Summary
Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.
Abstract
Cellule staminali neurali (NSC) sono multipotenti e può dar luogo a tre tipi di principali delle cellule del sistema nervoso centrale (CNS). Cultura in vitro e l'espansione delle CSN forniscono una fonte di cellule per neuroscienziati studiare la funzione dei neuroni e cellule gliali insieme a loro interazioni. Ci sono diverse tecniche segnalate per l'isolamento delle cellule staminali neurali da cervello mammifero adulto o embrione. Durante l'operazione di microsurgical per isolare NSCs provenienti da diverse regioni del SNC embrionale, è molto importante per ridurre i danni alle cellule cerebrali per ottenere il più alto rapporto delle cellule staminali dal vivo ed espandibile. Una tecnica possibile per ridurre lo stress durante l'isolamento di queste cellule del cervello di embrione di topo è la riduzione dei tempi chirurgici. Qui, dimostriamo una tecnica sviluppata per isolamento rapido di queste cellule dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare. Le procedure chirurgiche sono la raccolta di embrioni di topo E13 dall'utero, tagliando le fontanelle frontale dell'embrione con una punta di ago piegato, estraendo il cervello dal cranio, microdissection del cervello isolato per raccogliere l'eminenza gangliare, dissociazione del tessuto raccolto nel mezzo di NSC per ottenere una sospensione di singola cellula e infine di placcatura cellule nella coltura di sospensione per generare neurosfere.
Introduction
Cellule staminali neurali (NSC) risiedono in diverse regioni del cervello adulto ed embrione e hanno una tendenza a generare diversi tipi di neuroni e cellule gliali1. NSC ricche regioni3subventricular zone nel cervello dei mammiferi adulti2 e gangliare Eminenza nel cervello dell'embrione. Nel cervello in via di sviluppo, l'eminenza gangliare offre la maggior parte dei interneurons corticali e particolarmente di interneuroni GABAergici3. Ci sono anche metodi meno invasivi per la generazione di cellule staminali neurali da cellule staminali embrionali (ESCs) o utilizzare cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) che riducono la richiesta per l'animale. Nonostante il fatto che la generazione di NSC da CES o iPSCs è possibile4,5, ha alcuni vantaggi e svantaggi rispetto all'isolamento delle cellule staminali neurali da adulto o embrione cervello6,7, 8. I protocolli per indurre la differenziazione dei CES e iPSCs verso fenotipi neuronali sono sempre tempi e costi di consumo e il tasso di successo (70-80% Nestin cellule positive)5 è inferiore rispetto con isolamento diretto di NSC dal cervello animale ( più di 99% di cellule positive Nestin)9. Inoltre, le cellule staminali perdono loro tendenza stabilità e differenziazione genetica dopo parecchi passaggi10,11. Anche se ci sono altre nuove notizie di conversione diretta delle cellule somatiche in NSC, queste cellule sono geneticamente modificate e non sono facilmente accessibili in ogni laboratorio12. Di conseguenza, c'è ancora una grande richiesta per l'isolamento delle cellule staminali neurali del cervello animale; è possibile ridurre la quantità di utilizzo animali migliorando le tecniche chirurgiche. Riducendo il tempo chirurgico e migliorando le tecniche, è possibile mantenere le cellule dal danno e ottenere il più alto tasso di NSC da ciascun animale.
Qui, presentiamo una tecnica semplificata e riproducibile per l'isolamento delle cellule staminali neurali da cervello di embrione di topo E13 .
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Protocol
Tutti gli interventi chirurgici e procedure sull'animale sono state approvate dal comitato di etica animale dell'Istituto Royan, Teheran, Iran.
1. preparazione di strumenti chirurgici, lavaggio Buffer (HEPES-MEM), terreni di coltura delle cellule e piastre per colture cellulari
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici (forbici, impugnatura Lama bisturi e pinze) li basati sugli orientamenti dell'ordinaria sterilizzazione in autoclave.
- Preparare un adeguato volume di tampone HEPES-MEM (circa 100 mL è sufficiente per ogni topi incinta). Aggiungere le alte concentrazioni di antibiotici (penicillina/streptomicina 10%) il tampone HEPES-MEM. Questa concentrazione di antibiotici è necessaria ridurre il rischio di contaminazione microbica.
- Per preparare il tampone HEPES-MEM, aggiungere 0,5958 g di polvere HEPES a 100 mL di MEM (mezzo minimo essenziale) e mescolare bene. Regolare il pH a 7,3-7,4 e filtrare il mezzo utilizzando un filtro di 0,22 µm.
- Fare NSC medio contenenti neurobasal medio (NB), addizionata di 20 ng/mL EGF, bFGF ng/mL 10, supplemento di x N2 100 1% o 1% B27 supplemento (senza vitamina A), 1 U/mL eparina, 1% L-Glutammina, aminoacido 1% non essenziali (NEAA), 1% penicillina/streptomicina, e 0,1 mM β-mercaptoetanolo.
2. animale chirurgia e Micro-dissezione
- Anestetizzare un mouse incinto al 13° giorno di gestazione (qui, uso ceppo BALB/c da 4 mesi) tramite l'iniezione intraperitoneale di ketamina-xilazina, 100 mg/kg e 10 mg/kg di peso corporeo rispettivamente.
- Confermare l'anestesia profonda esercitando uno stimolo doloroso (ad es., pizzico con il forcipe) a piedi dell'animale e quando non c'è nessun riflesso del dolore, sacrificare l'animale di dislocazione cervicale.
- Pulito e disinfettante della pelle dell'addome spruzzando etanolo al 70%.
- Controllare la pelle sopra l'addome e poi tagliare la pelle e la fascia sottostante con le forbici per scoprire la cavità addominale e corni uterini.
- Rimuovere i corni uterini contenenti gli embrioni di forbici e trasferirli in una provetta conica da 50 mL contenente 25 mL di tampone HEPES-MEM refrigerato.
- Collocare la provetta conica sotto la cappa a flusso laminare e aprire il tappo sotto il cofano. Portare i corni uterini dal tubo e lavare 3 volte con un volume sufficiente del buffer HEPES-MEM freddo fresco per eliminare detriti e sangue.
- Trasferire il tessuto uterino a una capsula di Petri contenente 7-10 mL di tampone HEPES-MEM refrigerato di 10 cm. Aprire i corni uterini utilizzando bene le forbici e trasferimento di embrioni per un nuovo piatto contenente 7-10 mL di tampone HEPES-MEM refrigerato. Ora mettere il piatto di 10 cm con embrioni al microscopio per dissezione per il funzionamento di micro-dissezione.
- Piegare la punta di un ago di siringa 25-27 G spingendo la sua punta su un manico di lama del bisturi in acciaio. Piegare la punta dell'ago fino a quando la punta è piegata ad un angolo di 70-90°. Controllare la punta dell'ago sotto il microscopio per dissezione per vedere la curva sulla punta dell'ago.
Nota: Naturalmente, gli embrioni hanno una posizione laterale nel piatto. - Senza cambiare la loro posizione, tenere il collo e il corpo dell'embrione con una pinzetta e poi inserire la parte piegata della punta dell'ago la Fontanella frontale della testa dell'embrione. Ci sarebbe piccolo sanguinamento o un coagulo di sangue lì.
- Spostare la punta dell'ago superficialmente. Mentre la parte piegata è all'interno il rigonfiamento verso la fronte e poi verso la parte posteriore della testa, assicuratevi di tagliare attraverso il cranio e la pelle e non per danneggiare il cervello sottostante.
- Spingere la pelle con la punta dell'ago lateralmente per scoprire il cervello e inserire l'ago dalla parte laterale della pelle nell'area sotto il cervello. Rimuovere il cervello dal cranio spingendolo a venire fuori dal cranio dissecato.
- Tenete il cervello fermo con la pinzetta e tagliare la corteccia di ciascun emisfero utilizzando micro-forbici per esporre l'eminenza gangliare.
- Tenere il cervello e mettere l'eminenza gangliare dissecato nella provetta da centrifuga da 15 mL contenente cellule staminali neurali medio. L'eminenza gangliare è chiaramente dimostrato con le sue parti centrali e laterali.
- Ripetere questa procedura fino a quando tutti i cervelli sono stati dissecati micro.
- Tagliare l'eminenza gangliare dissecata inserendo la punta della pipetta contro il fondo del tubo. Dispensare la sospensione su e giù per 4 a 5 volte per rompere il tessuto per una sospensione unicellulare.
- Centrifugare la sospensione a 110 x g per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 1 mL di tripsina-EDTA 0,05%.
- Incubare la sospensione cellulare in un 37 ° C per 10 min e quindi aggiungere un volume equivalente di inibitore della tripsina della soia (25 µ g/mL) per interrompere l'attività della tripsina. Dispensare la sospensione cellulare su e giù per assicurarsi che la tripsina è stato totalmente inattivata.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 110 x g per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno completo di NSC e contare il numero di cellule.
- Piastra le cellule (2 x 105 cellule/mL) a mezzo di NSC nel pallone di coltura del tessuto formato adatto. Trasferire 5 mL in T25, 20ml per T75 e 40 mL di T175 boccette.
Nota: Neurosfere apparirà dopo cultura di 3 giorni a 37 ° C in un incubatore con 5% CO2. Dopo 6-7 giorni, le sfere dovrebbero misurare tra 150-200 µm di diametro e saranno pronte per subcoltura. Coltivando NSCs primario 1 milione dopo sette giorni il numero delle cellule aumenterà a 3 milioni.
3. trypsinization e passaggio di neurosfere
- Alla subcoltura la neurospheres, trasferire il mezzo con neurosfere sospesa la provetta da centrifuga, centrifugare a 110 x g per 5 min e poi scartare il surnatante. Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0,05% e incubare a 37° C per 10 min.
- Inattivare la tripsina usando inibitore della tripsina della soia e pipetta il neurosfere delicatamente fino e giù a fare loro cellule singole.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 110 x g per 5 min, scartare il surnatante e risospendere le cellule in 1 mL di terreno di NSC. Queste cellule sono pronte per il prossimo subcoltura o cultura il Laminin e Poly-L-ornitina rivestite superfici per esperimenti avanzati.
- Per la prossima sottocultura, NSC di trasferimento nel nuovo pallone (seguire il passo 2.8) e cultura li nel mezzo di NSC. Per l'induzione della cultura di differenziamento neuronale NSC nel medium NSC in assenza di bFGF ed EGF il Laminin e Poly-L-ornitina rivestito lastre (Figura 1B).
- Per la procedura di rivestimento, completamente rivestire la superficie di cultura cellulare aggiungendo abbastanza volume di soluzione diluita di poli-L-ornitina (25 µ g/mL) per la piastra di coltura delle cellule e incubare a 37 ° C per 2 h.
- Aspirare il poli-L-ornitina e sciacquare il ben 2 volte con PBS. Aggiungere un volume sufficiente di 5 µ g/mL laminin completamente coprire la superficie di cultura e incubare a 37 ° C per 2 h. aspirato la laminina prima placcatura cellule o memorizzare piastra a 4 ° C fino a quando necessario.
4. flusso Cytometry Assay
Nota: L'espressione di marcatori specifici di NSC, neuroni e cellule gliali può essere misurata con flusso cytometry dosaggio13. Il protocollo si basa su Menon et al.,13 con modifiche minori.
- Dissociare neurosfere o scollegare NSC coltivate da piastre di trypsinization di rendere loro singole cellule. Aggiungere 500 µ l di tampone di fissazione (2% paraformaldeide (PFA) in PBS) 100 µ l di sospensione cellulare (circa 1 milione cellule sono abbastanza per la macchiatura con ogni anticorpo) e poi incubare le provette a temperatura ambiente per 15 min.
- Lavaggio celle aggiungendo 1 mL di PBS per la provetta e centrifugare a 110 x g per 5 min. eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare, lasciando circa 100 µ l nella provetta.
- Permeabilize le cellule con Tween-20 (0,7% Tween-20 in PBS) aggiungendo 500 µ l di tampone di Tween-20 a 100 µ l di sospensione cellulare. Incubare le provette a temperatura ambiente per 15 minuti su agitatore orbitale (100 giri/min).
- Ripetere la centrifugazione e il lavaggio con PBS. Rimuovere il surnatante dai tubi completamente, lasciando solo il pellet. Aggiungere 100 µ l di anticorpi primari diluiti (coniglio anti-topo βtub-III, GFAP e nestina anticorpi alla concentrazione di 1: 200) in tampone di diluizione contenente 1% di albumina di siero bovino, 10% di siero (siero di capra) e 0,5% Tween-20 in PBS e delicatamente triturare per mescolare. Incubare le provette a temperatura ambiente per 30 minuti su agitatore orbitale.
- Lavare le cellule una volta con PBS e rimuovere il surnatante dai tubi completamente, lasciando solo il pellet.
- Aggiungere 100 µ l di anticorpo secondario diluito (capra anti-coniglio FITC coniugato alla concentrazione di 1: 500) in PBS per il pellet cellulare e delicatamente triturare per mescolare. Incubare le provette a temperatura ambiente per 30 minuti su un agitatore nel buio.
- Lavare i campioni 2 x con PBS e poi lavare una volta con buffer di flusso. Centrifugare e risospendere le cellule in circa 150 µ l di tampone di flusso per l'analisi di citometro a flusso.
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Representative Results
Micro-dissezione, isolamento delle cellule e Neurosphere cultura. Qui, abbiamo presentato un metodo rapido ed efficace per l'isolamento delle cellule staminali neurali e microchirurgia di cervello di topo E13 . Questo articolo viene illustrato che è possibile rimuovere l'intero cervello da un cranio di embrione E13 del mouse attraverso una rottura bene a fontanelle frontale. Con questo metodo, il cervello subisce meno danni ed è possibile isolare le cellule provenienti da diverse parti del cervello. Le cellule prelevate potrebbero generare neurosfere in mezzo NSC in presenza di bFGF ed EGF, e sono 150-200 µm dimensioni di diametro dopo sette giorni nella coltura (Figura 1A). Neurosfere fossero dissociati usando tripsina/EDTA 0,05% per farli singole cellule e la loro cultura su piatti Laminin/Poly-L-ornitina-rivestito in assenza di bFGF ed EGF ha mostrato che estendere del neurite come rami e mostrano morfologia neuronale dopo 7-10 giorni (Figura 1B).
Risultati delle analisi di citometria a flusso. Come mostrato nella Figura 2A, 95±3.16% delle cellule che costituiscono il neurosfere erano nestina positive, che è un indicatore noto per NSC (Figura 2A). Analisi su singole cellule coltivate NSCs usando β-tubulina-III e anticorpi GFAP ha rivelato che coltivando cellule sulle superfici verniciate, la maggior parte del NSC differenzierà la maggior parte dei neuroni (94±2.67%) e meno alle cellule gliali (5±2.46%).
Figura 1 : Immagini rappresentative da primario E13 del mouse embrione le cellule staminali neurali. R. coltivato neurosfere dopo 7 giorni. B. la differenziazione delle cellule staminali neurali a neuroni maturi dopo cultura 7 giorni il Laminin/Poly-L-ornitina rivestito piatti nel mezzo di NSC in assenza di bFGF ed EGF. Barre della scala rappresentano 20 µm nella A e 50 µm in B. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Le popolazioni di cellule positive nestina (A), βtubulin-III (B) e GFAP (C) sono state verificate dall'analisi di citometria a flusso. R. la maggior parte delle cellule (95±3.16%) costruendo il neurosfere erano nestina positivo. B. dosaggio sull'adesivo coltivati NSCs su piastre di laminina/Poly-L-ornitina rivestito in assenza di EGF e bFGF ha rivelato che il 94±3.67% delle cellule sono stati βtubulin-III positivo e 5±2.46% espresso GFAP. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Utilizzando una fonte di cellule staminali neurali è molto importante per i neuroscienziati. Cellule staminali neurali potrebbero essere raccolte da diverse aree del cervello embrionale e possono generare tipi specifici di neuroni e cellule gliali. Ci sono diversi metodi per l'induzione della differenziazione delle cellule staminali neurali per indurli a generare cellule gliali e neuroni maturi. Ci sono numerosi rapporti che indicano che in condizioni di impostazioni cultura specifiche e fattore trofico reggimenti, potrebbero generare neuroni14, oligodendrociti15,16 e17astrocitiin vitro. Sulla base dei dati da letteratura, Eminenza gangliare fornisce una buona fonte di cellule staminali neurali con il potenziale per generare diversi tipi di neuroni inibitori ed eccitatori come GABAergici18 e dopaminergici19 tipi. Pertanto, basata sulla naturale tendenza di questi NSC per la generazione di più alto tasso di neuroni GABAergici, forniscono una fonte adatta per studi sui neuroni inibitori.
In questo articolo, abbiamo migliorato la tecnica di microdissezione cervello per prelevare l'intero cervello dal cranio E13 del mouse embrione pur esercitando meno danni al tessuto cerebrale. Per ottenere il più alto tasso di NSC dal cervello animale, si raccomanda di ridurre la durata del tempo chirurgico ed eseguire i punti chiave come temperatura ambiente e condizioni di sterilità.
Ci sono alcuni passaggi critici per la buona riuscita di questa procedura. L'animale chirurgia e dissezione uterina devono essere eseguite più rapidamente possibile e in una camera pulita. Utilizzare la luce UV per pulire la camera prima dell'intervento chirurgico, se disponibile. Per ridurre il rischio di contaminazione, corni uterini di trasferimento nella provetta conica contenente 25 mL di tampone HEPES-MEM refrigerato e chiudere il tappo. Non utilizzare una capsula di Petri in questo passaggio quanto manca un tappo a vite. Il tubo aiuta ad evitare perdite medie dal tappo e aiuta a mettere a bagno i corni uterini in tampone HEPES-MEM. Mettere la tuba uterina sotto la cappa laminare e prima di trasferire l'uterino in una capsula Petri, sciacquare uterina almeno 3 volte con tampone HEPES-MEM refrigerato. Questo passaggio riduce efficacemente il rischio di contaminazione microbica.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato dall'Istituto Royan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
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