Summary
אנו מציגים פפטיד fluorogenic assay המחשוף המאפשר הקרנה מהירה הפעילות הפרוטאוליטי של פרוטאזות על פפטידים המייצגים האתר המחשוף של פפטידים פיוז'ן ויראלי. שיטה זו יכולה לשמש גם על כל מוטיב חומצת אמינו אחרות בתוך רצף חלבונים כדי לבדוק את הפעילות פרוטאז.
Abstract
מעטפת וירוסים כגון וירוס מעוררת או שפעת דורשים הפרוטאוליטי המחשוף של חלבון כימרי שלהם כדי להיות מסוגלים להדביק את התא המארח. לעיתים קרובות וירוסים התערוכה tropism תאים ורקמות ומותאמים כדי פרוטאזות תאים או רקמות ספציפיות. יתר על כן, וירוסים אלה ניתן להציג מוטציות או הוספות לתוך הגנום שלהם במהלך שכפול עשוי להשפיע את המחשוף, ובכך יכול לתרום עיבודים כדי פונדקאי חדש. כאן, אנו מציגים פפטיד fluorogenic assay המחשוף זה מאפשר סריקה מהירה של פפטידים מחקה האתר המחשוף של חלבונים ויראלי פיוז'ן. הטכניקה היא גמישה מאוד והוא יכול לשמש כדי לחקור את פעילות הפרוטאוליטי פרוטאז אחד על סובסטרטים רבים, בנוסף, זה גם מאפשר חקר הפעילות של פרוטאזות מרובים על מצעים פפטיד אחד או יותר. במחקר זה, השתמשנו פפטידים מחקה המוטיבים האתר המחשוף של החלבון ספייק הקורונה. בדקנו את האדם, גמל נגזר מעוררת תסמונת נשימתית במזרח התיכון (מרס-זה) כדי להדגים כי התחליפים ליחיד באתר המחשוף יכול לשנות את הפעילות של furin, לשנות באופן דרמטי את המחשוף יעילות. אנחנו גם השתמשו בשיטה זו בשילוב עם ביואינפורמטיקה כדי לבדוק furin פעילות המחשוף של נגיף הקורונה ספייק חלבונים שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם, זנים. שיטה זו מבוססת על פפטיד פחות עבודה - זמן אינטנסיבי יותר שיטות קונבנציונליות המשמש לניתוח של פעילות הפרוטאוליטי לאיתור וירוסים, והוא ניתן להשיג תוצאות בתוך יום אחד.
Introduction
נגיפי פיוז'ן עם קרום התא המארח הוא צעד חיוני במחזור החיים של וירוסי מעטפת ואסטמה ומקילה על כניסתו התא ואת השכפול של הנגיף. בדרך כלל, וירוסים בעלי חלבון מיוחדות (או חלבונים) נקשר לקולטנים על קרום התא המארח וזה מפעיל את קרום פיוז'ן של וירוס-תא1. חלבונים ויראלי פיוז'ן קובצו לשלוש מחלקות עיקריות (I-III)1. מספר וירוסים הנמצאות כעת הדאגה העיקרית לבריאות הציבור, כגון וירוס שפעת (ייצוג של הופעתה שפוגעות ארוכת שנים של ציפורים), תסמונת נשימתית במזרח התיכון-נגיפי (מרס-זה) (ייצוג שנערך שפוגעות הופעתה של גמלים), לנצל את מה שנקרא מחלקה אני פיוז'ן חלבונים, אשר דורשים עיבוד הפרוטאוליטי על ידי המארח פרוטאזות, להפעיל את הפעילות שלהם fusogenic2. באופן דומה, נגיף הקורונה (FCoV), אשר מייצג איום המחלה העיקריים לחתולים פראיים ויומיומיים, גם בעלי שיעור אני חלבון כימרי. מחלקה אני ויראלי פיוז'ן חלבונים הם בדרך כלל מסונתז כמו קודמן uncleaved ו מורכבת בדרך כלל שתי קבוצות המחשבים אשר אחראים על קולטן איגוד, ומפעילה את האירוע פיוז'ן בהתאמה. נכון להיום, hemagglutinin שפעת (HA) הוא הכי מובן חלבון כימרי מחקרים רבים תיארו את תפקידה מכניסטית מארח התא הפוסט ו fusion3. במקרה זה המחשוף של החלבון היתוך מתרחש רצף מסוים או האתר המחשוף בתוך HA, בשילוב עם שינויים הסתגלותי תלויי-pH, יוצרת החשיפה של פיוז'ן ויראלי פפטיד1,2.
פפטיד פיוז'ן של רצף זיהוי הקודמת שלו פרוטאז הם קריטיים עבור פתוגניות של ובהתאמה מארח את הנגיף. שינויים ברצף זיהוי פרוטאז יכול לשנות המחשוף באופן משמעותי עם השלכות שעשויות להיות דרמטי עבור הנגיף ולא מארח4. מצד אחד, הוא יכול מחסלים. את המחשוף, ובכך לחסל את מחזור החיים של הנגיף. אבל מצד שני, מוטציה יכולה להגדיל את יחודיות סובסטרט של פרוטאז נתון ו/או לאפשר פרוטאז "חדש" לדבוק החלבון פיוז'ן. לאחר מכן, זה ניתן גם להרחיב את tropism תאים ורקמות כפי שנצפו, למשל, עם שפעת וירוס תת5,6. בדרך כלל נמוך פתוגניות שפעת העופות (LPAI) וירוסים, וירוסי שפעת האנושי ביותר הם נכלאים את דרכי הנשימה או במערכת העיכול בגלל לוקליזציה מוגבלת של פרוטאזות להפעיל אותם. בדרך כלל, פפטיד פיוז'ן של חלבונים HA כזה לפניו ארבע אמינו חומצה רצף מורכב של 1-2 לא רציף בסיסי חומצות אמינו, אשר הוכר על ידי טריפסין כמו סרין פרוטאזות כמו טריפסין, matriptase או TMPRSS27, 8. כאשר הנגיף רוכש שהתוספות או מוטציות המשנות את האתר המחשוף אל אתר polybasic, היא מאפשרת furin כדי להפעיל את HA, העלול לגרום הרבה יותר חמור זיהום סיסטמי6,9. וירוסים אלה מכונים וירוס שפעת העופות פתוגניות גבוהה (HPAI), מאופיין H5N1 זנים.
בניגוד שפעת HA, מעוררת רבים, כגון שהרובוט-זה, יש שני אתרים המחשוף נפרדות בתוך חלבון ספייק שלהם. האתר S1/S2 מפריד בין התחום איגוד קולטן N-מסוף (S1) מהתחום פיוז'ן C-מסוף (S2), עם אתר המחשוף השני, המכונה S2', הזרם של אתר S1/S2, בסמיכות פפטיד פיוז'ן10. הוצע כי האתרים הם ביקע באופן רציף, ב S1/S2 ואחריו S2'. בניגוד HA של רוב זני וירוס שפעת, חלבון זה שהרובוט S S1/S2 S2' אתרים יכול להיות מוכר על ידי פרוטאזות של משפחת proprotein convertase (PC), כגון furin. חברי משפחה זו קליב-שאריות בסיסי מזווג עם מוטיב R/K-(X)0,2,4,6-R/K(X, any amino acid)2. בדרך כלל, חומצות אמינו במעלה הזרם של אתר המחשוף מכונים P1, P2, P3, וכו '. סופר מן האתר המחשוף של חומצות אמינו במורד הזרם המיועדים לשמש P1', P2', P3', ועוד. 11. זנים FCoV יכול לקבל יחיד או אתר המחשוף כפול. כמו שהרובוט-זה, כמה זנים FCoV גם מחזיקים שני אתרים המחשוף (S1/S2 ו- S2') חלבון S שלהם. התכונה הזאת זאת, מלבד serotype אני FCoVs (קלייד A). לעומת זאת, חברי הקיבוץ השני (קלייד B) serotype יש רק אתר המחשוף יחיד (S2')2,12. פרוטאזות מספר שהוצעו כדי לדבוק האתרים פצילות FCoV, כולל furin, פרוטאזות, כמו טריפסין, cathepsin. הוצע כי החלבון S של המעית FCoV (הידוע גם בשם נגיף הקורונה המעית או FECV) צפוי להיות ביקע furin באתר S1/S2 ו מוטציות באתר זה (וכן גם ב S2') מובילה לשינויים בדרישות פרוטאז. מוטציות אלה נקשרו עם שינויים tropism, פתוגניות של וירוסים אלה, המאפשר את וירוס להיות מערכתית מקרופאג-חוג (וירוס הצפק הידוע גם בשם של חתולים או FIPV)13.
וירוסים להציג באופן טבעי מוטציות לתוך הגנום שלהם במהלך כל מחזור שכפול, תתי סוגים חדשים לעתים קרובות, זנים של שפעת, שהרובוט-זה ו FCoV תיאר14,15,16. כחלק הערכה מהירה להעריך את האיומים בריאות הציבור של וירוסים מתפתחים, חיוני לבדוק שינויים באתר המחשוף וכן איך זה משפיע על הטווח של פרוטאזות הפעלת וירוסים אלה. כאן, אנו מתארים assay מבוססת על פפטיד המאפשר הערכה מהירה של אופן השפעת השינויים באתר המחשוף בחלבון S שהרובוט-זה על יחודיות סובסטרט של פרוטאז נתון וכדי במהירות מסך פרוטאזות שונים ביכולתם קליב נתון או רצפים מספר4. בערכה השניה של ניסויים, השתמשנו בטכניקה כדי לקבוע את פעילות פצילות furin שונים FCoV אשר נגרמו מהזנים אליהם, זנים.
פפטידים בשימוש assay הזה עוברות שינוי עם פלורסצנטיות תהודה אנרגיה העברה (סריג) הזוג, אצטיל 7-methoxycoumarin-4-yl (MCA) אמיני, N-2, 4-dinitrophenyl (DNP)-קצה קרבוקסילי. במהלך וזמינותו, MCA נרגש, פולט אנרגיית האור זה הוא מתרצה מאת DNP כל עוד הזוג הוא בקרבתו אחד לשני. אם המחשוף מתרחשת, אולם, DNP אינו מסוגל להרוות את פליטת יותר, יוכל לקרוא על ידי הקורא צלחת זריחה. שינויים ידי קרינה פלואורסצנטית נמדד במהלך הניסוי כדי לקבוע את שיעור המחשוף פפטיד, וכדי לחשב את המהירות שבה cleaves פרוטאז ה פפטיד ספציפי (הידוע גם בשם Vmax)17.
על מנת לעצב את פפטידים, הגן של החלבון פיוז'ן בהתאמה בטח יש כבר וסודרו ו/או זמינים במסד נתונים. עם זאת, השיטה זו פחות עבודה-אינטנסיבי ויקר יותר בשיטות המקובלות בדרך כלל דורשים את שכפול של הגן חלבון פיוז'ן לתוך ביטוי וקטורים לבטא את זה. בתאי יונקים לנתח את המחשוף. מתחילתו ועד סופו, פעולה זו עשויה להימשך מספר ימים עד מספר שבועות בזמן מבחני פפטיד המובאת כאן יכול להיעשות תוך יום אחד ברגע פפטידים פרוטאזות הינם זמינים. ההתקנה של וזמינותו אורכת בין 5 ל 30 דקות תלוי במספר דוגמאות, הריצה בקורא צלחת פלורסצנטיות ח' 1 ניתוח של הנתונים עשויה להימשך עד 2 שעות שוב בהתאם לגודל המדגם.
כאן בחרנו שתי דוגמאות שונות להציג וזמינותו. בדוגמה הראשונה, אנו מציגים נתונים המשווה את המחשוף בתיווך furin של האדם ושל גמל-derived שהרובוט-זה, כדי להעריך את הפוטנציאל של גמל-derived הזנים של להיות מופעל אצל בני אדם. אם הם לחצות את מחסום המינים. בדוגמה השניה, השתמשנו assay פפטיד של fluorogenic כדי לקבוע את המחשוף בתיווך furin של S1/S2 ו- S2' אתרים או S2' באתר של שני אדנו, ואני serotype שני זנים II FCoV, בהתאמה. עבור ניסויים אלו, השתמשנו טריפסין המחשוף כפקד חיובי.
Protocol
1. תכנון והכנה של פפטידים
- רוכשים את הרצף של החלבון פיוז'ן עניין ממסד נתונים ציבוריים כגון NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) או את הפתוגן מסד הנתונים וירוס (https://www.viprbrc.org). לבחור אתר הכרה פרוטאז הקודם של פפטיד פיוז'ן, כוללים 2-3 חומצות אמינו ויוצאת של הרצף הזה.
- בעת הזמנת את פפטידים, לשנות אותם עם acetyl 7-methoxycoumarin-4-yl זוג קשת/קשתית (MCA) אמיני, N-2, 4-dinitrophenyl (DNP)-קצה קרבוקסילי.
הערה: מספר ספקים לספק לבצע שינויים אלה. מחיר וזמן משלוח תלויים הספק של הבחירה. עם זאת, שינויים אלטרנטיביים קיימים אשר נבדלים רגישות ודורשים התאמות של הקורא צלחת במונחים של אורכי גל. - Resuspend פפטיד על-פי המלצות היצרנים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה. לדוגמה, resuspend פפטידים אתנול 70% על הריכוז הסופי של 1 מ מ.
- לחלופין, הוסף את שפופרת המכילה את פפטיד, הממס אמבטיה sonication עד זה הוא מלא resuspended אם פפטיד לא resuspend היטב על ידי pipetting.
- Aliquot פפטיד לתוך האור לשבור או עמידים צינורות כדי להגן על פפטיד הלבנה. לשמור aliquot בגדלים קטנים כדי למנוע מחזורים ההקפאה/ההפשרה מרובים (למשל, 100 µL). חנות aliquots ב-20 ° C.
2. הכנת לקורא צלחת קרינה פלואורסצנטית
- הפעל את הקורא צלחת ולאחר המתן לסיום הבדיקה העצמית.
- פתח את תוכנת ההפעלה במחשב המצורף וודא שהוא מחובר עם הקורא את הצלחת.
- פתח את הגדרת טמפרטורת והגדר 30 ° C (או לקבלת ביצועים מיטביים עבור פרוטאז הטמפרטורה).
- לחץ על הפקד | כלי ההתקנה כדי להגדיר את הניסוי.
- לבחור קינטי.
- בחר זריחה.
- הזן אורכי גל עירור, פליטה: 330 nm ו 390 nm בהתאמה.
- ביטול בחירה של ניתוק אוטומטי.
- בחר את רגישות בינונית, נורמלי.
- בחר את זמן הריצה של 1h לציון וזמינותו ובחר מדידה אחת כל 60 s.
- סט 5 s ערבוב לפני המדידה הראשונה ו- 3 s לפני כל מדידה
- בחר ולס לקרוא ולהתחיל וזמינותו.
3. הכנת וזמינותו
- להכין מאגר assay על-ידי חישוב הכמויות המתאימות עבור כל מרכיב והוספת אותה. עבור furin, לעשות את מאגר בהיקף של 100 מ מ HEPES, 1 מ"מ CaCl2, 1 מ מ מרקפטואתנול, 5% טריטון X-100. לשימוש טריפסין, פוספט סטנדרטי buffered תמיסת (PBS).
הערה: אמצעי אחסון של 10 מ"ל או פחות מספיקים. המאגר משתנה בהתאם protease(s) בשימוש וזמינותו. - מקררים את המאגר על קרח.
- מניחים את הצלחת assay על הקרח עם לוח מתכת דק מתחת ל קירור תמיכה ויציבות. שימוש מוצק שחור פוליסטירן 96-ובכן צלחת עם חלק תחתון שטוח, שאינם מטופלים.
הערה: זה חיוני להשתמש לוחיות שחור כדי למנוע פלורסנט "נזילה" בארות סמוכים. - לחשב את הכמות המתאימה של פרוטאז כדי להוסיף עבור כל התגובה מבוסס על פרסומים קודמים או נתוני הניסוי. לשימוש furin, 1 יחידה לכל התגובה המתאים 0.5 µL. לשימוש טריפסין, 0.5 µL של 160 טריפסין TPCK ננומטר.
- לדגימה להכין משכפל טכני 3 לכל וזמינותו של הנפח הכולל של µL 100 לכל דגימה.
הערה: זה השפעול הוערך כי זה לא משנה אם pipetting מבוצעת בתנאים רגילים אור או אור מעומעם. עם זאת, פפטידים אסור לחשוף לאור לתקופה ממושכת של זמן. - Pipette את הכמות המתאימה של מאגר assay (µL 94.5 כמתואר תחת שלב 3.1) כל טוב.
- הוסף את פרוטאז מכל קידוח. הן furin והן TPCK טריפסין, להשתמש µL 0.5 לדגימה. כדי ולס 6 (3 בארות עבור פקד ריק) ווולס 3 עבור פקד פפטיד, להוסיף מאגר 0.5 µL במקום פרוטאז בהתאמה.
- הוסף את פפטיד ריכוז סופי של 50 מיקרומטר, כדי כל טוב למעט הפקד ריק. במקרה זה, פיפטה 5 פפטיד µL מוכן כמתואר בשלב 1.3. להוסיף 5 µL מאגר הפקד ריק במקום פפטיד.
הערה: מספר ריכוזים של פפטיד בתחילה נבדקו עם ריכוז האנזים המתואר כדי להבטיח כי האנזימים רוו. - תכניס את הצלחת לקורא צלחת פלורסצנטיות ' ולחץ על ' התחל '.
4. ניתוח נתונים
- שמור את הקובץ הניסוי.
- לחץ על ייצוא , לייצא את הקובץ כקובץ. txt.
- ייבוא הקובץ. txt לתוך גיליון אלקטרוני.
- עבור כל שכפול טכני עבור דגימה, ליצור גרף התוויית היחידות פלורסנט היחסי (RFU) בציר ה-y נגד הזמן בציר ה-x (משלימה איור 1).
- בחר את טווח הנתונים שבו הגרף היא טווח ליניארי, הקרוב ביותר כדי להתחיל את העלייה זריחה.
- להתוות את הנתונים הנבחרים על הגרף השני ולהוסיף קו מגמה ליניארי.
- בחר באפשרויות מגמה הצג משוואה בתרשים. המשוואה יציג את Vmax.
- חישוב שהממוצע Vmax עבור כל דגימה 3 טכני משכפל.
- חזור על הניסוי עוד פעמיים כדי לקבל 3 משכפל ביולוגי.
- חישוב סטיית התקן בהתבסס על הנתונים מ- 3 ביולוגית עצמאית משכפל.
Representative Results
בחלק הראשון של המחקר הזה, השתמשנו פפטידים המייצגים S2' אתר המחשוף של שלושה חלבונים שהרובוט-זה S ברורים: ומופת EMC/2012 האנושי המתח (Genbank AFS88936.1) ומן שני נבחר הגמל נגזר שהרובוט-CoVs, NRCE-HKU205 (Genbank AHL18090.1), Mor215 (Genbank AVN89324.1) זנים, ב מצרים, מרוקו, בהתאמה (טבלה 1)16,18.
לעומת המתח EMC/2012, HKU205 S2' המחשוף באתר יש שתי מוטציות P1, P2' עמדות יכול באופן פוטנציאלי על ההכרה בכך furin, לשנות את המחשוף יעילות (טבלה 1). בנוסף, היינו מעוניינים לחקור אם ומשפיעה איך כל מוטציה בודדים נמצאו המתח HKU205 furin המחשוף. לכן, כללנו שני פפטידים איפה ההחלפות בודדים הוכנסו לתוך הרצף פפטיד EMC/2012 (EMC/2012 mutA-S S2' ו- EMC/2012 mutS-אני S2') (טבלה 1). Furin היה מסוגל לבקע את פפטיד EMC/2012 ביעילות עם Vmax של 6.3 ± 1.2 RFU/דקה, ואילו שהבחנו כמעט בלי מחשוף בעת שימוש S2' פפטיד של המתח HKU205 (Vmax 0.5 ± 0.1 RFU/min) (איור 1 א'). כאשר חוקרים S2 mutA-S EMC/2012 ' פפטיד, מצאנו המחשוף צומצם מאוד בהשוואה להרצף פראי סוג (Vmax 3.6 ± 1 RFU/min). היה כמעט בלי מחשוף בעת בדיקת mutS EMC/2012-אני S2' פפטיד (Vmax 1.1 ± 0.9 RFU/min) (איור 1 א').
לאחרונה, שהרובוט-זה מבודד מאפריקה המערבית דווחו כי phylogenetically נבדל שהרובוט-זה ניתן למצוא את חצי האי ערב16. אחד מבודד תיאר לאחרונה הוא המתח Mor213, אשר נושאת לאוצין במקום ארגינין בעמדה P4 של S2 "באתר (טבלה 1), אשר יכול באופן פוטנציאלי על ההכרה בכך furin ולשנות את היעילות המחשוף. Assay פפטיד שלנו הראו כי יש רק מחשוף מינימלי של Mor213 S2' באתר לעומת האתר EMC/2012 (איור 1b). Vmax עבור פפטיד Mor213 הוא 1.0 ± 0.1.
החלק השני של המחקר הזה, השתמשנו וזמינותו פפטיד זהה כדי להעריך את המחשוף בתיווך furin מהאתרים המחשוף חלבון FCoV S. השתמשנו פפטידים מחקה האתר המחשוף S1/S2 של שני FCoV serotype אני וירוסים: FECV I ו- 4 (מהמעבדה ויטאקר) ו- FIPV אני שחור (Genbank AB088223.1). השתמשנו גם פפטידים מחקה S2 "האתר של וירוסים אלה, כמו גם FCoV שתי serotype II: FECV II 1683 (Genbank AFH58021.1) ו- FIPV II 1146 (Genbank AAY32596.1) זנים (טבלה 1). בדרך כלל, מחשוף furin מתרחשת כאשר שאריות בסיסי (ארגינין, ליזין) נמצאים בעמדות P1 ו- P4 של אתר המחשוף. מוטציות ב P1, P4 ו P1' תפקידים מוצעים כדי להפריע cleavability furin, לכן שינוי בדרישות פרוטאז של החלבון. (טבלה 1). פצילות Furin נצפתה על פפטיד S1/S2 הטיפוסי FECV I ו- 4 S1/S2 (Vmax 100.36 ± 7.61 RFU/min) אך לא על פפטיד S1/S2 מוטציה FIPV אני שחור S1/S2 (Vmax-1.37 ± 1.29 RFU/min) (איור 2 א). באופן דומה, furin הצליח קליב S2 ומופת ' פפטיד FECV II 1683 S2' (Vmax 5.46 ± 0.97 RFU/min), אבל לא S2 מוטציה ' פפטידים FECV I S2 ו- 4' (Vmax 0.26 ± 0.11 RFU/min), FIPV אני S2 שחור ' (Vmax 0.30 ± 0.14 RFU/min) ו- FIPV II 1146 S2' (Vmax-0.36 ± 0.11 RFU / min) (איור 2B). השתמשנו טריפסין כפקד חיובי למחשוף פפטיד, הבחנו טריפסין המחשוף של כל פפטידים בשימוש (משלימה איור 2).
טבלה 1. פפטידים המתאימים והאהובות רצפי החומצות. פפטידים המשמשים את מבחני להכיל את זוג קשת/קשתית (MCA/DNP) אצטיל/2, 4-dinitrophenyl (7-methoxycoumarin-4-yl). P4 ו P1 המחשוף האתר ממוקם ארגינין (R) משקעי, אשר מוכרים על-ידי furin, הן בכתב מודגש. שאריות באדום שיתאימו מוטציות לעומת ההתייחסות רצפים.
איור 1 . בתיווך Furin המחשוף הפרוטאוליטי של האדם ושל גמל-derived S2 שהרובוט-זה ' אתרי fluorogenic פפטידים. א Furin assay המחשוף של S2 שהרובוט-זה EMC/2012 אנושי ' באתר, זן נגזר גמל HKU205 (מוטציה כפולה), יחד עם גרסאות מוטציה בודדת של EMC/2012 (mutA-S, mutS-אני). B. Furin assay המחשוף של S2 שהרובוט-זה EMC/2012 אנושי ' באתר, זן נגזר גמל Mor213. עבור לוחות A ו- B, פפטידים היו מודגרות עם furin רקומביננטי, העלייה ברמת קרינה פלואורסצנטית עקב עיבוד הפרוטאוליטי נמדדה באמצעות fluorometer. מבחני בוצעו ב triplicates עם תוצאות המייצג ממוצעים של Vmax מ 3 ניסויים עצמאית (n = 3). קווי שגיאה מציינים SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . בתיווך Furin המחשוף הפרוטאוליטי FCoV S1/S2 ו- S2' אתרי פפטידים fluorogenic. א Furin המחשוף וזמינותו של FECV I ו- 4 ו- FIPV אני שחור S1/S2 אתרים. פפטידים היו מודגרות עם furin רקומביננטי. B. Furin assay המחשוף של FECV I ו- 4, FIPV אני שחור, FECV II 1683 ו- S2 1146 השני FIPV' אתרים. העלייה ברמת קרינה פלואורסצנטית עקב עיבוד הפרוטאוליטי נמדדה באמצעות של fluorometer. מבחני בוצעו ב triplicates עם תוצאות המייצג ממוצעים של Vmax מ 3 ניסויים עצמאית (n = 3). קווי שגיאה מציינים SD. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה טבלה 1: ערכים Vmax השתמשו איור 1 , איור 2- Vmax חושבו הערכים של גרפים כמופיע משלימה איור 1 , כפי שמתואר פרוטוקול סעיף 4. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
משלימה איור 1: איור של הנתונים הגולמיים נגזר מתוך התוכנה קורא צלחת- תוספת בשיעור של זריחה מעל הזמן גרפים ששימשו לקביעת Vmax. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
משלימה איור 2: בתיווך טריפסין המחשוף הפרוטאוליטי FCoV S1/S2 ו- S2' אתרי פפטידים fluorogenic. טריפסין המחשוף וזמינותו של FECV I ו- 4 ו- FIPV אני שחור S1/S2 אתרים של FECV I ו- 4, FIPV אני שחור, FECV II 1683 ו- S2 FIPV II 1146' אתרים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הדמות הזו.
Discussion
אנו מציגים כאן assay פפטיד של fluorogenic המאפשר הקרנה מהירה של חלבון רצפי למחשוף הפרוטאוליטי שלהם על ידי פרוטאזות. בדוגמה הראשונה שלנו בחרנו המחשוף שונים באתר מוטיבים של החלבון ספייק (S) שהרובוט-זה כדי להמחיש ליישום אחד זה וזמינותו. כמה אפוף וירוסים אשר מחזיקים מחלקת פיוז'ן חלבונים כגון שהרובוט-זה, הסארס-זה (סארס), שפעת הם הדאגות העיקריות לבריאות הציבור, תתי סוגים חדשים כל הזמן מתפתחים זה לי את הפוטנציאל לחצות מינים המחסומים של מארחיהם טבעי ל15,1,בני16. בידוד וירוסים ומטפחים אותם במעבדה לא יכול תמיד להיות ריאלי או דורש מעבדות מיוחדות שאינן זמינות בכל מתקן מחקר. לפיכך, יש צורך שיטות להערכת פוטנציאל הסכנה לבריאות הציבור של וירוסים מתפתחים זה יכול להתבצע בתנאי מעבדה רגיל. בנוסף וירוסים מיקוד בני אדם, וירוסים בעלי חיים מסוימים כמו FCoV גם מחזיקים באותה מחלקה אני פיוז'ן חלבונים, לכן, שיתוף מאפיינים דומים מאשר עמיתיהם האנושי שלהם. בידוד וירוסים אלה ניתן גם אתגר, עושה שימוש בכלים חדשניים צריך להתעמק בהם צורך.
שלב חיוני במחזור החיים של וירוסים הנ ל הוא ערך התא המארח פיוז'ן מתווכת על ידי עיבוד הפרוטאוליטי של החלבון פיוז'ן בהתאמה על-ידי מארח פרוטאזות1,2. דרך סטנדרטית כדי לחקור את החלק הזה של מחזור חיי ויראלי היא לשכפל את הגן חלבון פיוז'ן לתוך ביטוי בתרבית של וקטור, transfect בתרבית של תאים לאפשר ביטוי חלבון, דגירה או transfect משותפת עם פרוטאז עניין, ולבודד חלבון ולבצע ניתוח תספיג חלבון. שיטה זו מגיעה עם מספר מגבלות: זמינות של ה-DNA/RNA נגיפי עבור השיבוט, עלויות עבור סינתזה הגן אם אין DNA או RNA הינו זמין, זמינות של נוגדן כדי לזהות את חלבון כימרי ו מוצרים המחשוף שלה, וזה יכול לקחת עד כמה שבועות עד המחקר כולו מתבצע. הוא הופך אפילו יותר זמן רב, כסף ועבודה אינטנסיבית אם האינטרס של המחקר היא לחקור מספר מוטציות באתר המחשוף, מכיוון שהיא דורשת מוטגנזה. Fluorogenic פפטיד וזמינותו שנתאר כאן אין מגבלות אלה. פפטידים עניין ניתן לעצב בהתבסס על רצפים זמין לציבור, יש מספר ספקים המספקים מגוון רחב של פרוטאזות רקומביננטי הרלוונטיים עבור סוגים אלה של מחקרים ואת וזמינותו כולל הניתוח יכול להתבצע בתוך יום ביומו.
בדוגמה שלנו, בדקנו בתיווך furin המחשוף של S2' פרוטאז אתר הכרה של החלבון S שהרובוט-זה נגזר מן בני אדם וגמלים מ מצרים ומרוקו. את EMC אנושי-2012 והן הגמל HKU205 S2' אתרים מכיל מוטיב המחשוף טיפוסי RXXR furin. עם זאת, על פי המחשוף PiTou 2.0 הבקיע אלגוריתם HKU205 S2' האתר לא לנבא כדי להיות ביקע מאת furin, אשר אנו השפעול אושרו19. הסיבה למה HKU5 S2' אינו מעובד על-ידי furin עשוי לנבוע איזולאוצין ב- P1' עמדה. כאשר בדקנו שני פפטידים אשר נישא מוטציות בודדות S2 EMC 2012' רצף, הצלחנו לאשר זאת איזולאוצין ב- P1' במידה רבה abrogates המחשוף, ואילו אלנין כדי החלפת סרין, גרמו המחשוף מופחת. Mor213 S2' האתר אינו מכיל מוטיב פצילות furin וזה לא היה מפתיע לגלות כמעט בלי מחשוף. גם בדקנו איך furin cleaves S1/S2 ו- S2' פרוטאז אתרי זיהוי של החלבון FCoV S. היינו מסוגלים להבחין furin המחשוף של שני פפטידים FECV (FECV I ו- 4 S1/S2 ו- S2 1683 השני FECV'), בעוד מוטציה רצפים מפני וירוסים FIPV היו לא ביקע על-ידי furin.
בעת השוואת בתיווך furin המחשוף של S2 EMC 2012' פפטיד (איור 1 א') עם FECV I ו- 4 S1/2 פפטידים (איור 2 א), מצאנו שהיה משוער השוני 26-fold Vmax. זו יכולה להיות מוסברת על ידי המוטיב פצילות furin שני רצפים (טבלה 1). בעוד הדרישה המינימלית עבור ביקוע חלבונים furin הוא מוטיב RXXR, רצף RXRR היא הרבה יותר חיובית2. לכן, S2 EMC 2012' פפטיד, אשר יש מוטיב RSAR, הוא ביקע עם ירידה לפרטים פחות בהשוואה של פפטיד FECV I ו- 4 S1/2 המכילה חלבון RSRR המחשוף פורין (טבלה 1).
מגבלה אחת גדולה של וזמינותו זאת, כי פפטידים אינן משקפות את מבנה שלישוני של החלבון שהם בדרך כלל מוטבעות. המחשוף של החלבון פיוז'ן באורך מלא חושף את פפטיד פיוז'ן ולארח המפעילים התא ערך1. גם עשוי להיות מושפע האינטראקציה בין חלבון פרוטאז ופיוז'ן מבנה שלישוני של החלבון פיוז'ן בעוד אנו מניחים כי פפטידים הם פחות או יותר ליניארי. לפיכך, המחשוף זוהה וזמינותו פפטיד עלול להיות מלאכותי, אינן משקפות בהכרח את המצב ויוו . זה נמסר למחשוף משפעת H3N2 חה המשנה על-ידי matriptase. בעוד מספר קבוצות שתיאר המחשוף של H3N2 חה matriptase ב מבחני פפטיד, זה גם הראו כי דגירה של אורך מלא H3N2 חה חלבונים, matriptase בתרבות תא לא לגרום fusogenic HA חלבון4,20, 21. ישנם עוד דוגמאות שמראות כי ויסות ביולוגית חשובה המחשוף הפרוטאוליטי הוא ברמה של חלבון קונפורמציה. זה תואר כי חלבונים פיוז'ן צריך לפעמים סדרה של אירועים פיוז'ן מראש כדי להיות מסוגל לחשוף את האתרים המחשוף על היתוך. חלבון כימרי וירוס יער Semliki, לדוגמה, דורש rearrangements מבנית במהלך מספר אירועים prefusion על מנת לחשוף את חלבון כימרי שלה, להפוך אותה לזמינה עבור ההפעלה הפרוטאוליטי22. לכן, התוצאות המתקבלות assay פפטיד fluorogenic צריך להיות מאומת על ידי מבחני פיוז'ן התא או ניסויים דומים. עם זאת, וזמינותו פפטיד עדיין מאפשר הקרנה מהירה של מספר שילובים פרוטאז/פפטיד וכדי להקטין את העבודה ואת הזמן של המשך הניסויים מאז שילובים שאינם מציגים המחשוף סביר מאוד להפגין אותו תוצאה ויוו.
המגבלה העיקרית השנייה של וזמינותו נוגע פרוטאזות. עד כה זה אפשרי רק לבדוק פרוטאזות מסיס אבל לא transmembrane פרוטאזות. בהתאם לכוונת הניסוי, זה יכול להיות בעיה. לדוגמה, שפעת משמשת מופעלות על ידי מספר פרוטאזות transmembrane ממוקם על קרום התא8. במידה מסוימת, בעיה זו ניתן שיפרו באמצעות התחומים פעיל הפרוטאוליטי מסיסים, אך התוצאות יש לפרש בזהירות, לאמת עם שיטות קונבנציונליות. אנחנו רוצים להפנות הדוגמה beforementioned עם matriptase, פעילותה לקראת H3N2 HA. In vivo matriptase ממוקם קרום התא אבל האנזים זמינים מסחרית הוא התחום קטליטי מסיסים. כפי שפורט ביחס החלבונים פיוז'ן, ייתכן שזה גם דורש את פרוטאז באורך מלא לקיים אינטראקציה עם המצע חלבון באורך מלא כדי להשיג את המחשוף, כי בדיקות רק יחיד תחומים עלול להניב תוצאות חיוביות שגויות.
מתודולוגיה זו הוכיחו להיות יעילים כדי ללמוד את המחשוף של רצפי חומצות אמינו ספציפיות על-ידי furin. עם זאת, היישומים של טכניקה extents פרוטאז זמין כלשהו (למשל, cathepsins, proprotein convertase), שהופך אותו שיטה שימושית מסך המועמדים פפטיד למחשוף פרוטאז. יתר על כן, הוכח כי assay הזה יכול לשמש גם כדי לבדוק את היעילות של מעכבי פרוטאז, ולפיכך מספק מהיר וקל לכלי מסך חלבון מעכבי23.
Fluorogenic פפטיד המחשוף וזמינותו המתוארים כאן מייצג תוספת פצילות bioinformatic הבקיע אלגוריתמים, אשר חוזה את המחשוף פפטיד על ידי פרוטאז נחוש, בהתבסס על מאפייני חומצת אמינו רצף. אלה שתי טכניקות, בשילוב עם המסורת המערבית סופג טכניקות יכול לשמש בתור שיטה יעילה ללמוד פרוטאז המחשוף בתוך חוץ גופית.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
מענקי מחקר עבור הפרויקט שהרובוט שהוצגו בכתב יד זה סופק על ידי NIH הענק R21 AI111085. המחקר נגיף הקורונה נתמכה על ידי מענקי מחקר מוריס חיה קרן, קרן של חתולים וין ומרכז בריאות חתולים קורנל. אנחנו גם רוצה להודות מאליק Peiris סיפק לנו רצף Mor213 לפני שזה היה נגיש לציבור.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peptides | Biomatik | N/A | |
| Furin | NEB | P8077S | |
| Trypsin, TPCK-treated | Sigma-Aldrich | 4352157-1KT | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| PBS | Corning | 21-040-CV | |
| SpectraMax Gemini XPS | Molecular Devices | XPS | |
| SoftMax Pro 6.5.1 | Molecular Devices | N/A | |
| 96-well plate (solid black polystyrene with a flat bottom and non-treated) | Costar | 3915 | |
| Light damping tubes | Watson Lab | 131-915BL or 131-915BR | |
| Microsoft Excel | Microsoft | N/A | |
| Prism 7 | GraphPad | N/A |
References
- Harrison, S. C.
- Millet, J. K., Whittaker, G. R. Host cell proteases: Critical determinants of coronavirus tropism and pathogenesis. Virus Research. , (2014).
- Hamilton, B. S., Whittaker, G. R., Daniel, S. Influenza virus-mediated membrane fusion: Determinants of hemagglutinin fusogenic activity and experimental approaches for assessing virus fusion. Viruses. 4 (7), 1144-1168 (2012).
- Straus, M. R., Whittaker, G. R. A peptide-based approach to evaluate the adaptability of influenza A virus to humans based on its hemagglutinin proteolytic cleavage site. PloS one. 12 (3), e0174827 (2017).
- Kawaoka, Y., Webster, R. G. Sequence requirements for cleavage activation of influenza virus hemagglutinin expressed in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (2), 324-328 (1988).
- Abdelwhab, E. S. M., et al. A Unique Multibasic Proteolytic Cleavage Site and Three Mutations in the HA2 Domain Confer High Virulence of H7N1 Avian Influenza Virus in Chickens. Journal of Virology. 90 (1), 400-411 (2016).
- Steinhauer, D. Role of hemagglutinin cleavage for the pathogenicity of influenza virus. Virology. 258 (1), 1-20 (1999).
- Böttcher-Friebertshäuser, E., Klenk, H. D., Garten, W. Activation of influenza viruses by proteases from host cells and bacteria in the human airway epithelium. Pathogens and disease. 69 (2), 87-100 (2013).
- Horimoto, T., Nakayama, K., Smeekens, S. P., Kawaoka, Y. Proprotein-processing endoproteases PC6 and furin both activate hemagglutinin of virulent avian influenza viruses. Journal of Virology. 68 (9), 6074-6078 (1994).
- Belouzard, S., Chu, V. C., Whittaker, G. R. Activation of the SARS coronavirus spike protein via sequential proteolytic cleavage at two distinct sites. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (14), 5871-5876 (2009).
- Polgar, L.
- Whittaker, G. R., André, N. M., Millet, J. K. Improving Virus Taxonomy by Recontextualizing Sequence-Based Classification with Biologically Relevant Data: the Case of the Alphacoronavirus 1 Species. mSphere. 3 (1), 1-8 (2018).
- Licitra, B. N., et al. Mutation in spike protein cleavage site and pathogenesis of feline coronavirus. Emerging Infectious Diseases. 19 (7), 1066-1073 (2013).
- Sanjuan, R., Nebot, M. R., Chirico, N., Mansky, L. M., Belshaw, R.
- Trombetta, C., Piccirella, S., Perini, D., Kistner, O., Montomoli, E. Emerging Influenza Strains in the Last Two Decades: A Threat of a New Pandemic? Vaccines. 3 (1), 172-185 (2015).
- Chu, D. K. W., et al. MERS coronaviruses from camels in Africa exhibit region-dependent genetic diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences. , 1-6 (2018).
- Caprioli, R. M., Smith, L. Determination of Km and Vmax for Tryptic Peptide Hydrolysis Using Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 58 (6), 1080-1083 (1986).
- Millet, J. K., Goldstein, M. E., Labitt, R. N., Hsu, H., Daniel, S., Whittaker, G. R. A camel-derived MERS-CoV with a variant spike protein cleavage site and distinct fusion activation properties. Emerging microbes and infections. 5 (12), e126-e129 (2016).
- Tian, S., Huajun, W., Wu, J. Computational prediction of furin cleavage sites by a hybrid method and understanding mechanism underlying diseases. Scientific Reports. 2, (2012).
- Hamilton, B. S., Gludish, D. W. J., Whittaker, G. R. Cleavage Activation of the Human-Adapted Influenza Virus Subtypes by Matriptase Reveals both Subtype and Strain Specificities. Journal of Virology. 86 (19), 10579-10586 (2012).
- Beaulieu, A., et al. Matriptase Proteolytically Activates Influenza Virus and Promotes Multicycle Epithelium Replication in the Human Airway. Journal of virology. 30 (878), 4237-4251 (2013).
- Hammar, L., Markarian, S., Haag, L., Lankinen, H., Salmi, A., Holland Cheng, R. Prefusion rearrangements resulting in fusion peptide exposure in Semliki Forest virus. Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 7189-7198 (2003).
- Hamilton, B. S., Chung, C., Cyphers, S. Y., Rinaldi, V. D., Marcano, V. C., Whittaker, G. R. Inhibition of influenza virus infection and hemagglutinin cleavage by the protease inhibitor HAI-2. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (2), 1070-1075 (2014).
