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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Dosage de Polyphosphate inorganique chez les bactéries

Published: January 21, 2019 doi: 10.3791/58818
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Microbiology, University of Alabama at Birmingham, 2Division of Infectious Diseases, University of Alabama at Birmingham

Summary

Nous décrivons une méthode simple pour la quantification rapide de polyphosphate inorganique dans diverses bactéries, y compris les espèces Gram négatifs, bactéries gram-positives et mycobactériennes.

Abstract

Polyphosphate inorganique (polype) est un polymère biologique dans les cellules de tous les domaines de la vie et est exigé pour la virulence et la réponse au stress chez les nombreuses bactéries. Il existe une variété de méthodes de quantification polype en biomatériaux, dont beaucoup sont fastidieuses ou insensible, limitant leur utilité. Nous présentons ici une méthode simplifiée pour la quantification des polypes chez les bactéries, en utilisant une extraction de colonne silice membrane optimisée pour un traitement rapide de plusieurs échantillons, digestion du polype avec le polype spécifiques exopolyphosphatase ScPPX et la détection de la phosphate de libre qui en résulte avec un dosage colorimétrique sensible-à base d’acide ascorbique. Cette procédure est simple, peu coûteux et permet la quantification fiable polype dans diverses espèces de bactéries. Nous présentons la quantification de polype représentatifs de la bactérie à gram négatif (Escherichia coli), la bactérie Gram-positive lactiques (Lactobacillus reuteri) et les espèces de mycobactéries (Mycobacterium smegmatis). Nous incluons également un protocole simple pour la purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX, qui n’est pas actuellement disponible dans le commerce.

Introduction

Polyphosphate inorganique (polype) est un biopolymère linéaire d’unités de phosphate lié à phosphoanhydride que l'on retrouve dans tous les domaines de la vie1,2,3. Diverses bactéries, polype est essentiel pour la réponse au stress, motilité, la formation de biofilm, contrôle du cycle cellulaire, la résistance aux antibiotique et virulence4,5,6,7,8 ,9,10,11. Études du polype métabolisme chez les bactéries ont donc la possibilité de déboucher sur des connaissances fondamentales sur la capacité des bactéries causent la maladie et se développent dans divers environnements. Dans de nombreux cas, toutefois, les méthodes permettant de quantifier polype dans les cellules bactériennes sont un facteur limitant dans ces études.

Il y a plusieurs méthodes actuellement utilisées pour mesurer les niveaux de polype en matières biologiques. Ces méthodes impliquent généralement deux étapes distinctes : extraction de polype et quantifier le polype présent dans ces extraits. La méthode actuelle de l’étalon-or, développé pour la levure Saccharomyces cerevisiae par Bru et ses collègues12, polype extraits ainsi que l’ADN et l’ARN à l’aide de phénol et de chloroforme, suivie par précipitation à l’éthanol, le traitement par désoxyribonucléase (DNase) et ribonucléase (RNase) et la digestion du polype purifiée obtenue avec le S. cerevisiae dégradant le polype enzyme exopolyphosphatase (ScPPX)13 à céder gratuitement phosphate, qui est ensuite quantifié à l’aide une Malachite verte essai reposant sur la colorimétrie. Cette procédure est très quantitative, mais fastidieux, limitant le nombre d’échantillons qui peuvent être traitées dans une expérience simple, n’est pas optimisé pour les échantillons bactériens. D’autres ont rapporté extraction polype d’une variété de cellules et de tissus à l’aide de perles de silice (« glassmilk ») ou silice membrane colonnes6,14,15,16,17, 18. Ces méthodes ne retirer pas efficacement à chaîne courte polype (moins de 60 unités de phosphate)12,14,15, bien que cela soit moins préoccupante pour les bactéries, qui sont généralement réputés pour synthétiser principalement polype de longue chaîne3. Anciennes méthodes d’extraction de polype à l’aide d’acides forts19,20 sont n’est plus largement utilisés, étant donné que le polype est instable sous conditions acides12.

Il existe également une variété de méthodes déclarées pour quantifier polype. Parmi les plus courantes est 4′, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI), un colorant fluorescent plus généralement utilisé pour colorer les ADN. DAPI-polype complexes ont des maxima d’excitation et d’émission de fluorescence différente que DAPI-ADN complexes21,22, mais il y a beaucoup d’autres composants cellulaires, y compris les ARN, nucléotides et inositol phosphates12,15,16,23, réduisant la spécificité et la sensibilité des mesures de polype effectuées à l’aide de cette méthode. Alternativement, les polypes et adénosine diphosphate (ADP) peuvent être convertis en adénosine triphosphate (ATP) à l’aide de purifiée Escherichia coli kinase polype (PPK) et l’ATP qui en résulte, quantifiée à l’aide de la luciférase14,17 ,,18. Cela permet la détection de très petites quantités de polype, mais nécessite deux étapes de la réaction enzymatique et luciférine et ADP très pure, qui sont des réactifs coûteux. ScPPX spécifiquement digestions polype en phosphate libre6,12,13,24, qui peut être détectée par des méthodes plus simples, mais ScPPX est inhibée par l’ADN et l’ARN12, nécessitant un traitement DNase et RNase polype contenant des extraits. PPK ni ScPPX sont disponibles dans le commerce, et purification de PPK est relativement complexe25,26.

Polype dans les lysats cellulaires ou des extraits aussi peut être visualisée sur gel de polyacrylamide par DAPI27,28,29,30, une méthode qui permet l’évaluation de la longueur de la chaîne, mais est une coloration négatif bas-débit et mal quantitative.

Nous rapportons un dosage de polype moyen débit, peu coûteux et rapide qui permet la quantification rapide de polype niveaux chez diverses espèces bactériennes. Cette méthode commence par la lyse des cellules bactériennes à 95 ° C en 4 M guanidine isothiocyanate (GITC)14 pour inactiver des phosphatases cellulaires, suivies d’une extraction de colonne silice membrane optimisée pour le traitement rapide des échantillons multiples. L’extrait contenant du polype qui en résulte est ensuite digéré avec un grand excès de ScPPX, éliminant le besoin de traitement DNase et RNase. Nous incluons un protocole pour simple purification d’affinité de nickel de quantités de mg de ScPPX. Enfin, phosphate libre dérivé de polype est quantifié avec un dosage colorimétrique simple, sensible, à base d’acide ascorbique24 et normalisée à total des protéines cellulaires. Cette méthode simplifie la mesure de polype dans des cellules bactériennes, et nous montrer son utilisation avec des espèces représentatives des bactéries à gram négatif, bactéries gram-positives et mycobactéries.

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Protocol

1. purification de levure Exopolyphosphatase (ScPPX)

  1. Transformer la souche de la surexpression de protéines Escherichia coli BL21 (de3)31 avec le plasmide pScPPX26 par électroporation32 ou33de la transformation chimique.
  2. Ensemencer 1 L de bouillon de lysogénie (LB) contenant 100 µg, ampicilline des-1 mL dans une fiole débafflé 2 L avec une seule colonie de BL21 (de3) contenant pScPPX2 et incuber une nuit à 37 ° C, sans agitation, à une absorbance à 600 nm (une600) d’environ 0,3, tel que mesuré dans un spectrophotomètre.
  3. Commencer la culture secouant (180 tr/min) et incuber 30 min à 37 ° C, au cours de laquelle les cellules passera à un A600 de 0,4 - 0,5.
  4. Ajouter isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration finale de 1 mM et le des 100 µg mL-1 ampicilline, puis incuber pendant 4 h à 37 ° C sous agitation à 180 tr/min.
    Remarque : Ce protocole surexpression génère une grande quantité de ScPPX soluble. Toutefois, la surexpression de ScPPX est très indulgente, et une variété d’autres protocoles de la surexpression de protéines communes ont été utilisés pour purifier avec succès ScPPX.
  5. Transférer les cellules dans une bouteille de centrifugeuse de 1 L et leur capture par centrifugation pendant 20 min à 5 000 x g à 4 ° C. Retirez le surnageant et le culot de transfert à un tube conique de 50 mL.
    Remarque : Boulettes de cellule peuvent être stockés indéfiniment à-80 ° C.
  6. Décongeler le culot sur la glace, puis il resuspendre dans 9 mL de 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl et imidazole de 5 mM (pH 8) pour un volume total d’environ 10 mL.
  7. Ajouter (concentration finale) 1 mg mL-1 lysozyme, 2 mM MgCl2et 50 unités mL-1 d’une endonucléase ADN-dégradant le RNA et (voir Table des matières) et incuber pendant 30 minutes sur la glace.
    Remarque : ScPPX lie les acides nucléiques (données non présentées), traitement de nucléase est donc essentiel au cours de la purification.
  8. En utilisant un sonicateur avec un microtip (voir Table des matières), lyse des cellules de 2 cycles de sonication sur glace à 50 % de puissance, impulsions 5 s sur et 5 s, avec un 2 min de repos entre les cycles.
    Remarque : Utiliser une protection auditive appropriée au cours de la sonication. De la même façon à l’affaire avec surexpression, une variété de méthodes de lyse cellulaire sont acceptables pour la purification de ScPPX.
  9. Enlever les débris insoluble en CENTRIFUGEANT le lysat pendant 20 min à 20 000 x g à 4 ° C. Filtrer le liquide surnageant obtenu (environ 10 mL) à travers un filtre de seringue 0,8 µm pore taille acétate de cellulose.
  10. Charger le lysat sur un colonne de chélation nickel-chargé de 5 mL (voir Table des matières) à l’aide d’une pompe péristaltique ou une grande seringue.
  11. Rincer la colonne avec 50 mL d’imidazole de 5 mM 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl (pH 8).
  12. Rincer la colonne avec 50 mL d’imidazole de 20 mM 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl (pH 8).
  13. Éluer ScPPX avec 50 mM HEPES, 0,5 M de NaCl et 0,5 M imidazole (pH 8), collecteurs 15 fractions de 1 mL. Tester ces fractions d’élution pour la teneur en protéines avec la Bradford protéine test34 (voir Table des matières) et exécutez un de gel SDS-PAGE35 pour confirmer les fractions contiennent ScPPX purifié (poids moléculaire = 45 kDa).
  14. Mettre en commun les fractions contenant ScPPX pure et ajuster la concentration de la protéine mise en commun d’environ 2 mg mL-1 avec 50 mM HEPES et 0,5 M de NaCl. Des concentrations plus élevées de protéines peuvent précipiter dans l’étape suivante.
  15. Échanger le ScPPX purifiée dans le tampon de stockage (20 mM Tris-HCl [pH 7.5], 50 mM KCl, glycérol à 10 % [v/v]) par la dialyse. Placer des fractions de ScPPX mise en commun dans une longueur scellée de 12 000-14 000 Da poids moléculaire limite dialyse membrane tube (voir Table des matières) et mettre en suspension dans 1 L de stockage tampon avec agitation continue à 4 ° C pendant au moins 4 h. Répétez cette étape avec frais tampon de stockage pour un total de 3 changements de tampon.
  16. Transférer la protéine purifiée, dialysée dans un tube à centrifuger ou tubes et centrifuger pendant 20 min à 20 000 x g à 4 ° C pour éliminer n’importe quel agrégat insolubles. Transvaser avec soin le surnageant dans un tube conique propre de 15 mL.
  17. Ajuster la concentration de le ScPPX purifié à mg 1 mL-1 avec le tampon de stockage, ajouter 0,1 % (p/v) d’albumine sérique bovine exempt de protéase (BSA ; concentration finale) et magasin pendant 6 mois à 4 ° C.
    Remarque : ScPPX perd plus de 90 % de son activité lorsqu’il est congelé13.

2. récolte des échantillons pour l’Extraction de Polyphosphate

  1. Cultiver des bactéries dans les conditions d’intérêt pour le dosage du polype. Pour ce protocole, poussent de Lactobacillus reuteri36 pendant une nuit à 37 ° C sans trembler dans l’enzyme malique induction (MEI) moyen37 sans cystéine (MEI-C).
  2. Récolter suffisamment de cellules par centrifugation dans un tube de microtubes de 1,5 mL pour un total de 50 à 100 µg de protéines cellulaires (voir étape 3 ci-dessous). Pour e. coli, c’est 1 mL d’une culture en phase log à un A600 de 0,2 - 0,4. Il s’agit de L. reuteri, 1 mL d’une culture d’une nuit ou plus. Ajuster au besoin pour d’autres espèces d’intérêt.
  3. Enlevez complètement le surnageant des granules cellulaires.
  4. Remettre en suspension les granules cellulaires dans 250 µL de tampon de lyse GITC (4 M guanidine isothiocyanate, 50 mM Tris-HCl, pH 7) et lyse par incubation à 95 ° C pendant 10 min. de lysats de magasin à-80 ° C.
    NOTE : Être cohérent avec le temps de lyse, puisque l’incubation prolongée à haute température peut entraîner une dégradation du polype par hydrolyse,38. Lysats peuvent être conservés indéfiniment à-80 ° C.
    Attention : Isothiocyanate de Guanidine est un sel de chaotropes et devrait être manipulé avec des gants et éliminé comme déchets dangereux.

3. mesurer la teneur en protéines de lysats cellulaires

  1. Élaborer des normes de BSA contenant 0, 0,1, 0,2 et 0,4 mg mL-1 de BSA dans le tampon de lyse GITC.
    Remarque : Il est important de faire les normes BSA dans GITC, puisque GITC influe sur le développement de la couleur de l’analyse de Bradford. Normes de BSA peuvent être conservés indéfiniment à-20 ° C.
  2. Aliquote 5 µL de lysats cellulaires décongelés, homogènes et des normes de BSA à différents puits dans une plaque à 96 puits clair.
  3. Ajouter 195 µL de réactif de Bradford34 dans chaque puits et mesurer l’absorbance à 595 nm (un595) dans un lecteur de plaque (voir Table des matières).
  4. Calculer la quantité de protéines dans chaque puits par rapport à la courbe d’étalonnage de BSA, à l’aide de la formule y = mx + b, où y est un595, x est µg de BSA, m est la pente de la courbe d’étalonnage, et b est l’ordonnée à l’origine de la courbe standard. Multipliez la valeur obtenue par 0,05 pour déterminer le total mg de protéine dans chaque échantillon.

4. extraction des polyphosphates

  1. Ajouter 250 µL d’éthanol à 95 % à chaque échantillon GITC-lysées et vortex pour mélanger.
  2. Appliquer ce mélange sur une colonne de silice membrane spin et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
  3. Jeter le cheminement, puis ajoutez 750 µL de 5 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM NaCl, 5 mM EDTA, 50 % d’éthanol et centrifuger pendant 30 s à 16 100 x g.
  4. Jeter le cheminement et centrifuger pendant 2 min à 16 100 x g.
  5. Placer la colonne dans un tube à centrifuger propre 1,5 mL et ajouter 150 µL de 50 mM Tris-HCl (pH 8).
  6. Incuber à température ambiante pendant 5 min, puis éluer le polype par centrifugation pendant 2 min à 8 000 x g.
    Remarque : Si vous le souhaitez, les éluats peuvent être stockés à-20 ° C pendant au moins 1 semaine.

5. digérer Polyphosphate

  1. Élaborer des normes contenant 0, 5, 50 ou phosphate de potassium 200 µM au 50 mM Tris-HCl (pH 8).
    Remarque : Les normes de phosphate de Potassium peuvent être stockés indéfiniment à la température ambiante.
  2. Aliquotes de 100 µL de chaque norme de phosphate et d’extraites des échantillons de polype dans puits séparés d’une plaque 96 puits clair.
  3. Préparer un mélange maître contenant (par exemple) : 30 µL de 5 x ScPPX réaction tampon (25 mM MgCl2, acétate d’ammonium 250 mM, 100 mM Tris-HCl, pH 7,5)13et 19 µL d’H2O 1 µL de ScPPX purifié (mg 1 mL-1).
  4. Ajouter 50 µL du mélange maître dans chaque puits de la plaque à 96 puits. Incuber pendant 15 min à 37 ° C.
    Remarque : Si vous le souhaitez, les polype digérées échantillons peuvent être conservés à-20 ° C indéfiniment.

6. détection de Phosphate libre24

  1. Préparer la solution de détection des base en dissolvant 0,185 g antimoine de tartrate de potassium dans 200 mL d’eau, ajouter 150 mL de 4 N H2SO4, puis en ajoutant 1,49 g d’heptamolybdate d’ammonium. Remuer pour dissoudre, puis l’outil pour un volume final de 456 mL. Filtrer la solution pour enlever les particules et les stocker abri de la lumière à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  2. Préparer une solution d’acide ascorbique 1 M. Boutique abri de la lumière à 4 ° C pendant environ 1 mois.
  3. Préparation d’un stock de travail frais de solution de détection chaque jour en mélangeant 9,12 mL de solution de détection base 0,88 ml d’acide ascorbique 1 M. Laisser la solution de détection à venir à température ambiante avant utilisation.
  4. Ajouter 50 µL de solution de détection pour chaque échantillon et de la norme dans la plaque à 96 puits et incuber à température ambiante pendant environ 2 min permettre le développement de la couleur.
  5. Mesurer l’absorbance à 882 nm avec un lecteur de plaque et calculer la concentration de phosphate de l’échantillon par rapport à la courbe standard de phosphate de potassium.
    Attention : La solution de détection contient des sels toxiques et acides forts. Porter des gants et traiter l’excédent de solution comme un déchet toxique.

7. on calcule le contenu cellulaire Polyphosphate

  1. Convertir les concentrations de phosphate, déterminées à l’étape 6.5 nanomoles de polype dérivés de phosphate dans chaque cellule entière lysat selon la formule suivante :
    polype nmol = 1,5 x (phosphate µM / 10)
    Remarque : La méthode basée sur des courbes standard à l’étape 6 détermine la concentration de phosphate (en µM) dans chaque échantillon de polype 100 µL aliquotés à l’étape 5.2. Pour convertir cette concentration à un certain nombre de nmol, 100 µL est divisé par 106 pour obtenir un volume en L, multiplié par la concentration (µmol L-1), puis multiplié par 1 000 (le nombre de nmol dans un µmol). Cela réduit à divisant la concentration par 10. Le volume total extrait préparé à l’étape 4 est 150 µL, il est donc nécessaire de multiplier la valeur obtenue par 1,5 pour calculer la nmol de phosphate présent dans l’extrait entier.
  2. Normaliser le contenu cellulaire polype de protéines cellulaires totales en divisant le polype nmol par mg de protéine totale dans chaque échantillon déterminé à l’étape 3.4. Polype niveaux sont exprimés en fonction de la concentration d’individuel phosphate libre dérivé de polype.
    Remarque : Dans certains cas, la quantité de dérivés de polype phosphate présent dans un échantillon peut tomber à l’extérieur de la gamme de linéarité de la courbe standard de phosphate (étape 6.5). Si les niveaux de polype sont très élevés, l’éluat contenant du polype excédentaire de l’étape 4.6 peut être dilué 01:10 ou au 1/100, au besoin et ensuite mesuré à nouveau comme décrit aux étapes 5 à 7.

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Representative Results

Les étapes clés du protocole sont schématisés sous une forme simplifiée de la Figure 1.

Pour illustrer l’utilisation de ce protocole avec des bactéries gram-négatives, sauvage, e. coli MG165539 a été passé à la phase logarithmique en milieu riche LB à 37 ° C sous agitation (200 tr/min), puis rincé et incubées pendant 2 h supplémentaires dans morpholinopropanesulfonate-tampon (MOPS) minimale moyenne40 contenant 4 g L-1 de glucose et 0,1 mM K2HPO4, une condition connue pour induire la production de polype14,29. Comme le montre la Figure 2 a, nous avons ne décelé aucun polype dans sauvage de e. coli cultivé chez LB et 192 ± 14 (moyenne ± écart-type [SD]) nmol polype mg-1 de protéine totale en VADROUILLES, conformes aux précédents rapports14,29 . Comme prévu, un ∆ppk mutant6, qui n’a pas de polype kinase41, ne produit aucun polype dans chaque milieu, un ∆ppx mutant6, qui n’a pas d’exopolyphosphatase42, produit environ la même quantité de polype dans le type sauvage et un ∆phoB mutant29, qui est défectueux dans le transport de phosphate, produisent beaucoup moins polype que le sauvage14,29,43.

Pour démontrer l’utilisation de ce protocole avec des bactéries gram-positives, sauvage, L. reuteri ATCC PTA 647536 et un mutant nul isogéniques ppk1 manque de kinase de polype, construit à l’aide d’oligo-réalisé recombineering44, ont été cultivés pendant la nuit en MEI-C à 37 ° C sans agitation. Comme illustré à la Figure 2 b, la sauvage accumulé 51 ± 6 nmol polype mg-1 protéine totale dans ces conditions, alors que le mutant ppk1 contenait moins de la moitié de ce montant. L. reuteri contient une deuxième kinase de polype, codée par le ppk2 gène45, qui vraisemblablement représente le polype se présente chez le mutant null ppk1 .

Pour illustrer l’utilisation de ce protocole avec des mycobactéries, Mycobacterium smegmatis souche SMR546 a été cultivé à phase logarithmique en Hartmans-de Bont (HdB) moyenne47, puis rincés et quintuplé dilué en HdB ou HdB avec 2 % d’éthanol. Ces cultures ont été ensuite incubés durant une nuit à 37 ° C sous agitation (180 tr/min). Comme illustré dans la Figure 2, en l’absence d’éthanol, M. smegmatis accumulé 141 ± 52 nmol polype mg-1 de protéine totale, traitement à l’éthanol a donné lieu à un triplé de 437 ± 102 nmol polype mg-1 de protéine totale. Ce résultat était attendu, puisque l’éthanol a déjà signalé à élever les niveaux de polype dans M. smegmatis48.

Figure 1
Figure 1 : schéma de procédure d’extraction et de mesure de polyphosphate. Les étapes essentielles du protocole de quantification polype sont illustrées. Boulettes de cellules bactériennes sont lysées à 95 ° C en GITC (isothiocyanate de guanidine). Petites parties aliquotes des lysats sont testés pour la teneur en protéines à l’aide de l’analyse de Bradford. Polype est extraite à l’aide de colonnes de membrane de silice et ensuite digéré avec ScPPX. Le phosphate libre qui en résulte est quantifié en utilisant le dosage de l’acide ascorbique. Dérivé de polype totale de phosphate est normalisée de protéines totales pour chaque échantillon. Un595 = absorbance à 595 nm ; Un882 = absorbance à 882 nm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : représentant des résultats avec diverses bactéries. (A), e. coli MG1655 sauvage et isogénique ∆ppket mutantsphoB ∆ ∆ppxont été cultivées à 37 ° C sous agitation (200 tr/min) pour un600 = 0,2 - 0,4 dans le riche milieu LB (cercles noirs) et ensuite déplacé vers un milieu minimal (MOPS contenant 4 g L-1 de glucose et 0,1 mM K2HPO4) pendant 2 h (cercles blancs ; n = 3, ± SD). (B) L. reuteri ATCC PTA 6475 (cercles) et un mutant nul isogéniques ppk1 (triangles) ont été cultivés pendant une nuit à 37 ° C dans un milieu MEI-C sans agitation (n = 3, ± SD). (C) M. smegmatis SMR5 a été cultivé à 37 ° C sous agitation (180 tr/min) pour un600 = 1 en milieu HdB (carrés fermés) ou sans (carrés vides) 2 % d’éthanol (n = 3, ± SD). Polype niveaux sont exprimés en fonction de la concentration d’individuel phosphate libre dérivé de polype. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Le protocole décrit ici simplifie et accélère la quantification des niveaux de polype dans diverses bactéries, avec un ensemble typique de 24 échantillons prenant environ 1,5 h à traiter entièrement. Cela permet le dépistage rapide des échantillons et l’analyse des bibliothèques mutantes et simplifie les expériences cinétiques mesurant l’accumulation de polype au fil du temps. Nous avons démontré que le protocole fonctionne efficacement sur les représentants de trois différents phyla : proteobacteria, firmicutes et actinobacteria, qui sont connus pour leur résilience, difficile de lyse des parois cellulaires,49.

Détection de polypes par digestion avec ScPPX est plus précis et plus sensible que la détection par fluorescence au DAPI et est moins cher et techniquement plus simple que la conversion du polype à l’ATP à l’aide de PPK. Bien que ScPPX est inhibée par l’ADN et l’ARN12, nous avons surmonté cela en utilisant un très grand excès d’enzyme (1 µg par exemple) pour atteindre la digestion complète même chez les bactéries contenant plus de 6 000 nmol polype mg-1 protéine29. Autre méthodes publiées utilisation 10 à 15 ng de ScPPX par réaction12,24. Notre protocole pour la purification de ScPPX entraîne généralement de plus de 5 mg de ScPPX pur par litre de culture surexpression, ce qui est suffisant pour plus de 5 000 tests. Nous avons trouvé que plusieurs protocoles différents pour la purification du nickel-affinité des protéines His-étiquetées fonctionnent bien pour purifier ScPPX surexprimé de pScPPX2 (données non présentées), et il y a une grande variété de tels protocoles disponibles en fonction des laboratoires avec des variables capacités techniques.

Protocoles précédents à l’aide de digestion ScPPX pour la détection de polypes ont souvent compté sur tests colorimétriques basés sur vert malachite à quantifier phosphate libre6,12. Ces tests sont sensibles, mais exigent généralement soigneusement minutée addition séquentielle de deux ou trois réactifs séparés pour faire des mesures précises de50,24,51. Le système de détection à base d’acide ascorbique utilisé ici24 a une plus large gamme linéaire de détection que vert malachite sans perte de sensibilité, n’implique l’addition d’un réactif unique et ne nécessite pas de précision de chronométrage.

Il y a plusieurs étapes qui sont essentiels à la réussite du présent protocole. Tout d’abord, bactériennes des échantillons devraient être lysées dans GITC immédiatement après la récolte, pour s’assurer que les niveaux de polype ne changent pas après le temps d’échantillonnage et d’inactiver rapidement des phosphatases cellulaires. Deuxièmement, ne pas incuber GITC lysats à 95 ° C pendant plus de 10 min et rangez-les immédiatement après à-80 ° C pour réduire au minimum l’hydrolyse polype possible. Troisièmement, soyez prudent lors du pipetage des échantillons dans des plaques de 96 puits pour les mesures de protéines ou de phosphate pas à éclabousser ou quoi que ce soit dans un échantillon égoutter dans un autre. Les dosages colorimétriques, particulièrement pour les phosphates, sont très sensibles, et de petites quantités de contamination peuvent fortement fausser les résultats. Enfin, certains réactifs utilisés dans le présent protocole (c'est-à-dire ScPPX, solution de détection) ont limité les durées de conservation. Préparer ScPPX frais tous les 6 mois et frais solution de détection chaque mois.

Une des limites de notre méthode est que les colonnes de silice ne lient pas de polype phosphate inférieur à 60 unités de temps tres bien12,14,15. Bien que les bactéries synthétisent généralement généralement longue chaîne polype3, nous vous recommandons d’expériences préliminaires à l’aide de27,l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide30 pour évaluer la longueur de la chaîne dans une espèce bactérienne donnée avant d’utiliser notre procédure. Pour les espèces où polype courte chaîne représente une fraction substantielle de la piscine de polype, notre protocole n’est pas approprié et nous recommandons extraction polype par une méthode différente (par exemple, phénol-chloroforme extraction12) et qu’elle recommanderait complétant la digestion ScPPX avec commercialement disponible S. cereviseae pyrophosphatase (PPA1)24, car ScPPX ne digère pas pyrophosphate13 et cela a un impact proportionnellement plus élevé sur des mesures de plus courte chaîne polype. Comme alternative à ScPPX, hydrolyse acide38 pourraient servir à hydrolyser le polype pour libérer le phosphate, mais cela nécessiterait des mesures supplémentaires de DNase, RNase et purification pour s’assurer que seulement polype dérivés de phosphate a été mesurée. Dans certains cas, il peut être utile d’utiliser une méthode alternative d’extraction afin de vérifier si l’efficacité de l’extraction du polype avec GITC varie entre souches ou des conditions, en particulier avec des bactéries connues pour avoir des parois cellulaires épaisses, tels que les mycobactéries. Si les niveaux de polype sous le seuil de détection de ce test sont importantes pour les études d’une espèce particulière, il peut être nécessaire d’utiliser un système de détection différentes, telles que l’utilisation de PPK pour convertir le polype à l’ATP, qui peut être détectée par extrêmement sensible disponible dans le commerce analyses luciférase14,17,18.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce projet a été soutenu par l’Université de l’Alabama au fonds de démarrage de Birmingham département de microbiologie et NIH grant R35GM124590 (à MJG) et NIH subvention R01AI121364 (FW).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
E. coli BL21(DE3) Millipore Sigma 69450
plasmid pScPPX2 Addgene 112877 available to academic and other non-profit institutions
LB broth Fisher Scientific BP1427-2 E. coli growth medium
ampicillin Fisher Scientific BP176025
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Gold Biotechnology I2481C
HEPES buffer Gold Biotechnology H-400-1
potassium hydroxide (KOH) Fisher Scientific P250500 for adjusting the pH of HEPES-buffered solutions
sodium chloride (NaCl) Fisher Scientific S27110
imidazole Fisher Scientific O3196500
lysozyme Fisher Scientific AAJ6070106
magnesium chloride (MgCl2) Fisher Scientific BP214-500
Pierce Universal Nuclease Fisher Scientific PI88700 Benzonase (Sigma-Aldrich cat. # E1014) is an acceptable substitute
Model 120 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-120 other cell lysis methods (e.g. French Press) can also be effective
5 mL HiTrap chelating HP column GE Life Sciences 17040901 any nickel-affinity chromatography column or resin could be substituted
nickel(II) sulfate hexahydrate Fisher Scientific AC415611000 for charging HiTrap column
0.8 µm pore size cellulose acetate syringe filters Fisher Scientific 09-302-168
Bradford reagent Bio-Rad 5000205
Tris buffer Fisher Scientific BP1525
Spectrum Spectra/Por 4 RC Dialysis Membrane Tubing 12,000 to 14,000 Dalton MWCO Fisher Scientific 08-667B other dialysis membranes with MWCO < 30,000 Da should also work
hydrochloric acid (HCl) Fisher Scientific A144-212 for adjusting the pH of Tris-buffered solutions
potassium chloride (KCl) Fisher Scientific P217500
glycerol Fisher Scientific BP2294
10x MOPS medium mixture Teknova M2101 E. coli growth medium
glucose Fisher Scientific D161
monobasic potassium phosphate (KH2PO4) Fisher Scientific BP362-500
dibasic potassium phosphate (K2HPO4) Fisher Scientific BP363-500
dehydrated yeast extract Fisher Scientific DF0886-17-0
tryptone Fisher Scientific BP1421-500
magnesium sulfate heptahydrate Fisher Scientific M63-50
manganese sulfate monohydrate Fisher Scientific M113-500
guanidine isothiocyanate Fisher Scientific BP221-250
bovine serum albumin (protease-free) Fisher Scientific BP9703100
clear flat bottom 96-well plates Sigma-Aldrich M0812-100EA any clear 96-well plate will work
Tecan M1000 Infinite plate reader Tecan, Inc. not applicable any plate reader capable of measuring absorbance at 595 and 882 nm will work
ethanol Fisher Scientific 04-355-451
silica membrane spin columns Epoch Life Science 1910-050/250
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Fisher Scientific BP120500
1.5 mL microfuge tubes Fisher Scientific NC9580154
ammonium acetate Fisher Scientific A637-500
antimony potassium tartrate Fisher Scientific AAA1088922
4 N sulfuric acid (H2SO4) Fisher Scientific SA818-500
ammonium heptamolybdate Fisher Scientific AAA1376630
ascorbic acid Fisher Scientific AC401471000

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References

  1. Rao, N. N., Gomez-Garcia, M. R., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate: essential for growth and survival. Annual Review of Biochemistry. 78, 605-647 (2009).
  2. Achbergerova, L., Nahalka, J. Polyphosphate--an ancient energy source and active metabolic regulator. Microbial Cell Factories. 10, 63 (2011).
  3. Kornberg, A., Rao, N. N., Ault-Riche, D. Inorganic polyphosphate: a molecule of many functions. Annual Review of Biochemistry. 68, 89-125 (1999).
  4. Albi, T., Serrano, A. Inorganic polyphosphate in the microbial world. Emerging roles for a multifaceted biopolymer. World Journal of Microbiology and Biotechnology. 32 (2), 27 (2016).
  5. Gray, M. J., Jakob, U. Oxidative stress protection by polyphosphate--new roles for an old player. Current Opinion in Microbiology. 24, 1-6 (2015).
  6. Gray, M. J., et al. Polyphosphate is a primordial chaperone. Molecular Cell. 53 (5), 689-699 (2014).
  7. Racki, L. R., et al. Polyphosphate granule biogenesis is temporally and functionally tied to cell cycle exit during starvation in Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (12), E2440-E2449 (2017).
  8. Rashid, M. H., et al. Polyphosphate kinase is essential for biofilm development, quorum sensing, and virulence of Pseudomonas aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (17), 9636-9641 (2000).
  9. Candon, H. L., Allan, B. J., Fraley, C. D., Gaynor, E. C. Polyphosphate kinase 1 is a pathogenesis determinant in Campylobacter jejuni. Journal of Bacteriology. 189 (22), 8099-8108 (2007).
  10. Richards, M. I., Michell, S. L., Oyston, P. C. An intracellularly inducible gene involved in virulence and polyphosphate production in Francisella. Journal of Medical Microbiology. 57 (Pt 10), 1183-1192 (2008).
  11. Singh, R., et al. Polyphosphate deficiency in Mycobacterium tuberculosis is associated with enhanced drug susceptibility and impaired growth in guinea pigs. Journal of Bacteriology. 195 (12), 2839-2851 (2013).
  12. Bru, S., Jimenez, J., Canadell, D., Arino, J., Clotet, J. Improvement of biochemical methods of polyP quantification. Microbial Cell. 4 (1), 6-15 (2016).
  13. Wurst, H., Kornberg, A. A soluble exopolyphosphatase of Saccharomyces cerevisiae. Purification and characterization. Journal of Biological Chemistry. 269 (15), 10996-11001 (1994).
  14. Ault-Riche, D., Fraley, C. D., Tzeng, C. M., Kornberg, A. Novel assay reveals multiple pathways regulating stress-induced accumulations of inorganic polyphosphate in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 180 (7), 1841-1847 (1998).
  15. Lee, W. D., et al. Simple Silica Column-Based Method to Quantify Inorganic Polyphosphates in Cartilage and Other Tissues. Cartilage. , (2017).
  16. Martin, P., Van Mooy, B. A. Fluorometric quantification of polyphosphate in environmental plankton samples: extraction protocols, matrix effects, and nucleic acid interference. Applied and Environmental Microbiology. 79 (1), 273-281 (2013).
  17. Cremers, C. M., et al. Polyphosphate: A Conserved Modifier of Amyloidogenic Processes. Molecular Cell. 63 (5), 768-780 (2016).
  18. Dahl, J. U., et al. The anti-inflammatory drug mesalamine targets bacterial polyphosphate accumulation. Nature Microbiology. 2, 16267 (2017).
  19. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 2. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 15-35 (2004).
  20. Werner, T. P., Amrhein, N., Freimoser, F. M. Novel method for the quantification of inorganic polyphosphate (iPoP) in Saccharomyces cerevisiae shows dependence of iPoP content on the growth phase. Archives of Microbiology. 184 (2), 129-136 (2005).
  21. Aschar-Sobbi, R., et al. High sensitivity, quantitative measurements of polyphosphate using a new DAPI-based approach. Journal of Fluorescence. 18 (5), 859-866 (2008).
  22. Kulakova, A. N., et al. Direct quantification of inorganic polyphosphate in microbial cells using 4'-6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Environmental Science and Technology. 45 (18), 7799-7803 (2011).
  23. Kolozsvari, B., Parisi, F., Saiardi, A. Inositol phosphates induce DAPI fluorescence shift. Biochemical Journal. 460 (3), 377-385 (2014).
  24. Christ, J. J., Blank, L. M. Enzymatic quantification and length determination of polyphosphate down to a chain length of two. Analytical Biochemistry. 548, 82-90 (2018).
  25. Ahn, K., Kornberg, A. Polyphosphate kinase from Escherichia coli. Purification and demonstration of a phosphoenzyme intermediate. Journal of Biological Chemistry. 265 (20), 11734-11739 (1990).
  26. Zhu, Y., Lee, S. S., Xu, W. Crystallization and characterization of polyphosphate kinase from Escherichia coli. Biochemical and Biophysical Research Communications. 305 (4), 997-1001 (2003).
  27. Smith, S. A., Morrissey, J. H. Sensitive fluorescence detection of polyphosphate in polyacrylamide gels using 4',6-diamidino-2-phenylindol. Electrophoresis. 28 (19), 3461-3465 (2007).
  28. Livermore, T. M., Chubb, J. R., Saiardi, A. Developmental accumulation of inorganic polyphosphate affects germination and energetic metabolism in Dictyostelium discoideum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (4), 996-1001 (2016).
  29. Rudat, A. K., Pokhrel, A., Green, T. J., Gray, M. J. Mutations in Escherichia coli Polyphosphate Kinase That Lead to Dramatically Increased In Vivo Polyphosphate Levels. Journal of Bacteriology. 200 (6), e00697-e00617 (2018).
  30. Smith, S. A., Wang, Y., Morrissey, J. H. DNA ladders can be used to size polyphosphate resolved by polyacrylamide gel electrophoresis. Electrophoresis. , (2018).
  31. Studier, F. W., Moffatt, B. A. Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. 189 (1), 113-130 (1986).
  32. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: Electroporation. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  33. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Bacterial Transformation: The Heat Shock Method. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  34. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  35. JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).
  36. Mu, Q., Tavella, V. J., Luo, X. M. Role of Lactobacillus reuteri in Human Health and Diseases. Frontiers in Microbiology. 9, 757 (2018).
  37. Alcantara, C., Blasco, A., Zuniga, M., Monedero, V. Accumulation of polyphosphate in Lactobacillus spp. and its involvement in stress resistance. Applied and Environmental Microbiology. 80 (5), 1650-1659 (2014).
  38. Kulaev, I. S., Vagabov, V. M., Kulakovskaya, T. V. Ch. 1. The Biochemistry of Inorganic Polyphosphates. , John Wiley & Sons, Ltd. 3-13 (2004).
  39. Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  40. Neidhardt, F. C., Bloch, P. L., Smith, D. F. Culture medium for enterobacteria. Journal of Bacteriology. 119 (3), 736-747 (1974).
  41. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. The polyphosphate kinase gene of Escherichia coli. Isolation and sequence of the ppk gene and membrane location of the protein. Journal of Biological Chemistry. 267 (31), 22556-22561 (1992).
  42. Akiyama, M., Crooke, E., Kornberg, A. An exopolyphosphatase of Escherichia coli. The enzyme and its ppx gene in a polyphosphate operon. Journal of Biological Chemistry. 268 (1), 633-639 (1993).
  43. Rao, N. N., Liu, S., Kornberg, A. Inorganic polyphosphate in Escherichia coli: the phosphate regulon and the stringent response. Journal of Bacteriology. 180 (8), 2186-2193 (1998).
  44. van Pijkeren, J. P., Britton, R. A. High efficiency recombineering in lactic acid bacteria. Nucleic Acids Research. 40 (10), e76 (2012).
  45. Zhang, H., Ishige, K., Kornberg, A. A polyphosphate kinase (PPK2) widely conserved in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (26), 16678-16683 (2002).
  46. Sander, P., Meier, A., Bottger, E. C. rpsL+: a dominant selectable marker for gene replacement in mycobacteria. Molecular Microbiology. 16 (5), 991-1000 (1995).
  47. Hartman, S., Bont, J. A. M. D., et al. The Prokaryotes, a handbook on the biology of bacteria: ecophysiology, isolation, application. Balows, A., et al. , Springer-Verlag. New York, Inc. 1215-1237 (1992).
  48. Winder, F. G., Denneny, J. M. The metabolism of inorganic polyphosphate in mycobacteria. Journal of General Microbiology. 17 (3), 573-585 (1957).
  49. Jankute, M., Cox, J. A., Harrison, J., Besra, G. S. Assembly of the Mycobacterial Cell Wall. Annual Review of Microbiology. 69, 405-423 (2015).
  50. Carter, S. G., Karl, D. W. Inorganic phosphate assay with malachite green: an improvement and evaluation. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 7 (1), 7-13 (1982).
  51. Cogan, E. B., Birrell, G. B., Griffith, O. H. A robotics-based automated assay for inorganic and organic phosphates. Analalytical Biochemistry. 271 (1), 29-35 (1999).

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Immunologie et Infection numéro 143 Polyphosphate réponse au stress exopolyphosphatase bactéries à gram négatif bactéries gram-positives mycobactéries
Dosage de Polyphosphate inorganique chez les bactéries
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Pokhrel, A., Lingo, J. C.,… More

Pokhrel, A., Lingo, J. C., Wolschendorf, F., Gray, M. J. Assaying for Inorganic Polyphosphate in Bacteria. J. Vis. Exp. (143), e58818, doi:10.3791/58818 (2019).

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