Summary
يصف لنا طريقة بسيطة للقياس الكمي السريع من وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوية في البكتيريا المتنوعة، بما في ذلك الأنواع المتفطرات إيجابية وسلبية الغرام.
Abstract
وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) بوليمر بيولوجية الموجودة في الخلايا من جميع مجالات الحياة، ومطلوب من أجل الفوعة وإجهاد استجابة في العديد من البكتيريا. وهناك مجموعة متنوعة من أساليب لتحديد سليلة في المواد البيولوجية، والعديد منها كثيفة العمالة أو غير حساسة، يحد من فائدتها. نقدم هنا طريقة مبسطة للقياس الكمي سليلة في البكتيريا، تستخدم استخراج عمود غشاء والسليكا الأمثل للمعالجة السريعة لعينات متعددة والهضم من سليلة مع اكسوبوليفوسفاتاسي الخاصة سليلة سكبكس، والكشف عن فوسفات الحرة الناتجة مع مقايسة اللونية حساسة على أساس حمض الأسكوربيك. هذا الإجراء مباشرة، وغير مكلفة، ويسمح سليلة موثوقية القياس الكمي في مختلف أنواع الجراثيم. نقدم الكمي سليلة الممثل من بكتيريا سلبية الغرام (الإشريكيّة القولونية) وبكتيريا حمض الالكتيك إيجابية (ريوتيري اكتوباكيللوس)، والأنواع المتفطرات (بكتريا سميجماتيس). نحن تشمل أيضا بروتوكول بسيط لتنقية النيكل تقارب كميات مغ من سكبكس، التي ليست متاحة تجارياً حاليا.
Introduction
وميلامين متعدد الفوسفات غير العضوي (سليلة) هو بيوبوليمير خطية وحدات الفوسفات المرتبطة فوسفوانهيدريدي موجودة في جميع مجالات الحياة1،،من23. في البكتيريا المتنوعة، سليلة ضروري لاستجابة الإجهاد وحركية وتشكيل بيوفيلم، مراقبة دورة الخلية، ومقاومة المضادات الحيوية والفوعه4،5،،من67،8 9، ،،من1011. ولذلك قد دراسات الأيض سليلة في البكتيريا يمكن أن تسفر عن الأفكار الأساسية في قدرة البكتيريا تسبب المرض وتزدهر في بيئات متنوعة. في كثير من الحالات، ومع ذلك، الأساليب المتوفرة لتحديد سليلة في الخلايا البكتيرية عاملاً مقيداً في هذه الدراسات.
وهناك العديد من الطرق المستخدمة حاليا لقياس مستويات سليلة في المواد البيولوجية. عادة ما تشمل هذه الأساليب خطوتين متمايزتين: استخراج سليلة والتحديد الكمي سليلة موجودة في تلك المقتطفات. طريقة معيار الذهب الحالية، وضعت للخميرة Saccharomyces cerevisiae Bru والزملاء في12، سليلة مقتطفات جنبا إلى جنب مع الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي باستخدام الفينول وكلوروفورم، تليها الإيثانول هطول الأمطار، المعاملة مع deoxyribonuclease (الدناز) وريبونوكليسي (رناسي)، والهضم من سليلة المنقي الناتج مع S. cerevisiae اللاإنسانية سليلة إنزيم اكسوبوليفوسفاتاسي (سكبكس)13 لإنتاج الفوسفات مجاناً، والتي يتم بعد ذلك كمياً باستخدام الملكيت الأخضر-على أساس مقايسة اللونية. هذا الإجراء الغاية الكمية لكن كثيفة العمالة، مما يحد من عدد العينات التي يمكن معالجتها في تجربة واحدة، وليس الأمثل للعينات البكتيرية. وقد أبلغ آخرون استخراج سليلة من مجموعة متنوعة من الخلايا والأنسجة باستخدام الخرز السليكا ("جلاسميلك") أو السليكا غشاء الأعمدة6،،من1415،16،17، 18. هذه الأساليب لا كفاءة استخراج سلسلة قصيرة سليلة (أقل من 60 وحدة الفوسفات)12،،من1415، على الرغم من أن هذا أقل قلقا للبكتيريا، والتي يعتقد عموما أن توليف أساسا 3من سليلة سلسلة طويلة. الأساليب القديمة لاستخراج سليلة استخدام الأحماض القوية19،20 لم تعد تستخدم على نطاق واسع، منذ سليلة غير مستقرة تحت الظروف الحمضية12.
وهناك أيضا مجموعة متنوعة من أساليب سليلة تحديد المبلغ عنها. ومن بين الأكثر شيوعاً هو 4, 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI)، صبغة فلورسنت أكثر عادة ما تستخدم لوصمة عار الحمض النووي. المجمعات سليلة DAPI لها الأسفار المختلفة ماكسيما الإثارة والانبعاثات من الحمض النووي DAPI مجمعات21،22، لكن هناك تدخل كبير من المكونات الخلوية الأخرى، بما في ذلك الجيش الملكي النيبالي والنيوكليوتيدات الإينوزيتول الفوسفات12،،من1516،23، الحد من خصوصية وحساسية من سليلة القياسات باستخدام هذا الأسلوب. بدلاً من ذلك، يمكن تحويل سليلة و diphosphate الأدينوزين (ADP) إلى أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP) استخدام المنقي الإشريكيّة القولونية سليلة كيناز (PPK) و ATP الناتجة كمياً باستخدام لوسيفراس14،17 ،18. وهذا يتيح الكشف عن كميات صغيرة جداً من سليلة، ولكن يتطلب خطوتين رد الفعل الأنزيمي ولوسيفرين وشرطة نقية جداً، التي هي الكواشف باهظة الثمن. سكبكس تحول دون التحديد النبذ سليلة إلى فوسفات حرة6،،من1213،24، التي يمكن الكشف عنها باستخدام طرق أبسط، ولكن سكبكس ب الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي12، مقتطفات الدناز يستلزم المعاملة رناسي المحتوية على سليلة. PPK سكبكس ليست متاحة تجارياً، وتنقية PPK معقدة نسبيا25،26.
يمكن أيضا تصور سليلة في ليساتيس الخلية أو مقتطفات في الهلام بولياكريلاميدي ب DAPI السلبية تلطيخ27،28،،من2930، أسلوب الذي يسمح بتقييم لطول السلسلة، ولكن هو انخفاض الإنتاجية وضعف الكمية.
ونحن الآن تقرير مقايسة سليلة سريعة وغير مكلفة، الإنتاجية المتوسطة يسمح التحديد الكمي السريع من سليلة المستويات في مختلف أنواع الجراثيم. يبدأ هذا الأسلوب بواسطة ليسينج الخلايا البكتيرية في 95 درجة مئوية في م 4 غوانيدين isothiocyanate (جتك)14 لإلغاء تنشيط phosphatases الخلوية، متبوعاً استخراج عمود غشاء والسليكا الأمثل للمعالجة السريعة لعينات متعددة. ثم يهضم الناتجة عن استخراج المحتوية على سليلة مع فائض كبير في سكبكس، مما يلغي الحاجة إلى معاملة الدناز ورناسي. نحن تشمل بروتوكول للنيكل واضحة انجذاب تطهير كميات مغ من سكبكس. وأخيراً، المستمدة من سليلة فوسفات حرة كمياً ب مقايسة اللونية البسيطة، حساسة، وتستند على حمض الأسكوربيك24 وتطبيع لمجموع البروتين الخلوي. يبسط هذا الأسلوب قياس سليلة في الخلايا البكتيرية، ونظهر استخدامه مع الممثل الأنواع من البكتيريا سلبية الغرام وإيجابية البكتيريا المتفطرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-تنقية الخميرة اكسوبوليفوسفاتاسي (سكبكس)
- تحويل سلالة overexpression بروتين كولاي BL21(DE3)31 مع بلازميد pScPPX26 انهانسر32 أو33من التحول الكيميائي.
- تطعيم 1 لتر مرق ليسوجيني (رطل) التي تحتوي على 100 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين في قارورة أونبافليد ل 2 مع مستعمرة واحدة من BL21(DE3) التي تحتوي على pScPPX2، واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المصافحة، لامتصاص 600 نيوتن متر (600) من حوالي 0.3، كما يقاس جهاز المطياف الضوئي.
- بدء ثقافة الهز (180 لفة في الدقيقة) واحتضانها لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، خلال الوقت الذي سوف تنمو الخلايا إلى A600 من 0.4-0.5.
- إضافة الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) بتركيز نهائي 1 ملم وإضافية 100 ميكروغرام مل-1 الأمبيسلّين، ثم احتضانها ح 4 في 37 درجة مئوية مع الهز 180 لفة في الدقيقة.
ملاحظة: هذا البروتوكول overexpression يولد كمية كبيرة من سكبكس قابلة للذوبان. ومع ذلك، أوفيريكسبريشن سكبكس متسامح جداً، وقد استخدمت مجموعة متنوعة من البروتوكولات overexpression البروتين الشائعة الأخرى لتنقية سكبكس بنجاح. - نقل الخلايا باستخدام زجاجة 1 لتر للطرد مركزي وحصادها من سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 5000 س ز في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية ونقل بيليه الخلية إلى أنبوب مخروطي 50 مل.
ملاحظة: الكريات خلية يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية. - ذوبان الجليد بيليه على الجليد، ثم ريسوسبيند أنه في 9 مل من 50 مم حبيس و 0.5 م كلوريد الصوديوم ايميدازول 5 مم (درجة الحموضة 8) لوحدة تخزين إجمالي حوالي 10 مل.
- إضافة lysozyme-1 مل 1 ملغ (تركيزات النهائي) و 2 مم مجكل2وحدات 50 مل-1 من endonuclease اللاإنسانية من الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي (انظر الجدول للمواد)، واحتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
ملاحظة: سكبكس ربط الأحماض النووية (البيانات لا تظهر)، ولذلك من الضروري معاملة نوكلاس أثناء تنقية. - استخدام سونيكاتور مع ميكروتيب (انظر الجدول للمواد)، الخلايا بدورات سونيكاتيون على الجليد بقوة 50%، النبض 5 2 s s 5 وعلى الخروج، مع راحة 2 دقيقة بين الدورات.
ملاحظة: تستخدم لحماية السمع المناسبة أثناء sonication. وبالمثل للحال بالنسبة أوفيريكسبريشن، مجموعة متنوعة من أساليب تحلل الخلية مقبولة لتنقية سكبكس. - إزالة الحطام غير قابلة للذوبان سينتريفوجينج لمدة 20 دقيقة في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية. تصفية المادة طافية الناتجة (حوالي 10 مل) من خلال مرشح حقنه اسيتات السليلوز حجم مسام 0.8 ميكرومتر.
- تحميل ليساتي على مل 5 مشحونة بالنيكل خالب العمود (انظر الجدول للمواد) باستخدام مضخة تمعجية أو حقنه كبيرة.
- شطف العمود مع 50 مل من 50 مم حبيس، 0.5 م كلوريد الصوديوم، 5 ملم ايميدازول (pH 8).
- شطف العمود مع 50 مل من 50 مم هيبيس، 0.5 م كلوريد الصوديوم، 20 مم ايميدازول (pH 8).
- الوت سكبكس مع 50 ملم حبيس وكلوريد الصوديوم M 0.5 0.5 M ايميدازول (pH 8)، جمع الكسور 1 مل 15. اختبار هذه الكسور شطف للبروتين المحتوى مع مقايسة البروتين برادفورد34 (انظر الجدول للمواد)، وتشغيل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي جل35 للتأكد من الكسور التي تحتوي على سكبكس المنقي (الوزن الجزيئي = كاتشين 45).
- تجمع الكسور التي تحتوي على سكبكس نقية وضبط تركيز البروتين المجمعة إلى حوالي 2 مغ مل-1 مع 50 ملم حبيس و 0.5 م كلوريد الصوديوم. قد يعجل بتركيزات أعلى من البروتين في الخطوة التالية.
- تبادل سكبكس المنقي في المخزن المؤقت لتخزين (20 مم تريس-HCl [الرقم الهيدروجيني 7.5]، 50 مم بوكل، والغليسيرول 10% [v/v]) عن طريق الغسيل الكلوي. ضع المجمعة سكبكس الكسور في طول مختومة من 12,000-14,000 دا الوزن الجزيئي الغسيل الكلوي قطع غشاء أنابيب (انظر الجدول للمواد) وتعليق في 1 لتر من المخزن المؤقت لتخزين مع التحريك المستمر في 4 درجات مئوية عن ه على الأقل 4. كرر هذه الخطوة مع الطازجة المخزن المؤقت لتخزين ما مجموعة 3 المخزن المؤقت تغييرات.
- نقل البروتين المنقي، دياليزيد إلى أنبوب الطرد مركزي أو أنابيب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 20,000 ز x عند 4 درجة مئوية لإزالة أي مجاميع غير قابلة للذوبان. نقل المادة طافية بعناية إلى أنبوب مخروطي نظيف 15 مل.
- ضبط تركيز سكبكس المنقي ل مل مغ 1-1 مع المخزن المؤقت لتخزين، وإضافة 0.1% (w/v) ألبومين المصل البقري خالية من مبطلات (جيش صرب البوسنة؛ والتركيز النهائي)، ومخزن لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: سكبكس يفقد أكثر من 90% نشاطها عندما يكون المجمدة13.
2-جمع عينات لاستخراج وميلامين متعدد الفوسفات.
- تنمو البكتيريا ظروف الاهتمام لتحديد محتوى سليلة. لهذا البروتوكول، تنمو reuteri ملبنة36 بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية دون المصافحة في إنزيم مالك التعريفي (مي) المتوسطة37 دون سيستين (مي-ج).
- جني ما يكفي من خلايا بالطرد المركزي في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل بإجمالي 50 – 100 ميكروغرام من البروتين الخلوي (راجع الخطوة 3 أدناه). كولاي، هذا 1 مل ثقافة المرحلة سجل A600 من 0.2-0.4. وهذا لام ريوتيري، 1 مل ثقافة بين عشية وضحاها. ضبط حسب الضرورة للأنواع الأخرى من الفائدة.
- إزالة المادة طافية من الكريات الخلية.
- ريسوسبيند الكريات الخلية في 250 ميليلتر من المخزن المؤقت لتحلل جيتك (isothiocyanate غوانيدين م 4، 50 مم تريس-HCl، ودرجة الحموضة 7) و بالحضانة عند 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 ليساتيس المخزن في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: تكون متسقة مع مرور الوقت تحلل، منذ الحضانة الموسعة في درجة حرارة عالية قد ينتج عن تدهور سليلة بالتحلل المائي38. ويمكن تخزين ليساتيس إلى أجل غير مسمى في-80 درجة مئوية.
تنبيه: isothiocyanate غوانيدين هو ملح تشاوتروبيك وينبغي التعامل مع القفازات والتخلص منها كنفايات خطرة.
3-قياس البروتين محتوى الخلية ليساتيس
- إعداد معايير جيش صرب البوسنة الذي يحتوي على 0، 0.1، 0.2 و 0.4 مغ مل-1 لجيش صرب البوسنة في المخزن المؤقت لتحلل جتك.
ملاحظة: من المهم جعل المعايير جيش صرب البوسنة في جتك، إذ جتك يؤثر وضع لون المقايسة برادفورد. ويمكن تخزين معايير جيش صرب البوسنة إلى أجل غير مسمى في-20 درجة مئوية. - الكوة 5 ميليلتر ليساتيس خلية المذابة، مختلطة جيدا والمعايير جيش صرب البوسنة لفصل الآبار في لوحة واضحة 96-جيدا.
- إضافة ميليلتر 195 من برادفورد كاشف34 لكل بئر وقياس امتصاص في 595 نانومتر (595) في قارئ لوحة (انظر الجدول للمواد).
- حساب كمية البروتين في كل بئر بالمقارنة إلى المنحنى المعياري جيش صرب البوسنة، باستخدام الصيغة y = mx + b، حيث y هو595x ميكروغرام لجيش صرب البوسنة، m هو منحدر المنحنى المعياري وب هو التقاطع y للمنحنى المعياري. قم بضرب القيمة الناتجة عن 0.05 لتحديد مجموع ملغ من البروتين في كل عينة.
4-استخراج وميلامين متعدد الفوسفات.
- إضافة 250 ميليلتر من الإيثانول 95% لكل عينة تفكيك جتك ودوامه المزيج.
- تطبيق هذا الخليط على السليكا غشاء عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 16,100 س ز.
- تجاهل في التدفق من خلال، ثم إضافة 750 ميليلتر من 5 مم تريس-HCl (درجة الحموضة 7.5)، 50 مم كلوريد الصوديوم، 5 مم يدتا، الإيثانول 50% وجهاز الطرد المركزي لمدة 30 ثانية في 16,100 س ز.
- تجاهل من خلال التدفق والطرد المركزي لمدة 2 دقيقة في 16,100 س ز.
- وضع العمود في أنبوب [ميكروفوج] مل 1.5 نظيفة وإضافة 150 ميليلتر من 50 مم تريس-HCl (pH 8).
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق، ثم الوتي سليلة من سينتريفوجينج لمدة 2 دقيقة في 8,000 س ز.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، الواتس يمكن تخزين في-20 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد على الأقل.
5-هضم وميلامين متعدد الفوسفات.
- إعداد المعايير التي تحتوي على 0, 5, 50 أو 200 ميكرومتر البوتاسيوم الفوسفات في 50 ملم تريس-HCl (pH 8).
ملاحظة: المعايير فوسفات البوتاسيوم يمكن تخزينها إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة. - الكوة ميليلتر 100 لكل معيار الفوسفات واستخراج عينات سليلة في آبار منفصلة من لوحة واضحة 96-جيدا.
- إعداد تحتوي على مزيج الرئيسي (لكل عينة): 30 ميليلتر من 5 x ScPPX رد فعل المخزن المؤقت (100 ملم تريس-HCl، 25 مم مجكل2، خلات الأمونيوم 250 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)13و 19 ميليلتر من ح2س 1 ميليلتر من سكبكس المنقي (1 mg مل-1).
- إضافة 50 ميليلتر من مزيج الرئيسي لكل بئر من لوحة 96-جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا رغبت في ذلك، سليلة هضم العينات التي يمكن تخزينها في-20 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
6-الكشف عن الفوسفات الحرة24
- إعداد الكشف عن الحل الأساسي بإذابة 0.185 ز من الأنتيمون طرطرات البوتاسيوم في 200 مل الماء، إضافة 150 مل "ح ن" 42حتى4، ثم إضافة 1.49 g موليبدات أمونيوم. يحرك بحل وإحضار ثم إلى وحدة تخزين نهائي لمل 456. تصفية الحل لإزالة الجسيمات وتخزين محمية من الضوء عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد حل أسهم من حمض الأسكوربيك 1 متر. مخزن محمية من الضوء عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد مخزون عمل جديدة للكشف عن حل كل يوم بخلط 9.12 مل من محلول الكشف عن قاعدة مع 0.88 مل حمض الأسكوربيك 1 متر. السماح بالكشف عن الحل للتوصل إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستعمال.
- إضافة 50 ميليلتر من الكشف عن الحل لكل نموذج ومعيار في لوحة 96-جيدا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لحوالي 2 دقيقة للسماح بوضع اللون.
- قياس امتصاص في 882 شمال البحر الأبيض المتوسط مع قارئ لوحة وحساب تركيز الفوسفات لكل عينة بالمقارنة إلى المنحنى القياسي فوسفات البوتاسيوم.
تنبيه: الكشف عن الحل الذي يحتوي على الأملاح السامة والأحماض القوية. ارتداء القفازات وعلاج حل الزائدة كنفايات سامة.
7-حساب محتوى وميلامين متعدد الفوسفات الخلوية
- تحويل تركيزات الفوسفات تحديده في الخطوة 6، 5 إلى نانوموليس المستمدة من سليلة الفوسفات في كل الخلية بأكملها ليساتي وفقا للصيغة التالية:
سليلة نمول = 1.5 x (الفوسفات ميكرومتر/10)
ملاحظة: يحدد الأسلوب القائم على المنحنى القياسي في الخطوة 6 تركيز الفوسفات (في ميكرومتر) في كل عينة سليلة ميليلتر 100 اليكووتيد في الخطوة 5، 2. لتحويل هذا التركيز إلى عدد من نمول، ينقسم 100 ميليلتر من 106 لإعطاء وحدة تخزين في لام، مضروبة في التركيز (µmol ل-1)، ثم مضروبة 1,000 (عدد نمول في µmol). وهذا يقلل إلى قسمة التركيز 10. حجم استخراج مجموع إعدادها في الخطوة 4 هو 150 ميليلتر، ولذلك من الضروري أن تتضاعف القيمة الناتجة من 1.5 حساب نمول الفوسفات في استخراج كامل. - تطبيع المحتوى سليلة الخلوية لمجموع البروتين الخلوي بقسمة سليلة نمول ملغ إجمالي البروتين في عينة كل تحديد في الخطوة 3، 4. يتم التعبير عن مستويات سليلة من حيث تركيز الفوسفات الحرة الفردية سليلة-مشتقة.
ملاحظة: في بعض الحالات، قد تقع كمية الفوسفات المستمدة من سليلة موجودة في عينة خارج النطاق الخطي للمنحنى المعياري الفوسفات (الخطوة 6، 5). إذا كانت مستويات سليلة عالية جداً، يمكن أن تضعف 01:10 أو 1: 100، حسب الاقتضاء، النذرة المحتوية على سليلة الزائدة من الخطوة 4، 6 وثم يقاس مرة أخرى كما هو موضح في الخطوات من 5 إلى 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخطوات الرئيسية للبروتوكول هي تخطيطي في شكل مبسط في الشكل 1.
للتدليل على استخدام هذا البروتوكول مع بكتيريا سلبية الغرام، البرية من نوع كولاي MG165539 قد ازدادت إلى سجل منتصف المرحلة المتوسطة الغنية رطل في 37 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة)، ثم تشطف والمحتضنة ح 2 إضافية في مورفولينوبروبانيسولفونيت مخزنة (والمماسح) الحد الأدنى المتوسط40 التي تحتوي على جلوكوز– 1 ز 4 لتر و 0.1 مم ك2هبو4، شرط المعروف للحث على إنتاج سليلة14،29. كما هو مبين في الشكل 2 ألف، اكتشفنا لا سليلة في البرية من نوع كولاي تزرع في رطل و 192 ± 14 (يعني ± الانحراف المعياري [SD]) نمول سليلة ملغ-1 مجموع البروتين في الممسحات، اتساقا مع السابقة التقارير14،29 . كما هو متوقع، ∆ppk متحولة6، الذي يفتقر إلى سليلة كيناز41، أنتجت لا سليلة في أما المتوسطة، ∆بكس متحولة6، الذي يفتقر إلى اكسوبوليفوسفاتاسي42، أنتجت حوالي نفس المبلغ من سليلة البرية-النوع، و ∆فب متحولة29، ومعيبة في نقل الفوسفات، تنتج سليلة أقل بكثير من ال29،،البرية من نوع1443.
للتدليل على استخدام هذا البروتوكول مع إيجابية البكتيريا، البرية من نوع ريوتيري L. ATCC منطقة التجارة التفضيلية 647536 والمسخ فارغة اسوي ppk1 تفتقر إلى سليلة كيناز، شيدت باستخدام توجيه اليغو ريكومبينيرينج44، كانت نمت بين عشية وضحاها في مي-ج على 37 درجة مئوية دون المصافحة. كما هو مبين في الشكل 2، البرية من نوع المتراكمة 51 ± 6 نمول سليلة ملغ-1 مجموع البروتين في ظل هذه الظروف، بينما تتضمن المسخ ppk1 أقل من نصف هذا المبلغ. ريوتيري ل. يحتوي كيناز سليلة ثانية، مرمزة بواسطة ppk2 الجينات45، الذي يفترض أن يقدم حسابات لسليلة في المسخ فارغة ppk1 .
للتدليل على استخدام هذا البروتوكول مع أنموذجية، سميجماتيس متفطره سلالة SMR546 كان نمت إلى سجل منتصف المرحلة في هارتمانس-دو بونت (المحاسب) المتوسطة47، ثم مشطوف والمخفف خمسة إضعاف في المحاسب أو المحاسب مع الإيثانول 2%. ثم كانت المحتضنة هذه الثقافات بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع الهز (180 لفة في الدقيقة). كما هو مبين في الشكل 2، في غياب الإيثانول، تراكمت سميجماتيس م. 141 ± 52 نمول سليلة ملغ-1 مجموع البروتين، بينما العلاج الإيثانول أدى زيادة ثلاثة إضعاف إلى 437 ± 102 نمول سليلة ملغ-1 البروتين الكلي. ومن المتوقع هذه النتيجة، حيث سجلت سابقا الإيثانول للارتقاء بمستويات سليلة في سميجماتيس م.48.
رقم 1: رسم تخطيطي لإجراءات استخراج وقياس وميلامين متعدد الفوسفات. يتم توضيح الخطوات الأساسية للبروتوكول الكمي سليلة. يتم تفكيك حبيبات الخلايا البكتيرية في 95 درجة مئوية في جتك (غوانيدين isothiocyanate). هي جزيئي مختبرين الصغيرة ليساتيس للمحتوى البروتين باستخدام مقايسة برادفورد. يتم استخراج سليلة استخدام أعمدة غشاء والسليكا وهضمها ثم مع سكبكس. هو كمية الفوسفات الحرة الناتجة باستخدام مقايسة حمض الأسكوربيك. هو تطبيع الفوسفات المستمدة من سليلة مجموع إلى مجموع البروتين لكل عينة. 595 = امتصاص في 595 نانومتر؛ 882 = امتصاص في 882 شمال البحر الأبيض المتوسط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: الممثل النتائج مع البكتريا المتنوعة. وكانت تزرع في 37 درجة مئوية مع الهز (200 لفة في الدقيقة) إلى600 (A) MG1655 كولاي البرية من نوع وأسوي ∆ppkو ∆بكسوطفراتفب ∆ = 0.2-0.4 في الغنية رطل المتوسطة (دوائر سوداء) وثم تحول إلى متوسط الحد الأدنى (والمماسح التي تحتوي على جلوكوز– 1 ز 4 لتر ومم 0.1 ك2هبو4) ح 2 (دوائر بيضاء; n = 3، ± SD). (ب) ريوتيري L. ATCC منطقة التجارة التفضيلية 6475 (الدوائر) والمسخ اسوي ppk1 فارغة (مثلثات) قد نمت بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في المتوسط ج مي دون المصافحة (n = 3، ± SD). SMR5 م. سميجماتيس (ج) وقد نمت في 37 درجة مئوية مع الهز (180 لفة في الدقيقة) إلى600 = 1 في المتوسط المحاسب مع (المربعات المغلقة) أو دون الإيثانول (فتح المربعات) 2% (n = 3، ± SD). يتم التعبير عن مستويات سليلة من حيث تركيز الفوسفات الحرة الفردية سليلة-مشتقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
البروتوكول هو موضح هنا يبسط ويسرع الكمي لمستويات سليلة في البكتيريا المتنوعة، مع مجموعة نموذجية من عينات 24 أخذ حوالي 1.5 ح الكامل عملية. هذا يسمح بالفحص السريع للعينات وتحليل لمكتبات متحولة، ويبسط الحركية تجارب قياس تراكم سليلة على مر الزمن. لقد أظهرنا أن البروتوكول يعمل بشكل فعال على ممثلي ثلاث يعج مختلفة: بروتيوباكتيريا، فيرميكوتيس، أكتينوباكتيريا، وسيئة السمعة لهذه المرونة، والصعب جدران الخلية49.
كشف سليلة بالهضم مع سكبكس هو أكثر تحديداً وأكثر حساسية من الأسفار الكشف مع DAPI، وهو أرخص وأكثر من الناحية التقنية مباشرة من تحويل سليلة إلى ATP باستخدام PPK. على الرغم من أن تحول دون سكبكس ب الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي12، لقد تغلبنا على هذا باستخدام فائض كبير جداً من إنزيم (1 ميكروغرام كل عينة) لتحقيق الهضم الكامل حتى في البكتيريا التي تحتوي على أكثر من 6,000 نمول سليلة ملغ-1 البروتين29. أخرى أساليب نشر استخدام 10 إلى 15 نانوغرام من سكبكس كل رد فعل12،24. عادة ينتج لدينا بروتوكول لتنقية سكبكس أكثر من 5 ملغ سكبكس البحتة للتر الواحد للثقافة أوفيريكسبريشن، وما يكفي لفحوصات أكثر من 5,000. وقد وجدنا أن العديد من البروتوكولات المختلفة لتنقية النيكل-تقارب البروتينات معلم صاحب العمل جيدا لتنقية سكبكس أوفيريكسبريسيد من pScPPX2 (البيانات لا تظهر)، وهناك مجموعة متنوعة واسعة من هذه البروتوكولات المتاحة التي تتناسب مع مختبرات مع اختلاف القدرات التقنية.
غالباً ما يعتمد البروتوكولات السابقة استخدام الهضم سكبكس للكشف عن سليلة على الملكيت الأخضر-على أساس فحوصات اللونية تحديد كمية الفوسفات الحرة6،12. هذه الاختبارات الحساسة، ولكن عادة ما تتطلب عناية توقيت إضافة متسلسلة من الكواشف منفصلة اثنين أو ثلاثة لإجراء قياسات دقيقة24،،من5051. نظام الكشف على أساس حمض الأسكوربيك المستخدمة هنا24 أوسع مجموعة خطي للكشف من الملكيت الأخضر مع عدم فقدان حساسية ويشمل إضافة كاشف واحد فقط، ولا تتطلب دقة التوقيت.
وهناك العديد من الخطوات الحاسمة لنجاح هذا البروتوكول. وينبغي تفكيك العينات البكتيرية، والأولى في جتك فورا بعد الحصاد، لضمان أن مستويات سليلة لا تتغير بعد وقت أخذ العينات وسرعة إلغاء تنشيط phosphatases الخلوية. ثانيا، لا احتضان ليساتيس جيتك في 95 درجة مئوية لمدة أكثر من 10 دقائق، وتخزينها مباشرة بعد ذلك في-80 درجة مئوية التقليل إلى أدنى حد ممكن سليلة التحلل المائي. وثالثاً، كن حذراً عند بيبيتينج عينات في لوحات 96-جيدا لقياس البروتين أو الفوسفات لا البداية أو التنقيط أي شيء من نموذج واحد إلى آخر. فحوصات اللونية، خاصة بالنسبة للفوسفات، وحساسة للغاية، وكميات صغيرة من التلوث بشدة يمكن أن تحرف النتائج. وأخيراً، لديك بعض الكواشف المستخدمة في هذا البروتوكول (أي سكبكس، الكشف عن الحل) حياة الجرف محدودة. إعداد سكبكس جديدة كل 6 أشهر والطازجة حل الكشف عن كل شهر.
واحد الحد من أسلوبنا أن أعمدة السليكا لا تربط سليلة الفوسفات أقل من 60 وحدات طويلة جيد جداً12،14،15. على الرغم من أن عادة توليف البكتيريا معظمها سليلة سلسلة طويلة3، نوصي بتجارب أولية باستخدام هلام polyacrylamide التفريد27،30 لتقييم طول السلسلة في أنواع بكتيرية معينة قبل استخدام لدينا الداخلي. للأنواع حيث يجعل سليلة سلسلة قصيرة حتى جزء كبير من حوض سليلة، لدينا بروتوكول ليس مناسباً ونوصي باستخراج سليلة بطريقة مختلفة (مثلاً، الفينول كلوروفورم استخراج12)، وسيوصي أيضا المكمل الهضم سكبكس مع المتاحة تجارياً سيريفيسيي س. بيروفوسفاتاسي (PPA1)24، نظراً لعدم هضم سكبكس بيروفوسفات13 وهذا له تأثير أعلى نسبيا على قياسات للسلسلة الأقصر سليلة. كبديل سكبكس، التحلل حمض38 يمكن أن يتحلل سليلة لتحرير الفوسفات، ولكن هذا يتطلب خطوات إضافية الدناز، رناسي، وتنقية للتأكد من أنه كان يجري قياس الفوسفات فقط المستمدة من سليلة. وفي بعض الحالات، قد يكون من المفيد استخدام أسلوب استخراج بديل لاختبار ما إذا كانت كفاءة الاستخراج سليلة مع جتك يختلف بين السلالات أو شروط، لا سيما مع البكتيريا التي يعرف أن لها جدران سميكة من الخلايا، مثل البكتيريا. إذا كانت مستويات سليلة الحد الأدنى للكشف عن هذا الفحص مهم للدراسات المتعلقة بنوع خاص، قد يكون من الضروري استخدام نظام كشف مختلفة، مثل استخدام PPK لتحويل سليلة إلى ATP، التي يمكن الكشف عنها باستخدام حساس جداً فحوصات المتاحة تجارياً على أساس لوسيفراس14،،من1718.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
وأيد هذا المشروع جامعة ألاباما في "برمنغهام قسم الأحياء المجهرية" أموال بدء التشغيل والمعاهد الوطنية للصحة منحة R35GM124590 (MJG)، والمعاهد الوطنية للصحة منحة R01AI121364 (مهاجم).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli BL21(DE3) | Millipore Sigma | 69450 | |
| plasmid pScPPX2 | Addgene | 112877 | available to academic and other non-profit institutions |
| LB broth | Fisher Scientific | BP1427-2 | E. coli growth medium |
| ampicillin | Fisher Scientific | BP176025 | |
| isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) | Gold Biotechnology | I2481C | |
| HEPES buffer | Gold Biotechnology | H-400-1 | |
| potassium hydroxide (KOH) | Fisher Scientific | P250500 | for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions |
| sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S27110 | |
| imidazole | Fisher Scientific | O3196500 | |
| lysozyme | Fisher Scientific | AAJ6070106 | |
| magnesium chloride (MgCl2) | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Pierce Universal Nuclease | Fisher Scientific | PI88700 | Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute |
| Model 120 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-120 | other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective |
| 5 mL HiTrap chelating HP column | GE Life Sciences | 17040901 | any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted |
| nickel(II) sulfate hexahydrate | Fisher Scientific | AC415611000 | for charging HiTrap column |
| 0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters | Fisher Scientific | 09-302-168 | |
| Bradford reagent | Bio-Rad | 5000205 | |
| Tris buffer | Fisher Scientific | BP1525 | |
| Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO | Fisher Scientific | 08-667B | other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work |
| hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144-212 | for adjusting the pH of Tris-buffered solutions |
| potassium chloride (KCl) | Fisher Scientific | P217500 | |
| glycerol | Fisher Scientific | BP2294 | |
| 10x MOPS medium mixture | Teknova | M2101 | E. coli growth medium |
| glucose | Fisher Scientific | D161 | |
| monobasic potassium phosphate (KH2PO4) | Fisher Scientific | BP362-500 | |
| dibasic potassium phosphate (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-500 | |
| dehydrated yeast extract | Fisher Scientific | DF0886-17-0 | |
| tryptone | Fisher Scientific | BP1421-500 | |
| magnesium sulfate heptahydrate | Fisher Scientific | M63-50 | |
| manganese sulfate monohydrate | Fisher Scientific | M113-500 | |
| guanidine isothiocyanate | Fisher Scientific | BP221-250 | |
| bovine serum albumin (protease-free) | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| clear flat bottom 96-well plates | Sigma-Aldrich | M0812-100EA | any clear 96-well plate will work |
| Tecan M1000 Infinite plate reader | Tecan, Inc. | not applicable | any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work |
| ethanol | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| silica membrane spin columns | Epoch Life Science | 1910-050/250 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Fisher Scientific | BP120500 | |
| 1.5 mL microfuge tubes | Fisher Scientific | NC9580154 | |
| ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | |
| antimony potassium tartrate | Fisher Scientific | AAA1088922 | |
| 4 N sulfuric acid (H2SO4) | Fisher Scientific | SA818-500 | |
| ammonium heptamolybdate | Fisher Scientific | AAA1376630 | |
| ascorbic acid | Fisher Scientific | AC401471000 |
References
- Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
- Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
- Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
- Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
- Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
- Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
- Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
- Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
- Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
- Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
- Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
- Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
- Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
- Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
- Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
- Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
- Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
- Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
- Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
- Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
- Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
- Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
- Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
- Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
- Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
- Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
- Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
- Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
- Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
- Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
- Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
- Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
- Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
- Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F.
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
- Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
- Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
- van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
- Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
- Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
- Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
- Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
- Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S.
- Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
- Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).
