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Immunology and Infection

ब्लियोमाइसिन के एंडोट्रेकल इंजेक्शन द्वारा माउस फेफड़ों की चोट का प्रेरण

Published: April 30, 2019 doi: 10.3791/58922
Automatic Translation
*1, *2, 2, 2, 2, 3, 3, 1, 2, 2
1Servizio di Allevamento e Sperimentazione Animale, Polo ScientificoTecnologico, Istituto di Ricovero e Cura a Carattere Scientifico (IRCCS)-Istituto Nazionale Ricovero e Cura Anziani (INRCA), 2Dipartimento di Scienze Cliniche e Molecolari, Università Politecnica delle Marche, 3UOS Centro di Terapia Cellulare "G. Lanzani", Azienda Socio Sanitaria Territoriale (ASST) Papa Giovanni XXIII
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ हम C57BL में ब्लियोमाइसिन के एंडोस्ट्रियल इंजेक्शन द्वारा फेफड़ों की चोट के प्रेरण के बाद पूरे गर्भनाल से प्राप्त अंतःशिरा संचार मानव मेसेन्काइमल स्ट्रॉमल कोशिकाओं की एंटीफाइब्रोटिक गतिविधि की जांच करने के लिए एक प्रभावी विधि प्रस्तुत करते हैं /6 चूहों. इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य चिकित्सकीय के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Abstract

पल्मोनरी फाइब्रोसिस एक अलग एटियोलॉजी के साथ कई मानव फेफड़ों की बीमारियों की एक पहचान है। के बाद से वर्तमान उपचार बल्कि सीमित हैं, माउस मॉडल के लिए नए antifibrotic रणनीतियों के विकास के लिए एक आवश्यक उपकरण होना जारी है. यहाँ हम पूरे गर्भनाल (एचयूसी-एमएससी) से प्राप्त मानव मेसेन्काइमल स्ट्रॉमल कोशिकाओं की विवो एंटीफाइब्रोटिक गतिविधि में जांच करने के लिए एक प्रभावी विधि प्रदान करते हैं, जो ब्लियोमाइसिन-प्रेरित फेफड़ों की चोट को कम करता है। C57BL/6 चूहों bleomycin का एक एकल endotracheal इंजेक्शन प्राप्त (1.5 U/kg शरीर वजन) के बाद एक डबल जलसेक के द्वारा hUC-एमएससी (2.5 x 105) पूंछ नस में, 24 ज और 7 दिन bleomycin प्रशासन के बाद. दिन 8, 14, या 21 में बलिदान पर, भड़काऊ और फाइब्रोटिक परिवर्तन, कोलेजन सामग्री, और explanted फेफड़ों के ऊतकों में एचयूसी-एमएससी उपस्थिति का विश्लेषण कर रहे हैं। माउस श्वासनली में ब्लियोमाइसिन का इंजेक्शन फेफड़ों के प्रत्यक्ष लक्ष्यीकरण की अनुमति देता है, जिससे व्यापक फुफ्फुसीय सूजन और फाइब्रोसिस होता है। एचयूसी-एमएससी की दोहरी खुराक के प्रणालीगत प्रशासन का परिणाम ब्लियोमाइसिन-प्रेरित फेफड़ों की चोट के शुरुआती कुंदन में परिणाम है। अंतःशिरा रूप से संक्रमित एचयूसी-एमएससी को माउस फेफड़ों में क्षणिक रूप से प्रवेश किया जाता है, जहां वे अपने विरोधी भड़काऊ और एंटीफाइब्रोटिक गतिविधि को लागू करते हैं। अंत में, इस प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक मानव फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस के एक प्रयोगात्मक माउस मॉडल में एचयूसी-एमएससी के पूर्व नैदानिक परीक्षण के लिए लागू किया गया है। हालांकि, इस तकनीक को आसानी से फेफड़ों के pathophysiology पर विभिन्न endotracheally प्रशासित पदार्थों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए और नए विरोधी भड़काऊ और एंटीफाइब्रोटिक प्रणालीगत उपचार को मान्य करने के लिए दोनों बढ़ाया जा सकता है।

Introduction

पल्मोनरी फाइब्रोसिस एक प्रगतिशील रोग प्रक्रिया है जो एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स घटकों के अत्यधिक जमाव की विशेषता है, मुख्य रूप से प्रकार मैं कोलेजन, फेफड़ों इंटरस्टिशियम में, बिगड़ा फेफड़ों के समारोह के लिए अग्रणी। यह एक अलग एटियोलॉजी के साथ कई मानव फेफड़ों के रोगों की पहचान है और एक गरीब नैदानिक पूर्वानुमान कारक का प्रतिनिधित्व करता है। के बाद से वर्तमान चिकित्सा बल्कि सीमित कर रहे हैं1, माउस मॉडल दोनों रोगजनक तंत्र की आगे की जांच के लिए शुरुआत और रोग की प्रगति को प्रभावित करने के लिए और नए antifibrotic के विकास के लिए एक आवश्यक उपकरण होना जारी रणनीतियों2,3.

तारीख करने के लिए, ब्लियोमाइसिन का प्रशासन प्रयोगात्मक प्रेरित फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस4का सबसे अधिक लागू मॉडल रहा है। इसके अलावा कई देने के तरीकों (अंतःशिरा, इंट्रापेरिटोनल, subcutaneous, और साँस लेना सहित), इंट्राट्रेकल या एंडोट्रेकल इंजेक्शन ब्लोमाइसिन के सबसे अक्सर इस्तेमाल किया मार्गों के रूप में उभरा है4,5. जिस विधि का वर्णन हम यहाँ करते हैं, उसे श्वासनली श्लेष्म पर ब्लियोमाइसिन के स्कलिंग प्रभाव से बचने के लिए विकसित किया गया है। वास्तव में, श्वासनली को बाहरी बनाकर और इसे ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के माध्यम से विज़ुअलाइज़ करके, ऊपरी वायुमार्ग में किसी भी रिसाव के बिना ब्लियोमाइसिन समाधान की पूरी मात्रा को सीधे निचले वायुमार्ग में प्राप्त करना संभव है। जब आवश्यक शल्य विशेषज्ञता और इंस्ट्रूमेंटेशन उपलब्ध हैं, इस विधि के लिए अनुमति देता है सुरक्षित, मजबूत, और फेफड़ों की सूजन और फाइब्रोसिस के reproduible प्रेरण, के रूप में नीचे की सूचना दी.

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Protocol

सभी पशु देखभाल और प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (प्राधिकरण एन 456/2016-पीआर) द्वारा अनुमोदित किया गया था और हेलसिंकी परंपराओं की घोषणा के अनुसार प्रदर्शन किया गया था।

1. चूहे

  1. उन्हें खरीदने के बाद, चूहों इंजेक्शन से पहले कम से कम 7 दिनों के लिए acclimate करने के लिए अनुमति देते हैं।
    नोट: चूहे रोगज़नक़ मुक्त शर्तों के तहत पशु सुविधा में रखे गए थे, एक 12 एच प्रकाश / अंधेरे चक्र पर लगातार तापमान और आर्द्रता के तहत बनाए रखा गया था, और पानी और मानक गोली भोजन के लिए नि: शुल्क पहुँच दिया गया.
  2. महिला C57BL/6 चूहों का प्रयोग करें और उन्हें 12 से 16 सप्ताह की उम्र में इंजेक्ट करें।

2. ब्लियोमाइसिन का एंडोट्रेकल इंजेक्शन

  1. ब्लियोमाइसिन तैयारी
    चेतावनी: वर्गीकरण और रसायन (जीएचएस) के लेबलिंग की वैश्विक सामंजस्य प्रणाली के आधार पर, bleomycin एक GHS08 स्वास्थ्य खतरा के रूप में वर्गीकृत किया गया है.
    1. एक रासायनिक हुड के तहत ब्लियोमाइसिन तैयार करें।
    2. वांछित काम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए (0.05 U/100 $L), बाँझ नमकीन के 30 एमएल में lyophilized bleomycin सल्फेट के 15 यू resuspend.
    3. थक्का गठन से बचने के लिए ट्यूब को उलटते हुए नमूने को सावधानी से मिलाएं।
    4. ट्यूब को पुन: निलंबन की तारीख के साथ ठीक से लेबल करें, इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, और इसकी सामग्री का उपयोग 24 घंटे के भीतर करें।
    5. पैदा करने से पहले, कमरे के तापमान के लिए ब्लियोमाइसिन समाधान को बराबर कर दें।
      नोट: इस प्रयोग में, ब्लोमाइसिन के 1.5 यू/किग शरीर के वजन की एक खुराक C57BL/6 चूहों में फेफड़ों की चोट को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। फिर भी, प्रत्येक माउस तनाव bleomycin6,7के लिए एक अलग संवेदनशीलता है. प्रयोगों के लिए इस्तेमाल माउस तनाव में इष्टतम खुराक निर्धारित करने के लिए bleomycin का Titration किया जाना चाहिए.
  2. संज्ञाहरण
    1. बाँझ लवण के 9 एमएल में 2,2,2-tribromoethanol के 0.2 ग्राम भंग करके संज्ञाहरण तैयार करें और निरपेक्ष इथेनॉल के 1 एमएल (20 मिलीग्राम/एमएल की एक काम एकाग्रता पर)।
    2. थक्का गठन से बचने के लिए ट्यूब को उलटकर अच्छी तरह से मिलाएं।
    3. ठीक से तैयारी की तारीख के साथ ट्यूब लेबल, यह अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर, और 3 दिनों के भीतर इसका इस्तेमाल करते हैं.
    4. माउस प्रति 200 मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन की अंतिम खुराक पर, एक 1 एमएल सिरिंज और एक 26 जी सुई का उपयोग करते हुए, 250 डिग्री सेल्सियस ट्राइब्रोमेनोल समाधान के एक इंट्रापेरिटोनल इंजेक्शन के साथ चूहों को एनेस्थेटाइज़ करें।
      नोट: इस खुराक के साथ, चूहों कम से कम 20 मिनट के लिए बेहोश कर रहे हैं. जब आवश्यक हो, माउस प्रतिक्रिया के अनुसार खुराक समायोजित, पशु चिकित्सक के साथ परामर्श में.
    5. माउस श्वास की निगरानी करें। श्वसन दर थोड़ी धीमी हो जाएगी। कुछ मिनट के बाद, पेडल पलटा की कमी की जांच करने के लिए माउस पैर में से एक चुटकी।
  3. एंडोट्रेकल इंजेक्शन
    1. सभी प्रक्रिया के दौरान aseptic शर्तों को बनाए रखें। बाँझ शल्य चिकित्सा उपकरणों और सामग्री का प्रयोग करें, बाँझ दस्ताने पहनते हैं और किसी भी गैर बाँझ सतह के साथ संपर्क से बचें।
    2. एक शल्य मंच पर अपनी पीठ पर एनेस्थेटाइज्ड माउस लेट जाओ और नाजुक सर्जिकल टेप स्ट्रिप्स के साथ अपने पैरों फिक्सिंग द्वारा जगह में पकड़।
      नोट: माउस पैरों की कोमल टेपिंग अपने रोटेशन के दौरान शल्य चिकित्सा मंच से दूर फिसलने माउस से बचने के लिए सिफारिश की है (चरण 2.3.10).
    3. हस्तक्षेप के दौरान गुदा तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर रखने के लिए माउस को गर्म चटाई पर रखें। गुदा जांच से गुदा तापमान को मापने।
    4. धीरे से एक "पिल्ल" रखकर माउस गर्दन hyperextend, उदाहरण के लिए, एक दंत कपास रोल, अपने गर्भाशय ग्रीवा क्षेत्र के नीचे.
    5. धीरे एक उस्तरा ब्लेड के साथ गले दाढ़ी.
    6. शराब के साथ शल्य चिकित्सा क्षेत्र से बालों को निकालें और माउस त्वचा को कई बार 1% povidone-आयोडीन समाधान के साथ कीटाणुरहित करें।
    7. शारीरिक संदंश की एक जोड़ी के साथ त्वचा चुटकी और माउस sternohyoid मांसपेशियों के पत्राचार में एक छोटी चीरा बनाने के लिए, अंगूठी संभाल, घुमावदार कुंद कैंची की एक जोड़ी का उपयोग कर.
      नोट: त्वचा का चीरा लंबाई में लगभग 0.5 सेमी है। इसी त्वचा टुकड़ा जो हटा दिया जाता है इतना छोटा है कि यह माउस गर्दन में कोई तनाव पैदा करेगा.
    8. कपास ऊन चिपक जाती है के साथ खून बह रहा बंद करो.
    9. कुंद विच्छेदन द्वारा श्वासनली को बाहरी ीकृत करें, धीरे से वसा और अन्य ऊतकों से इसे साफ करें।
    10. ऑपरेटर की ओर अपने सिर के साथ माउस उन्मुख करने के लिए शल्य मंच घुमाएँ.
      नोट: यह स्थिति ऑपरेटर की अनुमति देता है, इंजेक्शन के दौरान, सिरिंज कोण इतना है कि यह सीधे फेफड़ों के लिए श्वासनली के प्राकृतिक पथ का पालन करता है.
    11. श्वासनली के दृश्य के साथ मदद करने के लिए एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप के नीचे माउस रखें। रोशनी समायोजित करें और आवर्धन सेट (1 और 1.2 के बीच), फोकस, और तीखेपन. श्वासनली आसानी से एक सफेद पारदर्शी ट्यूब के रूप में प्रतिष्ठित किया जा सकता है, और श्वासनली के छल्ले स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं।
    12. धीरे pipeting द्वारा bleomycin समाधान मिक्स, और एक 25 जी सुई के साथ एक 0.5 एमएल सिरिंज में 100 $L aspirate, बुलबुला गठन से बचने.
    13. एक बार श्वासनली स्पष्ट रूप से कल्पना कर ली जाती है, तो इसे सुई सिरे से 30 डिग्री (चित्र1क) के कोण पर सावधानीपूर्वक पंचर कर लें।
    14. धीरे-धीरे ब्लियोमाइसिन या बाँझ लवण (वाहन नियंत्रण) के 100 डिग्री सेल्सियस को सीधे श्वासनली के लुमेन में डालदिया जाता है। जब तक संपूर्ण आयतन सुई के नीचे यात्रा नहीं करती, तब तक कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें, और फिर इसे श्वासनली से निकालें।
    15. एपनिया के कुछ सेकंड का निरीक्षण करें, जो तब होता है जब सुई सही ढंग से श्वासनली में डाला जाता है ताकि माउस तुरंत तरल की पूरी मात्रा श्वास होगा।
    16. यदि माउस तरल inhaling नहीं है, ध्यान से अपनी सांस की निगरानी और सुई की स्थिति को समायोजित. यदि माउस साँस लेना बंद कर देता है, तो तुरंत सुई को हटा दें और माउस को इसे फिर से डालने से पहले सामान्य रूप से सांस लेने की अनुमति दें।
    17. इंजेक्शन के बाद सीरिंज और सुई को सुरक्षित रूप से त्याग दें।
    18. चमड़े के नीचे फासिया और त्वचा घाव को 5-0 अवशोषणीय सीवन के साथ बंद करें।
      नोट: जब पूरी तरह से reabsorbed नहीं, टांके 7-10 दिनों के बाद सर्जरी को हटा दें।
  4. पशु वसूली
    1. वसूली के लिए एक हीटिंग पैड पर अपनी तरफ इंजेक्शन माउस प्लेस.
    2. माउस श्वास की निगरानी और माउस का निरीक्षण जब तक यह चलती शुरू होता है और कठोर recumbency और पूर्ण चेतना हासिल.
    3. एक बार यह पुष्टि की है कि माउस अच्छी हालत में है, यह मूल पिंजरे में वापस. यह पूरी तरह से बरामद किया है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी को वापस मत करो.
    4. लंबे समय तक analgesia सुनिश्चित करने और किसी भी अवशिष्ट के बाद हस्तक्षेप दर्द से बचने के लिए, subcutaneously buprenorphine प्रशासन ( 0.05 mg/kg शरीर के वजन की अंतिम खुराक पर) माउस के लिए हर 12 एच पोस्ट एंडोट्रेल इंजेक्शन.
    5. ब्लियोमाइसिन के एंडोट्रेकल इंजेक्शन के बाद 24 एच के लिए चूहों की जांच करें और दिन में दो बार ऐसा करें। श्वसन संकट, वजन घटाने, व्यवहार असामान्यताएं, और रुग्णता के किसी भी संकेत के लिए चूहों की निगरानी करें।

3. मानव गर्भनाल mesenchymal stromal कोशिकाओं की पूंछ नस जलसेक

  1. सेल की तैयारी
    नोट: अलगाव, विशेषता, और गर्भनाल से mesenchymal stromal कोशिकाओं की खेती पहले8,9,10वर्णित किया गया है . एचयूसी-एमएससी को असापट रूप से हेरफेर और संचार किया जाना चाहिए; इसलिए, एक बाँझ हुड के तहत सभी चरणों का पालन करें।
    1. 75 सेमी2 संस्कृति फ्लास्क में एचयूसी-एमएससी को प्रारंभिक मार्ग (1-3 अधिकतम) तक विस्तृत करें।
      नोट: एचयूसी-एमएससी चूहों में अपने जलसेक के दिन 70% confluent होना चाहिए।
    2. कमरे के तापमान पर बाँझ फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) के 10 एमएल के साथ कोशिकाओं को धो लें।
    3. ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ें और कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस पर लगभग 1 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, जब तक कि वे अलग करना शुरू न करें।
    4. एचयूसी-एमएससी पूर्ण माध्यम के 8 एमएल को जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) शामिल है।
    5. कोशिकाओं को 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रण द्वारा लीजिए।
    6. बाँझ लवण में गोली resuspend और एक B$rker कक्ष का उपयोग कर कोशिकाओं की गिनती. कोशिकाओं को 2.5 x 105 की अंतिम सांद्रता में 200 डिग्री सेल्सियस प्रति बाँझ लवण के लिए कम करके जलसेक के लिए सेल निलंबन तैयार करें। सभी चूहों infusing के लिए पर्याप्त मात्रा है यह सुनिश्चित करने के लिए एक अतिरिक्त सेल निलंबन तैयार करें.
    7. जलसेक से पहले कोशिकाओं को बर्फ पर रखें। कुछ ही घंटों के भीतर डालें, जैसा कि अनुभाग 3.3 में वर्णित है.
  2. संज्ञाहरण
    नोट: इंजेक्शन के दौरान माउस पूंछ नस को नुकसान पहुंचाने के जोखिम को कम करने के लिए माउस को स्थानांतरित नहीं करना चाहिए। इसलिए संज्ञाहरण सरल माउस निरोधक पर पसंद किया गया है.
    1. एक प्रेरण कक्ष में चूहों को 4% isoflurane साँस लेना द्वारा एनेस्थेटाइज करें।
    2. माउस श्वास की निगरानी करें। श्वसन दर थोड़ी धीमी हो जाएगी। कुछ मिनट के बाद, उचित एनेस्थेटाइजेशन की जांच करने के लिए माउस पैर में से एक चुटकी।
  3. पूंछ नस जलसेक
    1. एक बार बेहोशी की पुष्टि की गई है, aseptic hUC-एमएससी अंतःशिरा जलसेक के लिए एक बाँझ हुड के नीचे माउस जगह है.
    2. 1.5% isoflurane की एक सतत प्रवाह के साथ एक चेहरे का मुखौटा के माध्यम से प्रयोग के दौरान सामान्य संज्ञाहरण बनाए रखें.
    3. vasodilation को बढ़ावा देने और एक आसान इंजेक्शन के लिए अनुमति देने के लिए, 2 मिनट के लिए गर्म पानी में माउस पूंछ लेना.
    4. कोशिकाओं clumps फार्म नहीं है कि यह सुनिश्चित करने के लिए धीरे pipeting द्वारा सेल निलंबन मिक्स. एक 26 जी सुई के साथ एक 1 एमएल सिरिंज में Aspirate 200 $L, बुलबुला गठन से बचने.
    5. नोक से माउस पूंछ पकड़ो और धीरे से इसे सीधा.
    6. माउस पूंछ के पार्श्व नस का पता लगाएँ; धीरे यह एक स्केलपेल के साथ परिमार्जन और यह 70% इथेनॉल के साथ पोंछ.
      नोट: धीरे पूंछ के scraping बालों को दूर करने के लिए किया जाता है, इंजेक्शन चिकनी और क्लीनर की साइट बना रही है.
    7. पुच्छ के दूरस्थ भाग से प्रारंभ करके सुई को 15 डिग्री कोण पर नस में सम्मिलित करें तथा धीरे-धीरे एचयूसी-एमएससी अथवा बाँझ लवण (वाहन नियंत्रण) (चित्र1बी)का 200 डिग्री सेल्सियस का निवेश करें।
    8. प्रतिरोध के बिना नस में प्रवेश करने वाले तरल द्वारा और बहिर्वेशन की कमी से सफल अंतःशिरा जलसेक की निगरानी करें। कुछ सेकंड प्रतीक्षा करें जब तक कि संपूर्ण वॉल्यूम सुई के नीचे यात्रा न कर े, और फिर इसे नस से निकालें।
    9. रक्तस्राव को रोकने के लिए, कुछ समय के लिए एक बाँझ धुंध के साथ प्रवेश घाव पर दबाव लागू करें।
    10. जलसेक के बाद सिरिंज और सुई को सुरक्षित रूप से त्याग दें।
  4. पशु वसूली
    1. वसूली के लिए एक हीटिंग पैड पर अपनी तरफ संचार माउस रखें.
    2. माउस श्वास की निगरानी और माउस का निरीक्षण जब तक यह चलती शुरू होता है और कठोर recumbency और पूर्ण चेतना हासिल.
    3. एक बार यह पुष्टि की है कि माउस अच्छी हालत में है, यह मूल पिंजरे में वापस. यह पूरी तरह से बरामद किया है जब तक अन्य जानवरों की कंपनी को वापस मत करो.
    4. पूंछ नस जलसेक और हर दूसरे दिन के बाद 24 एच के लिए चूहों की जांच, उनके स्वास्थ्य की स्थिति पर नजर रखने और किसी भी दुख या रोग संकेत जल्दी का पता लगाने के लिए.

4. अंग एक्सप्लांट और ऊतक प्रसंस्करण

  1. इंजेक्शन एनेस्थेटिक की अधिक मात्रा से ब्लियोमाइसिन प्रशासन (चित्र 1C) के बाद दिन 8, 14, या 21 में चूहों को बलिदान करें।
  2. श्वासनली और फेफड़ों को उत्पादित करें और उन्हें तुरंत बर्फ-ठंडा पीबीएस में धो लें।
  3. सही फेफड़ों को तरल नाइट्रोजन में स्नैप-फ्रीज करें और उन्हें बाद के आणविक विश्लेषण10के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड के साथ बाएं फेफड़ों को फुलाना और उन्हें 24 ज के लिए 10% तटस्थ-बफर फॉर्मेलिन समाधान में ठीक करें; फिर, उन्हें वर्गीकृत शराब श्रृंखला में निर्जलित, उन्हें xylene में साफ है, और उन्हें पैराफिन10में एम्बेड.

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Representative Results

फेफड़ों की चोट बाँझ नमकीन के 100 डिग्री एल में ब्लियोमाइसिन सल्फेट के 1.5 यू/किग्रा शरीर के वजन के एक एकल एंडोट्रेकल इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया गया था। नियंत्रण जानवरों नमकीन के एक बराबर मात्रा का एक endotracheal इंजेक्शन प्राप्त किया. एचयूसी-एमएससी के दो शॉट्स (2.5 x 105 में 200 जेडएल बाँझ नमकीन) माउस पूंछ नस में संचार किया गया, 24 एच और 7 दिन ब्लियोमाइसिन प्रशासन के बाद। नियंत्रण जानवरों बाँझ लवण के एक बराबर मात्रा का एक अंतःशिरा जलसेक प्राप्त किया. चूहे को ब्लियोमाइसिन प्रशासन के बाद दिन 8, 14 और 21 पर फेफड़ों के एक्सप्लांट और टिश्यू प्रोसेसिंग के लिए बलिदान दिया गया (चित्र 1)।

हमने दिखा दिया है कि माउस श्वासनली में ब्लियोमाइसिन का प्रत्यक्ष आसरण फेफड़ों के लिए एक तेजी से प्रसार की अनुमति दी, व्यापक सूजन में जिसके परिणामस्वरूप, प्रगतिशील फाइब्रोसिस, और उनके सामान्य वास्तुकला के एक विरूपण, लगातार पूर्व अध्ययन के साथ 11.फेफड़ों के हिस्टोपैथोलॉजिकल परिवर्तनों का मूल्यांकन हेमाटॉक्सिन-ईओसिन (एच एंड ई) और पिक्रोसिरियस लाल धुंधला10द्वारा किया गया था , और फाइब्रोसिस की पुष्टि एक बढ़ी हुई हाइड्रॉक्सीप्रोलाइन सामग्री और कोलेजन जमाव द्वारा की गई थी (चित्र 2) . ऊतक में भड़काऊ परिवर्तन ब्रोन्किओल्स, ब्रोंची, और रक्त वाहिकाओं के आसपास सूजन घुसपैठ के आधार पर एक हिस्टोलॉजिकल स्कोरिंग प्रणाली द्वारा मूल्यांकन किया गया था, और हेमेटोक्सीलिन-ईओसिन दाग फेफड़ों वर्गों10में मनाया बीचवाला निमोनिया । ब्लियोमाइसिन इंजेक्शन के बाद, फेफड़ों के वर्गों के Ashcroft स्कोर उत्तरोत्तर दिन 8 में 1.5 का एक औसत मूल्य से वृद्धि हुई दिन 14 में 4.5 का एक औसत मूल्य और दिन में 6.5 के 2110. माउस पूंछ नस में एचयूसी-एमएससी का डबल अर्क काफी हद तक क्षीण ब्लियोमाइसिन प्रेरित फेफड़ों की चोट, महत्वपूर्ण कमी के साथ, हालांकि सूजन घुसपैठ और हर समय बिंदु पर फाइब्रोसिस की सीमा दोनों का पूरा न होना () चित्र 2) विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग10 से पता चला कि संचार एचयूसी-एमएससी तेजी से और प्रभावी ढंग से माउस फेफड़ों तक पहुंच गया, हालांकि केवल कुछ कोशिकाओं का पता चला, दिन 8 से दिन 21 तक कम संख्या के साथ (चित्र3)। जैसा कि पहले12की सूचना दी , इन आंकड़ों से पता चलता है कि उनके लंबे समय तक सुरक्षात्मक प्रभाव के बावजूद, चोट की साइट से कोशिकाओं की तेजी से अव्यवस्था। एचयूसी-एमएससी के इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (आईएचसी) का दाग भी नमकीन उपचारित नमूनों में किया गया था, लेकिन एचयूसी-एमएससी को आकर्षित करने वाले भड़काऊ फॉसी की अनुपस्थिति को देखते हुए कोई सेल का पता नहीं लगाया जा सका।

Figure 1
चित्र 1: प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का Schematic. (ए) चूहे को फेफड़ों की चोट (दिन 0) को प्रेरित करने के लिए ब्लियोमाइसिन के 1.5 यू/किग्रा शरीर के वजन का एक एकल एंडोट्रेकल (ई.टी.) इंजेक्शन प्राप्त हुआ। (बी) एक डबल अंतःशिरा (अर्थात) 2.5 x 105 मानव mesenchymal stromal कोशिकाओं के अर्क पूरे गर्भनाल से प्राप्त (एचयूसी-एमएससी) 24 ज (दिन 1) और 7 दिन (दिन 7) bleomycin प्रशासन के बाद प्रदर्शन किया गया था. (ग) इंजेक्शन और बलिदान के क्षणों की एक समय रेखा यहाँ दिखाया गया है. चूहे समूहों के दिन 8, 14, और 21 में bleomycin प्रशासन के बाद बलिदान किया गया (यानी, 24 एच, 7 दिन, और 14 दिन के बाद दूसरी एचयूसी-एमएससी जलसेक, क्रमशः). यह आंकड़ा मोरोंसिनी एट अलसे संशोधित किया गया है। 10इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: एचयूसी-एमएससी नीचे ब्लोमाइसिन प्रेरित फेफड़ों की सूजन और फाइब्रोसिस को नियंत्रित करते हैं। (ए और बी) प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों (10x आवर्धन) hematoxylin-eosin (एच एंड ई) और picrosirius elungiors elunge के फेफड़ों वर्गों के लाल धुंधला C57BL/6 चूहों से प्राप्त, बाँझ नमकीन (saline) या bleomycin के एंडोहेल इंजेक्शन के 21 दिनों के बाद बाद में भी एचयूसी-एमएससी (ब्लियोमाइसिन +एचयूसी-एमएससी) या बाँझ नमकीन (ब्लियोमाइसिन +सैलीन) का अंतःशिरा जलसेक होता है। नमकीन नियंत्रण सामान्य फेफड़ों वास्तुकला का प्रदर्शन किया. व्यापक भड़काऊ घुसपैठ ब्लियोमाइसिन चोट के 21 दिनों के बाद देखी गई, फेफड़ों की वास्तुकला की एक गंभीर विरूपण और फाइब्रोटिक फॉसी के गठन के साथ। Bleomycin प्रेरित परिवर्तन काफी hUC-एमएससी उपचार द्वारा क्षीण लेकिन नमकीन द्वारा नहीं थे. (ग) उपरोक्त उपचार प्राप्त करने वाले C57BL/6 चूहों के फेफड़ों में दिन 8, 14 और 21 में hydroxyproline सामग्री। परिणाम मतलब हैं - एसडी (n $ 8 प्रति समूह), endotracheal लवण उपचार चूहों से प्राप्त मूल्य के प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया और तीन स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं. *पी एंड एलटी; 0.05, *पी एंड एलटी; 0.01, ब्लोमाइसिन-उपचारित चूहों की तुलना में। (डी) माउस Col1A1 अभिव्यक्ति का स्तर पूरे फेफड़ों MRNA में दिन 8, 14, और 21 C57BL/6 चूहों कि ऊपर उल्लिखित उपचार प्राप्त से प्राप्त की. परिणाम मतलब है - एसडी (n $ 5 प्रति समूह) और तीन स्वतंत्र तीन स्वतंत्र तीन तीन में प्रदर्शन प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं triplicate में प्रदर्शन किया. *पी एंड एलटी; 0.05, *पी एंड एलटी; 0.01, ब्लोमाइसिन-उपचारित चूहों की तुलना में। यह आंकड़ा Moroncini एट अल से संशोधित किया गया है. 10इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: फेफड़ों के ऊतकों में एचयूसी-एमएससी का पता लगाना। (ए और बी) प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियों (200x और 400x आवर्धन, क्रमशः) विरोधी HLA-1 फेफड़ों वर्गों के एंटीबॉडी के साथ इम्यूनोस्टेनिंग के C57BL/6 चूहों से प्राप्त endotracheal bleomycin प्राप्त करने के बाद अंतःशिरा एचयूसी-एमएससी। लाल तीर सकारात्मक-सना हुआ एचयूसी-एमएससी इंगित करते हैं। (सी) मानव GAPDH मात्रात्मक वास्तविक समय polymerase श्रृंखला प्रतिक्रिया (पीसीआर) पूरे MRNA में परख से जलसेक से पहले सुसंस्कृत HUC-MSC से निकाले गए (संक्रमित एचयूसी-एमएससी) या दिन में फेफड़ों के ऊतकों से 8, 14, और C57BL/6 चूहों के 21 endotrac प्राप्त ब्लियोमाइसिन अंतःशिरा एचयूसी-एमएससी (ब्लियोमाइसिन+एचयूसी-एमएससी) के बाद। परिणाम मतलब है - एसडी (n $ 5 प्रति समूह) और तीन स्वतंत्र तीन स्वतंत्र तीन तीन में प्रदर्शन प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं triplicate में प्रदर्शन किया. नोट की, इस प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल में मानव GAPDH प्रतिलिपि के स्रोत विशेष रूप से नसों में संचार एचयूसी-एमएससी द्वारा प्रदान किया जा सकता है. यह आंकड़ा Moroncini एट अल से संशोधित किया गया है. 10इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

फेफड़ों में बहिर्जात एजेंटों को वितरित करने के लिए एंडोट्रेकल प्रशासन एक अधिमानी मार्ग है। कई वर्षों के बाद से, श्वासनली में ब्लियोमाइसिन का प्रत्यक्ष इंजेक्शन व्यापक रूप से फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस13 को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और, हाल ही में, इस14को पूरा करने के लिए और अधिक उन्नत, noninvasive तकनीक विकसित की गई है 14,15 ,16.

यहाँ वर्णित विधि कुछ संभावित सीमाओं पर कई सार्थक लाभ प्रदान करता है. श्वासनली के इंजेक्शन के लिए एक शल्य चिकित्सा हस्तक्षेप की आवश्यकता होती है, इसके साथ प्रक्रिया के कारण जटिलताओं के लिए क्षमता को ले जाने, गहरे पशु के मलीकरण की आवश्यकता के साथ। इसलिए, प्रक्रिया को सिद्ध करने में अच्छी तैयारी और अभ्यास की आवश्यकता है। इसके अलावा, माउस दुख को कम करने के लिए, यह माउस तनाव के अनुसार संवेदनाहारी की उचित खुराक सेट करने के लिए और व्यक्तिगत प्रतिक्रिया के लिए और पशु sedation राज्य के एक कठोर अवलोकन बनाए रखने के लिए आवश्यक है. फिर भी, हम मृत्यु दर और संज्ञाहरण से इष्टतम पशु वसूली की एक बहुत कम दर मनाया. Ketamine और xylazine संज्ञाहरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही tribromoethanol. हालांकि, चूहों में, केटामाइन और जाइलज़ीन की प्रभावी खुराक घातक खुराक के करीब है; इस प्रकार, वे आसानी से एक श्वसन गिरफ्तारी पैदा कर सकते हैं. इसके विपरीत, tribromoethanol dosing आसानी से समायोजित किया जा सकता है और है, इस प्रकार, एक बेहतर संवेदनाहारी एजेंट. श्वासनली में ब्लियोमाइसिन के एंडोट्रेकल इंजेक्शन के बाद, हमने किसी भी प्रतिकूल प्रभाव का पालन नहीं किया। चूहों बुखार से मुक्त थे और सूजन या संक्रमण का कोई संकेत नहीं श्वासनली और त्वचा घाव के आसपास मनाया गया. इसलिए, एंटीबायोटिक प्रोफिलैक्सिस की कोई आवश्यकता नहीं थी। इसके अलावा, एक ऑपरेटिंग माइक्रोस्कोप का उपयोग ऑपरेटर सही पैदा करने से पहले माउस श्वासनली में सुई की सही स्थान की निगरानी करने की अनुमति देकर सफलता का एक उच्च विश्वास सुनिश्चित करता है, इस प्रकार यह हानिकारक के जोखिम को कम से कम.

ब्लियोमाइसिन का एंडोट्रेकल इंजेक्शन दोनों फेफड़ों में एक शक्तिशाली सूजन और फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया में परिणाम देता है और मानव अंतरालीय फेफड़ों की बीमारियों (आईएलडी) के प्रयोगात्मक माउस मॉडल उत्पन्न करने के लिए एक मजबूत विधि के रूप में देखा जा सकता है। हालांकि, जैसा कि पहले7प्रलेखित , चूहों में ब्लियोमाइसिन के लिए फाइब्रोटिक प्रतिक्रिया तनाव पर निर्भर है और लिंग- और उम्र से संबंधित है। इसलिए, यह प्रोटोकॉल की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है हर प्रयोगात्मक सेटिंग में bleomycin की सहनीय खुराक खोजने के लिए. महिला चूहों इस अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था क्योंकि इस शोध में मुख्य रुचि प्रणालीगत स्क्लेरोसिस के साथ जुड़े अंतरालीय फेफड़ों की बीमारी थी, जो एक रोग काफी हद तक युवा वयस्क महिलाओं में प्रचलित है. तीन से चार महीने के चूहों को चुना गया क्योंकि यह वह उम्र है जिस पर वे वयस्क चरण में प्रवेश करते हैं (मीस 8-12 सप्ताह की उम्र में यौन परिपक्वता प्राप्त करते हैं)17. इस प्रकार, वे युवा वयस्क चूहों माना जाता है और युवा जानवरों से अधिक बेहतर कर रहे हैं, के बाद से फेफड़ों फाइब्रोसिस बहुत युवा व्यक्तियों में आम नहीं है. वे भी पुराने जानवरों पर बेहतर कर रहे हैं के बाद से18 का प्रदर्शन किया है कि वृद्ध चूहों फेफड़ों फाइब्रोब्लास्ट phenotype में परिवर्तन का प्रदर्शन किया, फेफड़ों की चोट के बाद मरम्मत और फाइब्रोसिस के लिए एक वृद्धि की संवेदनशीलता के लिए अग्रणी, जो यहाँ प्रस्तुत प्रयोगात्मक मॉडल में एक संभव पूर्वाग्रह का प्रतिनिधित्व कर सकता है.

टेल नस जलसेक खून के लिए दवाओं की तेजी से और प्रभावी वितरण सुनिश्चित करने के लिए एक सरल, विश्वसनीय, और noninvasive तरीका है। यह आसानी से सरल चिकित्सा उपकरण, लघु मैनुअल प्रशिक्षण, और कम लागत के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.

यहाँ वर्णित प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल, पहले से प्रकाशित अध्ययन से संशोधित19,20,21, माउस में सेल engraftment बढ़ाने के लिए 2.5 x 105 hUC-MSC की एक डबल अंतःशिरा जलसेक का मौजूद है फेफड़ों और उनके चिकित्सीय प्रभाव. वास्तव में, चूंकि प्रक्रिया nontraumatic है, यह एक ही जानवर में दोहराया जा सकता है, लेकिन लगातार दो इंजेक्शन के बीच 7 दिनों की अवधि की सिफारिश की है, अंतिम vasal घावों की क्षतिपूर्ति की अनुमति देने के लिए. इसके अलावा, हमने प्रक्रिया के दौरान सी 57BL/6 चूहों को एनेस्थेटाइज करने के लिए isoflurane इनहेलेशन का उपयोग किया, अचानक पशु आंदोलनों के मामले में पूंछ नस चोट से बचने के लिए।

अंत में, इस प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक C57BL/6 चूहों में फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस प्रेरित करने के लिए और एचयूसी-एमएससी के विवो एंटीफाइब्रोटिक प्रभाव को मान्य करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया है। इस विधि को विभिन्न प्रयोगात्मक फेफड़ों की बीमारी मॉडल उत्पन्न करने के लिए, वायुमार्ग में ब्लियोमाइसिन के अलावा अन्य दवाओं या एजेंटों के प्रशासन के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

यह काम एक अनुदान आरएफ-2011-02352331 Ministero इटालियनो डेला सलामी (Armando Gabrieli के लिए) से समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
C57BL/6 mice Charles River Jax Mice Stock n. 000664
2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) Sigma-Aldrich T48402
Barraquer Micro Needle Holder Lawton 62-3755
Bleomycin sulfate Sigma-Aldrich B1141000
Bürker chamber Brand  718905
Culture Flasks EuroClone ET7076
Disposable razors Unigloves 4080
Dissecting Forceps Aesculap Surgical Instruments BD311R
DPBS Gibco 14190-144
Heating pad 2Biological Instruments 557023
Isoflurane Vet Merial Italia N01AB06
Operating Microscope Carl Zeiss Model OPM 16
TrypLE Select Enzyme Gibco 12563-029
Vannas Micro Scissors Aesculap Surgical Instruments OC498R
Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm Ethicon VCP392ZH

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक 146 ब्लियोमाइसिन एंडोट्रेकल इंजेक्शन फेफड़ों की चोट मानव गर्भनाल मेसेन्काइम लमल सेल (एचयूसी-एमएससी) पूंछ नस जलसेक C57BL/
ब्लियोमाइसिन के एंडोट्रेकल इंजेक्शन द्वारा माउस फेफड़ों की चोट का प्रेरण
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Orlando, F., Paolini, C., Agarbati, S., Tonnini, C., Grieco, A., Capelli, C., Introna, M., Provinciali, M., Gabrielli, A., Moroncini, G. Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin. J. Vis. Exp. (146), e58922, doi:10.3791/58922 (2019).

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