Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات

Published: March 6, 2019 doi: 10.3791/58901
Automatic Translation
*1, *1, 1, *1, *1
1Institute for Translational Neurology and Neurology Clinic, University of Muenster
* These authors contributed equally

Summary

Microvascular خلايا بطانية لعضلات الهيكل العظمى (مك) شكل الجدار الداخلي للعضلات الشعيرات الدموية وتنظم على حد سواء، تبادل السوائل/الجزيئات والهجرة من الخلايا (المناعية) بين أنسجة العضلات والدم. عزل مك مورين الأولية، كما هو موضح هنا، يتيح إجراء تحقيقات شاملة في المختبر لوحدة "ميوفاسكولار".

Abstract

خلايا بطانية للهيكل العظمى والعضلات الشعيرات الدموية (العضلات خلايا بطانية ميكروفاسكولار، مك) بناء الحاجز بين مجرى الدم وعضلات الهيكل العظمى التي تنظم تبادل السوائل والمواد الغذائية، فضلا عن الاستجابة المناعية ضد المعدية وكلاء بمراقبة الهجرة الخلية المناعية. لأداء هذه المهام، تشكل مك وظيفية "وحدة ميوفاسكولار" (مفو)، مع زيادة أنواع الخلايا، مثل الخلايا الليفية، وبيريسيتيس، وخلايا الهيكل العظمى والعضلات. ونتيجة لذلك، يسهم خلل وظيفي مك ومن ثم مفو مجموعة متنوعة واسعة من ميوباثيس. ومع ذلك، آليات تنظيمية من مك في الصحة والمرض تظل مفهومة غير كاف وعلى توضيح تسبق علاجات أكثر تحديداً ميوباثيس. عزلة والتحقيق المتعمق في وظائف مك الأولية في سياق مفو قد تيسر فهم أفضل لهذه العمليات.

توفر هذه المقالة بروتوكول لعزل مك مورين الأولية من الهيكل العظمى والعضلات بالتفكك الميكانيكية والانزيميه بما في ذلك تنقية وخطوات الحفاظ على الثقافة.

Introduction

عبر مجرى الدم والخلايا والأجهزة مزودة بالأكسجين وركائز والجزيئات الضرورية الأخرى. ويجري هذا التبادل في الشعيرات الدموية، سفن أصغر. الشعيرات الدموية تتشكل من طبقة خلايا بطانية داخلية (EC) سلامتها يظل شرطا أساسيا للتنظيم الناجح للعضلات التوازن بين المساحة داخل الأوعية والمتداخلة. لضمان انتقال انتقائية من العوامل القابلة للذوبان والخلايا، تشكل الجماعة الأوروبية أحادي الطبقة مترابطة بضيق و تقاطعات أدهيرينس 1. وإلى جانب دورها كحاجز للمواد الغذائية أو المنتجات الأيضية، تنظيم المفوضية الأوروبية تجنيد الكريات البيضاء في عمليات الالتهابات. أضرار التهاب أو الأنسجة يؤدي إلى أعلى لائحة جزيئات الالتصاق على السطح EC وإنتاج المستقطبات تيسير مرفق الكريات البيض والتهجير في الأنسجة المستهدفة 2. ونتيجة لذلك، تشارك المفوضية الأوروبية حاسمة في تنظيم عمليات تحريضية مثل الدفاع ضد العوامل الممرضة أو إصلاح الأنسجة.

خلل من المفوضية الأوروبية مباشرة المرتبطة بأمراض الأوعية الدموية والفشل الكلوي المزمن وتجلط وريدي مسببات المرض شديد العدوى. وعلاوة على ذلك، تشارك المفوضية الأوروبية تقريبا دائماً في الخاصة بجهاز المناعة الذاتية مثل السكري أو التصلب المتعدد 3. وظيفة الحاجز بين مجرى الدم والأجهزة ولذلك تسيطر تفاعل متضافرة من أنواع مختلفة من الخلايا. في الهيكل العظمى والعضلات microvascular غشائي الخلايا (مك) جنبا إلى جنب مع خلايا العضلات، الليفية وبيريسيتيس تشكل وحدة وظيفية، ووحدة "ميوفاسكولار" (مفو). ولذلك، اختلال وظيفي مفو قد دور حاسم في الفسيولوجيا المرضية ميوباثيس. ومع ذلك، فهم أعمق لهذه الآليات التنظيمية لا يزال مفقوداً وحاليا يحول دون تحديد أهداف جديدة، وهناك حاجة ماسة إليها، والعلاجية في ميوباثيس.

للتحقيق في الآليات الفيزيولوجية والفيزيولوجية المرضية المعقدة، ويشيع استخدام نماذج حيوانية. ومع ذلك، ميزة نماذج في المختبر التركيز على هذا موضوع اهتمام باستثناء مجموعة متنوعة من العوامل المؤثرة الأخرى. للتحقيق في العمليات في المختبر من الضروري عزل الخلايا الابتدائية نقية وقابلة للحياة. وعلى النقيض من خطوط الخلايا، تمكين الخلايا الأولية المعزولة من الحيوانات المحورة وراثيا بالتحقيق في آثار التعديلات الوراثية في المختبر.

هنا، يتم وصف طريقة لعزل مك مورين الأولية باستخدام التفكك الميكانيكية والانزيميه متبوعاً بخلية تنشيط مغنطيسية الفرز تقنيات (MCS) لتنقية. وتستخدم لهذا الغرض، حبات مغناطيسية ضد علامات سطح معين. الصفائح الدموية غشائي خلية التصاق جزيء-1 (PECAM1, CD31) هو أساسا عن المفوضية الأوروبية ويمكن استخدامها لإثراء هذا النوع الخلية. لتبرير خلية عالية النقاء، مستبعدة خلايا المنشأ المكونة للدم بتحديد سلبي لبروتين تيروزين الفوسفاتيز مستقبلات نوع ج (بتبرك، CD45). علاوة على ذلك، يتم عرض عمليات مراقبة الجودة، وزراعة مك مورين الأولية، والتطبيقات المحتملة والقيود، فضلا عن اعتبارات خاصة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع التجارب على الحيوانات كانت معتمدة من قبل السلطات المحلية وتجري وفقا للقانون الألماني الرفق بالحيوان (84-02.05.20.13.097).

الملاحظات العامة على التجارب على الحيوانات

  1. إجراء جميع التجارب الماوس وفقا للمبادئ التوجيهية لرعاية الحيوان المؤسسية الخاصة بكل منها واستخدام اللجنة.
  2. الحفاظ على الفئران في ظروف موحدة، ووفقا للمبادئ التوجيهية الدولية مثل الاتحاد للجمعيات الحيوان مختبر العلوم (فيلاسا).
    ملاحظة: بشكل عام يمكن استخدام هذا الأسلوب العزلة للفئران مستقلة عن السن أو نوع الجنس أو الخلفية الوراثية. للحصول على عدد كاف من خلايا، 4 – 10 الأسبوع القديمة الذكور المفضلة، نظراً لأن الخصائص البيولوجية يمكن أن تختلف مع العمر ونوع الجنس.

2-إعداد الحلول ووسائل الإعلام وطلاء

  1. إعداد الحل الهضم (DS) بخلط 2.2 مل من النسر Dulbecco´s المتوسطة تعديل (دميم) مع 200 ميكروليتر كولاجيناز-ديسباسي وميكروليتر 45 ديسوكسيريبونوكليسي (الدناز).
  2. إعداد 500 مل من الخلية البطانية المتوسطة (ECM) عن طريق خلط 450 مل دميم مع 50 مل FCS (حوالي 10%)، بفجف عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية 0.25 مل (20 ميكروغرام/مل؛ حوالي 0.05%) ومل 5 البنسلين-ستربتوميسين (حوالي 1%). إجراء الترشيح العقيمة في أنبوب زجاج (قطر المسام تصفية: 0.2 ميكرومتر). وبعد ذلك تخزين الحل عند 4 درجة مئوية.
  3. معطف خلية ثقافة لوحات كما هو موضح أدناه.
    1. لزراعة الغطاء MEC مورين الابتدائي معزول طازجة الخلية السطح كله مع 1 مل كل بئر 6 أيضا لوحة الثقافة بمحلول طلاء جيلاتين على أساس سرعة (انظر الجدول للمواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لمدة 3-5 دقيقة في الغرفة درجة الحرارة (RT).
    2. نضح وتجاهل الحل الطلاء. أشطف كل بئر مع 2 مل الفوسفات العقيمة مخزنة المالحة (PBS)، الرقم الهيدروجيني 7.1 – 7.5 في خطوتين متتاليتين الغسيل.
    3. نضح وتجاهل برنامج تلفزيوني. تملأ الآبار بحجم 1 مل من إدارة المحتوى في المؤسسة.

3-عزل العضلات مورين الابتدائي Microvascular خلايا بطانية (مك)

  1. Euthanize بالغ واحد 4-12 أسابيع ماوس القديمة، والذكور من التفكك عنق الرحم دون أي تخدير. ويهدف إلى فصل بسرعة الحبل الشوكي من الدماغ بغية تزويد الحيوان موت سريع وغير مؤلم.
  2. قطع الأطراف.
    1. استخدام العمليات جراحية حادة/بلانت (طليعة 42 مم، على التوالي)، وشارب/شارب مقص (قطع حافة 23 ملم، على التوالي)، على التوالي (مسنن، 2 مم × 1.25 مم × 12 سم) ومنحني (مسنن، 1.3 مم × 1 مم × 13 سم) الملقط.
    2. تطهير جميع الأدوات الجراحية مع الإيثانول 70%.
    3. ضع الحيوان على ظهرها، وترطيب الساقين مع الإيثانول 70%. قطع الساق كله بالقطع في الورك مع مقص جراحي حاد/بلانت. تضع الأطراف في طبق ثقافة خلية مغلقة (35 مم × 10 مم).
      ملاحظة: من الآن فصاعدا تنفيذ كل خطوة تحت غطاء الاندفاق الصفحي عقيمة، والعمل مع أدوات معقمة.
  3. عزل الأنسجة العضلية (شكل تفضيلي استخدام موسكولوس الفخذ الفخذية أو موسكولوس الرؤوس سوري من ساقيه).
    1. قطع الجلد مفتوحة من الورك إلى أخمص القدمين-التلميح باستخدام مقص حاد/حاد والملقط منحنية. عقد إصبع القدم أو قاطع مع الملقط على التوالي. تقشر الجلد مع الملقط منحنى من أخمص قدميه إلى الورك.
    2. عزل موسكولوس الفخذ الفخذية بقطع الوتر من الركبة وقطع في العضلات على طول عظم الفخذ الورك. عزل موسكولوس الرؤوس سوري بقطع وتر أخيل. فيما يلي، قص على طول الساق إلى الحفرة المابضيه وإزالة العضلات.
      ملاحظة: إذا كانت السفن الكبيرة (فيموراليس ألف، ألف الظنبوبي الأمامي، الخلفي الظنبوبي أ، فيبولاريس أ) مرئية في العضلات معزولة، إزالة السفن لتجنب التلوث بالبطانة ماكروفاسكولار.
    3. لإزالة السفن الكبيرة، عقد الجزء من العضلات التي لا تحتوي على السفن الكبيرة مع ملقط منحنية وقطع جانب السفينة. لهذا البروتوكول، ينصح ز 1 أو أقل أنسجة العضلات يساوي الفخذ الفخذية و سوري ثلاثية الرؤوس .
    4. إضافة ميليلتر 2,445 س (من الخطوة 2، 1) لطبق ثقافة خلية (35 مم × 10 مم) وتحديد الوزن.
    5. نقل جميع العضلات القطع لهذا الطبق ثقافة الخلية التي تحتوي على ميليلتر 2445 DS وتحديد الوزن. الفرق بين كلا القيم المقاسة يوفر الوزن الجاف لانسجة العضلات التي يجب أن لا تتجاوز 1 غ.
    6. قطع أنسجة العضلات كلها إلى قطع صغيرة (مكعبات مم دي تو، وحوالي 100 قطعة) باستخدام مقص حاد/حاد.
  4. ننأى بأنسجة العضلات.
    ملاحظة:     هذه الخطوة تستغرق حوالي 120 دقيقة.
    1. تعليق العضلات/DS مخزن في 37 درجة مئوية (حاضنة مع 5% CO2) ل 1.5 h. مزيج تعليق بعناية كل 20 دقيقة لمدة حوالي 5 دقائق باستخدام حقنه الأنسولين 1 مل.
    2. نقل تعليق إلى 70 ميكرومتر نايلون خلية مصفاة توضع في أنبوب 50 مل والتدفق من خلال جمع. أغسل مصفاة الخلية مع 8 مل دميم والتدفق من خلال جمع.
    3. تجاهل تعليق خلية مصفاة والطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 20 درجة مئوية. بعناية إزالة المادة طافية.
      تنبيه: بيليه من السهل أن تفقد.
    4. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل من وجود مخزن ليسينج الأمونيوم-كلوريد البوتاسيوم (ACK) (انظر الجدول للموادالمغلقة) لتحلل لخلايا الدم الحمراء واحتضان 30 ثانية في الرايت إضافة 9 مل دميم + 10% FCS لوقف تعليق خلية رد فعل ونقل إلى تي 15 مل التعليم الأساسي للجميع.
  5. تستنفد CD45+ الخلايا اتباع إرشادات الشركة المصنعة ميكروبيدس CD45. لجميع الخطوات التالية من CD45+ استنفاد استخدام المخزن المؤقت MCS (انظر "الجدول للمواد" المغلقة).
    ملاحظة:     هذه الخطوة تستغرق حوالي 60 دقيقة.
    1. تحديد أرقام الخلية باستخدام خلية نويباور عد الدائرة (نتوقع حوالي 5 × 106 الخلايا في أنسجة العضلات ز).
    2. تعليق الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. خلع المادة طافية تماما وريسوسبيند بيليه الخلية في 90 المخزن المؤقت من MCS ميليلتر (107 خلايا أو أقل). إضافة 10 ميكروليتر من ميكروبيدس CD45 (107 خلايا أو أقل).
    3. مزيج تعليق خلية واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة على 4 – 8 درجة مئوية.
    4. أضف 1 مل MCS المخزن المؤقت (107 خلايا أو أقل). أجهزة الطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية تماما وريسوسبيند الخلايا في 500 ميكروليتر MCS العازلة.
    5. لفصل المغناطيسية الخلية استخدام عمود مغناطيسية كبيرة (LMC) مع حجم خزان 8 مل وقدرة تصل إلى 2 × 109 مجموع الخلايا. ضع سابع في المجال المغناطيسي للفاصل.
    6. شطف مع 3 مل من المخزن المؤقت للإشراف في خزان سابع. بعد الشطف، ضع أنبوب مخروطي 15 مل أسفل عمود للتدفق من خلال جمع. تطبيق تعليق خلية كاملة (500 ميليلتر) على العمود والسماح لها تماما تدفق من خلال.
    7. أغسل العمود ثلاث مرات بإضافة 3 مل من المخزن المؤقت للإشراف إلى الخزان وانتظر حتى فارغ خزان column´s قبل إجراء الخطوة التالية الغسيل.
    8. جمع الخلايا غير مسمى يمر العمود تستخدم لاتخاذ مزيد من الخطوات الفاصلة (تمثل CD45 كسر– ). تسمية الخلايا (تمثل في CD45+ الكسر) المتراكمة في العمود يمكن التخلص.
  6. تراكم CD31+ الخلايا التالية CD31 ميكروبيدس لإرشادات الشركة المصنعة. لجميع الخطوات التالية من CD31+ تراكم استخدام المخزن المؤقت للرصد والمراقبة.
    ملاحظة:     هذه الخطوة تستغرق حوالي 60 دقيقة.
    1. تحديد عدد الخلايا باستخدام خلية نويباور عد الدائرة (حوالي 4 × 106 الخلايا في أنسجة العضلات ز تتوقع).
    2. أجهزة الطرد المركزي الحصول على تعليق خلية غير مسمى من الخطوة 3.5 لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 4 درجات مئوية.
    3. إزالة المادة طافية تماما. ريسوسبيند بيليه في ميكروليتر 90 MCS المخزن المؤقت وإضافة 10 ميكروليتر من ميكروبيدس CD31 (107 مجموع الخلايا أو أقل). مزيج تعليق كامل واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة على 4 – 8 درجة مئوية.
    4. أضف 1 مل MCS المخزن المؤقت والطرد المركزي في 300 x ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية. خلع المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة.
    5. لفصل المغناطيسية الخلية استخدام عمود مغناطيسي متوسطة (MMC) مع حجم خزان 3.5 مل وقدرة تصل إلى 2 × 108 مجموع الخلايا.
    6. ضع MMC في المجال المغناطيسي للفاصل. شطف MMC مع 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة. بعد الشطف، ضع أنبوب مخروطي 15 مل أسفل عمود للتدفق من خلال جمع.
    7. تطبيق تعليق خلية كاملة (500 ميليلتر) على العمود والسماح لها تماما تدفق من خلال.
    8. أغسل العمود ثلاث مرات بإضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت للرصد والمراقبة والانتظار حتى خزان للعمود فارغاً قبل تنفيذ الخطوة التالية الغسيل. تمثل الخلايا غير مسمى يمر العمود CD45– CD31– الكسر. تخزينها لضوابط الجودة كذلك.
    9. إزالة عمود من الفاصل ووضعه في أنبوب جمع مناسبة (أنبوب 15 مل). ماصة 2 مل MCS المخزن المؤقت على العمود. فورا طرد الخلايا المسماة مغناطيسيا بدفع المكبس بقوة إلى العمود. هذا CD45– CD31+ الكسر يمثل الجماعة الأوروبية مورين الابتدائي العالي التخصيب.
    10. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 350 x ز في 20 درجة مئوية. إزالة المادة طافية تماما وريسوسبيند الخلايا (نتوقع حوالي 0.6 × 106 الخلايا في أنسجة العضلات ز) في 1 مل ECM (راجع الخطوة 2.2.). نقل الخلايا (0.5 – 0.7 × 106 خلايا) إلى بئر واحدة من صفيحة المغلفة 6-بئر الثقافة (من الخطوة 2، 3) الذي يحتوي على 1 مل من إدارة المحتوى في المؤسسة.
  7. للزراعة، واحتضان خلايا في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة. تحديث المحتوى كل يومين أو ثلاثة أيام.

4-الابتدائي مك مورين تنقية

  1. إجراء دورة ثانية من CD31+ تراكم، اتباع إرشادات الشركة المصنعة (ميكروبيدس CD31 الماوس البروتوكول؛ وراجع الخطوة 3.6.).
    1. فصل الخلايا مع التربسين/يدتا الحل عندما يكونون في التقاء 80 – 90% (عادة بعد 7 أيام). ولهذا الغرض، شطف كل بئر مع PBS العقيمة 2 مل، في خطوتين متتاليتين الغسيل. استخدام 800 ميكروليتر التربسين/يدتا الحل الواحد 6-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة ل 3 – 5 دقيقة وقف النشاط الأنزيمي باستخدام 1200 ميكروليتر دميم تحتوي على حد أدنى من 10% FCS.
    2. الطرد المركزي من تعليق خلية لمدة 5 دقائق في 350 x ز في 20 درجة مئوية.
    3. نفذ الخطوة CD31 MCS الثانية زيادة النقاء (وفقا للتعليمات manufacturer´s ميكروبيدس CD31؛ انظر 3.6).
    4. نلاحظ التقاء الخلية عن طريق حقل مشرق أو استخدام الفحص المجهري المرحلة القياسية--على النقيض
      20 x التكبير وفتحه العدسة 0.35 العددية. انظر الشكل 1.
      ملاحظة: يمكن استخدامها لإجراء التجارب على كل الخلايا أو أبقى في الثقافة التي باساجينج. استخدام الخلايا لإجراء التجارب على الفور في الممرات السفلي. لا ينصح باستخدام الخلايا بعد مرور
      8 – 10.

5-مراقبة الجودة

  1. أداء التدفق الخلوي مميك موريني الأولية بعد CD31-الإشراف-الخطوة الثانية.
    1. إعداد أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية عن طريق إضافة 1 مل التدفق الخلوي (FC) المخزن المؤقت (انظر الجدول للموادالمغلقة).
    2. فصل الخلايا مع التربسين/يدتا الحل عندما يكونون في التقاء 100 ٪ (عادة بعد 14 يوما). ولهذا الغرض، شطف كل بئر مع PBS العقيمة 2 مل، في خطوتين متتاليتين الغسيل. استخدام 800 ميكروليتر التربسين/يدتا الحل الواحد 6-جيدا واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة ل 3 – 5 دقيقة وقف النشاط الأنزيمي باستخدام 1200 ميكروليتر دميم تحتوي على السفح 10%.
    3. تحديد عدد الخلايا استخدام نويباور عد الخلايا للدائرة وإضافة الحد ني خلايا 1 × 105 إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية المعدة.
    4. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 4 درجات مئوية. إجراء خطوتين الغسيل بإزالة المادة طافية والخلايا الموجودة في المخزن المؤقت 1 مل FC ريسوسبيندينج وسينتريفوجينج لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 4 درجات مئوية.
    5. إعداد مزيج المصبوغة بإضافة جسم CD31-فيتك (1: 100) المضادة الماوس والماوس المضادة CD45-PE (1: 100) مع المخزن المؤقت لنادي.
    6. ريسوسبيند الخلايا في 100 ميكروليتر من تلطيخ المزيج في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. احتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية. أضف 1 مل من المخزن المؤقت لنادي. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 300 x ز في 4 درجات مئوية. بعناية إزالة المادة طافية والخلايا في 200 ميكروليتر من المخزن المؤقت لنادي ريسوسبيند.
    7. قياس الخلايا في تدفق cytometer عقب الاستراتيجية النابضة التي تظهر في الشكل. 2A.
  2. وبدلاً من ذلك إجراء الفلورة تلطيخ من مك مورين الأولية بعد CD31-الإشراف-الخطوة الثانية.
    1. معطف كوفيرسليبس.
      1. نقل قطره معقمة 13 مم جولة ساترة زجاجية في بئر صفيحة جيدا 24. معطف ساترة بإضافة 300 ميليلتر لسرعة حل طلاء كل بئر. احتضان لمدة 3-5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT).
      2. نضح وتجاهل الحل الطلاء. أشطف كل بئر مع 2 مل PBS العقيمة في خطوتين متتاليتين الغسيل. نضح وتجاهل برنامج تلفزيوني.
      3. البذور 1 × 105 خلايا في 1 مل ECM على ساترة المغلفة، واحتضان في 37 درجة مئوية و 5% CO2 في حاضنة عقيمة حتى يتم روافد 99% من الخلايا.
    2. إجراء التثبيت وتلطيخ الفلورة.
      1. إزالة المتوسطة ECM للخلايا المزروعة من 5.2.1.3.
      2. إصلاح الخلايا المستزرعة بإضافة 300 ميليلتر 4% بارافورمالدهيد (PFA) مع درجة حموضة 7.4 الواحد جيدا، لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
        تنبيه: منهاج عمل بيجين هو السامة ويجب التعامل معها بحذر.
      3. الخطوات الغسيل 3 بإضافة 1 مل برنامج تلفزيوني في البئر وإزالة المادة طافية بعد 5 دقائق في الرايت
      4. تعد بالحل الذي يتضمن حظر 5% جيش صرب البوسنة، 0.2% تريتون-X و 1% مصل الماعز في برنامج تلفزيوني.
      5. إضافة 300 ميليلتر من عرقلة الحل لكل بئر واحتضانها ح 1 في الرايت
      6. إزالة المادة طافية وإضافة 200 ميليلتر كل بئر جسم المضادة-بيكم-1 (CD31) (1: 200) في جيش صرب البوسنة 5%، 1% مصل الماعز في برنامج تلفزيوني واحتضان في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      7. تنفيذ 3 الغسيل الخطوات بإضافة 1 مل برنامج تلفزيوني في البئر وإزالة طافية بعد 5 دقائق في RT في كل خطوة.
      8. تحضير محلول جسم ثانوي يحتوي على مترافق Cy3 الفئران المضادة الأجسام المضادة مفتش (1: 500) في جيش صرب البوسنة 1% وبرنامج تلفزيوني. إضافة 300 ميليلتر كل من حل جسم الثانوية جيدا واحتضانها ح 1 في RT في الظلام.
      9. تنفيذ 3 الغسيل الخطوات بإضافة 1 مل برنامج تلفزيوني في البئر وإزالة طافية بعد 5 دقائق في RT في كل خطوة.
    3. إخراج كوفيرسليبس الزجاج جولة بعناية مع الملقط وتحويلها إلى شريحة مجهرية. إضافة مبلغ مناسب لتصاعد DAPI تحتوي على المتوسط على طبقة الخلايا ووضعت بعناية كوب غطاء على ذلك (انظر المرفق الجدول للمواد).
    4. مراقبة الخلايا مع مجهر الأسفار مناسبة مزودة بمصدر ضوء فلورية (120 واط) واثنان بتصفية مجموعات: تعيين عامل تصفية إثارة/انبعاثات مع 550/25 نانومتر وأطوال موجية nm 605/70 للكشف عن Cy3 540/562 شمال البحر الأبيض المتوسط.
    5. استخدام عامل تصفية ثاني مع الطول موجي إثارة/انبعاثات من 365/50 نانومتر و 445/50 نانومتر للكشف عن DAPI 350/440 نانومتر. استخدام تكبير من 40 س وكثافة 80% من 14.5 ميغاواط/سم2 ل DAPI بفترة اقتناء 30 السيدة للكشف عن Cy3 استخدام 80% من 67.5 ميغاواط/سم2 مع مدة اقتناء 60 مللي ثانية.
  3. إجراء PCR الكمي.
    1. عزل مرناً.
      1. اتبع الإجراءات القياسية باستخدام كاشف ثيوسيانات-فينول (أجتب) حمض جوانيدينيوم عزل مرناً. استخدام الحد ني 0.5 × 106 خلايا من CD45– CD31– (راجع الخطوة 3.6.8)، CD45– CD31+ (راجع الخطوة 3.6.9.) الكسور ويزرع مك مورين الابتدائي (4.1.3)
      2. تعليق خلية الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 300 x ز في 20 درجة مئوية. تقلع من المادة طافية تماما. ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر من أجتب كاشف ونقل تعليق خلية في أنبوب رد فعل 2 مل. احتضان لمدة 5 دقائق في الرايت
      3. إضافة 100 ميليلتر من كلوروفورم واهتز بشدة إينكوباتي س. 15 لمدة 3 دقائق في الرايت
      4. تعليق الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في س 12,000 ز في 4 درجات مئوية.
      5. الإقلاع العلوي مائي المرحلة (التي تحتوي على الحمض النووي الريبي) بعناية ونقل إلى أنبوب رد فعل 1.5 مل. إضافة 250 ميليلتر من الايزوبروبانول واحتضان لمدة 10 دقائق في الرايت
      6. إجراء خطوة الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية.
      7. خلع المادة طافية وإضافة 1 مل من 75 ٪ الإيثانول بعناية. أجهزة الطرد المركزي في 7,500 س ز لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
        ملاحظة: بيليه من السهل أن تفقد.
      8. إزالة المادة طافية تماما. واسمحوا بيليه الجافة على الهواء لمدة 5 – 10 دقائق.
        ملاحظة: الإيثانول يحتاج إلى إزالة لكن لم تجف كثيرا.
      9. حل بيليه في 30 ميليلتر ديثيلبيروكاربوناتي معاملة المياه التي تحتوي والحرارة لمدة 10 دقائق في 55 درجة مئوية.
        ملاحظة: يمكن قياس تركيز الحمض النووي الريبي ونقاء شحني-طيفية.
    2. إجراء توليف كدنا (المنتسخة العكسية PCR).
      1. إعداد mastermix التي تحتوي على: 10 ميليلتر PCR المخزن المؤقت (س 5)، 2، 5 ميليلتر ديسوكسيريبونوكليوسيد ثلاثي الفوسفات (دنتب (10 مم))، ومزيج عشوائي 0.5 ميليلتر من التمهيدي واحد-الذين تقطعت بهم السبل (0.2 ميكروغرام/ميليلتر)، 1 ميليلتر من مثبط رناسي (40 ش/ميليلتر، 0.4 عكس المنتسخة (200 يو/ميليلتر) و 5.6 ميليلتر من ديثيلبيروكاربونات المياه المعالجة (انظر مرفق الجدول للمواد).
      2. تمييع 500 نانوغرام الجيش الملكي النيبالي في 30 ميليلتر ديثيلبيروكاربوناتي معاملة المياه في 0.2 مل PCR أنابيب وإضافة mastermix 20 ميليلتر الكامل.
      3. استخدام cycler بكر تنفيذ الخطوات التالية: 10 دقيقة 25 درجة مئوية، 50 درجة مئوية، 5 دقيقة 85 درجة مئوية و 30 دقيقة وعقد في 4 درجات مئوية.
  4. إجراء PCR الكمي (قبكر).
    ملاحظة: تنفيذ qPCR للعينات في التكرارات أو تريبليكاتيس.
  5. استخدام التمهيدي مع اثنين من الأصباغ الفلورية مختلفة. التمهيدي امتصاص 495 نانومتر وانبعاث من 517 نانومتر للجينات للفائدة.
  6. للكشف عن التعبير الجيني علامة الخلية الأقمار الصناعية، استخدام كبسولة تفجير للبروتين إقران مربع 7 (Pax7) و M-كادهيرين (Cdh15) (انظر الجدول للموادالمغلقة).
  7. للكشف عن التعبير الجيني علامة الخلية البطانية، استخدم الإشعال كلودين-5 (Cld5)، أوككلودين (أوكلن) وزونولا أوككلودينس-1 (Tjp1 أو ZO1) (انظر المرفق الجدول للمواد).
  8. كمرجع الجينات ل 18s الرنا الريباسي، استخدم التمهيدي مع استيعاب 538 شمال البحر الأبيض المتوسط، وانبعاثات من الطول الموجي نانومتر 554.
  9. إعداد mastermix qPCR لكل الجينات من الاهتمام مع التمهيدي كل منهما. يتضمن Mastermix: 10µl قبكر المخزن المؤقت (2x)، 1 ميليلتر من التمهيدي للجينات للفائدة (10 ميكرومتر)، 1 ميليلتر من التمهيدي ل 18s الرنا الريباسي و 4 ميليلتر من نوكلاس مجانية الماء.
  10. إضافة 16 ميليلتر من mastermix إلى بئر واحدة للوحة الرد 96-جيدا. إضافة 4 ميليلتر من كدنا (التي تم الحصول عليها من الخطوة 5.3.2.) الواحدة وكذلك المحتوية على mastermix.
  11. استخدام cycler PCR الوقت الحقيقي أداء الخطوات التالية: عقد المرحلة مع 50 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة و 95 درجة مئوية للحد الأدنى 10 المرحلة ركوب مع دورات 40 من s 95 درجة مئوية 15 و 60 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يوم واحد بعد عزلة، مك مورين الأولية وبقايا الخلايا الأخرى تشكيل التكتلات والتقيد بالجزء السفلي من ثقافة الأطباق (اليوم 1 منالشكل 1A ). من يوم 7، يمكن ملاحظة خلايا مسطحة وممدود. ومع ذلك، لا تزال واضحة تلوث أخرى، معظمها خلايا كروي، (الشكل 1A يوم 7). وهكذا، دورة أخرى من CD31 إيجابية التحديد عن طريق الإشراف مطلوب. الآخرة، مك مورين الأولية تنتشر بكثافة من حوالي 80 – 90%. وتشكل عادة عند التقاء أحادي الطبقة غير متداخلة طوليا محاذاة الخلايا (الشكل 1A 14 يوم). انتشار توقف عند التقاء بسبب إعاقة الاتصال. وبعد 14 يوما عن 5 – 10 × 105 خلايا يمكن استخدامها لإجراء مزيد من التحقيقات.

مراقبة الجودة عن طريق التدفق الخلوي صلاحية يمكن حلها صبغ FVD780 (وصمة عار للخلايا الميتة)، PECAM1 (CD31) وبتبرك (CD45، كعلامة للحصول على خلايا المنشأ المكونة للدم) وأظهرت القيم للبقاء والنقاء تتراوح بين حوالي 70% من كل الخلايا فورا بعد أن عزلة (الشكل 2A). الخلايا المزروعة بعد آخر CD31 التحديد الإيجابي عن طريق الإشراف، أظهر إرضاء القيم للنقاء، وكذلك فيما يتعلق بصلاحية تتراوح تصل إلى 95% لكل منهما (الشكل 2).

لتقييم دقة التحديد الخطوات، الحصول على خلايا كانت كذلك للتعبير الجيني من البروتين العضلات علامة خانة إقران جينات الخلية الأقمار الصناعية 7 (Pax7) و M-كادهيرين (Cdh15) على مستوى مرناً بالتحقيق PCR الكمي (قبكر). مك مورين الأولية (بمميك) وخلايا متمايزة العضلات مورين الأولية (الثمينة) استخدمت كمراقبة سلبية وإيجابية، على التوالي. وتم شراء خلايا العضلات مورين تجارياً. وكما كان متوقعا، إلا CD45– CD31 كسر– ، فضلا عن الثمينة أعربت عن Pax7 و Cdh15، بينما CD45– CD31+ ومك مورين الأولية كانت سلبية لهذه العلامات (الشكل 2).

المفوضية الأوروبية المستمدة من الشعيرات الدموية في اندوميسيوم من الهيكل العظمى والعضلات مفرق ضيق التعبير عن البروتينات 4،5. وتم تقييم خطوة باستخدام قبكر، والتعبير عن كلودين-5 (Cld5)، أوككلودين (أوكلن) وزونولا أوككلودينس-1 (Tjp1 أو ZO1) من المتلاقية مك مورين الأولية بعد MCS CD31 الثانية. واستخدمت شركة تسويق المعادن الثمينة كعناصر تحكم (الشكل 2D). مك مورين الابتدائي أعرب عن مستويات عالية من Cld5و أوكلن و Tjp1، في حين الثمينة فقط إظهار التعبير منخفضة من Tjp1. وعلاوة على ذلك، أكدت الفلورة تلطيخ كمراقبة جودة التعبير السطحي للعلامة الخاصة بالبطانة PECAM1 في مك مورين الأولية (الشكل 2E).

Figure 1
رقم 1: مورفولوجية مك مورين الأولية. (أ) صورة الممثل مثقف مك مورين الأولية الطوري من 1 إلى 14 يوما. d1 = 1 يوم، d7 = 7 يوم، d14 = 14 يوم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: مراقبة الجودة من الابتدائي مورين مك. النابضة استراتيجية سيتوميتريك تحليل لتدفق مميك موريني الأولية مباشرة بعد عزلة (A)، وفي يوم 15 (ب) استخدام (ط) منتدى التعاون الأمني/SSC، FVD780 (II) و CD45 (IIIa)، CD31 (IIIb) (متقطع خطوط = ايستب عنصر التحكم). (ج) التعبير مستوى Pax7 ، وأم-كادهيرين (Cdh15) في CD45– CD31-، CD45– CD31+ الكسور بعد عزلة الإشراف كذلك كما هو الحال في مك مورين الأولية (بمميك) وخلايا العضلات مورين الأولية (الثمينة ). تظهر مستويات التعبير كقيمt ΔC (نموذج-الرنا الريباسي 18S)، n.d. = لا العزم. (د) التعبير مستوى مفرق ضيق البروتينات كلودين-5 (Cldn5)، أوككلودين (أوكلن) أو زونولا أوككلودينس-1 (Tjp1 أو زوي-1) بمميك والثمينة، سيظهر كقيمt ΔC. (ﻫ) الفلورة تلطيخ ل PECAM1 (أحمر) في ح 24 مك مورين الأولية المزروعة بعد التحديد الإيجابي CD31 الثاني. النووية تلطيخ مع تصاعد (أزرق) المحتوية على DAPI المتوسطة؛ اليسار = مكافحة--PECAM1/DAPI، الحق: السلبية السيطرة/DAPI. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

خلايا بطانية microvascular توفر وظائف الحاجز في جميع الأنسجة ونتائجها اختلال وظيفي في المرض من الأجهزة المرتبطة بها 3. وعلاوة على ذلك، الدراسات الخاصة بالجهاز للجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار قد يمهد الطريق لاستراتيجيات علاجية جديدة. ولذلك، فهم أعمق للدالة EC ميكروفاسكولار تحت الظروف الفسيولوجية والفيزيولوجية المرضية ذات أهمية علمية كبيرة. التحوير لتفاعل الكريات البيض/البطانة يستخدم بنجاح لعلاج مرضى التصلب المتعدد ناتاليزوماب، جسم مما يمنع التصاق الخلايا اللمفاوية، ومن ثم التهجير 6. بيد ميوباثيس المختلفة بما في ذلك الأنواع الفرعية التحريضية لا تزال تبقى فقط علاجها سيئة حتى الآن. ولذلك، يمكن أن يساعد توضيح خصائص الجماعة الأوروبية على وجه التحديد في البطانة الهيكل العظمى والعضلات لتوسيع نطاق العلاجات المتاحة عضلي أو النتيجة في رواية النهج العلاجية.

أنشئت خطوط الخلايا غشائي مخلدة (ايكل) وتستخدم لعدة نماذج في المختبر. هذه الخطوط الخليوي توفر بعض المزايا المقارنة للجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار الأولية بسبب انتشار سريع وتخليد. وعلاوة على ذلك، الخلايا المستزرعة الابتدائي يمكن الخضوع للشيخوخة وتفقد أو تغيير مورفولوجية أو الوظيفة الفسيولوجية بعد بعض الوقت أو الممرات. ومع ذلك، إييكل فقط الحفاظ على بعض خصائص الخلية البطانية ولا تشبه مجموعة متنوعة من مختلف تنقلها إلى الجهاز الرئيسي microvascular الجماعة الأوروبية. من المذكرة، أنها نادراً ما مشتقة من عضلات الهيكل العظمى. وحتى الآن، يصف فقط منشور واحد خط خلية بطانية microvascular بشرية الهيكل العظمى اسمه TSM15 5. وفي المقابل، قد لا وصف EC microvascular مورين حتى الآن. وأخيراً، الخلايا الأولية من الحيوانات المحورة وراثيا فرصة لدراسة التعديلات الوراثية في المختبر. ومع ذلك، عقد الثقافات الخلية الابتدائية أيضا بعض المزالق. أولاً، يمكن أن تتداخل التلوث مع الخلايا من أي اهتمام بصحة النتائج التجريبية. ولذلك، يجب ضمان دقة التحديد العديد من الخطوات ودرجة نقاء عالية من الخلايا المعزولة. تعليق خلية بعد تفكك أنسجة العضلات يحتوي على الكريات الحمراء وأنواع مختلفة من الخلايا وحيدات النوى مثل الخلايا المناعية والخلايا الأقمار الصناعية، بيريسيتيس، والخلايا الليفية وخلايا بطانية 7. ولذلك، تم اختبار خلية الكسور بعد الخطوة CD31 MCS لعلامات أعرب حصرا بخلايا العضلات الأقمار الصناعية. ك CD45 المتوقعة– CD31– الكسر والخلايا العضلية الأولية أظهرت التعبير باكس-7 و Cdh15 ، بينما CD45– CD31+ والمزروعة مك مورين الأولية كانت سلبية لهذه العلامات بعد CD31 ثانية الخطوة MCS. وعلاوة على ذلك مراقبة الجودة للخلايا المعزولة أو مثقف حتما ضمان تجارب موثوقة واستنساخه. تتوفر أساليب عدة لمراقبة الجودة من مك مورين الأولية: بالإضافة إلى الفحص المجهري للخصائص المورفولوجية، التدفق الخلوي، يمكن استخدام ستينينجس بكر والفلوره لعلامات المفوضية الأوروبية المميزة (مثل CD31، وهيئة الأوراق المالية-1). كان تقييم نقاء مك مورين الأولية المعزولة حديثا فقط حوالي 60-70%، بينما يمكن أن يتم الكشف عن جدوى من حوالي 70%. ويبين الفحص المجهري لهذه الخلايا جزئيا التكتلات الخلية، التي قد تتكون من تلويث الخلايا مثل الخلايا الليفية أو بيريسيتيس المرفقة للجماعة الأوروبية. بعد 7 أيام يمكن ملاحظة أساسا شقة وممدود الخلايا والخلايا كروي. بيد اثنين من الممرات CD31 MCS أدت إلى بقاء عالية ونقاء. النهج البديلة لزيادة نقاء مثل فشل في الوسائط التي تحتوي على بوروميسين في مك مورين الأولية بينما يجري فعالة في الفاري الدماغ microvascular المفوضية الأوروبية 8.

منذ microvascular EC المستمدة من الشعيرات الدموية التعبير عن البروتينات مفرق ضيق، وتمت دراسة التعبير الجيني Cld5و أوكلن و Tjp1 في مك مورين الابتدائي مقارنة بالتمييز بين خلايا العضلات. كما هو متوقع تم الكشف عن جميع مفرق ضيق الجزيئات في مك مورين الأولية. وبالمقارنة، أظهرت خلايا العضلات تعبير منخفضة فقط من Tjp1، بينما يمكن أن يحدد أي تعبير عن Cld5 و أوكلن . كانت سابقا أظهرت أنماط التعبير مشابهة في أسرة مورين الهيكل العظمى والعضلات. هنا، يمكن الكشف عن تعبير على مستوى الجينات والبروتين Tjp1 لكن لا أوككلودين 9. كذلك يمكن قياس الخصائص الوظيفية مثل المقاومة ترانسيندوثيليال.

ويضم البروتوكول هو موضح هنا فقط عزل المفوضية الأوروبية ميكروفاسكولار من أنسجة العضلات مورين. ومع ذلك، فإنه قد يحال إلى مختلف الأنواع الأخرى على سبيل المثال صدر بروتوكول مماثل للفئران microvascular EC المستمدة من منصات الدهون البربخيه. هنا، CD31 التحديد الإيجابي عن طريق الإشراف وسبق كثافة الطرد المركزي التدرج 10. نهج مماثلة كانت ناجحة بمعزل عن الجماعة الأوروبية ماكروفاسكولار من الفئران الشرايين فخذي 11. يستخدم أسلوب نشر مؤخرا على عزل الجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار لانسجة القلب والرئة CD31 واندوجلين (CD105) كمولدات المضادات للخلية المغناطيسية فرز 12. بيد نقاء المفوضية الأوروبية يمكن أن لا تكون زيادة باستخدام الفصل المغناطيسي حبة CD105 إضافية. وثمة إمكانية أخرى لعزل وتنقية مك مورين الأولية هو متعدد الألوان الفلورية تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية). عدد سكانها متميزة للهيئة-1+، CD31+، CD34خافت و CD45– خلايا من عضلات مورين يمكن أن تكون معزولة، واتسم بالابتدائي مورين مك 13. ميزة هذا الأسلوب هو عدد سكان EC الصرفة التي يمكن استخدامها مباشرة أو مثقف لتجارب أخرى (علما بأن لدينا تجربة نظام مراقبة الأصول الميدانية يؤدي إلى زيادة موت الخلايا بسبب ارتفاع الخلية الإجهاد). خلايا أخرى ميتة أو تكتلات من أنواع مختلفة من الخلايا يمكن أن تقلل عدد الخلايا المعزولة بنظام مراقبة الأصول الميدانية. بالإضافة إلى ذلك، أفيد أن مك مورين الابتدائي معزول بواسطة نظام مراقبة الأصول الميدانية كانت مثقف دون جدوى في ظروف الثقافة استخداماً من 21% O2 و 5% CO2. هنا، كان مستوى الأوكسجين إلى تعديل نسبة 5 في المائة ل زراعة كافية 13. وعلاوة على ذلك، تقنية نظام مراقبة الأصول الميدانية أكثر تعقيداً، وتستغرق وقتاً طويلاً ومكلفة لمتطلبات البنية التحتية.

الفخذية الرباعية موسكولوس وسوري الرؤوس موسكولوس من الفئران الذكور في سن 4-12 أسابيع الأكثر مناسبة لعزل MEC مورين الأولية كما متاحة بسهولة وكبيرة بما يكفي لعزل عدد كاف من الخلايا (5-10 × 105 العضلات غرام). ولذلك، يجب التأكد من أن الشروط قابلة للمقارنة في تجارب مستقلة. الخلايا الأولية كما هو موضح أعلاه، يمكن الخضوع للشيخوخة. ومن ثم استخدام خلايا لتجارب كل منهما على وجه السرعة في الممرات السفلي. بعد مرور تغيير على مورفولوجيا مك مورين الابتدائي 8 – 10 وتظهر معدلات الانتشار البطيء وتفقد تثبيط الاتصال بهم كعلامات ديديفيرينتييشن والشيخوخة.

كذلك هناك بعض الملاحظات لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها لهذا البروتوكول. العامل العقيمة ضروري لتجنب التلوث. ضوابط الجودة ضرورية لمراقبة نقاء وبقاء الخلايا المعزولة. يجب تخزين المواد المستخدمة في هذا البروتوكول وتطبيقها وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. إضافية، العمر والجنس من الحيوانات المستخدمة، فضلا عن مجموعات مختلفة من العضلات قد تؤثر على نوعية وقابلية الخلايا المعزولة في التجارب.

بروتوكول وصف اعتبار الأسلوب الأساسي لعزل الجماعة الأوروبية ميكروفاسكولار الأولية لعضلات الهيكل العظمى. يمكن استخدام خلايا معزولة للعديد من التطبيقات للحصول على مزيد من رؤى في وظيفة حاجز الدم العضلات. الخلايا مناسبة للبروتين والحمض النووي الريبي التعبير الدراسات فضلا عن الاختبارات الوظيفية (بما في ذلك دراسات الهجرة العابرة والالتصاق). بيد أن هذا البروتوكول هو الأمثل للدراسات التي تركز على العمليات التحريضية وبالتالي قد يلزم إدخال تعديلات طفيفة فيما يتعلق بمختلف مجالات البحث.

نموذج التفاعلات الخلوية المعقدة المكانية والوظيفية داخل مفو، ليمكن أن تزرع مك مورين الأولية في خلية 3D الثقافة نظم أكثر تعقيداً مع أنواع الخلايا الأخرى. مستقبلا، كما سيكون من الممكن لتوليد أورجانويدس مفو كما قد تم وصفها للأنسجة الأخرى قبل 14. ومع ذلك، نجاح عزل مك مورين الابتدائي أمر لا مفر منه لهدف هذه الخطوة التالية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل "آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ" (2018_A03 إلى TR)، "مبتكرة Medizinische Forschung (صندوق النقد الدولي) مونستر" (I-RU211811 إلى TR) ومؤسسة البحوث الألمانية (DFG أنست 2105/27-1، لي 3283/5-1 ولي 3283/6-1 إلى SGM). الصور مصورة قدمتها هايك بلوم.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Thermo Fisher 25200-056 ready to use
ACK buffer 150 mM NH4Cl, 10 mM KHCO3, 0.1 mM EDTA in water at a pH of 7.3
Anti-mouse CD31-FITC (clone MEC13.3) Biolegend 102506 Isotype control: FITC Rat IgG2a, κ Isotype Ctrl
Anti-mouse CD45-PE (clone 30-F11) Biolegend 103106 Isotype control: PE Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl
bFGF Peprotech 100-18B Basic fibroblast growth factor
BSA Sigma Aldrich A4503
CD31 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-097-418
CD45 MicroBeads mouse Miltenyi Biotec 130-052-301
Collagenase-Dispase Roche 10269638001 Collagenase from V. alginolyticus, Dispase from B. polymyxa
Corning Costar TC-Treated Multiple 6-Well Plates Corning 3516
Cy3-conjugated anti-rat IgG antibody dianova 712-166-153
DAPI (ProLong Gold antifade reagent with DAPI) Thermo Fisher P36935
Desoxyribonuclease Sigma Aldrich D4513 Deoxyribonuclease I from bovine pancreas
Diethylpyrocarbonat treated water Thermo Fisher AM9916
DMEM, containing Glutamin Supplement and pyruvate Thermo Fisher 31966-021 warm up to 37 °C before use
dNTP Mix (10 mM) Thermo Fisher R0192 1 mL
EDTA Sigma Aldrich E5134
FACS tubes Sarstedt 551,579
Falcon 70 μm Cell Strainer Corning 352350
FC buffer 0.1% BSA, 0.2% NaN3, 2 mM EDTA
Fetal calf serum Sigma Aldrich F6178 Fetal calf serum
Fixable Viability Dye eFluor780 Thermo Fisher 65-0865-14
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11002-12
Forceps (serrated, straight, 12 cm) Fine Science Tools 11009-13
Insulin syringe 100 Solo 1 mL (Omnifix) Braun 9161708V
large magnetiv columns (LS columns) Miltenyi Biotec 130-042-401 for CD45-MACS-step
MCS buffer 0.5% BSA, 2 mM EDTA in PBS at a pH of 7.2
Medium magnetic column (MS column) Miltenyi Biotec 130-042-201 for CD31-MACS-step
Nuclease free water Thermo Fisher R0581
PBS Sigma Aldrich Phosphate buffered saline, ready to use
PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742 in a kit with the reverse transcriptase
Pecam1 rat α-mouse SantaCruz Sc-52713 100 µg/mL
Penicillin-Streptomycin Sigma Aldrich P4333
primary murine muscle cells celprogen 66066-01
Primer Cdh15 (M-Cadherin) Thermo Fisher Mm00483191_m1 FAM labeled
Primer Cldn5 (claudin-5) Thermo Fisher Mm00727012_s1 FAM labeled
Primer Ocln (occludin) Thermo Fisher Mm00500912_m1 FAM labeled
Primer Pax-7 Thermo Fisher Mm01354484_m1 FAM labeled
Primer Tjp-1 (Zonula occludens 1) Thermo Fisher Mm00493699_m1 FAM labeled
Primer 18s rRNA (Eukaryotic endogenous control) Thermo Fisher 4310893E VIC labeled
qPCR buffer (Maxima Probe/ROX qPCR Master Mix (2X) Thermo Fisher K0231 2 x 1,25 mL; for 200 reactions each
Random mixture of single-stranded primer Thermo Fisher SO142 Random Hexamer Primer
Reverse Transcriptase (200 U/μL) + PCR buffer (5x) Thermo Fisher EP0742
Rnase Inhibitor (40 U/μL) Thermo Fisher EO0381
Scissor (cutting edge 23 mm, sharp/sharp) Fine Science Tools 14088-10
Scissor (cutting edge 42 mm, sharp/blunt) Fine Science Tools 14001-13
Speed Coating solution PeloBiotech PB-LU-000-0002-00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rodrigues, S. F., Granger, D. N. Blood cells and endothelial barrier function. Tissue Barriers. 3 (1-2), e978720 (2015).
  2. Michiels, C. Endothelial cell functions. Journal of Cellular Physiology. 196 (3), 430-443 (2003).
  3. Pierce, R. W., Giuliano, J. S. Jr, Pober, J. S. Endothelial cell function and dysfunction in critically ill children. Pediatrics. 140 (1), Epub 2017 Jun 1 (2017).
  4. Nasdala, I., Wolburg-Buchholz, K., Wolburg, H., et al. A transmembrane tight junction protein selectively expressed on endothelial cells and platelets. Journal of Biological Chemistry. 277 (18), 16294-16303 (2002).
  5. Sano, H., Sano, Y., Ishiguchi, E., et al. Establishment of a new conditionally immortalized human skeletal muscle microvascular endothelial cell line. Journal of Cellular Physiology. 232 (12), 3286-3295 (2017).
  6. Kappos, L., Bates, D., Edan, G., et al. Natalizumab treatment for multiple sclerosis: Updated recommendations for patient selection and monitoring. Lancet Neurology. 10 (8), 745-758 (2011).
  7. Birbrair, A., Zhang, T., Wang, Z. M., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Research. 10 (1), 67-84 (2013).
  8. Ruck, T., Bittner, S., Epping, L., Herrmann, A. M., Meuth, S. G. Isolation of primary murine brain microvascular endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (93), e52204 (2014).
  9. Hwang, I., An, B. S., Yang, H., Kang, H. S., Jung, E. M., Jeung, E. B. Tissue-specific expression of occludin, zona occludens-1, and junction adhesion molecule A in the duodenum, ileum, colon, kidney, liver, lung, brain, and skeletal muscle of C57BL mice. Journal of Physiology and Pharmacology. 64 (1), 11-18 (2013).
  10. Frye, C. A., Patrick, C. W. Jr Isolation and culture of rat microvascular endothelial cells. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 38 (4), 208-212 (2002).
  11. Le, G. Y., Essackjee, H. C., Ballard, H. J. Intracellular adenosine formation and release by freshly-isolated vascular endothelial cells from rat skeletal muscle: Effects of hypoxia and/or acidosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 450 (1), 93-98 (2014).
  12. Cheung, K. C., Marelli-Berg, F. M. Isolation of microvascular endothelial cells. Bio-protocol. 8 (12), (2018).
  13. Ieronimakis, N., Balasundaram, G., Reyes, M. Direct isolation, culture and transplant of mouse skeletal muscle derived endothelial cells with angiogenic potential. PLoS One. 3 (3), e0001753 (2008).
  14. Pham, M. T., Pollock, K. M., Rose, M. D., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).

Tags

علم الأعصاب، 145 قضية، وعزل الخلية، مورين microvascular خلايا بطانية، خلايا الهيكل العظمى والعضلات، حاجز الدم في العضلات، ووحدة ميوفاسكولار، عضلي
عزل خلايا بطانية Microvascular الابتدائي مورين الهيكل العظمى والعضلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Müntefering, T., Michels, A. P. … More

Müntefering, T., Michels, A. P. E., Pfeuffer, S., Meuth, S. G., Ruck, T. Isolation of Primary Murine Skeletal Muscle Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (145), e58901, doi:10.3791/58901 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter