Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging

Published: January 31, 2019 doi: 10.3791/58820
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Nebraska Medical Center

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att karakterisera nukleosomens partiklar på singel-molekyl nivå använda statiska och time-lapse atomic force microscopy (AFM) imaging tekniker. Den beskrivna ytan funktionalisering metoden möjliggör tillfångatagandet av strukturen och dynamiken i nucleosomes i hög upplösning på nanonivå.

Abstract

Kromatin, som är en lång kedja av nukleosomens subenheter, är ett dynamiskt system som möjliggör sådana kritiska processer som DNA-replikation och transkription att ta plats i eukaryota celler. Dynamiken i nucleosomes ger åtkomst till DNA av replikation och transkription maskinerier och bidrar kritiskt till de molekylära mekanismerna bakom kromatin funktioner. Singel-molekyl studier såsom atomic force microscopy (AFM) imaging har bidragit avsevärt till vår nuvarande förståelse av rollen av nukleosomens struktur och dynamik. Det nuvarande protokollet beskriver de steg som gör det möjligt för högupplösta AFM avbildningstekniker att studera den strukturella och dynamiska egenskaper för nucleosomes. Protokollet är illustrerad av AFM data erhållna för de centromer nucleosomes där Histon H3 ersätts med dess motsvarighet centromer protein A (CENP-A). Protokollet börjar med montering av mono-nucleosomes med en kontinuerlig utspädning metoden. Beredning av glimmer substratet functionalized med aminopropyl silatrane (APS-mica) som används för nukleosomens bildtagning är kritiska för AFM visualisering av nucleosomes beskrivs och förfarandet för att förbereda underlaget tillhandahålls. Nucleosomes deponeras på APS-mica ytan är först avbildas med hjälp av statiska AFM, som fångar en ögonblicksbild av nukleosomens befolkningen. Från analyser av dessa bilder, sådana parametrar som storlek av DNA lindad runt nucleosomes kan mätas och denna process är också detaljerade. Time-lapse AFM imaging förfarande i vätskan beskrivs för höghastighetståg time-lapse AFM som kan fånga flera bildrutor av nukleosomens dynamics per sekund. Slutligen är analysen av nukleosomens dynamics möjliggör kvantitativa karakterisering av de dynamiska processerna beskrivs och illustreras.

Introduction

I eukaryota celler är DNA mycket komprimerad och organiserade i kromosomer. 1 den första nivån av DNA organisation inom en kromosom är montering av nucleosomes i vilka 147 bp DNA är tätt lindade runt en Histon octamer kärna. 2 , 3 nucleosome partiklar montera på en lång DNA-molekyl som bildar en kromatin-matris som organiseras sedan tills en mycket kompakt kromosom enhet bildas. 4 disassemblyen av kromatin ger tillgången till fri DNA som krävs av kritiska cellulära processer såsom gen transkription och arvsmassan replikering, vilket tyder på att kromatin är ett mycket dynamiskt system. 5 , 6 , 7 förstå de dynamiska egenskaperna hos DNA på olika kromatin nivåer är kritiskt viktigt klarlägga genetiska processer på molekylär nivå där misstag kan leda till celldöd eller utvecklingen av sjukdomar som cancer. 8 en kromatin egenskap av stor betydelse är dynamiken i nucleosomes. 9 , 10 , 11 , 12 hög stabilitet av dessa partiklar har möjliggjort strukturella karakterisering av kristallografiska tekniker. 2 vad dessa studier saknas är de dynamiska detaljerna för nucleosomes såsom mekanismen för DNA uppackning från Histon kärnan; den dynamiska vägen som krävs för transkription och replikering processer. 7 , 9 , 13 , 14 , 15 , 16 vidare särskilda proteiner kallas remodeling faktorer har visat sig underlätta demonteringen av nucleosomal partiklar17; inneboende dynamiken i nucleosomes är dock den kritiska faktorn i denna process som bidrar till hela demontering processen. 14 , 16 , 18 , 19

Singel-molekyl tekniker såsom enda-molekyl fluorescens19,20,21, optiska svällning (pincett)13,18,22,23 och AFM 10 , 14 , 15 , 16 , 24 , 25 , 26 har varit avgörande för att förstå dynamiken i nucleosomes. Bland dessa metoder, AFM förmåner från flera unika och attraktiva funktioner. AFM gör att man kan visualisera och karaktärisera enskilda nucleosomes samt de längsta matriser27. Från AFM bilder, kan viktiga egenskaper hos nukleosomens struktur såsom längden av DNA lindad runt Histon kärnan vara uppmätta 10,14,26,28. en parameter som är central för karakterisering av nukleosomens uppackning dynamics. Studier har visat nucleosomes vara mycket dynamiska system och att DNA kan spontant packa från Histon core14förbi AFM. Den spontana uppackning av DNA från nucleosomes var direkt visualiseras av AFM verksamma i time-lapse läget när bildtagning sker i vattenlösningar 14,26,29.

Tillkomsten av höghastighetståg time-lapse AFM (HS-AFM) instrumenteringen gjort det möjligt att visualisera nukleosomens uppackning processen på millisekund tidsskala 14,15,24. Senaste HS-AFM 16,30 studier av centromer specifika nucleosomes avslöjade flera nya funktioner i de nucleosomes jämfört med den kanoniska typ. Centromer nucleosomes utgör av en centromer, en liten del av kromosomen kritiskt viktigt för kromosom segregation31. Till skillnad från canonical nucleosomes i bulk kromatin innehåller Histon kärnan i Centromeren nucleosomes CENP-A Histon istället för Histon H332,33. Till följd av detta Histon substitution, DNA inslagning i Centromeren nucleosomes är ~ 120 bp i stället för de ~ 147 bp för kanoniska nucleosomes; en skillnad som kan leda till olika morfologier Centromeren och kanoniska nucleosomes kedjor34, tyder på att centromer kromatin genomgår högre dynamics jämfört med huvuddelen en. Den nya dynamik som visas av centromer nucleosomes i HS-AFM16,30 studier exemplifiera en unik möjlighet som tillhandahålls av denna enda-molekyl teknik att direkt visualisera den strukturella och dynamiska egenskaper för nucleosomes. Exempel på dessa funktioner kort och diskuteras illustreras i slutet av uppsatsen. Detta gjordes framsteg på grund av utvecklingen av nya protokoll för AFM avbildning av nucleosomes samt ändringarna av befintliga metoder. Målet med det protokoll som beskrivs här är att göra dessa spännande framsteg i singel-molekyl AFM nukleosomens studier tillgänglig för alla som vill utnyttja dessa tekniker i sina kromatin-undersökningar. Många av de tekniker som beskrivs är tillämpliga på problem utanför studien av nucleosomes och kan användas för undersökningar av andra protein och DNA system av intresse. Några exempel på sådana program kan hittas i publikationer35,36,37,38,39,40,41, 42,43,44,45,46,47,48,49 och utsikterna för AFM studier av olika Biomolekylär system ges i recensioner29,50,51,53,54.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kontinuerlig utspädning montering av Mono-nucleosomes

  1. Generera och rena en ungefärligt 400 bp DNA substrat som innehåller en off-centrerad Widom 601 nukleosomens positionering sekvens. 55
    Obs: För att begränsa oönskade bildandet av di-nucleosomes, varje 'arm' flankerande positionering sekvensen bör inte överstiga ~ 150 bp.
    1. Använd plasmiden pGEM3Z-601 tillsammans med designade primers och förstärka substrat DNA med PCR. För 423 bp underlaget med 122 och 154 bp arm längder används här, Använd framåt (5'-CAGTGAATTGTAATACGACTC-3') och bakåt (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3') primers.
    2. Lägg till rör som innehåller reaktionsblandningen att en termocykel förvärmts till 95 ° C. Kör följande program för 33 cykler efter en inledande denaturering för 5 min vid 95 ° C: 30 s denaturering på 95 ° C, 30 s glödgning vid 49 ° C, 35 s förlängning vid 72 ° C. Ställa in en sista förlängning vid 72 ° C i ca 10 min efter 33 cykler.
    3. Rena DNA från PCR-blandningen med en kommersiellt tillgänglig PCR rening Kit. När eluering DNA från kolumnen PCR-rensning, använda 10 mM Tris buffert (pH 7,5) i stället för satsen tillhandahålls eluering buffert.
      Obs: Extra försiktig inte att överföra buffertar mellan reningssteg. En förorenad eluenten kan orsaka problem nedströms när mäta DNA-koncentration och/eller kan påverka start salt koncentrationen av nukleosomens montering blandningen.
  2. För att bestämma DNA koncentration genom att mäta absorbansen av renade DNA på 260 nm.
    1. Samla en tom på UV-VIS spektrofotometern använder endast 10 mM Tris pH 7,5 eluering bufferten. Samla en mätning av renade DNA.
  3. Med koncentrationen bestäms, alikvotens 25 pmol av renade DNA i ett 0,6 mL mikrofugrör och placera den i en vakuum centrifug tills lösningen är knappt synlig; Detta är vanligtvis 30 min till 1 h.
    Obs: DNA substratet är nu klara för nukleosomens montering. Annars protokollet kan pausas här och DNA lagras vid-20 ° C fram till användning.
  4. Placera den mikrofugrör med de 25 pmol DNA på isen och tillsätt nukleosomens monteringskomponenterna i tabell 1, i angiven ordning. När alla komponenter har lagts till, ta bort blandningen från isen och inkubera vid rumstemperatur (RT) i 30 min.
    Obs: Det är viktigt att salthalten lager Histon buffertens anses när beräkningen av NaCl behövs för att uppnå 2 M slutliga koncentration. 15 , 56
  5. Montera nucleosomes genom att minska 2 M salt koncentrationen av blandningen till 200 mM med en kontinuerlig takt utspädning. 57
    1. Fyller en spruta med 100 µL förtunningsbuffert som innehåller 10 mM Tris pH 7,5 och placera den på en sprutpump.
    2. Nålen på sprutan genom ett pre punkterad hål i locket på mikrofugrör, att säkerställa kontakt direkt görs med församlingen blandningen (figur 1).
    3. Köra sprutpumpen med en hastighet av 0,75 µL/min för 120 min.
      Obs: Den resulterande 100 µL lösningen innehåller 250 nM nucleosomes och 200 mM NaCl.
    4. Överför blandningen till en 10 K MWCO dialys knapp och dialyze mot 200 mL en pre kylda (4 ° C) låg salt buffert innehållande 10 mM Tris pH 7.5, 0,25 mM EDTA och 2,5 mM NaCl, för 1 hr vid 4 ° C.
  6. För att bedöma Histon innehållet i nukleosomens församlingen, förbereda en diskontinuerlig SDS-PAGE-gel med en 15% separera och 6% stapling som tidigare beskrivna30.
    1. Alikvotens 10-20 µL av nukleosomens lager till ett mikrofugrör och Lägg 4 x Laemmli prov buffert till en fungerande koncentration av 1-2 x. 58
    2. Som en kontroll, upprepa denna beredning i ett separat mikrofugrör för 1-2 µg Histon beståndet. Värm proverna vid 95 ° C i ~ 5 min.
    3. Läsa in proverna i intilliggande körfält till varandra på gelen. Lägga till provet buffert oanvända gränderna och främja även bandet migration.
    4. Kör gelen vid 65 V tills dye främre rör sig genom stapling gelen. När separerande gelen nås, öka till 150 V och kör tills dye framsidan har migrerats helt ur gelen.
    5. Demontera enheten elektrofores och försiktigt överföra gelen till en färgning behållare fylld med dd H2O. Låt gelen sitta i 5 min med försiktig skakning. Upprepa denna process två gånger mer med färska dd H2O används varje gång.
      Obs: Coomassie fläcken används i detta protokoll inte kräver de typiska fastställande steg som behövs för Coomassie fläckar (se Tabell för material). Om en annan Coomassie beredning används, justera fastställande stegen som behövs.
    6. Ta bort vattnet från den sista sköljningen och tillsätt lagom fläcken för att täcka gelen. Låt gelen sitta med mild agitation för minst 1 h.
      Obs: För agitationen, färgning behållaren kan placeras på någon apparat som främjar rörlighet fläcken över gelen samtidigt också hålla gelen omfattas i vätska.
    7. Ta bort fläcken från behållaren och skölj gelen med dd H2O. Ersätt den dd H2O och Blötlägg gelen för 30 min med försiktig skakning. (Gelen ska visas som det visas i figur 2, med tydlig separation mellan banden Histon.)
  7. Lagra nucleosomes vid 4 ° C fram till användning.
    Obs: När de lagras i dessa villkor, nucleosomes förblir stabila under flera månader. Protokollet kan pausas här.

2. funktionalisering av Mica yta för statiska AFM avbildning av Nucleosomes

  1. Förbereda en 50 mM 1-(3-Aminopropyl) silatrane APS stamlösning i avjoniserat vatten som beskrivs. 30 store 1 mL portioner av denna lösning vid 4 ° C fram till användning.
    Obs: Alikvoter kan lagras i mer än ett år vid 4 ° C. 59
  2. Förbereda en fungerande APS 1:300 lösning för glimmer modifiering av upplösning 50 µL av 50 mM APS beståndet i 15 mL dd H2O.
    Obs: Denna fungerande lösning kan förvaras vid rumstemperatur i flera dagar.
  3. Skär 1 x 3 cm remsor av glimmer från högkvalitativa glimmer ark (se Tabell av material för glimmer används här).
    1. Kontrollera att lappa passar när den placeras diagonalt i en kyvetten. Använd spetsen på sharp pincett, rakblad eller tejp, klyva lager av glimmer tills både sidor klyvs nymalet och pjäsen är lika tunn som ~0.1 mm (figur 3A). Omedelbart placera glimmer lappa till den APS fylld kyvetten och inkubera i 30 min (figur 3B).
  4. Överföra glimmer lappa till en kyvetten fylld med dd H2O och blöt i 30 s (figur 3 c). Helt torr båda sidor av APS-mica remsan under en argon flöde.
    Obs: En icke-vävd cellulosa och polyester renrum torka (rekommenderade torka detaljerad i material) kan användas till stöd i fuktspridande vatten från kanten av glimmer vid torkning.
  5. Använd torr glimmer remsan är nu för provpreparering. Annars förvara pjäsen i en ren, torr kyvetten (figur 3D).
    Obs: Ytterligare lagringsutrymme i ett vakuum för 1-2 h rekommenderas när miljön är fuktiga. Protokollet kan pausas här.

3. förberedelse av Nucleosome prover på APS-Mica för statiska AFM Imaging

  1. Applicera double-faced tejp till flera magnetiska puckar och Lägg dem åt sidan.
  2. Skär APS-mica substratet till önskad storlek (1 x 1 cm rutor för MM AFM instrumentet används här). Placera dessa bitar i en ren petriskål och hålla täckt.
  3. Förbered tre utspädningar av de sammansatta nucleosomes (slutliga nukleosomens koncentrationer av 0,5, 1,0 och 2,0 nM) använder en 0,22 µm filtreras buffert innehållande 10 mM HEPES pH 7,5 och 4 mM MgCl2.
    Obs: För att begränsa förlusten av nucleosomes på låg slutliga koncentration, spädningarna bör göras en i taget, omedelbart före avsättning på den APS-mica.
  4. Insättning 5 – 10 µL utspädda nukleosomens provet i mitten av APS-mica lappa och låt Inkubera i två minuter. Skölj försiktigt provet med 2-3 mL dd H2O ta bort alla komponenter som buffert. Efter varje ~0.5 mL dd H2O används, skaka försiktigt den glimmer för att ta bort överflödig sköljvattnet.
    Obs: En engångsspruta rekommenderas för detta skölja steg.
  5. Torka det deponerade provet under ett lättare flöde av ren argongas.
    Obs: Urvalet är nu redo att avbildas eller kan lagras i ett vakuum skåp eller exsickator fylld med argon. Prover beretts och lagrats enligt beskrivningen har varit avbildade ett år efter beredning utan kvalitetsförlust. Protokollet kan pausas här.

4. statisk AFM avbildning av Nucleosomes

  1. Montera en AFM tips på hållaren för tips. Använd ett tips som har en fjäder konstant ~ 40 N/m och en resonansfrekvens mellan 300 och 340 kHz (se Tabell av material för de utliggare som används här).
  2. Montera provet beredd i avsnitt 3 på AFM scenen att vara noga med att inte kontakta prov ytan.
  3. Positionera lasern över uthänget tills summan är högst och justera vertikala och laterala böjning värdena till nära noll.
  4. Tune AFM sonden för att hitta dess resonansfrekvens och justera enheten amplituden och ange bildstorlek till 100 x 100 nm. Klicka på knappen engage för att påbörja metoden.
  5. När närmade sig, gradvis optimera amplitud börvärdet tills ytan av provet syns tydligt. Öka skanningsstorlek till 1 x 1 µm och upplösningen till 512 x 512 pixlar. Klicka på capture-knappen följt av knappen engage att börja bild förvärv.
    Obs: Bilderna i figur 4 visar slät bakgrund som kan förväntas när imaging dessa prover.
  6. För att analysera nukleosomens provet, öppna de tagna bilderna med hjälp av AFM instrument analys programvara.
    1. Platta till bilden med en polynom linje subtraktion eller liknande funktion.
    2. Duka upp färg motsvarar det lägsta värdet för minst och det högsta värdet för maximal. Föra ett register över dessa värden för varje bild som de kommer att behövas i ett senare steg.
      Obs: Om dessa värden inte används, höjd data att vara felaktiga i den sena analysen som tvärsnitt av nukleosomens kärnor visas som platåer av lika, snarare än varierande höjd.
    3. Exportera bilden som en TIFF-bild på den ursprungliga storleken. Avmarkera alla alternativ för att spara bilden med en kantlinje eller skala barer.
    4. Öppna bilden i analysprogram kan kontur längd mätningar.
    5. Ange x, y och z skalor att matcha bilden.
    6. Som en Invändig längd kalibrering, mät och anteckna kontur längden på gratis DNA från ena änden till den andra. För denna kalibreringsfaktorn, använda mätningarna att generera ett histogram och passar det med en (Gaussisk) normalfördelningen. Dela upp stadens peak (x-c) av substrat längden i baspar.
      Obs: Detta värde är bilden specifika konverteringsfaktorn från nanometer till bas par av DNA.
    7. Mät och anteckna kontur längden på båda armarna för varje nukleosomens från den fria änden av armen till mitten av kärnan, för konsekvens (figur 5A).
    8. För varje nukleosomens kärna, samla två hela bredd vid halva maximala (FWHM) värden från ett vinkelrätt par core tvärsnitt mätningar (figur 5B genomsnitt två FWHM mätningarna och dra ifrån hälften av det resulterande värdet från varje nukleosomens arm till rätta för uppmätta längden från exit/posten DNA till stadens kärna som ingår inte i armlängd.
    9. Dela varje armlängd av beräknade kalibreringsfaktorn (steg 4.5.6) att erhålla arm längder i DNA baspar.
    10. Beräkna omfattningen av DNA inslagning genom att subtrahera nukleosomens arm summan från totala baspar längden av oförpackade substratet. Rita dessa värden som ett histogram och passa slutvolym med en normal (Gaussisk) fördelning att erhålla medelvärdet inslagna basparen i DNA för nukleosomens befolkningen.
    11. Beräkna genomsnittliga nukleosomens höjd från de uppmätta tvärsnitt. Rita detta som ett histogram och passa slutvolym med en normal (Gaussisk) fördelning att få höjden av nukleosomens befolkningen.

5. time-Lapse AFM avbildning av Nucleosome Dynamics

  1. Montera AFM spetsen på hållaren för tips. En sond med en fjäder konstant på cirka 0,1 N/m och en resonansfrekvens på 7-10 kHz kan användas (se listan material för de utliggare som används här).
  2. Bifoga en 1 × 1 cm bit av APS-glimmer i en magnetisk puck med dubbel-stick tejp och montera pucken på AFM instrumentet.
  3. Späd nucleosomes till en 1 nM koncentration i en 0,22 µm filtrerade imaging buffert innehållande 10 mM HEPES pH 7,5 och 4 mM MgCl2.
  4. Insättning 5 – 10 µL av den utspädda nukleosomens i mitten av glimmer lappa för 2 min. Skölj deponerade provet med 20µL imaging buffertens två gånger. Efter den andra sköljningen, hålla en droplet Imaging buffert på ytan.
  5. Använd kamerans ovansida för att hitta tips och förhållningssätt till ytan manuellt tills spetsen är ~ 100-500 µm från ytan.
  6. Lägga till ytterligare tänkbar buffert för att fylla gapet mellan spetsen och ytan. I det här exemplet räcker ca 50 µL av imaging buffert att fylla tomrummet. Hitta en resonans topp för tipset.
  7. Påbörja det datorstyrda förhållningssättet till ytan. När närmade sig, börja imaging med en 1-2 µm området välja ett ~ 500 nm intresseområde. Med detta intresseområde som valts, justera data förvärv densiteten till 512 x 512 pixlar.
  8. Justera börvärdet spänningen och köra amplitud parametrar att förbättra bildkvaliteten. En gratis amplituden av 10 nm eller mindre och en avsökningshastighet av ~ 2 Hz kan användas för att fånga Kvalitetsbilder. Ett exempel på nukleosomens dynamics tagits med time-lapse AFM visas i figur 6.

6. höghastighetståg Time-Lapse AFM avbildning av Nucleosome Dynamics

Obs: Protokollet nedan tillhandahålls för HS-AFM instrumentet utarbetas av gruppen Ando (Kanazawa universitet, Kanazawa, Japan). 60

  1. Förbereda APS-mica för flytande avbildning.
    1. Tillmäter AFM scanner scenen med hjälp av glasstaven - scanner lim glasstaven (se Tabell för material). Låt detta torka i minst 10 min.
    2. Göra ~0.1 mm tjocka runda bitar av glimmer med 1,5 mm diameter genom stansning dem från ett större glimmer-blad. Använda HS-AFM glimmer-glas rod limmet (se Tabell för material) för att fästa smycket glimmer glasstaven på HS-AFM och torr, orörda i minst 10 minuter. Cleave lager med en tryckkänslig tejp tills ett väl klyvs lager ses på bandet.
    3. Späd 1 µL 50 mM APS lager i 99 µL dd H2O göra en 500 µM APS lösning. Sätta in 2,5 µL av denna lösning på nybakade klyvs glimmer ytan och låt functionalize i 30 min.
      Obs: För att förhindra uttorkning av ytan medan funktionaliserar, locket på en 50 mL konisk centrifugrör kan passa med en fuktig bit filtrerpapper och placeras över skannern. APS beståndet späds 3 gånger mindre för flytande avbildning än för statisk avbildning för att styra dynamiken till en ränta som kan observeras med AFM.
    4. Skölj glimmer med 20 µL av dd H2O genom att tillämpa flera ~ 3 µL sköljningar. Ta bort vatten helt efter varje sköljning genom att placera en icke-vävda torka vid kanten av glimmer. Efter den sista sköljningen, placera ~ 3 µL av dd H2O på ytan och låt det sitta i minst 5 min att ta bort eventuella nonspecifically bundna APS.
  2. Placera sonden i HS-AFM hållaren och placera hållaren på AFM scenen med spetsen uppåt. Skölj innehavaren använder ~ 100 µL av dd H2O följt av två ~ 100 µL sköljningar av 0,22 µm filtreras nucleosomes imaging buffert som innehåller 10 mM HEPES pH 7,5 och 4 mM MgCl2.
  3. De sköljningar gjort, fylla kammaren med ~ 100 µL av nukleosomens imaging buffert, dränka spetsen. Justera fribärande position tills det är träffar med laser. Skölj den APS-glimmer med 20 µL av filtrerade nukleosomens imaging buffert, använder ~ 4 µL per skölj.
  4. Späd 1 µL av nukleosomens montering beståndet till 250 µL av filtrerade nukleosomens imaging buffert för en sista nukleosomens koncentration av 1 nM. Sätta in 2,5 µL denna utspädning på ytan och låt det sitta i 2 min. Skölj ytan med ~ 4 µL av nukleosomens imaging buffert två gånger. Efter den sista sköljningen, lämna ytan täckt i imaging buffert.
    Obs: Om ytan inte sköljs efter insättning nukleosomens provet, ytan kommer snabbt bli överfulla.
  5. Ange skanner och prov ovanpå spets innehavaren så att provet är vänd nedåt. Till att börja med metoden med funktionen auto-strategi med en börvärdet amplitud, ens nära fri svängning amplituden A0.
    Obs: Helst ens = 0,950, dock på 82% av0 fungerar också om försiktig.
  6. Justera börvärdet tills ytan väl spåras.
    Obs: För att minimera överföringen av energi från AFM spets till nukleosomens provet, amplituden av uthänget bör hållas små, med amplituder så lågt som 1 nm optimal.
  7. Ange bildområdet runt 150 x 150 nm till 200 x 200 nm med förvärvet datahastighet för ~ 300 ms per imaging ram.
    Obs: Denna bildstorlek är normalt tillräcklig för att fånga dynamiken i flera nucleosomes samtidigt. En mindre befolkade yta kan kräva ändringar av dessa parametrar. Föreslagna bildfrekvensen är tillräcklig för att fånga nukleosomens dynamics såsom looping, glidande och uppackning, bland annat (se representativa resultat nedan).

7. analys av Nucleosome Dynamics tagits med Time-Lapse AFM

  1. Konvertera bilder från HS AFM datatypen (ASD) till TIFF-bilder.
    1. Platta till bilderna med AFM systemets analys programvara med antingen plan eller linje funktioner tills bakgrunden har enhetliga kontrast.
    2. Ange bildens kontrast (färgskala) till automatisk.
      Obs: Kontrasten kan justeras manuellt för presentationssyfte men inte för analys. Detta orsakar höjd information att gå förlorad i de konverterade bilderna.
    3. Spara det markerade området av bilder som en .mov-fil. Avmarkera skalstapeln och gränsar alternativ innan du sparar.
      ANTECKNINGAR: Gör inte analys på bilder som har skala barer i ramen. Dessa ändra storleken på bilden och kommer att resultera i falskt mätningar.
    4. Konvertera mov-filen till tiff-bilder med hjälp av en lämplig programvara (se Tabell för material). Använda samma bildhastighet för konvertering som användes när du skapar MOV-filen.
  2. För arm längd kontur mätningar, öppna bilderna i en mätning programvara klarar av denna mätning typ (se Tabell för material).
    1. Ange bildens dimensioner att matcha dem som det fångades.
    2. Mät kontur längden på varje nukleosomens arm från slutet av armen till stadens nukleosomens kärnan och anteckna måtten i ett kalkylblad (figur 4A).
    3. Mät längden av oförpackade DNA substratet i ramarna efter en nukleosomens unwraps. Använda detta för en film specifika kalibrering av förhållandet nm/bp som används för nukleosomens inslagning beräkningar
    4. Samla in två tvärsnitt profiler för nukleosomens kärnan och två för bare DNA (figur 4B).
    5. Importera de tvärsnitt profilerna till ett kalkylprogram och normalisera tomter genom att subtrahera det lägsta z-värdet från alla punkter i profilen.
    6. Beräkna höjden och full bredd högst hälften (FWHM) för varje tvärsnitt och genomsnittliga värdena från de två profilerna för varje bildruta.
  3. Subtrahera hälften för FWHM från var och en av nukleosomens armar är tomt som ett spridningsdiagram tillsammans med den beräknade summan av armarna.
    1. Beräkna den genomsnittliga kontur längden från DNA mätningarna för DNA i bildrutor efter nukleosomens oöppnade.
    2. Bestämma nm/bp kalibreringsfaktorn genom att dividera medelvärdet kontur längden på gratis DNA av längden baspar i DNA substratet. Använda detta värde för att beräkna nukleosomens omslag i varje ram, som beskrivs i avsnitt 5.12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Mono-nucleosomes var först förberedda för AFM imaging experiment med en kontinuerlig utspädning montering metod (figur 1). De beredda nucleosomes kontrollerades sedan använda diskontinuerligt SDS-PAGE (figur 2). En glimmer yta var nästa functionalized använder APS, som fångar nucleosomes på ytan samtidigt som en slät bakgrund för högupplöst avbildning (figur 3). Nucleosomes sattes in på APS-mica och var därefter avbildas med hjälp av statiska AFM imaging. Som en kontroll för församlingen och nedfall, H3 mono-nucleosomes var beredda och avbildas med hjälp av statiska AFM. En bild av de H3 mono-nucleosomes (figur 4A) ger en ögonblicksbild av nukleosomens befolkningen som det fanns ögonblick innan nedfall, bekräftar att nucleosomes monterades framgångsrikt. 2 nM nukleosomens nedfall enligt en enhetlig fördelning av nukleosomens och DNA partiklar över ytan och väldigt lite att ingen trängsel observerades.

Med H3 kontroll montering en framgång tillämpades nästa presenteras metoder för studier av CENP-A nucleosomes. Statiska AFM avbildning av exemplet (figur 4B) avslöjade att församlingen var en framgång. För att demonstrera påverkan av nukleosomens koncentration på ytan partikel densiteten, de CENP-A nucleosomes sattes in på 1 nM (figur 4B), jämfört med 2 nM används för H3 (figur 4A). Detta resulterade i en minskad yta partikel täthet för CENP-A provet till ungefär hälften att H3 provet. Från statisk AFM bilder, höjd och tur antalet mono-nucleosomes präglades (figur 5). Både vinkeln mellan gratis DNA armarna och längden på gratis DNA armarna användes för att bestämma antalet DNA vänder i den individuella nukleosomens.

Time-lapse AFM avbildning av nucleosomes i buffert användes för att visualisera det övergripande spontana uppackning uppförandet av nucleosomes (figur 6). Att mäta vinkeln mellan nukleosomens armar och kontur längden på armarna tillåts för slå numret skall fastställas i ramarna under uppackning processen (Figur 6 B-C). Som tur antalet i nukleosomens minskar, har en motsvarande minskning i volymen nukleosomens core också observerats (figur 6 c). Höghastighetståg time-lapse AFM användes nästa sond mer intrikata nukleosomens dynamiken som missade med hjälp av standard time-lapse imaging. Denna teknik förmåga att fånga dynamiken under en lång tid var viktigt att visualisering av en långväga flyttning av en CENP-A nukleosomens kärna (figur 7) som fångades under loppet av ~ 1200 ramar. Denna teknik var också kritisk fånga sällsynta överföring av en CENP-A nukleosomens kärna från en DNA-substrat till en annan (figur 8). Snabb bild fånga priset (~ 300 ms/ram) möjliggjort visualisering av denna dynamiska händelse, eftersom det bara tog flera bildrutor att slutföra.

Tabell 1: reagenser som behövs för kontinuerlig salt gradient nukleosomens montering. Var och en av de komponenter som anges läggs till den mikrofugrör med renade DNA. Detta bör göras i den ordning som reagenserna som listas i tabellen, med vatten och NaCl läggs först, följt av H2A/H2B dimeren och den Histon tetramer lagt till senast. Om pre vikta Histon octamers skall användas, lägga till i samma förhållande som för tetramer ovan. * Ta del av NaCl innehåll i varje Histon bestånden och justera den 5 M NaCl för att lägga till således finalen [NaCl] ska vara lika 2M.  (Se tabell material).

Figure 1
Figur 1: Schematisk av sprutpumpen används för hur provtagningsutrustningen skall nukleosomens montering. Montering blandningen är positionerat för att vara i kontakt med slutet av sprutans nål. Som utspädningen levereras buffert av sprutpumpen till församlingen blandningen koncentrationen av NaCl minskas, att främja nukleosomens församling. Denna siffra är anpassad från Stumme-Diers et al. 30 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: SDS-PAGE av sammansatta nucleosomes. Lanes 1 och 2 innehåller de H3-octamer och CENP-A montering av histoner, respektive. Lanes 3 och 4 innehåller de monterade H3-nucleosomes och de monterade CENP-A nucleosomes, respektive. Jämförelse av de sammansatta nucleosomes Histon bara kontrollerna Lanes, bekräfta att nucleosomes monterades korrekt. Den tecknade schematiskt ovanför varje lane anger vilka Histon komponenter är närvarande. Denna siffra är anpassad från Stumme-Diers et al. 30 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Schematisk bild av processen att förbereda APS functionalized glimmer för AFM avbildning av nucleosomes. (A) en bit av mica ~0.1 mm i tjocklek har båda sidor nymalen klyvs. (B) klyvs glimmer lappa omgående placeras diagonalt i en kyvetten innehållande APS lösningen och är inställd på Inkubera i 30 min. (C) följande the APS funktionalisering steg, APS-mica verket överförs till en kyvetten fylld med dd H2 O för en 30 s-skölj. (D) den APS-mica bit lagras i en kyvetten fram till användning.   Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: exempel AFM bilder av H3 och CNEP-A nucleosomes. (A) exempelbild av H3 mono-nucleosomes deponeras på APS-mica, fångas med hjälp av statiska AFM. Varje ljusa blob är en nukleosomens core partikel med kompletterande DNA regioner visas som nudel-liknande vapen. Lång nudel-liknande funktioner är gratis DNA-partiklar som inte är associerade med en Histon kärna. För denna bild användes en 2 nM nukleosomens koncentration, som ger en jämn fördelning över ytan, med liten eller ingen trängsel. (B), exemplet nukleosomens deponerades på 1 nM och är mycket mindre befolkad än 2 nM används i (A). Detta visar den direkta effekt som nukleosomens utspädning har på ytan tätheten av nucleosomes. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: visuell skildring av den analys som används för att karakterisera inslagning och höjd partiklarna i nukleosomens. (A) A representativa nukleosomens partikel från bilderna som de visas i figur 3. Varje nukleosomens arm kontur längd mäts från slutet av armen till mitten av kärnan (prickade gröna linjer).  Plottning tvärsnitt profiler (röda och blå linjerna) av en nukleosomens producera kurvor visas i (B) från dessa kurvor, höjd och bredd detalj av partikel kan bestämmas.  (C) Schematisk bild av de olika insvept påstår av nucleosomes. (D) varje inslagna stat kännetecknas med vinkeln mellan DNA armarna, antalet DNA varv och bp inslagna DNA. Skalstapeln = 20 nm. Denna siffra är anpassad från Ljubtjenko et al. 24 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6. Exempel på time-lapse AFM bilder fånga den spontana uppackning av nucleosomes. (A) A serie av på varandra följande AFM bilder av den spontana uppackning nucleosomes fångas av kontinuerlig skanning i bufferten. Storleken på varje bildruta är 200 nm och bilder fångades i en takt på ~ 170 s per bildruta. (B) som uppackning processen fortskrider i varje bildruta, arm längder av nukleosomens ökar, (C) vilket resulterar i en minskning av DNA vänder runt nukleosomens. Denna tur nummer kan bestämmas från antingen de uppmätta arm längderna (svart) eller vinkeln mellan nukleosomens armar (röd). Eftersom antalet tur minskar, en minskning av nukleosomens volym har också observerats (blå kurva, höger axel). Varje bildruta är 200 x 200 nm i storlek. Denna siffra är anpassad från Ljubtjenko et al. 24 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7. Demonstration av höghastighetståg time-lapse AFM hög kapacitet för lång bild förvärv gånger (A) A galleri av bilder från mer än 1200 ramar visar beteendet translokation av en CENP-A nucleosomes kärna. Varje bild fångades med en hastighet av ~ 300 ms/ram. (B) Contour längd mätningar från ena änden av DNA substratet CENP-A kärnan används för att karakterisera denna långa translokation process. Skalstapeln = 25 nm. Denna siffra är anpassade från Stumme-Diers o.a. 16 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8. Exempel på dynamisk nukleosomens core transfer tagits med höghastighetståg time-lapse AFM (figur anpassad från Stumme-Diers et al. 16 (A) valda ramar visar spontan överföring av en CENP-A nukleosomens kärna från en DNA-substrat till en annan. Denna process ägde rum inom flera bildrutor som fångades med en hastighet av ~ 300 ms/ram. (B) en schematisk bild av överföringsprocessen visas i (A). Skalstapeln = 25 nm. Denna siffra är anpassade från Stumme-Diers o.a. 16 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollet beskrivs ovan är ganska enkelt och ge mycket reproducerbara resultat, även om några viktiga frågor kan understrykas. Functionalized APS-mica är viktiga substrat för att få tillförlitliga och reproducerbara resultat. En hög stabilitet av APS-glimmer är en av de viktigaste inslagen i detta substrat som gör att man kan förbereda imaging underlaget i förväg för användning som kan användas minst två veckor efter förbereds. 59 , 61 dock ytan kan skadas av ångor av lim om det används för glimmer montering på metall pucken. Därför är det rekommenderat att använda dubbla stick tape för den glimmer montering som beskrivs i protokollet (avsnitt 2). I fall när användning av lim är nödvändigt, rekommenderas till exempel vissa användare använda lim för montering av glimmer på metall diskar för imaging i vätska, följande procedur ändras från det som beskrivs i avsnitt 6.1.3 för provpreparering för HS-AFM imaging . Mica är limmade till metall disken eller annat fast material och klyvs när limmet är stelnat. Blåsa i glimmer med argon ta bort potentiella ångor av limmet. Sedan glimmer kan vara klyvs med scotch tape och APS glimmer arbetslösning placerade för att täcka nymalen klyvs glimmer remsan. Mängden lösningen beror på glimmer strip storlek. Tillåta APS reagera i 30 min. För att minimera avdunstning, kör reaktionen i en våt petriskål. Använd följande procedur: blöt lab torka papper och plats är längst ned i petriskål. Placera en 5 mm tjock plast disk på våtservetter och sätta metall disken med limmade glimmer på det. Undvik kontakt med vatten på botten av petriskål. Efter 30 min, ta bort glimmer/disk församlingen och skölj glimmer ytan med dd vatten och pipett som beskrivs i avsnitt 6.1.3. Ytan är redo för prov nedfall. APS koncentrationen behöver justeras i experiment med DNA, även om arbetar APS lösning (1:300) beskrivs i avsnitt 2.2 bör vara en bra utgångspunkt. I det protokoll som beskrivs i avsnitt 6.1.3 där förfarandet för avbildning av nucleosomes med HS-AFM beskrivs, den trefaldigt högre koncentrationen av APS (1: 100) användes.

Protokollet beskrivs baseras på glimmer funktionalisering med APS. Detta är den mest robusta, mycket reproducerbara och enkel procedur. Den enda nackdelen är att APS, aminopropyl silatrane är inte kommersiellt tillgängliga. Men förfarandet för APS syntesen är okomplicerad och protokollet för dess syntes beskrivs i detalj. 59 om syntes förfarande är problematiska, kommersiellt tillgängliga reagens, aminopropyltriethoxy silan (APTES) kan användas för glimmer funktionalisering (AP-glimmer). Samma papper ger protokollet för beredning av AP-glimmer med ångor av APTES. Förfarandet testades och används för avbildning av topologically olika typer av DNA 35,36,50,62,63 och olika protein-DNA komplex inklusive nucleosomes. 27 , 50 , 64 på samma sätt som APS-mica, AP-mica är stabil under veckorna och kan förberedas i omgångar; AP-mica ytan är så smidig som APS-mica och ganska okänsligt för buffert sammansättning, så att proverna kan förberedas i buffertlösningar med pH-värden upp till pH10 och Joniska styrkor mellan 1 mM och 200 mM NaCl. 59 , 65 den enda nackdelen med användning av AP-mica är möjligheten med aminopropyl silan att hydrolysera och montera i aggregat på ytan under time-lapse imaging i vatten, även om denna process är ganska långsam med aggregaten som kan vara skiljer sig på ytan, så högupplösta bilder av DNA kan erhållas. 35 hydrolys av silatrane delen är mycket långsam, så inga synliga aggregat ses under långsiktig imaging; 26 , 35 , 56 , 66 , APS-mica är därför att föredra substratet jämfört med AP-mica om imaging i vatten är anställd. För reproducerbarhet använder APTES, rekommenderas destillation av reagens i utarbetandet av AP-mica. Protokollet för APTES destillering beskrivs i papper 59.

AFM, fungerar som en enda molekyl teknik med nukleosomens koncentrationer på intervallet nanomolar och att nucleosomes kan spontant dissociera vid sådana låga koncentrationer. Enligt vår data 25uppstår dissociation processen i tiotals minuter tyder på att provet för AFM studier bör förberedas strax före nedfall. Vissa rengöringsmedel såsom 3-[(3-Cholamidopropyl) dimethylammonio] -1-propanesulfonate (käkar) öka stabilitet och nukleosomens så nucleosomes öka livslängden med flera tiopotenser 25, men användningen av rengöringsmedel bör göras med försiktighet. Vi visade i 25 att stabiliseringen av nucleosomes åtföljs av ändringen av sekvens specificitet, så nukleosomens även med användning av en sådan sekvens specifika motiv som Widom 601 mall, montera utan en specificitet på bindande till 601 sekvens.

Det finns ett antal viktiga frågor med den föreslagna metoden i förhållande till andra AFM prov förberedelse metoder. Först APS-mica och AP-mica substrat är stabila över veckor och kan förberedas i omgångar; ytorna är släta och ganska okänsligt för buffert sammansättning så att proverna kan tillagas i fungera som buffertlösningar med pH-värden upp till pH10 och Joniska styrkor mellan 1 mM och 200 mM NaCl. 59 , 65 ingen av de befintliga metoderna matcha dessa egenskaper. Andra AFM är en enda molekyl teknik och kräver ett mycket litet urval. Protokollet beskrivs driver med nanoskala mängder av preparatet. För det tredje, i time-lapse AFM studier, och HS-AFM dataförvärvet finns det en betydande mängd tid som krävs för att generera och karakterisera de stora datamängder som förvärvats. Den metod som beskrivs här är väl lämpad för att analysera hundratals AFM bilder.

Den prov förberedelse metoden är inte begränsad till nukleosomens typ prover. Utan det är okänsligt för typ av de protein-DNA-komplex och har redan tillämpats på ett antal proteiner som erkänner specifika sekvenser på DNA, e.g. begränsningar enzymer 67,68,69, enkelsträngat DNA bindande proteiner 44,45,56,70,71 tillsammans med komplexa protein system inblandade i DNA-replikering 47,72 och rekombination68,73. Ännu viktigare, har HS-AFM tillämpats på dessa system att följa dynamiken i dessa system.  Dessa studier gör det möjligt att tillämpa utvecklade metoder för karakterisering av nukleosomens matriser som föreslås i och belysa den roll av sådan centromer specifika proteiner som centromer protein B (CENP-B) eller C (CENP-C) i Centromeren församling och förstå sin roll i utvecklingen av många cancerformer33,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

Acknowledgments

Författare bidrag: YLL och MSD utformade projektet. MSD monterade nucleosomes. MSD och ZS utförs AFM experiment och data analyser. Alla författare skrev och redigerade manuskriptet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plasmid pGEM3Z-601 Addgene, Cambridge, MA 26656
PCR Primers IDT, Coralville, IA Custom Order (FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3' (RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
DreamTaq polymerase ThermoFischer Scientific, Waltham, MA EP0701 Catalog number for 200 units
PCR purification kit Qiagen, Hilden, Germany  28104 Catalog number for 50 units
Tris base Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 10708976001 Catalog number for 250 g
EDTA ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 15576028 Catalog number for 500 g
(CENP-A/H4)2, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0010 Catalog number for 50 ug
H2A/H2B, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 15-0311 Catalog number for 50 ug
H3 Octamer, recombinant human EpiCypher, Durham, NC 16-0001 Catalog number for 50 ug
Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device Kit, 10K MWCO, 0.1 mL ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 69574 Catalog number for 10 devices
Sodium Chloride Sigma-Aldrich, St. Louis, MO S9888-500G Catalog number for 500 mg
Amicon Ultra-0.5 mL Centrifugal Filters  Millipore-sigma, Burlington, MO UFC501008 Catalog number for 8 devices
HCl Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 258148-25ML Catalog number for 25 mL
Tricine Sigma-Aldrich, St. Louis, MO T0377-25G Catalog number for 25 g
SDS Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 11667289001 Catalog number for 1 kg
Ammonium Persulfate (AmmPS)  Bio-Rad, Hercules, CA 1610700 Catalog number for 10 g
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 Bio-Rad, Hercules, CA 1610158 Catalog number for 500 mL
TEMED Bio-Rad, Hercules, CA 1610800 Catalog number for 5 mL
4x Laemmli protein sample buffer for SDS-PAGE Bio-Rad, Hercules, CA 1610747 Catalog number for 10 mL
2-ME Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M6250-10ML Catalog number for 10 mL
ageRuler Prestained Protein Ladder  ThermoFischer Scientific, Waltham, MA 26616 Catalog number for 500 uL
Bio-Safe™ Coomassie Stain Bio-Rad, Hercules, CA 1610786 Catalog number for 1 L
Nonwoven cleanroom wipes: TX604 TechniCloth  TexWipe, Kernersvile, NC TX604
Muscovite Block Mica AshevilleMica, Newport News, VA Grade-1
Aminopropyl silatrane (APS) Synthesized as described in 22
HEPES Sigma-Aldrich, St. Louis, MO H4034-25G Catalog number for 25 g
Scotch Tape Scotch-3M, St. Paul, MN
TESPA-V2 afm probe (for static imaging) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
MSNL-10 afm probe (for standard time-lapse imaing) Bruker AFM Probes, Camarillo, CA
Aron Alpha Industrial Krazy Glue Toagosei America, West Jefferson, OH AA480 Catalog number for 2 g tube
MgCl2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M8266-100G Catalog number for 100 g
Millex-GP Filter, 0.22 µm Sigma-Aldrich, St. Louis, MO SLGP05010 Catalog number for 10 devices
BL-AC10DS-A2 afm probe (for HS-AFM) Olympus, Japan
Compound FG-3020C-20  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
Compound FS-1010S135-0.5  FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japan 
MultiMode Atomic Force Microscope Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, CA
High-Speed Time-Lapse Atomic Force Microsocopy Toshio Ando, Nano-Life Science Institute, Kanazawa University, Kakuma-machi, Kanazawa, Japan

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184 (4139), 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mäder, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Å resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
  3. Clark, D. J. Nucleosome Positioning, Nucleosome Spacing and the Nucleosome Code. Journal of biomolecular structure. 27 (6), 781-793 (2010).
  4. Poirier, M. G., Oh, E., Tims, H. S., Widom, J. Dynamics and function of compact nucleosome arrays. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (9), 938-944 (2009).
  5. Li, B., Carey, M., Workman, J. L. The Role of Chromatin during Transcription. Cell. 128 (4), 707-719 (2007).
  6. Venkatesh, S., Workman, J. L. Histone exchange, chromatin structure and the regulation of transcription. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 16, 178 (2015).
  7. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews in Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  8. Adam, S., Polo, S. ophieE., Almouzni, G. Transcription Recovery after DNA Damage Requires Chromatin Priming by the H3.3 Histone Chaperone HIRA. Cell. 155 (1), 94-106 (2013).
  9. Ahmad, K., Henikoff, S. Epigenetic Consequences of Nucleosome Dynamics. Cell. 111 (3), 281-284 (2002).
  10. Filenko, N. A., Palets, D. B., Lyubchenko, Y. L. Structure and dynamics of dinucleosomes assessed by atomic force microscopy. Journal of amino acids. 2012, 650840 (2012).
  11. Hihara, S., et al. Local nucleosome dynamics facilitate chromatin accessibility in living mammalian cells. Cell reports. 2 (6), 1645-1656 (2012).
  12. Jiang, C., Pugh, B. F. Nucleosome positioning and gene regulation: advances through genomics. Nature reviews. Genetics. 10 (3), 161-172 (2009).
  13. Brennan, L. D., Forties, R. A., Patel, S. S., Wang, M. D. DNA looping mediates nucleosome transfer. Nature Communications. 7, https://www.nature.com/articles/ncomms13337 - supplementary-information 13337 (2016).
  14. Lyubchenko, Y. L. Nanoscale nucleosome dynamics assessed with time-lapse AFM. Biophysical Reviews. 6 (2), 181-190 (2014).
  15. Miyagi, A., Ando, T., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes assessed with time-lapse high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 50 (37), 7901-7908 (2011).
  16. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Hashemi, M., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale dynamics of centromere nucleosomes and the critical roles of CENP-A. Nucleic Acids Research. 46 (1), 94-103 (2018).
  17. Narlikar, G. eetaJ., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. Mechanisms and Functions of ATP-Dependent Chromatin-Remodeling Enzymes. Cell. 154 (3), 490-503 (2013).
  18. Ngo, T. T., Zhang, Q., Zhou, R., Yodh, J. G., Ha, T. Asymmetric Unwrapping of Nucleosomes under Tension Directed by DNA Local Flexibility. Cell. 160 (6), 1135-1144 (2015).
  19. Ruth, B., Wietske, K., Kirsten, M., John van, N. spFRET reveals changes in nucleosome breathing by neighboring nucleosomes. Journal of Physics: Condensed Matter. 27 (6), 064103 (2015).
  20. Buning, R., van Noort, J. Single-pair FRET experiments on nucleosome conformational dynamics. Biochimie. 92 (12), 1729-1740 (2010).
  21. Koopmans, W. J. A., Brehm, A., Logie, C., Schmidt, T., van Noort, J. Single-Pair FRET Microscopy Reveals Mononucleosome Dynamics. Journal of Fluorescence. 17 (6), 785-795 (2007).
  22. Brower-Toland, B. D., et al. Mechanical disruption of individual nucleosomes reveals a reversible multistage release of DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (4), 1960 (1960).
  23. Bennink, M. L., et al. Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers. Nature Structural Biology. 8 (7), 606-610 (2001).
  24. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Chromatin Protocols. Chellappan, S. P. , Springer New York. 27-42 (2015).
  25. Menshikova, I., Menshikov, E., Filenko, N., Lyubchenko, Y. L. Nucleosomes structure and dynamics: effect of CHAPS. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 2, 2129-2137 (2011).
  26. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of nucleosomes revealed by time-lapse atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (33), 7842-7848 (2009).
  27. Yodh, J. G., Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Woodbury, N., Lohr, D. Evidence for nonrandom behavior in 208-12 subsaturated nucleosomal array populations analyzed by AFM. Biochemistry. 38 (48), 15756-15763 (1999).
  28. Filenko, N. A., et al. The role of histone H4 biotinylation in the structure of nucleosomes. PLoS One. 6 (1), e16299 (2011).
  29. Lyubchenko, Y. L. Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R. , John Wiley & Sons, Ltd. Chichester. 1-24 (2013).
  30. Stumme-Diers, M. P., Banerjee, S., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Nanoscale Imaging: Methods and Protocols. Lyubchenko, Y. L. , Springer. New York. 225-242 (2018).
  31. Cleveland, D. W., Mao, Y., Sullivan, K. F. Centromeres and Kinetochores. Cell. 112 (4), 407-421 (2003).
  32. Rosin, L. F., Mellone, B. G. Centromeres Drive a Hard Bargain. Trends in Genetics. 33 (2), 101-117 (2017).
  33. McKinley, K. L., Cheeseman, I. M. The molecular basis for centromere identity and function. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17 (1), 16-29 (2016).
  34. Lyubchenko, Y. L. Centromere chromatin: a loose grip on the nucleosome. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (1), 8 (2014).
  35. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of supercoiled DNA with atomic force microscopy in situ. Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (2), 496-501 (1997).
  36. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Aki, T., Adhya, S. Atomic force microscopic demonstration of DNA looping by GalR and HU. Nucleic Acids Research. 25 (4), 873-876 (1997).
  37. Herbert, A., et al. The Zalpha domain from human ADAR1 binds to the Z-DNA conformer of many different sequences. Nucleic acids research. 26 (15), 3486-3493 (1998).
  38. Oussatcheva, E. A., et al. Structure of branched DNA molecules: gel retardation and atomic force microscopy studies. Journal of Molecular Biology. 292 (1), 75-86 (1999).
  39. Gaillard, C., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Strauss, F. Structural analysis of hemicatenated DNA loops. BMC Struct Biol. 2 (1), 7 (2002).
  40. Potaman, V. N., et al. Unpaired structures in SCA10 (ATTCT)n.(AGAAT)n repeats. Journal of Molecular Biology. 326 (4), 1095-1111 (2003).
  41. Virnik, K., et al. "Antiparallel" DNA loop in gal repressosome visualized by atomic force microscopy. Journal of Molecular Biology. 334 (1), 53-63 (2003).
  42. Pavlicek, J. W., et al. Supercoiling-induced DNA bending. Biochemistry. 43 (33), 10664-10668 (2004).
  43. Karymov, M., Daniel, D., Sankey, O. F., Lyubchenko, Y. L. Holliday junction dynamics and branch migration: single-molecule analysis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (23), 8186-8191 (2005).
  44. Shlyakhtenko, L. S., et al. Nanoscale structure and dynamics of ABOBEC3G complexes with single-stranded DNA. Biochemistry. 51 (32), 6432-6440 (2012).
  45. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. Y., Miyagi, A., Lyubchenko, Y. L. Specificity of binding of single-stranded DNA-binding protein to its target. Biochemistry. 51 (7), 1500-1509 (2012).
  46. Shlyakhtenko, L. S., et al. APOBEC3G Interacts with ssDNA by Two Modes: AFM Studies. Scientific Reports. 5, 15648 (2015).
  47. Sun, Z., Tan, H. Y., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Remodeling of RecG Helicase at the DNA Replication Fork by SSB Protein. Scientific Reports. 5, 9625 (2015).
  48. Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. SSB and the RecG DNA helicase: An intimate association to rescue a stalled replication fork. Protein Science. 26 (4), 638-649 (2017).
  49. Zhang, Y., et al. High-speed atomic force microscopy reveals structural dynamics of alpha-synuclein monomers and dimers. Journal of Chemical Physics. 148 (12), 123322 (2018).
  50. Lyubchenko, Y. L. DNA structure and dynamics: an atomic force microscopy study. Cell Biochem Biophys. 41 (1), 75-98 (2004).
  51. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. AFM for analysis of structure and dynamics of DNA and protein-DNA complexes. Methods. 47 (3), 206-213 (2009).
  52. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A. Atomic force microscopy imaging and probing of DNA, proteins, and protein DNA complexes: silatrane surface chemistry. Methods in Molecular Biology. 543, 337-351 (2009).
  53. Lyubchenko, Y. L. Nanoimaging methods for biomedicine. Methods. 60 (2), 111-112 (2013).
  54. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Imaging of DNA and Protein-DNA Complexes with Atomic Force Microscopy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 26 (1), 63-96 (2016).
  55. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).
  56. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S., Ando, T. Imaging of nucleic acids with atomic force microscopy. Methods (San Diego, Calif). 54 (2), 274-283 (2011).
  57. Luger, K., Rechsteiner, T. J., Richmond, T. J. Preparation of nucleosome core particle from recombinant histones. Methods in enzymology. 304, 3-19 (1999).
  58. Gallagher, S. R. One-dimensional SDS gel electrophoresis of proteins. Current protocols in immunology. , Chapter 8 Unit 8.4 (2006).
  59. Shlyakhtenko, L. S., Gall, A. A., Lyubchenko, Y. L. Cell Imaging Techniques: Methods and Protocols. Taatjes, D. J., Roth, J. , Humana Press. 295-312 (2013).
  60. Uchihashi, T., Ando, T. Atomic Force Microscopy in Biomedical Research: Methods and Protocols. Braga, P. C., Ricci, D. , Humana Press. 285-300 (2011).
  61. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Visualization of DNA and protein-DNA complexes with atomic force microscopy. Methods in molecular biology. 1117, 367-384 (2014).
  62. Lyubchenko, Y. L., Shlyakhtenko, L. S. Proceeding of the Fourth International Workshop: STM-AFM-SNOM: New Nanotools for Molecular Biology. , Foundation Fourmentin-Guilbert. 20-34 (1997).
  63. Kato, M., et al. Interarm interaction of DNA cruciform forming at a short inverted repeat sequence. Biophys J. 85 (1), 402-408 (2003).
  64. Yodh, J. G., Woodbury, N., Shlyakhtenko, L. S., Lyubchenko, Y. L., Lohr, D. Mapping nucleosome locations on the 208-12 by AFM provides clear evidence for cooperativity in array occupation. Biochemistry. 41 (11), 3565-3574 (2002).
  65. Lyubchenko, Y. L., Gall, A. A., Shlyakhtenko, L. S. Atomic force microscopy of DNA and protein-DNA complexes using functionalized mica substrates. DNA-Protein Interactions: Principles and Protocols. , 569-578 (2001).
  66. Lyubchenko, Y. L. Preparation of DNA and nucleoprotein samples for AFM imaging. Micron. 42 (2), 196-206 (2011).
  67. Gilmore, J. L., et al. Single-molecule dynamics of the DNA-EcoRII protein complexes revealed with high-speed atomic force microscopy. Biochemistry. 48 (44), 10492-10498 (2009).
  68. Shlyakhtenko, L. S., et al. Molecular mechanism underlying RAG1/RAG2 synaptic complex formation. J Biol Chem. 284 (31), 20956-20965 (2009).
  69. Suzuki, Y., et al. Visual Analysis of Concerted Cleavage by Type IIF Restriction Enzyme SfiI in Subsecond Time Region. Biophysical. 101 (12), 2992-2998 (2011).
  70. Shlyakhtenko, L. S., Lushnikov, A. J., Li, M., Harris, R. S., Lyubchenko, Y. L. Interaction of APOBEC3A with DNA assessed by atomic force microscopy. PloS one. 9 (6), e99354 (2014).
  71. Pan, Y., et al. Nanoscale Characterization of Interaction of APOBEC3G with RNA. Biochemistry. 56 (10), 1473-1481 (2017).
  72. Sun, Z., Hashemi, M., Warren, G., Bianco, P. R., Lyubchenko, Y. L. Dynamics of the Interaction of RecG Protein with Stalled Replication Forks. Biochemistry. 57 (13), 1967-1976 (2018).
  73. Pavlicek, J. W., Lyubchenko, Y. L., Chang, Y. Quantitative analyses of RAG-RSS interactions and conformations revealed by atomic force microscopy. Biochemistry. 47 (43), 11204-11211 (2008).

Tags

Biokemi fråga 143 AFM time-lapse nukleosomens kromatin dynamik struktur histoner singel - molekyl DNA epigenetik imaging
Sondera strukturen och dynamiken i Nucleosomes med hjälp av Atomic Force Microscopy Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T.,… More

Stumme-Diers, M. P., Stormberg, T., Sun, Z., Lyubchenko, Y. L. Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging. J. Vis. Exp. (143), e58820, doi:10.3791/58820 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter