Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Mekanisk Micronization av Lipoaspirates for regenerativ Therapy

Published: March 15, 2019 doi: 10.3791/58765
Automatic Translation
1, 1, 1, *1, *1
1Department of Plastic and Cosmetic Surgery, Nanfang Hospital, Southern Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å få pancreatic fra fettvev gjennom en rekke mekaniske prosesser, som inkluderer emulgering og flere centrifugations.

Abstract

Pancreatic (sendinger) har blitt en regenererende verktøy for ulike sykdommer; imidlertid regulerer lovgivningen strengt klinisk anvendelse av cellen produkter med collagenase. Her presenterer vi en protokoll for å generere en injiserbare blanding av sendinger celler og innfødt ekstracellulær matrix fra fettvev en rent mekanisk prosess. Lipoaspirates er satt i en sentrifuge og spunnet på 1200 x g i 3 minutter. Det midterste laget samles og delt inn i to lag (høy tetthet fat nederst) og lav fett på toppen. Det øvre laget er direkte emulgert av intersyringe skiftende, med en hastighet på 20 mL/s for 6 x til 8 x. Emulgert fettet er centrifuged 2000 x g for 3 min, og klissete stoffet under olje laget er samlet og definert som den ekstracellulære matrisen (EFM) / sendinger-gel. Oljen på det øverste laget samles. Ca 5 mL olje er lagt til 15 mL av høy tetthet fett og emulgert av intersyringe skiftende, med en hastighet på 20 mL/s for 6 x til 8 x. Emulgert fettet er centrifuged 2000 x g for 3 min, og klissete stoffet er også ECM/sendinger-gel. Etter transplantasjon av ECM/sendinger-gel i naken mus, er graftet høstet og vurdert av histologic undersøkelse. Resultatet viser at produktet har potensial til å regenerere i normal fettvev. Denne fremgangsmåten er en enkel, effektiv mekanisk dissosiasjon prosedyre å kondensere sendinger cellene innebygd i deres naturlige støttende ECM for regenerativ formål.

Introduction

Stilk cellen terapi gir et paradigmeskifte for reparasjon av vev og regeneration slik at de kan tilby en alternativ terapeutiske diett for ulike sykdommer1. Stamceller (f.eks, indusert pluripotent stamceller og embryonale stamceller) har stort terapeutiske potensial, men er begrenset celle regulering og etiske hensyn. Liggende under adipose-avledet mesenchymal stromal/stamceller (ASCs) er lett å få fra lipoaspirates og ikke underlagt de samme begrensningene; Derfor har det blitt en ideell celle type for praktisk regenerativ medisin2. Dessuten, de er nonimmunogenic og har rikelig med ressurser fra autologous fett3.

Foreløpig hentes ASCs hovedsakelig av collagenase-mediert fordøyelsen av fettvev. Pancreatic (sendinger) av fettvev inneholder ASCs, endoteliale progenitor celle, pericytes og immunceller. Selv om å få en høy tetthet av sendinger/ASCs enzymatisk ble vist å ha gunstige effekter, regulerer lovgivningen i flere land strengt klinisk anvendelse av celle-baserte produkter bruker collagenase4. Fordøye fettvev med collagenase i 30 minutter til 1 time å få sendinger celler øker risikoen for både ytre materiale i forberedelse og biologiske forurensning. Tilhenger kulturen og rensing av ASCs, som tar dager til uker, krever bestemte laboratorieutstyr. Videre, i de fleste studier, sendinger celler og ASCs brukes i suspensjon. Uten beskyttelse av ekstracellulær matrix (EFM) eller en annen bærer, friplassene er sårbare, forårsaker en dårlig celle oppbevaring etter injeksjon og kompromiss terapeutiske resultatet5. Alle disse årsakene begrense ytterligere anvendelse av stilk cellen terapi.

For å få ASCs fra fettvev uten collagenase-mediert fordøyelsen, har flere mekaniske prosedyrer, inkludert sentrifugering, mekanisk chopping, shredding, pureeing og hakking, vært utviklet6,7 , 8 , 9. disse metodene er tenkt å kondensere vev og ASCs av mekanisk forstyrre moden adipocytter og deres olje inneholder blemmer. Videre viste disse preparater, som inneholder høye konsentrasjoner av ASCs, betydelig terapeutiske potensial som regenerativ medisin i dyr modeller8,9,10.

I 2013 introduserte Tonnard et al. nanofat pode teknikk, som innebærer produsere emulgert lipoaspirates av intersyringe behandling11. Klipping styrken skapt av intersyringe skiftende kan selektivt bryte eldre adipocytter. Basert på sine funn, utviklet vi en rent mekanisk behandlingsmetode som fjerner de fleste lipid og væske i lipoaspirates, slik at bare sendinger celler og fraksjonert ECM, som er ECM/sendinger-gel12. Her beskriver vi detaljene av mekanisk menneske-avledet fettvev å produsere ECM/sendinger-gel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne forskningen ble godkjent av den Ethical Review Board i Nanfang sykehus, Guangzhou, Kina. Fettvev ble samlet inn fra sunn givere som ga skriftlig samtykke til å delta i studien. Alle dyreforsøk ble godkjent av Nanfang Hospital institusjonelle Animal Care og bruk komité og utført i henhold til retningslinjene for National Health and Medical Research Council (Kina).

1. ECM/sendinger-gel forberedelse

  1. Høste fett.
    1. Utfører fettsuging på et menneske med en 3 mm multiport kanyle, som inneholder flere skarpe siden hull 1 mm i diameter, på-0.75 atm inntaks press.
    2. Samle 200 mL lipoaspirates i et sterilt bag.
  2. Forberede Coleman fett.
    1. Overføre til lipoaspirates i fire 50 mL rør og la høstet fett å stå stille i 10 min.
    2. Samle fettet på det øverste laget i to 50 mL rør med en bred-tip pipette for å overføre, og forkaste likvide delen på den nederste laget.
    3. Bruker 50 mL rør, centrifugate fett laget på 1200 x g ved romtemperatur (RT) for 3 min.
    4. Define det øvre laget (ca 80 mL) som Coleman fat.
    5. Overføre den øverste 2/3 av Coleman fat til en 20 mL tube ved hjelp av en bred-tip pipette, og Definer denne delen som lav fett.
    6. Overføre den nederste 1/3 av Coleman fat til en annen 20 mL tube ved hjelp av en bred-tip pipette, og Definer denne delen som høy tetthet fat.
  3. Produsere ECM/sendinger-gel fra lav fett.
    1. Bruke to 20 mL sprøyter forbindelse av en kvinne-til-hunn Luer-Lock connector (med en intern diameter på 2,4 mm) intershift 20 mL lav fett.
    2. Gjenta for 6 x til 8 x opprettholde skiftende stabil (ved 20 mL/s).
    3. Centrifugate blandingen på 2000 x g ved RT i 3 minutter.
    4. Samle den olje-delen øverst i en 10 mL tube med en bred-tip pipette på RT for videre bruk.
    5. Samle klissete stoffet i midten laget, som er ECM/sendinger-gel (figur 1A), ved hjelp av en bred-tip pipette, og forkaste væske på det nederste laget.
  4. Produsere ECM/sendinger-gel fra høy tetthet fett.
    1. Legge til 5 mL olje (samlet fra trinn 1.3.4) 15 mL av høy tetthet fett.
    2. Intershift blandet fett mellom sprøyter 6 x til 8 x før en flocculate er observert i emulsjonen.
    3. Centrifugate blandingen på 2000 x g ved RT i 3 minutter.
    4. Kast delen olje på toppen.
    5. Samle klissete stoffet i midten laget (ECM/sendinger-gel) ved hjelp av en bred-tip pipette og forkaste væske på det nederste laget.
    6. Bland ECM/sendinger-gel fra trinn 1.3.5 og 1.4.5.

2. naken mus ECM/sendinger-gel pode modell

  1. Bedøve naken mus (8 uker gamle, kvinnelige) med isoflurane (1% - 3%) innånding anestesi i et dyr operasjon rom.
  2. Overføre ECM/sendinger-gel til en 1 mL sprøyte.
  3. Koble 1 mL sprøyte med en stump infiltrasjon kanyle.
  4. Sett inn kanyle subcutaneously i hver flanken av musen.
  5. Injisere 0,3 mL av ECM/sendinger-gel.

3. vev høsting på 3, 15 og 90 dager etter ECM/sendinger-gel injeksjon

  1. Bedøve mus med isoflurane (1% - 3%) innånding anestesi.
  2. Ofre mus for metoden cervical forvridning.
  3. Foreta et snitt på midtlinjen av musen er dorsal huden med kirurgisk saks.
  4. Dissekere og høste fett graftene på begge sider av musen. Bygge inn fett graftene i 4% paraformaldehyde på RT over natten.
  5. Tørke vevet i økende konsentrasjoner av etanol: 70% etanol, to endringer, 1 h hver; 80% etanol, en endring, 1 h; 95% etanol, en endring, 1 h; 100% etanol, tre endringer, 1,5 t hver; xylen, tre endringer, 1,5 t.
  6. Infiltrere vevet med parafin voks (58-60 ° C), to endringer, 2t hver.
  7. Bygge inn vevet blokkene parafin. Skjær deler en tykkelse på ca 4 µm og satte dem på lysbilder.

4. hematoxylin og Eosin flekker

  1. Deparaffinize parafin blokk lysbildene av soaking dem i xylen I, II og III (10 min hver).
  2. Rehydrate delene vev av passerer dem i å redusere konsentrasjonene (100%, 100%, 95%, 80%, 70%) etanol bad i 3 minutter hver.
  3. Skyll avsnittene vev i destillert vann (5 min).
  4. Stain avsnittene vev i hematoxylin i 5 minutter.
  5. Skyll avsnittene vev i rennende vann fra springen i 20 min. Decolorize i 1% syre alkohol (1% HCl i 70% alkohol) for 5 s. skylling i rennende vann fra springen til delene er blå igjen.
  6. Legge til to til tre dråper Eosin Y fargestoff direkte på lysbildene ved pipette, og la fargestoff satt for 10 min.
  7. Vask lysbildene i springvann for 1-5 minutter.
  8. Tørke lysbildene i økende konsentrasjoner (70%, 80%, 95%, 100%, 100%) av etanol i 3 minutter hver.
  9. Fjern lysbildene i xylen I og II for 5 min.
  10. Montere lysbildene i montering media.

5. immunofluorescent flekker

  1. Deparaffinize avsnittene vev i xylen I, II og III (5 min hver).
  2. Rehydrate delene vev ved å sende dem gjennom ulike konsentrasjoner (100%, 100%, 95%, 95%, 70%) alkohol bad i 3 minutter hver.
  3. Inkuber avsnittene i en 3% H2O2 løsning i metanol i RT i 10 min.
  4. Skyll lysbildene 2 x med destillert vann, 5 min.
  5. Slipp lysbildene i et lysbilde kurv. Legg til 300 mL 10 mM citrate bufferen (pH 6.0) og ruge lysbilder på 95-100 ° C for 10 min.
  6. Cool lysbilder i RT for 20 min.
  7. Skyll lysbildene 2 x med fosfat-bufret saltvann (PBS), 5 minutter hver.
  8. Legg 100 µL av 10% fosterets bovin serum på lysbildene og ruge i en fuktet kammer på RT 1t.
  9. Inkuber delene med primære antistoff løsning (marsvin anti-mus Perilipin, 1:400) på 4 ° C over natten.
  10. Skyll lysbildene med PBS 3 x, 5 minutter hver.
  11. Inkuber delene med sekundær antistoff løsning (geit anti-guinea gris-488 IgG) 2 h på RT.
  12. Skyll lysbildene med PBS 3 x, 5 minutter hver.
  13. Tørk av vann rundt delen med rent papir.
  14. Slipp 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og Alexa Fluor 488-konjugerte isolectin i sirkelen å dekke delen på lysbildet.
  15. Montere coverslips og la dem tørke i mørket.
  16. Observere lysbildene med fluorescerende mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter behandling Coleman fett til ECM/sendinger-gel, volumet av kasserte olje tar opptil 80% av det siste bindet, og bare 20% av fettvev bevart under olje laget regnes som ECM/sendinger-gel (figur 1A). ECM/sendinger-gel er en væske-lignende konsistens som gjør det muliggjør å gå gjennom en 27 G tynn nål; men Coleman fett består av en integrert adipose struktur med store fiber og kan bare gå gjennom en 18 G kanyle (figur 1B).

Dag 3 etter transplantasjon dukket stort antall lite preadipocytes med flere intracellulær lipid dråper, omfattende godt vascularized bindevev og infiltrere inflammatoriske celler. Begynnelsen på dag 15, antall betennelsesceller begynte å bli redusert gradvis, og adipocytter begynte å modne. Dag 90, hadde de fleste av vascularized connective vev i graftene blitt erstattet av eldre adipocytter (figur 2, øvre panel).

ECM/sendinger-gel grafts inneholdt noen perilipin-positive adipocytter, 3 dager etter transplantasjon. Lite preadipocytes med flere intracellulær lipid dråper begynte å vises på dag 15. Hvert felt av ECM/sendinger-gel pode deler på dag 90 viste mange perilipin-positive adipocytter og nylig dannet blodkar (figur 2, nedre panel).

Figure 1
Figur 1 : Bilder av ECM/sendinger-gel. Sentrifugeres Coleman fett og ECM/sendinger-gel etter behandling (A). ECM/sendinger-gel kan lett injiseres gjennom en 27 G nål; men kan Coleman fett bare passere gjennom en 18 G kanyle (B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Histologiske endring i ECM/sendinger-gel etter transplantasjon. ECM/sendinger-gel viste omfattende godt vascularized bindevev og infiltrere inflammatoriske celler på dag 3. Senere, de fleste av vascularized bindevevet ble erstattet av en struktur som inneholder eldre adipocytter (øvre panel). Immunofluorescent flekker viser at de fleste av vev består av området perilipin-negativ dag 3. Dag 15, dukket opp en stor del av perilipin + adipocytter. Mange perilipin-positive adipocytter ble funnet etter 90 dager (nedre panel). Skala barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Stem cell-baserte regenerativ therapy har vist en stor potensiell fordel i ulike sykdommer. ASCs er enestående terapeutiske kandidater fordi de er enkle å få og ha evne til reparasjon av vev og fornyelse av romanen vev15. Det er imidlertid begrensninger til å utvide sin klinisk anvendelse, siden det krever kompliserte prosedyrer for å isolere celler og collagenase for behandling6. Derfor er det viktig å utvikle en enkel teknikk for å få stamceller uten bruk av collagenase.

I denne studien presenterte vi en rent mekanisk prosess av fettvev hente sendinger celler som er beskyttet av innfødte adipose ECM. Videre er denne prosessen collagenase-fri. En tidligere studie sammenlignet ulike intersyringe saksbehandlingstid og viste at intersyringe behandling av standard Coleman fett for 1 min på en flow rate på 10 mL/s er den optimale protokollen for å produsere ECM/sendinger-gel12. Ved å bruke intersyringe skiftende, er de fleste adipocytter i lipoaspirates ødelagt, de fleste sendinger celler og ECM bevart. Dermed er intersyringe skiftende viktig i hele prosessen. Intersyringe skiftende hastigheten og tidsbruk gjennomføre skiftende fastslå hvilket ødeleggelse av fettvev fordi sheering skapt av intersyringe prosessen er forbundet med skiftende hastigheten. Vi foreslår at skiftende hastigheten skal være stabilt på 20 mL/s. utilstrekkelig ødeleggelse fører til gjenværende uønskede adipocytter, mens overdestruction resulterer i skade sendinger cellene. Produktet av denne protokollen kan defineres som ECM/sendinger-gel bare hvis den nådde følgende kriterier: 1) siste volumet er ~ 20% av det første volumet; 2) det injiseres lett gjennom en 27 G nål. En tidligere studie vist at ECM/sendinger-gel inneholder høye tettheter av både CD45-/ CD31- / CD34 + ASCs og sendinger celle tetthet er > 4.0 x 105 celler/mL12.

Under prosessen med å opprette ECM/sendinger-gel, var sentrifugering gjennomført 2 x, før og etter intersyringe skiftende. Før intersyringe skiftende, bruker vi sentrifugering opprette "gradert tettheter" fett. Dette er et viktig skritt. Det har blitt bevist at høy tetthet fett laget nederst, etter sentrifugering, er rik på kondensert ECM men har mindre olje, mens det lav fett laget på toppen har mer olje, men mindre ECM fiber16,17. Dermed skal disse to lagene behandles på to forskjellige måter. Lav fett kan direkte gjennomgå intersyringe behandling for å ødelegge adipocytter. Høy tetthet fettet på det nederste laget krever imidlertid ekstra olje for å lette ødeleggelsen av adipocytter. Ekstra olje kan redusere tettheten av høy tetthet fat, slik skiftende mye lettere. Videre kan olje hjelpe ut mer olje fra de ødelagte adipocytter; imidlertid ikke vandig væske. Derfor lagt vi ekstra olje til høy tetthet fettet. Sentrifugering etter intersyringe skiftende er å skille delen olje fra sendinger celler og ECM. Olje bør unngås i sluttproduktet.

Transplantasjon av ECM/sendinger-gel resulterte i en stor oppbevaring rate. Som vi nevnte ovenfor, det viktigste trinnet i behandlingen av ECM/sendinger-gel er intersyringe skiftende, som ødelegger det meste av adipocytter. Dermed forble lite adipocytter i ECM/sendinger-gel. Som vist i figur 2, dukket et lite perilipin-positive område i transplantert ECM/sendinger-gel på dag 3. Men etter 15 dager, mye perilipin-positive adipocytter dukket opp og ble modne etter 90 dager. En tidligere studie har vist at transplantasjon av ECM/sendinger-gel indusert verten celle-mediert fettvev gjenfødelse14. Bruke anti-menneskelige leukocytter antigen til å finne opprinnelsen til de nyopprettede adipocytter, oppdaget vi at selv om de fleste cellene i sendinger var pode-avledet, de fleste av nydannede fettvev var vert-avledet. ECM/sendinger-gel har en stor regenerativ funksjon, som vi tidligere rapportert. Dette produktet hadde stor terapeutiske effekter i sårheling12. Dessuten, det hjalp for å forbedre overlevelse av gratis klaffen i en musemodell av akselererende angiogenese10.

Sendinger-gel er en autologous injectable inneholder innfødte ECM og funksjonelle cellulære komponenter. Produktet er generert fra lipoaspirate av en enkel mekanisk prosess, som kan utføres enkelt uten spørsmål angående regulatoriske forhold. Regenerativ effekten av ECM/sendinger-gel er imidlertid uklart. For å bedre karakteriserer de gunstige effektene av ECM/sendinger-gel, er videre undersøkelser som karakteriserer underliggende molekylære mekanismer regenererende effekt av ECM/sendinger-gel på vei.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av National Science Foundation natur Kina (81471881, 81601702, 81671931), naturvitenskap grunnlaget for Guangdong-provinsen i Kina (2014A030310155) og Administrator Foundation av Nanfang sykehuset (2014B009, 2015Z002, 2016Z010, 2016B001).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alexa Fluor 488-conjugated isolectin GS-IB4 Molecular Probes I21411
guinea pig anti-mouse perilipin Progen GP29
DAPI Thermofisher D1306
wide tip pipet Celltreat 229211B
Confocal microscope  Leica  TCS SP2
nude nice  Southern Mdical University /
light microscope  Olympus /
50 mL tube Cornig 430828
sterile bag Laishi /
microtome Leica  CM1900
centrifuge Heraus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bateman, M. E., et al. Using Fat to Fight Disease: A Systematic Review of Non-Homologous Adipose-Derived Stromal/Stem Cell Therapies. Stem Cells. 36 (9), 1311-1328 (2018).
  2. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. , 812693 (2012).
  3. Gimble, J. M., Katz, A. J., Bunnell, B. A. Adipose-derived stem cells for regenerative medicine. Circulation Research. 100 (9), 1249-1260 (2017).
  4. Halme, D. G., Kessler, D. A. FDA regulation of stem-cell-based therapies. New England Journal of Medicine. 355 (16), 1730-1735 (2006).
  5. Cheng, N. C., Wang, S., Young, T. H. The influence of spheroid formation of human adipose-derived stem cells on chitosan films on stemness and differentiation capabilities. Biomaterials. 33 (6), 1748-1758 (2012).
  6. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  7. van Dongen, J. A., et al. The fractionation of adipose tissue procedure to obtain stromal vascular fractions for regenerative purposes. Wound Repair and Regeneration. 24 (6), 994-1003 (2016).
  8. Mashiko, T., et al. Mechanical Micronization of Lipoaspirates: Squeeze and Emulsification Techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (1), 79-90 (2017).
  9. Feng, J., et al. Micronized cellular adipose matrix as a therapeutic injectable for diabetic ulcer. Regenerative Medicine. 10 (6), 699-708 (2015).
  10. Zhang, P., et al. Ischemic flap survival improvement by composition-selective fat grafting with novel adipose tissue derived product - stromal vascular fraction gel. Biochemistry and Biophysics Research Communication. 495 (3), 2249-2256 (2018).
  11. Tonnard, P., et al. Nanofat grafting: basic research and clinical applications. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (4), 1017-1026 (2013).
  12. Yao, Y., et al. Adipose Extracellular Matrix/Stromal Vascular Fraction Gel: A Novel Adipose Tissue-Derived Injectable for Stem Cell Therapy. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (4), 867-879 (2017).
  13. Yao, Y., et al. Adipose Stromal Vascular Fraction Gel Grafting: A New Method for Tissue Volumization and Rejuvenation. Dermatologic Surgery. 44 (10), 1278-1286 (2018).
  14. Zhang, Y., et al. Improved Long-Term Volume Retention of Stromal Vascular Fraction Gel Grafting with Enhanced Angiogenesis and Adipogenesis. Plastic and Reconstructive Surgery. 141 (5), 676-686 (2018).
  15. Sun, B., et al. Applications of stem cell-derived exosomes in tissue engineering and neurological diseases. Reviews in the Neurosciences. 29 (5), 531-546 (2018).
  16. Allen, R. J., et al. Grading lipoaspirate: is there an optimal density for fat grafting. Plastic and Reconstructive Surgery. 131 (1), 38-45 (2013).
  17. Qiu, L., et al. Identification of the Centrifuged Lipoaspirate Fractions Suitable for Postgrafting Survival. Plastic and Reconstructive Surgery. 137 (1), 67-76 (2016).

Tags

Medisin problemet 145 liggende under Adipose-avledet stilk cellen mekanisk prosess lipoaspirates fett pode stilk cellen terapi pancreatic gel
Mekanisk Micronization av Lipoaspirates for regenerativ Therapy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F.,… More

Zhu, H., Ge, J., Chen, X., Lu, F., Cai, J. Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy. J. Vis. Exp. (145), e58765, doi:10.3791/58765 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter