Summary
E13マウス胚神経節隆起から顕微鏡下神経幹細胞の分離法を紹介します。
Abstract
神経幹細胞 (NSCs) は多能性、中枢神経系 (CNS) の 3 つの主要な細胞型に上昇を与えることができます。生体外で文化と NSCs の拡大は、ニューロンの機能を研究する神経科学者のための細胞との相互作用とグリア細胞の適切なソースを提供します。大人または胚の哺乳動物の脳からの神経の幹細胞の隔離のためのいくつかの報告されたテクニックがあります。胚の中枢神経系のさまざまな地域から NSCs を分離する顕微鏡の操作中にライブと拡張可能な幹細胞の最も高い比率を取得する脳細胞にダメージを軽減する非常に重要です。マウス胎児脳からこれらのセルの隔離中にストレス解消する方法は、手術時間の削減です。ここでは、E13マウス胚神経節隆起からこれらの細胞の迅速単離技術の開発を示します。手術は、頭蓋、神経節隆起を収穫するため分離脳のレーザーマイクロダイ セクションから脳を抽出、曲がった針の先端を持つ胚の前頭部泉門を切断、子宮から E13マウス胚を収穫解離の単一細胞懸濁液を得るために NSC 培地で収穫された組織と最後にめっき細胞懸濁培養神経幹細胞を生成します。
Introduction
大人と胚の脳の異なる領域に存在する神経幹細胞 (NSCs) とニューロンとグリア細胞1のさまざまな種類を生成する傾向があります。2大人の哺乳類の脳の脳室下帯のゾーンと胚の脳神経節隆起は、NSC の豊富な地域の3です。発展途上の脳では、神経節隆起は皮質介在ニューロンと特に gaba 作動性介在ニューロンの3のほとんどを提供します。動物の需要を減らす誘導多能性幹細胞 (Ips) を使用または胚性幹細胞 (Esc) から神経幹細胞生成のため少ない侵襲的方法もあります。Esc または Ips から NSCs の生成が可能な4,5であるにもかかわらず、それは、いくつかの長所と短所、大人または胚脳6,7、神経幹細胞の分離と比較されます。 8。Esc と Ips の神経細胞への分化誘導のためのプロトコルは、常に時間とコストを消費し、成功 (70-80 %nestin 陽性細胞)5の率は低かった動物の頭脳 (から NSCs の直接分離以上 99 %nestin 陽性細胞)9。また、幹細胞は、いくつかの通路10,11の後遺伝的安定性と分化傾向を失います。NSCs に体細胞の直接の変換については、他の新しいレポートがあるにもかかわらずこれらの細胞は遺伝子組み換えし、は簡単にすべての演習12でアクセスできません。したがって、動物の脳からの神経の幹細胞の隔離のための大きな需要はまだあります。手術技術の向上によって動物の使用量を低減することが可能です。手術時間を短縮して、技術の向上により、損傷から細胞を維持し、それぞれの動物から NSCs の最高速度を取得することが可能です。
ここでは、E13胎児の脳の神経幹細胞の隔離のための簡体字で再現可能な手法を紹介します。
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Protocol
すべての手術や動物に関する手続きは、ロワイヤンの所、テヘラン、イランの動物倫理委員会によって承認されました。
1. 手術用器具、洗浄バッファー (HEPES MEM)、細胞培養媒体および細胞培養皿の準備
- オートクレーブ滅菌が日常の滅菌ガイドラインに基づいて手術ツール (ハサミ、メスのブレードのハンドルおよび鉗子) 滅菌します。
- HEPES メモリ バッファーの十分な容積を準備 (約 100 mL は各妊娠マウスのために十分です)。高濃度の抗生物質 (ペニシリン/ストレプトマイシン 10%) を HEPES メモリ バッファーに追加します。抗生物質のこの集中は、微生物汚染の危険性を減らすために必要です。
- HEPES メモリ バッファーを準備するには、MEM (最小値必要な媒体) 100 mL に HEPES 粉末の 0.5958 g を加え、よく混ぜます。7.3 7.4 に pH を調整し、0.22 μ m フィルターを使用してメディアをフィルターします。
- NSC 媒体含んでいる neurobasal (NB) 媒体、20 ng/ml の EGF, 10 ng/mL bFGF 添加 1 %100 x N2 サプリメントや 1 %b27 サプリメント (ビタミン A)、なし 1 U/mL のヘパリン、1% 1% 1% 非必須アミノ酸 (NEAA)、L-グルタミン ペニシリン/ストレプトマイシンと0.1 mM β-メルカプトエタノール。
2. 動物の外科手術、マイクロ郭清
- 妊娠 13 日目妊娠マウスの麻酔 (ここでは、使用 BALB/c ひずみ歳 4 ヶ月) ケタミン ・ キシラジンの腹腔内投与で 100 mg/kg および 10 mg/kg 体重それぞれ。
- 動物の足の痛みを伴う刺激 (例えば鉗子でピンチ) を出すことによって深い麻酔を確認し、痛みの反射がない、頚部転位によって動物を犠牲にします。
- 清潔で消毒 70% エタノールを噴霧することにより腹部の皮膚。
- 腹部の皮膚を制御し、腹腔内や子宮角を明らかにハサミで切って、皮膚や基本的な筋膜。
- はさみで胚を含む子宮角を削除し、25 mL の冷たい HEPES メモリ バッファーを含む 50 mL の円錐管にそれらを転送します。
- 層流フードの下で円錐形のチューブを置き、フードの下でキャップを開きます。チューブと破片と血を除去するために新鮮な冷たい HEPES メモリ バッファーの十分なボリュームで 3 回すすぎから子宮の角を引き出します。
- 10 cm シャーレ 7-10 mL の冷たい HEPES メモリ バッファーを含む子宮組織に転送します。7-10 mL の冷たい HEPES メモリ バッファーを含む新しい料理に高級はさみと転送胚を使用して子宮角を開きます。今マイクロ郭清の操作のため解剖顕微鏡下で胚を 10 センチメートルの皿を置きます。
- 鋼刃メスのブレードのハンドルで、その先端を押して 25 27 G 注射針の先端を曲げます。70-90 ° の角度で先端が曲がっているまでは、針の先端を曲げます。針の先端でベンドをして解剖顕微鏡下で針の先端を確認します。
注: 当然、胚皿の横の位置にあります。 - 自分の位置を変えずに、微細鉗子で首と胚の体を保持して胚の頭の前頭部泉門に針の先端の曲がった部分を挿入します。小さな出血や血栓があるでしょう。
- 針の先端を表面的に移動します。曲がった部分は、額に向かって、頭の後ろのふくらみの中は、皮膚や頭蓋骨をカットして、脳に損傷を与えることを確認します。
- 脳を明らかにし、針を皮膚の外側から脳の下の領域に挿入する横方向に針先で皮膚を押してください。切り裂かれた頭蓋骨から出てくるそれを押すことによって、頭蓋骨から脳を削除します。
- 脳をカーブタイプ鉗子を使用して安定した保持し、マイクロはさみを使用して神経節隆起を公開する各半球の皮質をカットします。
- 脳を保持し、神経幹細胞培地を含む 15 mL 遠心管に切り裂かれた神経節隆起を配置します。神経節隆起、中央と外側部分が明確に表示されます。
- すべての脳の微小解剖がされるまで、この手順を繰り返します。
- チューブの底に対してピペット先端を配置することによって切り裂かれた神経節隆起をカットします。上下に 5 回単一細胞懸濁液のための組織を分割する 4 懸濁液をピペットします。
- 110 x g で 5 分間削除の懸濁液上清を遠心し、0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL の細胞を再停止します。
- 10 分間、37 ° C の細胞懸濁液をインキュベートし、大豆トリプシンインヒビター (25 μ g/mL) のトリプシン処理を停止するのと同等のボリュームを追加します。トリプシンが完全に活性化されていることを確認してください、上下に細胞懸濁液をピペットします。
- 5 分、上清を除去再中断完全 NSC 培地 1 mL のセルとセルの数をカウント、110 x g で細胞懸濁液を遠心します。
- 適当な大きさの組織培養のフラスコに NSC の中で細胞 (2 x 105セル/mL) をプレートします。T25、T75 し T175 フラスコに 40 mL 20 mL 5 mL に転送します。
注: 神経幹細胞が 5% CO2と加湿のインキュベーターで 37 ° C で 3 日間培養後表示されます。6-7 日後球は直径 150-200 μ m の間で測定する必要があり、サブカルチャーの準備ができています。7 日後 100 万プライマリ NSCs を育成することによって細胞の数は、300 万に拡大します。
3. trypsinization と神経幹細胞の継
- サブカルチャー、神経幹細胞、浮遊細胞の培地を遠心管に転送、5 分間 110 × g で遠心分離機および上澄みを廃棄します。0.05% トリプシン-EDTA の 1 mL を追加し、37 ° C、10 分間インキュベートします。
- 優しくまで大豆トリプシンインヒビターとピペット、神経幹細胞を使用してトリプシンを不活化し、細胞を単一それらを作るために。
- 110 x g で 5 分で細胞懸濁液を遠心分離機、上澄みを廃棄し、NSC の中の 1 mL の細胞を再度中断します。これらの細胞は次のサブカルチャーまたは Laminin のカルチャの準備ができているし、ポリ L-オルニチン コーティング高度な実験のための表面。
- 次のサブカルチャーの新しいフラスコ (従ってください手順 2.8) NSCs を転送し、NSC 培地でそれらを文化します。神経分化誘導培養 NSCs NSC bFGF とラミニンおよびポリ L-オルニチンの EGF の不在中に誘導プレート (図 1 b) をコーティングしました。
- 塗装手順の完全に薄めたポリ L-オルニチン (25 μ g/mL) の十分な量を細胞培養プレートに追加することによって細胞培養表面をコートし、37 ° C 2 時間で孵化させなさい。
- ポリ L-オルニチンを吸引し、PBS でよく 2 x をすすいでください。完全に文化表面を覆うとセルをメッキする前に 2 h. 吸引、ラミニンの 37 ° C で孵化させなさいまたは 4 ° c まで必要なプレートは保管 5 μ G/ml ラミニンの十分な量を追加します。
4. 流れの Cytometry の試金
メモ: フロー フローサイトメトリー分析13NSCs、ニューロンとグリア細胞の特定のマーカーの発現を測定できます。プロトコルは、メノンら、マイナーな修正と13に基づいています。
- 神経幹細胞を分離またはそれらの単一セルを作成する trypsinization によってコーティング プレートから培養 NSCs をデタッチします。細胞懸濁液が (約 1 百万セルは、十分な染色を各抗体) の 100 μ L に固定バッファー (PBS で 2% パラホルムアルデヒド (PFA)) の 500 μ l 添加し 15 分間常温管をインキュベーションしています。
- 110 x g で 5 分間遠心管に 1 mL の PBS を追加してセルを洗浄する上澄みを廃棄し、管内約 100 μ L を残して、細胞ペレットを再懸濁します。
- Tween 20 とセルを permeabilize (0.7 %pbs でトゥイーン 20) 細胞懸濁液を 100 μ l 添加するトゥイーン 20 バッファーの 500 μ L を追加することによって。軌道シェーカー (100 rpm) で 15 分間室温でチューブを孵化させなさい。
- 遠心分離と PBS 洗浄を繰り返します。上清を完全に、チューブから削除して、ペレットだけを残してします。0.5%、10% 血清 (ヤギ血清) 1% ウシ血清アルブミンを含む希釈バッファーで希釈した一次抗体 (抗マウス βtub III、GFAP とネスチン抗体濃度 1: 200 でウサギ) の 100 μ L を追加トゥイーン 20 PBS と軽く混ぜてカップ刻んだ。軌道シェーカー上で 30 分間室温でチューブを孵化させなさい。
- PBS で 1 回洗浄し、上澄みチューブから完全に削除、ペレットだけを残してくださいします。
- 希釈した二次抗体を 100 μ l 添加 (ヤギ抗うさぎ 1: 500 濃度共役 FITC) ミックス カップ刻んだ PBS 細胞ペレットに、穏やかに。暗闇の中でシェーカー上で 30 分間室温でチューブを孵化させなさい。
- サンプル 2 を洗う PBS とフロー バッファーで一度洗い x。遠心分離機し、流れの cytometer 分析フロー バッファーの約 150 μ L のセルを再度中断します。
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Representative Results
マイクロ郭清、電池隔離および文化 Neurosphere 。ここでは、迅速かつ効率的なマウス E13脳手術と神経幹細胞の分離法を提案します。この記事は、前頭泉門で細かい断裂を通じて E13マウス胚頭蓋骨から脳全体を削除することが可能だ示しています。この方法では、脳は以下のダメージを耐えるし、脳のさまざまな部分から細胞を分離することが可能です。収穫された細胞が bFGF と EGF, 存在下で NSC 中神経幹細胞を生成する、文化 (図 1 a) で 7 日後に直径 150-200 μ m サイズ。神経幹細胞解離し、単一細胞およびラミニン/ポリ-L-オルニチン-コーティング料理文化 bFGF と彼らは枝のような突起を拡張し、7 ~ 10 日後神経細胞形態を示すことを示した EGF の不在の 0.05% トリプシン/EDTA を使用して(図 1 b)。
流れ Cytometry アッセイ結果します。図 2 aに示すように、神経幹細胞を構成する細胞の 95±3.16% は NSCs (図 2 a) のための既知のマーカーである正をネスチンいた。一細胞アッセイ培養 β-チューブリン-III を使用して NSCs と GFAP 抗体がコーティングされた表面の細胞を育成することによって、NSCs のほとんどにニューロン (94±2.67%) のほとんどが区別するために明らかに、グリア細胞 (5±2.46%) 以下。
図 1: プライマリ E13から代表的な画像胚の神経幹細胞をマウスします。A.は、7 日後の神経幹細胞を培養しました。B.ラミニン/ポリ-L-オルニチンで 7 日間培養後成熟したニューロンに神経幹細胞の分化は、NSC bFGF と EGF の不在中に料理をコーティングしました。スケール バーで 20 μ m と B の 50 μ m を表すこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ネスチン (A)、βtubulin III (B)、および GFAP (C) 陽性細胞の集団は、流れの cytometry の試金によって検証されました。A.神経幹細胞を構築する細胞 (95±3.16%) のほとんどは、肯定的なネスチンでした。B.接着剤のアッセイ培養 NSCs EGF の不在でラミニン/ポリ-L-オルニチン コーティング プレートに、bFGF は、細胞の 94±3.67% を明らかにした βtubulin III と 5±2.46 %gfap を表明しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
神経幹細胞の適切なソースを使用しては、神経科学者に非常に重要です。神経幹細胞は胎児の脳の異なる領域から悪用される可能性が、ニューロンとグリア細胞の特定の種類を生成することができます。成熟したニューロンとグリア細胞を生成するように誘導する神経幹細胞の分化誘導方法はいくつかあります。特定のカルチャ条件および栄養要因の連隊の下ニューロン14、オリゴデンドロ サイト15,16 、およびアストロ サイト17体外を生成可能性がありますそれらを示す多数の報告があります。文学からのデータに基づいて、神経節隆起は抑制性と興奮性ニューロン gaba 作動性18とドーパミン19型などのさまざまな種類を生成する可能性のある神経幹細胞の良い情報源を提供しています。したがって、gaba 作動性ニューロンのレートの高速生成のこれらの NSCs の自然な傾向に基づいて、彼らは抑制的なニューロンの研究の適切なソースを提供します。
この記事では E13マウス胚頭蓋骨から脳の組織に以下の損傷を発揮しながら脳全体を撤回する脳レーザーマイクロダイ セクション法を改善しました。動物の脳から NSCs の最高速度を取得、手術時間の期間を短縮し、周囲温度、滅菌条件など重要なポイントを実行する推奨です。
このプロシージャの成功したパフォーマンスのいくつかの重要なステップがあります。できるだけ早く、きれいな部屋で動物の外科手術と子宮の郭清を行う必要があります。利用可能な場合、手術前に部屋を掃除するのに紫外線を使用します。汚染のリスクを減らすためには、25 mL の冷たい HEPES メモリ バッファーを含む円錐管に子宮角を転送、キャップを閉めてください。スクリュー キャップを欠いているので、この手順でペトリ皿を使用しないでください。チューブ キャップから媒体の漏出を避けることができ、支援に漬 HEPES MEM バッファー子宮角。層流フードの下で子宮管を入れて転送する前に、シャーレに子宮を洗う冷たい HEPES MEM バッファーと子宮の少なくとも 3 倍。この手順は、微生物汚染の危険性を効果的に削減されます。
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Disclosures
利害の対立が宣言されていません。
Acknowledgments
この作品は、ロワイヤン研究所によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL tubes | Falcon | 352097 | |
| 50 mL tubes | Falcon | 352235 | |
| Adson Forceps, 12 cm, Straight | WPI | 14226 | |
| B27 | Gibco | 17504-44 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | |
| dish 10cm | Falcon | 353003 | |
| Dressing Forceps, 12.5 cm, Straight | WPI | 15908 | |
| Dumont Tweezers, 11 cm, Straight | WPI | 500342 | |
| EGF | Sigma | E9644 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Glutamate | Sigma | G3291 | |
| Glutamax | Gibco | 35050061 | |
| goat anti rabbit FITC conjugated secondary antibody | Sigma | AP307F | |
| goat serum | Sigma | G9023 | |
| Heparin | Sigma | h3149 | |
| HEPES | Sigma | 83264 | |
| HEPES | Sigma | 90909C | |
| insulinsyringe with 25-27 gauge Needle | SUPA medical | A1SNL127 | |
| laminin | sigma | L2020 | |
| MEM | Sigma | M2279 | |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| NB medium | Gibco | 21103-31 | |
| Non-essential amino acid (NEAA) | Gibco | 11140050 | |
| PBS without Ca and Mg | Gibco | 20012050 | |
| Penicilin/ Streptomycin | Gibco | 5140122 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma | P4957 | |
| rabbit anti mouse beta tubulin-III antibody | Sigma | T2200 | |
| rabbit anti mouse GFAP antibody | Sigma | G4546 | |
| rabbit anti mouse Nestin antibody | Sigma | N5413 | |
| Scalpel Handle #3 | WPI | 500236 | |
| Scissors curve | WPI | 14396 | |
| Scissors sharp straight | WPI | 14192 | |
| Soybean trypsin inhibitor | Roche | 10109886001 | |
| Tissue culture flasks, T25 | BD | 353014 | |
| Tissue culture flasks, T75 | BD | 353024 | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Vannas Scissors, 8 cm, Straight | WPI | 14003 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M6250 |
References
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