Summary
在这里, 我们提出了两个方案, 一个用于测量特定的生长速率, 另一个是利用斑块分析和 rt-qpcr 来测量轮状病毒的细胞结合能力。这些协议可用于确认轮状病毒株之间表型的差异。
Abstract
轮状病毒是婴儿腹泻的主要病因。它是一种双链 rna 病毒, 由于其变异率很高, 形成了基因多样化的种群, 被称为准物种。在这里, 我们描述如何测量轮状病毒作为其表型的特定生长速度和细胞结合能力。轮状病毒用胰蛋白酶治疗, 以识别细胞受体, 然后接种到 m104 细胞培养中。上清液, 包括病毒后代, 是间歇性收集的。斑块检测用于确认每个采集的上清液的病毒滴度 (斑块形成单位: pfu)。通过将 pfu ml 的时程数据拟合改进后的贡珀兹模型, 估计了具体的增长率。在细胞结合检测中, 24 孔板中的 m104 细胞感染轮状病毒, 在4°c 下孵育 90分钟, 以便轮状病毒吸附到细胞受体中。低温抑制轮状病毒侵入宿主细胞。在洗涤以去除未结合的病毒后, rna 从附着在细胞受体上的病毒中提取, 然后进行 cdna 合成和逆转录酶定量 pcr (rt-qpcr)。这些方案可用于研究病毒株之间的表型差异。
Introduction
rna 病毒形成了一个基因多样化的群体, 被称为准物种1, 因为它们的突变率,2高于 dna 基生物。准物种的种群结构受种群遗传因素的影响, 包括突变、选择压力和遗传漂移。由于遗传多样性的原因, 单一遗传谱系内的菌株可能表现出不同的表型。例如, rachmadi 等人表明, 源于斑光纯化株 s7-pp3 的小鼠诺如病毒株对游离氯的敏感性是不同的.
轮状病毒 (龙生科轮状病毒属) 是非包有的 rna 病毒, 形成准物种2。除了上述群体遗传因素外, 基因组重组还影响轮状病毒的遗传多样性, 因为该病毒有11个分段基因组 4.轮状病毒主要在婴儿中引起腹泻, 2013年婴儿死亡人数估计约为 250000 人5 人。有两种疫苗在几个国家使用, 并有效地减轻了轮状病毒感染的负担, 但一些研究人员现在正在讨论疫苗逃逸突变体6,7, 8 的存在,9. 这些突变体的特性对于了解疫苗逃逸机制很重要。
在这里, 我们提出了两个检测的协议, 以评估轮状病毒的具体生长速度和细胞结合能力, 以了解字符串/突变体之间的表型差异。轮状病毒的生长曲线已在以前的 10份报告中提出, 但通常不测量特定增长率等生长参数。以前进行的细胞结合检测涉及免疫荧光染色技术11。我们在这里展示了更简单的方法, 使用斑块检测和 rt-qpcr, 使我们能够定量地讨论病毒表型的差异。这些方法适合轮状病毒表型的鉴定, 最终可能有助于构建对多种基因型有效的新疫苗。
Protocol
1. 中等准备
- 为制备细胞培养基 (含血清培养基), 在500毫升蒸馏水中加入4.7 克鹰的 mL 粉。在120°c 的高压灭菌器20分钟内, 让介质冷却至室温。加入胎儿牛血清 (最终浓度: 10%)、l-谷氨酰胺 (2mm)、青霉素链霉素 (1%) 和碳酸氢钠 (1.125 gl)。在4°c 下存放1个月。
- 按照步骤1.1 中的描述, 准备无血清的培养基, 但不使用胎儿牛血清。在4°c 下存放1个月。
- 在斑块检测中, 采用高压灭菌方法对鹰的 mL 培养基 (不含酚红) 进行100毫升的灭菌。让介质冷却到室温, 然后加入2% 的 fbs、2% 的青霉素链霉素、4mm l-谷氨酰胺和 2.25 g/L nahco3。存放在4°c。
- 在斑块检测中, 用高压灭菌器对2.5% 琼脂糖凝胶的100毫升进行灭菌。在进行斑块检测的当天准备凝胶。将凝胶存放在47°c 的水浴中。
2. 细胞培养
- 从液氮容器中取出含有 ma104 细胞系的冷冻管。将低温管放在37°c 的水浴中, 以解冻细胞。在 t75 瓶中的含血清介质中加入1毫升的细胞悬浮液。将烧瓶在37°c 和 5% co 2 的孵化器中孵育2或 3天 。
请注意:悬浮液中的最终细胞浓度约为 106 细胞。 - 一旦细胞单层达到80% 的融合度, 取出上清液, 用 1x dulbecco pbs (磷酸盐缓冲盐水) 的5毫升将细胞洗两次。
- 在烧瓶中加入4毫升0.05% 的胰蛋白酶 edta, 在37°c 孵育 5分钟, 将细胞从烧瓶中分离。将细胞悬浮液转移到 190 x g 的15毫升管和离心机上5分钟。
- 丢弃上清液, 在1.1 中制备的1毫升含血清介质中重新悬浮颗粒细胞 (106个细胞)。用培养基将重新悬浮的细胞稀释100倍。
- 将稀释后的细胞悬浮液分别加入3毫升, 加入6井 (用于斑块检测) 或24孔板 (用于细胞结合检测)。在37°c 和 5% co 2 的孵化器中孵育板, 在饱和蒸气下孵育2或3天。
请注意:t75 烧瓶适用于收集时间过程样本, 因为与总上清液体积 (30 毫升) 相比, 上清液 (1 毫升) 的样品体积可以忽略。同时, 通过斑块检测测量病毒在每个上清液中的传染性滴度, 斑块检测通常使用6孔板进行。24孔板用于细胞结合试验。
3. 轮状病毒的特定生长速率
请注意:在本协议中使用了恒河轮状病毒 (rrv, 基因型: G3P[3]), 因为 rrv 可以快速、轻松地与 m104 细胞形成斑块。
- 将含有1毫升病毒悬浮液 (107 pfuml) 的管放入在-80°c 储存在37°c 水浴中的无血清介质中解冻。从猪胰腺加入1μμμl 胰蛋白酶到病毒悬浮液的1毫升 (最终胰蛋白酶浓度为 4μg/ml), 然后进入涡旋。在37°c 和 5% co2 下在饱和蒸气下培养病毒悬浮液30分钟。
请注意:胰蛋白酶可以使用其他来源, 但对轮状病毒传染性的影响需要提前测试。 - 用无血清介质稀释激活的病毒悬浮液, 以将感染的多样性 (moi) 调整为 0.1 pfu 细胞。
- 在细胞电镀 (2.1) 3天后, 将稀释后的病毒悬浮液加入 t75 烧瓶中的 mad104 细胞系 (80% 融合), 在37°c 孵育 1小时, 每15分钟轻轻摇晃一次烧瓶。
- 然后, 从猪胰腺加入含有0.13μgl 胰蛋白酶的无血清介质30毫升到烧瓶中。在37°c 和 5% co2 的饱和蒸汽下培育烧瓶 。
- 在感染后的0、6、12、18、24和 36 (和/或 48) 时 (hpi) 收集烧瓶中的上清液1毫升, 并使用移液器更换 1.5 ml 管中的上清液。
- 进行冷冻 (-80°c), 并在37°c 循环的水浴中熔化三次。然后在4°c 下, 以 12, 600 x克的温度离心管10分钟。收集上清液。
- 用蒸馏0.2μm 过滤器过滤上清液, 去除细胞分数。将上清液-80°c 储存在冰箱中, 直到将其应用于斑块检测中, 以测量病毒滴度。
- 将含有收集到的上清液 (步骤 3.5) 的管放在37°c 的水浴中。将4μgml 胰蛋白酶加入1毫升稀释样品的1毫升中, 在37°c 孵育30分钟。
- 在3.8 的30分钟孵育过程中, 为了开始检测从时间过程样本 (步骤 3.5) 中获得的病毒滴度的斑块检测, 在去除含血清介质后, 在6孔板中两次清洗 mL 细胞, 2 毫升为 1x pbs。
- 用无血清介质连续稀释培养的样品, 并将稀释后的样品1毫升接种到每口井中。在37°c 下将板材孵化 90分钟, 在饱和蒸汽下培养 5% co 2, 每15分钟轻轻摇晃一次。
- 孵育后, 将接种物从6孔板上取出。在制备的介质 (步骤 1.3) 中加入4μgml 胰蛋白酶。轻轻但立即加入3毫升的介质与琼脂糖凝胶混合 (比例为 1:1) 到每口井。
- 将板材在室温下保持10分钟以上 (直到琼脂糖凝胶变硬), 在37°c 下孵育 2天, 在饱和蒸汽下孵育 5% co 2。
请注意:将与琼脂混合的介质从井边倒出来。 - 在每口井中加入1毫升用 1x pbs 稀释的0.015 中性红色溶液, 在37°c 和 5% co 2 下在饱和蒸汽下孵育。在3小时后取出染料, 在37°c 下孵育 1天, 在饱和蒸汽下孵育5% 二氧化碳.
- 第二天, 数一数每口井的斑块数量, 计算出。在斑块检测前仔细检查细胞融合, 以确保斑块数量。
4. 细胞结合检测
请注意:该协议以吉林的报告13为基础。
- 从猪胰腺加入1μgμμl 胰蛋白酶到病毒悬浮液的1毫升 (最后胰蛋白酶浓度为 4μg/ml), 然后进入涡旋 (与2.1 中的相同方式)。用无血清介质稀释病毒悬浮液, 以调整 1 pfum-cell 的 moi。
- 然后, 用1毫升的三管盐水 (tbs; 2.53 gl tris 基, 6.54 g/l ncl, 0.3 g/l kcl, 0.046 g/l kcl, 0.046 g/2 hpo4 用蒸馏水到达1 l), 在24毫升的板上清洗 m104 细胞。
- 将稀释后的病毒悬浮液100μl 接种到具有细胞的24孔板的每口井上, 在4°c 孵育 90分钟, 每15分钟轻轻晃动一次。
- 取出病毒接种, 用1毫升的 tbs 清洗细胞两次。要提取轮状病毒的双链 rna, 请在每口井中加入140μl 的 1x pbs 和560μl 的 rna 提取缓冲液 (见材料表)。与移液器充分混合 (约10倍或直到看不到缓冲液中细胞的阴霾或污染物)。
- 根据制造商的协议回收双链 rna (dsrna) 后, 将含有 dsrna 提取物的 1.5 ml 管放在95°c 的热块上 5分钟, 使 dsrna 变性, 然后立即将管放在冰上并孵育2分钟以上最小值。
- 使用逆转录酶试剂盒合成 cdna (见材料表)。在含有16μl 混合物的 pcr 管中加入4μl 的病毒 rna 溶液 (表 1), 并将其与移液器仔细混合, 以免产生气泡。旋转下来的管。
- 在表 2所示条件下, 使用热循环器执行逆转录酶。如果未立即使用 cdna, 请将含有 cdna 的 pcr 管在-20°c 下存储长达1年。
- 使用引物进行定量 pcr (前; 5 '-acacacacacacacacacccc-3 ', 反向; 5 '-ggatacatacccc-3 ')14和插入淬火器的探针 (qpr 探针; 5 '/famgacacachencher/attatamatatatatacatacatacatma-3 ' 3 ', 目标是96–1049轮状病毒 nsp3 基因组段区域 (st3 菌株, genbank: x81436)。
注 : quencher 入曾等人设计的探头 . - 用 pcr 级水连续稀释标准质粒 (101至 106 copiesl) 到 qpcr 混合物 (表 3), 并在表4下制作qpcr 的主混合物 (20μl/t"样品)。
- 将主混合物的20μl 加入96孔 pcr 板的井中, 然后通过移液10次混合5μl 的 cdna 样本或5μl 的标准质粒。根据表 4所示的条件开始 qpcr 系统的反应。
- 要计算与 m104 细胞表面结合的轮状病毒基因组, 在 ct 值和标准质粒的已知基因组数之间进行线性回归, 并估计样本的基因组数。然后计算与细胞结合的维里翁数与初始接种 (g0) 的比值。
Representative Results
图 1 a 和2 a分别概述了纯化型 rrv 菌株的特异性生长率和细胞结合试验。
在特定生长速率的测定中, 在 t75 烧瓶上繁殖时, 最终病毒滴度达到 10 7 pfukl 以上。如果最大浓度低于 107 pfu ml, 则 ma104 细胞可能没有产生融合, 或者胰蛋白酶没有很好地激活 rrv。一些生长模型可用于使用传染性单位数据估计具体增长率。在该协议中, 以修改后的贡珀兹模型12为例;
其中 n0 (本研究中的 10 4 pfu/ml) 和 nt ( 104 至10 8 pfu-ml ) 是病毒感染滴定仪 (pfu/ml) 在0和 t (例如: 0, 6, 12, 18, 24, 36) hpi, 分别为渐近值 [log (n/n0]] (例如: 3 到 4), μ是特定的增长率 [半], e 是 napier 的常数, 是滞后期 [h]。通过分析软件的求解函数得到模型参数, 最大限度地减少了观测值和建模值之间的平方和。在图 1 b 中的示例中, 通过将最小二乘法应用于修改后的贡珀兹模型, 估计具体增长率 (μ) 为 0.197 [-5], 滞后期 () 为 6.61 [h], 而在固定阶段, 病毒的相对滴度为初始滴度 (日志刻度) (a) 为 3.15 [日志 (nn0)]。我们总共测试了6个轮状病毒克隆, 估计的具体增长率值在0.19 到0.19 之间 [半]。这些估计值是可靠的, 因为模型拟合中的确定值系数超过0.98。
在使用24孔板进行细胞结合试验时, 与细胞表面结合的 rrv 维瑞子约为 103 copiesml (结合效率约为 1%) (图 2b)。该检测通常对每个样品进行三次, 如果在样品中观察到复制编号的较大差异, 则可能会出现一些问题, 如胰蛋白酶过度清洗和 rrv 激活不足等。在 qpcr 条件下, qpcr 的 ct 值超过约36.0 是不可取的, 并且被认为低于检测极限。
| Volume/反应 | |
| 5个 primescript 缓冲区 | 4.0μl |
| primescript rt 酶混合 i | 1.0μl |
| 奥利戈 dt 底漆 | 1.0μl |
| 随机 6 mers | 4.0μl |
| 去离子蒸馏水 | 6.0μl |
| ssrna 样本 | 4.0μl |
| 总 | 20.0 μl |
表 1: 轮状病毒基因组 cdna 合成的主混合组合成分。
| 温度 [°c] | 时间 |
| 37。 | 15分钟 |
| 42 | 15分钟 |
| 85 | 5秒 |
| 4个 | ∞ |
表 2: 轮状病毒基因组 cdna 合成的反应条件。
| volume1 反应 | |
| 预混料 taq | 12.5μl |
| 正向底漆 (10μm) | 0.5μl |
| 反向底漆 (10μm) | 0.5μl |
| 探头 (10μm) | 0.5μl |
| 参考染料 ii | 0.5μl |
| 去离子蒸馏水 | 5.5μl |
| cdna 样本 | 5.0 微米 |
| 总 | 25μl |
表 3: 轮状病毒 a 基因组定量 pcr 的主混合组合物。
| 温度 [°c] | 时间 | |
| 95 | 5分钟 | |
| 94 | 20秒 | 45个循环 |
| 60 | 1分钟 | |
| 72 | 5分钟 |
表 4: 轮状病毒 a 基因组定量 pcr 的反应条件。
图 1: 轮状病毒生长估计和轮状病毒生长曲线的示意图概述.(a) 用斑块检测轮状病毒的传染性单位进行测量。(b) 根据我们实验室 (白圈) 观测数据, 用改进的贡佩茨模型逼近曲线 (蓝线)。具体增长率 [μ];0.197 [h-1], 滞后期 ();6.61 [h], 相对病毒滴度在静止阶段到初始滴度 (日志刻度) (a);3.15 [log (nn 0]。请点击这里查看此图的较大版本.
图 2: 我们实验室从斑块中纯化的五种 rrv 菌株的细胞结合试验示意图和具有代表性的结果.(a) 接种轮状病毒的细胞培养板在4°c 孵育, 以抑制病毒侵入细胞。在培养和去除未结合的病毒颗粒进入细胞后, 用 rt-qpcr 量化从结合病毒颗粒到细胞表面的基因组数量。(b) 细胞结合测定的结果显示为结合效率 (%), 即结合病毒颗粒与接种剂中存在的病毒颗粒的比率。粗体条: 中值, 框的结尾: 四分位偏差, 行尾: 最大值和最小值。请点击这里查看此图的较大版本.
Discussion
我们测量特定生长速度的协议比以前的协议更容易, 可以适应其他病毒, 除非它们的细胞培养系统尚未建立。在这项研究中, 我们使用 rrv (G3P[3)), 因为这种菌株可以形成斑块比人类轮状病毒时使用 m104 细胞系。一些人轮状病毒株不能在这个细胞系中形成斑块。因此, 焦点形成单元 (ffu) 检测15或组织培养感染剂量 (tcid50) 中位数法 (tcid50) 可用于许多轮状病毒株16, 而不是斑块分析。所提出的确定特定生长率的协议可用于其他病毒类型, 但不适用于尚未建立细胞培养系统的病毒。在开始特定生长速度的实验之前, 最好在初步测试中提前了解病毒感染滴定仪何时开始增加并达到固定阶段。如果有太多斑块存在, 应在改变病毒样本的稀释率后再次进行斑块检测。感染后收集样本的时间也很重要, 因为如果错过了到达固定阶段的适当时间点, 指数增长阶段的坡度可能会被低估。在改进的贡珀兹模型的近似中, 应始终计算和检验确定系数。如果对修改后的贡珀茨模型的适用性较低, 则其他生长模型, 如修改后的逻辑模型12可能更可取。
在处理细胞时, 当去除培养基或病毒接种时, 用于清洗或琼脂糖凝胶进行斑块检测的 pbs 必须及时添加到细胞培养板的每口井中, 以防止细胞干燥。同时, 你必须轻轻地将 pbs 或琼脂糖倒进细胞, 不要脱离水井。这一步是这两种检测中最重要的一步 (第3.9 步和3.11 步)。如果斑块检测有太多的样本, 我们建议将琼脂糖凝胶 (建议每个最大100毫升) 细分为几个中等的瓶子, 并保持瓶子温暖, 直到使用前, 因为琼脂糖凝胶在大约10分钟内凝固在房间温度。由于胰蛋白酶容易受到17高温的影响, 因此应在充分冷却后, 在培养基和琼脂糖中添加胰蛋白酶溶液, 用于斑块检测。
在细胞结合试验中, 病毒与细胞结合的孵育必须在4°c 下进行, 以防止细胞的侵袭。根据 gilling 的方法13, 细胞在低温下容易干燥, 因此在孵育过程中每15分钟需要轻微晃动一次。这里使用的 rna 提取试剂盒可以替代其他试剂盒。rt-qpcr 标准曲线的斜率应在3.3 左右, 测定系数应大于0.98。与荧光显微镜相比, 该方法能直观地显示病毒在细胞中的定位, 因为荧光物质与病毒的结合是不必要的, 因此使用起来更快、更容易。
最近, 人类肠道肠素 (hie) 表现出与人胃肠道上皮相似的细胞组成和功能, 已可用于轮状病毒的传播18。hie 的使用可以使我们评估轮状病毒非可培养菌株的特定生长速度和细胞结合能力。此外, 这里描述的两个实验都可用于评估药物对两种表型的影响 19。本文提出的协议可以定量地讨论轮状病毒株在不同条件下表型参数值的变化。
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项工作得到了 "卫生价值链: 将卫生系统设计为生态社区价值系统" 项目的支持, 人类与自然研究所 (rihn, No.14200107 项目)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7500 Real Time PCR System | Applied Biosystems | qPCR | |
| Agar-EPI | Nakalai Tesque, Inc | 01101-34 | Plaque assay |
| Disodium Hydrogenphosphate | Wako Pure Chemical Corporation | 194-02875 | Cell binding assay |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05900 | Cell culture |
Eagle's MEM "Nissui"  |
Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05901 | Plaque assay |
| EasYFlask 75 cm2 | Thermo Scientific | 156499 | Cell culture |
| Fetal bovine Serim, qualified, USDA-approved regions | Gibco | 10437028 | Cell culture and Plaque assay |
| Forward / Reverse primers | Eurofins Genomics | qPCR | |
| L-Glutamine, 200 mM Solution | Gibco | 2530081 | Cell culture and Plaque assay |
| Neutral Red | Wako Pure Chemical Corporation | 140-00932 | Plaque assay |
| PBS (-) "Nissui" | Nissui Pharmaceutical Co., Ltd | _05913 | Cell culture and Plaque assay |
| Penicillin-Streptomycin, Liguid | Gibco | 15140122 | Cell culture and Plaque assay |
| Potassium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 163-03545 | Cell binding assay |
| Premix ExTaq (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR039A | qPCR |
| PrimeScriptTN RT reagent Kit (Perfect Real Time) | TAKARA Bio Inc. | RR037A | cDNA synthesis |
| PrimeTime qPCR Probes | Medical and Biological Laboratories Co., Ltd. | qPCR | |
| QIAamp Viral RNA Mini Kit | QIAGEN | 52904 | RNA extraction |
| Sodium Bicarbonate | Wako Pure Chemical Corporation | 199-05985 | Cell culture and Plaque assay |
| Sodium Chloride | Wako Pure Chemical Corporation | 198-01675 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 24-well plate | TPP | 92024 | Cell binding assay |
| Tissue culture plates 6-well plate | TPP | 92006 | Plaque assay |
| Trizma base | SIGMA-ALDRICH | T1503 | Cell binding assay |
| Trypsin from porcine pancrease | SIGMA-ALDRICH | T0303-1G | Activate for rotavirus |
| Trypsin-EDTA (0.05 %), phenol red | Gibco | 25300054 | Cell culture |
| Vertical 96-Well Thermal Cycler | Applied Biosystems | cDNA synthesis |
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