미디어에 파생 상품 선택 실패 Nat/CaCas9/가이드 모듈의 손실 FLP/FRT 절단 박테리아에 의해 발생 합니다. - Miniprep에 의해 4 개의 transformants에서 플라스 미드를 정화 하 고 시퀀싱 뇌관 (표 1) 삽입 시퀀스를 시퀀스.
참고: 4 transformants를 시퀀싱 하는 시간의 대부분 적어도 1 정확한 복제를 식별 하기 위해 충분 하다. - 잘라-20 ° c.에 사이트 BsmBI에 한 번 복제 가이드 RNA 순서 있는 플라스 미드를 저장
2. 설계 및 수리 서식 파일의 생성
- 유전자 시퀀스에 정지 codon 및 제한 소화 사이트 (그림 1C표 1) 인코딩 뉴클레오티드를 추가 하 여 정지 codon를 삽입 합니다.
참고: 삽입 팸 시퀀스를 중단 됩니다.
참고: 제한 소화 사이트 클론 (그림 1C)의 효율적인 심사를 용이 하 게 복구 템플릿 순서로 포함 됩니다. - 10 돌연변이 만들 수의 하류 기초 끌어서 커서 60 기초 상류 왼쪽 클릭 하십시오. 추가 뇌관 뇌관 탭에서 왼쪽 클릭 하십시오. 이 복구 템플릿 Forward_3을 추가 합니다. 10 돌연변이 만들 수의 상류 기초 끌어서 커서 60 기초 하류 왼쪽 클릭 하십시오. 추가 뇌관 뇌관 탭에서 왼쪽 클릭 하십시오. 복구 템플릿 리버스 3 추가 됩니다. (그림 1C)
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뇌관 연장 수리 서식 파일 생성을 수행 합니다.
- 100 μ m 복구 템플릿 앞으로 뇌관, 100 μ m 복구 템플릿 리버스 뇌관의 1.2 μ, deoxynucleotide 된 (dNTPs)의 6 μ의 1.2 μ 추가 (총 농도 40 m m), 6 버퍼, Taq 중 합 효소 (3 단위)의 0.6 μ H2O 4 PCR의 각각의 45 μ의 μ 튜브입니다.
- 뇌관 연장 PCR의 20과 30 라운드 사이의 실행을 수행 합니다. 예제 확장 조건: 95 ° C에서 2 분 (30 s 95 ° C, 50 ° C, 68 ° C에서 1 분에 1 분에서) x 34, 68 ° c.에서 10 분
- 1.5 mL 튜브에 모든 4 PCR 튜브의 내용을 결합 하 고 PCR 정화 키트를 사용 하 여 H2o.의 50 μ에서 제품을 정화
- 뇌관 연장 제품 260에서 흡 광도 결정 하 여 충분 한 DNA를 확인을 quantitate nm.
참고: 뇌관 연장 제품의 전형적인 마지막 농도 ~ 200-300 ng / µ L.
3. C. albicans 복구 템플릿 및 플라스 미드의 변화
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테/리튬 아세테이트를 확인 합니다.
- 믹스 10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, 100 m m 리튬 아세테이트, 그리고 H2O (모든 재고 솔루션 pH 7.5) 50 mL 전체 볼륨을 달성 하기 위해.
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플레이트 만들기
- 믹스 40% 말뚝 3350, 100 m m 리튬 아세테이트, 10 mM Tris Cl, 1 mM EDTA, H2O (모든 재고 솔루션 pH 7.5) 50 mL 전체 볼륨을 달성 하기 위해.
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소화 단계 1.9에서에서 올바르게 복제는 플라스 미드.
- 플라스 미드, 10 x 버퍼의 4 µ L, 10 mg/mL 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 0.4 µ L의 10 μ g, 0.5 µ L KpnI의, SacI의 0.5 µ L 및 H20 ~ 40 µ L 총 1.5 mL 튜브에 볼륨. 37 ° C에서 하룻밤 (그림 1D) 품 어.
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C. albicans SC5314, 야생-타입 prototroph OD600 6 미만 이상적으로 0.27 m m Uridine (YPD + Uri), 보충 효 모 펩 포도 당에서 25 ° C에서의 숙박 문화를 성장.
- 2,348 x g 에 5 분 동안 회전 하 여 5 세600 단위 변환 당 세포의 작은 고 5 세600 100 µ L 테/리튬 아세테이트에 수송과 셀의 중단.
- 나열 된 순서로 1.5 mL 튜브에 다음을 추가: 단계 3.4.1, 삶은 고 빠른 냉각 연어 정자 DNA (10mg/mL), 플라스 미드 소화 단계의 3.3.1, 순화 된 복구 서식 4) 6 µ g의 3) 10 µ g의 2) 40 µ L에서에서 세포의 1) 100 µ L 및 5) 접시의 1 mL.
- 나열 된 순서로 1.5 mL 튜브에 다음을 추가: 셀의 1) 100 µ L, 삶은 고 빠른 냉각 연어 정자 DNA (10mg/mL), 3) H2O 볼륨 단계 3.5 판의 4) 1 mL에서 DNA 변형의 동등의 2) 40 µ L.
참고:이 부정적인 제어 될 것입니다. - Pipetting으로 변환을 부드럽게 혼합 하 고 하룻밤 25 ° C에서 품 어 보자.
- 열 44 ° C 물 목욕 25 분에 배치 하 여 세포를 충격.
- 벤치탑 원심 분리기에서 2,348 x g 에 5 분 동안 회전 시키십시오 하 고 표면에 뜨는 접시 혼합물을 제거 합니다. 2,348 x g에서 YPD + Uri와 다시 5 분 동안 원심 분리기의 1 mL을 추가 하 여 한 번 세척.
- 0.1 ml YPD + Uri의 세포를 중단 하 고 하룻밤 롤러 드럼 또는 25 ° C에서 셰이 커에 품 어.
- 플레이트와 200 μ g/mL nourseothricin YPD + Uri에. 식민지는 2-5 일에 표시 됩니다.
4입니다. 단일 식민지를 위한 줄무늬
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분기에는 100 x 15 mm 페 트리 접시를 분할 하 고 각 사분면을 라벨.
- 사분면의 긴 측면에 걸쳐 메 마른이 쑤 시 게 또는 주걱와 행진 변환 접시에서 식민지 중 하나를 터치 합니다.
- 무 균 기술을 사용 하 여 단일 식민지를 위한 streak 고 30 ° C에서 2 일 동안 성장 식민지.
5입니다. 식민지 PCR
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앞으로 체크 뇌관 (FCP) ~ 200 기지 상류의 쌍 도입 된 제한 사이트 및 역방향 체크 뇌관 (RCP) ~ 300 자료 쌍 하류 디자인.
- FCP, RCP, 내 중 합 효소 (ExTaq 1.5 단위)의 0.3 μ, dNTPs의 3 μ의 0.3 μ의 0.3 μ 추가 (총 농도 40 m m), 3 ExTaq 버퍼, 그리고 H2O 1.5 mL 튜브에의 23 μ의 μ.
참고: 0.5 μ/반응 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 추가 PCR 효율을 개선할 수 있습니다. - 4.1.2 단계에서 단계 5.1.1, P10 피 펫 팁을 사용 하 고는 agar를 방해 하지 않도록 주의 복용에서 혼합물 단일 효 모 식민지의 0.25 μ를 추가 합니다.
- PCR에 의하여 DNA를 증폭 하 고 증폭 성공, 튜브의 아래쪽에 셀 펠 렛을 방해 하지 않도록 주의 복용 되도록 젤에 PCR의 5 μ를 실행 합니다.
- FCP, RCP, 내 중 합 효소 (ExTaq 1.5 단위)의 0.3 μ, dNTPs의 3 μ의 0.3 μ의 0.3 μ 추가 (총 농도 40 m m), 3 ExTaq 버퍼, 그리고 H2O 1.5 mL 튜브에의 23 μ의 μ.
6. 식민지 PCR의 제한 소화
- 추가 10 μ의 PCR 제품 (튜브의 아래쪽에 셀 펠 렛을 방해 하지 않기로 돌), 버퍼의 3 μ, 제한 효소, 1 μ H2O, 16 μ 그리고 제조업체의 지침에 따라 품 어 리를 식별 하는 agarose 젤에 해결 ct 게놈 편집입니다.
참고: 여기에서 사용 하는 제한 효소 TPK2 특정 복구 서식 파일에 인코딩 하는 사이트입니다.
7. 종자 저장
- 성장 제한 소화 YPD + Uri에서 30 ° c.에 의해 확인 된 식민지에서 숙박 문화
- 스토리지-80 ° c.에 대 한 적합 한 튜브를 1 mL의 문화 및 (글리세롤의 최종 농도 25%를 데리고) 50% 글리세롤의 1 mL을 추가
- -80 ° c.에 정확한 복제품을 저장하시오
참고: 올바른 종자 몇 년 동안-80 ° C에 저장할 수 있습니다.
8. Natr 마커 제거
- 효 모 펩 糖 (YPMaltose)에 올바른 transformant 행진 (2% 糖).
- 질주 된 접시에서 식민지를 선택 하 고 액체 YPMaltose 20 g/L 맥 아당에서 30 ° C에서 48 h에 대 한 효 모 문화.
- YPMaltose 20 g/L 맥 아당에 200-400 셀 접시 하 고 24 시간에 30 ° C에서 품 어.
- YPMaltose 및 YPMaltose 200 μ g/mL 자연과학에 접시를 복제
- 24 h 30 ° C에서 품 어.
참고: 더 이상 YPMaltose 200 μ g/mL nourseothricin에 성장 하지만 YPMaltose에 성장 식민지 Natr 마커 (CaCAS9)을 잃 었 하 고 RNA를 안내 합니다. - Natr 마커 (CaCAS9) 및 가이드 RNA 7.1-7.3 단계에서 다 잃은 긴장을 저장 합니다.
참고: 유사한 플라스 미드, pV1393, SAP2 MAL2 promotor 반대로 사용합니다. YCB-BSA에 성장 pV1393 유전자 편집에 사용 되는 경우 flippase 및 Natr 의 제거를 유발 한다.
Representative Results
시퀀스의 가이드 C. albicans TPK2, 대상 복구 서식 파일 및 RNAs c 앰프 니 촉매 소 단위, 위에 제안한 지침에 따라 설계 되었습니다. 시퀀스 (표 1, 그림 1)에 표시 됩니다. 가이드 RNAs CaCas9 식 벡터에 복제 되었고 야생-타입 C. albicans서식 파일 복구 cotransformed. 에코리 제한 소화 사이트 복구 서식 파일에서 정지 codons 팸 사이트 중단 및 올바른 돌연변이 (그림 1)에 대 한 심사를 용이 하 게. Transformants 단일 식민지를 위한 줄무늬 그리고 복구 템플릿 (그림 2)의 설립에 대 한 식민지 PCR 및 제한 소화에 의해 상영. 제한 소화는 신속 하 게 돌연변이 시퀀스에서 야생-타입을 구분합니다.
| Oligonucleotide 이름 | Oligonucleotide 시퀀스 |
| 앞으로 가이드 Primer_3 | ATTTGgggtgaactatttgttcgccG |
| 역 가이드 Primer_3 | AAAACggcgaacaaatagttcacccC |
| 복구 템플릿 Forward_3 | tcagcaatatcagcaacaatttcaacaaccgcagcaacaactttatTAAGAATTCggcga |
| 복구 템플릿 Reverse_3 | attttgtccagtttgggctgcagcagggtgaactatttgttcgccGAATTCTTAataaag |
| 앞으로 체크 뇌관 | ttaaagaaacttcacatcaccaag |
| 역방향 확인 뇌관 | actttgatagcataatatctaccat |
| 시퀀싱 뇌관 | ggcatagctgaaacttcggccc |
표 1:이 연구에 사용 하는 올리고 뉴클레오티드의 목록. 사이트 목적 복제에 대 한 추가 대문자로 하 고 가이드 뇌관에 굵게 시퀀스. 게놈 DNA를 변형 복구 서식 파일에서 시퀀스는 대문자로 하 고 굵게.
그림 1 : 가이드 RNA 및 복구 템플릿 디자인의 다이어그램. (A)의 TPK2의 처음 100 개의 뉴클레오티드의 모든 PAM 시퀀스 표시. 이 연구에서 사용 하는 순서는 팸 시퀀스 3 (PAM_3) 강조 표시 됩니다. (B) 가이드 RNA PAM_3를 사용 하 여 디자인 합니다. SnapGene를 사용 하 여 디자인의 기본 뇌관 20 개는 소문자 파란색입니다. 복제에 필요한 추가 기지 오프셋 표시와 녹색 있습니다. (C) 수리 TAA 정지 codon 및 에코리 사이트 템플릿 뇌관 TPK2 독서 프레임에 삽입 됩니다. 야생-타입 시퀀스와 다른 DNA는 빨간색과 대문자. (D) 예 방법 가이드는 PAM_4를 사용 하 여 DNA의 긍정적인 물가에 설계 되었습니다. (E) 가이드 RNA와 KpnI와 SacI 소화의 복제 후 pV1524의 회로도. Neut5L-5'-Neut5L-3' C. albicans 게놈에 있는 Neut5L 사이트에 벡터를 대상. CaENO1p promotor를 누 룩에 최적화 된 CaCas9의 표현 이다. Natr nourseothricin 저항 카세트입니다. CaSNR52p promotor 운전 가이드 RNA 식 (sgRNA) 이다. FRT 사이트 죽 습 고 flippase (FLP) flippase 식 시 CRISPR 카세트를 제거 하 여 재결합. 회로도 (E)와 유사한 Vyas 외에 의해 출판 되었다. 11. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 소개 및 정지 codon 그리고 에코리 제한 사이트 TPK2를 확인. 뇌관 증폭에 사용 되는 표 1에 나열 됩니다. 야생-타입 및 돌연변이 시퀀스 젤 아래 표시 됩니다. 이 그림은 Vyas 외.11에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 삭제 (A) 및 (B) 삽입 생성 복구 템플릿 설명 만화. 회색 (A)에 대시 묘사 중간 시퀀스 복구 템플릿 뇌관에는 없음. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
C. albicans CRISPR C. albicans 게놈에 효율적으로 편집합니다. pV1524 인코딩 효 모 코 돈 최적화 Cas9 하 고 조사 쉽게 CaSNR52 발기인 (그림 1)11의 하류 가이드 RNA 시퀀스를 복제할 수 있다 그런 설계 되었습니다. 그것은 그 가이드 시퀀스의 단일 복사본만 복제 되었습니다 CaCas9 식 벡터에 시퀀싱에 의해 여분의 사본 게놈 편집 방해 것으로 보장 해야 합니다. 가이드의 여러 복사본을 지속적으로 도입 하는 경우 한 결 찰에 사용 된 단련된 가이드의 농도가 낮은 해야 합니다. 벡터 및 프로토콜 설명 어떤 C. albicans 유전자의 수 있습니다. C. albicans 는 2 중만 단일 변환은 유전자의 두 대립 유전자를 대상으로 필요 합니다. 또한, CRISPR-CaCas9 게놈 편집의 processive 자연 유전자 가족의 여러 구성원을 대상으로 연구를 수 있습니다. 분 비 aspartyl 프로 테아 제 (얼 간) 및 agglutinin와 같은 시퀀스 단백질 (ALS) 등 많은 유전자 가족은 C. albicans 독성에 대 한 중요 합니다. CRISPR를 편집 하는 게놈이 유전자 가족의 조사를 촉진할 것 이다.
위에서 설명한 프로토콜 null (그림 2)에 해당 하는 phenotypic 결과 열려있는 독서 프레임 정지 codon를 소개 합니다. 다양 한 유전 교대 복구 서식 파일을 변경 하 여 만들 수 있습니다. 넌센스, missense, 및 침묵 돌연변이 재결합 적절 한 수리 템플릿을 통해 삽입할 수 있습니다. 제한 사이트의 합리화 transformant 심사로 그 없이12,13시퀀싱 하 여 검사 해야 합니다. 또한, C. albicans CRISPR 선호도 태그를 삽입 하 고 promotor 스왑, 수행 하 고, 녹아웃 (그림 3)를 생성 하는 이상적인 시스템을 만드는 연구자를 삽입 및 삭제, 생성에 있습니다. 이 돌연변이 대 한 올바른 transformants에 대 한 심사 복구 서식 파일의 올바른 결합을 확인 하는 편집을 시퀀싱 하는 데 필요한 만큼 더 힘 드는입니다. 또한, 남부 오 유전자의 복사본을 추가로 게놈에 추가 위치에 삽입 되지 않습니다 보장 하기 위해 필요할 수 있습니다. NGG 팸 사이트의 요구 사항을 대상으로 지정할 수 있는 게놈의 지역에 약간의 제한 배치 합니다. 대체 nucleases Cpf1 등을 사용 하는 대체 CRISPR 시스템의 개발 또는 유사 시스템 가지고/지 Cas9에 많은 이러한 제한14경감. 이 이번에 수 사관의 지식, 이러한 시스템 하지 아직 적용 되었을 C. albicans에.
그런 종 Saccharomyces cerevisiae, 인간의 병원 체 Candida glabrata11, Naumouozyma castellii, 등의 다양 한 적용 될 수 있습니다 위의 프로토콜에서 설명 하는 CRISPR 시스템 개발 되었습니다. . 변환 및 효율적인 편집이 효 설명된 프로토콜에 약간의 변화를 필요 하지만 이러한 대체 게놈을 편집 하기 위해 프레임 워크는 C. albicans12에 대 한 설명에 비슷해. 또한, 효 모 게놈 편집 하는 절차를 개발 하는 우수한 메커니즘을 제공 합니다. 효 모, ADE2 돌연변이 때 아데닌 생 합성 통로에 전조 축적, 붉은 세포를 선회. 이 쉽게 관찰 표현 형 조사가 편집된 셀을 식별 하 고 신속 하 게 게놈 프로토콜 편집을 문제 해결을 수 있습니다. 버섯에 사용할 수 있는 광범위 한 분자 생물학 도구 상자와 함께, 수많은 효 모 종 편집에 대 한 프로토콜 개발된15,16되었습니다. 곰 팡이에 게놈 편집 기술의 광범위 한 응용 프로그램 다양 한 과학 분야에 큰 영향을 미칠 가능성이 있다.
CRISPR는 크게 C. albicans에 게놈 엔지니어링의 효율성 개선 하지만 CRISPR까지 사용 되지 않은 C. albicans의 게놈 넓은 스크린을 수행 하. C. albicans 에 통로 합류 nonhomologous 끝은 비효율적인12현재 프로토콜 변이 소개 하는 수리 서식 파일이 필요 합니다. 모든 유전자에 대 한 복구 템플릿 oligos의 세대는 게놈 넓은 스크린의 실행에 상당한 장벽이 다. DNA 합성 및 CRISPR 기술 발전의 감소 비용의 합류 더 실현 가능한 삭제 라이브러리의 개발을 하게된다. 예를 들어, CaCas9 벡터에서 복구 서식 파일의 표현 대상으로 모든 유전자11지속 가능한 플라스 미드 라이브러리의 개발에 대 한 방법을 포장 한다. 또한, CaCas9 식 벡터 C. albicans 게놈으로 통합을 요구 하지 않는 과도 Candida CRISPR 프로토콜 개발된17되었습니다. 또한, 증가 효율18편집 가이드 식 증가 게놈. 이들은, 그리고 CRISPR 기술, 다른 진보는 C. albicans19,20,,2122게놈 넓은 스크린의 발전에 중요 한.
C. albicans 게놈은 2 중, A 및 B 대립 유전자는 항상 동일한5. 이러한 heterozygosity 모두 도전과 기회를 제공합니다. 만약 한 두 대립 유전자를 대상 하는 것을 목표로, 팸 사이트, 가이드 시퀀스, 및 유전자의 두 복사본에 행동 한다 복구 서식 파일을 사용 해야 합니다. 그러나, C.albicans CRISPR 시스템 단일 대립 유전자를 대상으로 조사 수 있습니다 단 하나 뉴클레오티드 동 질 다 상 유전자에 존재에 따라. 이러한 정밀 검사 대립 유전자 사이의 기능적 차이를 조사 수 있도록 가능성이 있다. 특정 대립 유전자를 대상으로 수행 되어야 합니다 신중 하 게, 손실 heterozygosity (LOH) 대립 유전자 또는 전체 염색체의 관찰 되었습니다. 단일 C. albicans 편집할 때 대립 유전자, 하나의 클론은 2 중 SNP 프로필을 유지 하는 경우 확인 하려면 인접 한 DNA 시퀀스를 검사 해야 합니다. 또한, 오프 대상 효과 C. albicans CRISPR에 대 한 매우 낮은 하지만 전체 게놈 시퀀싱 주요 변종에 대 한 간주 될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
저자는 독서에 대 한 박사 Gennifer Mager 감사 및 원고에 대 한 유용한 의견. 이 작품 볼 주립 대학교 실험실 시작 자금 및 NIH-1R15AI130950-01 D.A.B.에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agar | BD Bacto | 214010 | |
| agarose | amresco | 0710-500G | |
| Ampicillan | Sigma-Aldrich | A9518 | |
| Bacto Peptone | BD Bacto | 211677 | |
| Bsmb1 | New England Biolabs | R0580L | |
| Calf intestinal phosphatase (CIP) | New England Biolabs | M0290L | |
| Cut Smart Buffer | New England Biolabs | B7204S | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| dNTPs | New England Biolabs | N0447L | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | 3609 | |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 2810000ACS | |
| Glucose | BDH VWR analytical | BDH9230 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 49767 | |
| Kpn1 | New England Biolabs | R3142L | |
| LB-Medium | MP | 3002-032 | |
| Lithium Acetate | Sigma-Aldrich | 517992 | |
| L-Tryptophan | Sigma-Aldrich | T0254 | |
| Maltose | Sigma-Aldrich | M5885 | |
| Molecular Biology Water | Sigma-Aldrich | W4502 | |
| NEB3.1 Buffer | New England Biolabs | B7203S | |
| Nourseothricin | Werner Bioagents | 74667 | |
| Poly(ethylene glycol) PEG 3350 | Sigma-Aldrich | P4338 | |
| Sac1 | New England Biolabs | R3156L | |
| Salmon Sperm DNA | Invitrogen | AM9680 | |
| T4 Polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202L | |
| Taq polymerase | New England Biolabs | M0267X | |
| Tris HCl | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| uridine | Sigma-Aldrich | U3750 | |
| Yeast Extract | BD Bacto | 212750 | |
| Equipment | |||
| Electrophoresis Appartus | |||
| Incubator | |||
| Microcentifuge | |||
| PCR machine | |||
| Replica Plating Apparatus | |||
| Rollerdrum or shaker | |||
| Spectrophotometer | |||
| Waterbath |
References
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