Summary
Qui presentiamo un metodo efficace per studiare l'attività antifibrotica delle cellule manomalifonde umane infuso infuso ottenuto da tutto il cordone ombelicale in seguito all'induzione della lesione polmonare da un'iniezione endotracheale di bleomycina nel C57BL /6 topi. Questo protocollo può essere facilmente esteso ai test preclinici di altre terapie.
Abstract
La fibrosi polmonare è un segno distintivo di diverse malattie polmonari umane con un'eziologia diversa. Poiché le terapie attuali sono piuttosto limitate, i modelli murini continuano ad essere uno strumento essenziale per lo sviluppo di nuove strategie antifibrotiche. Qui forniamo un metodo efficace per studiare l'attività antifibrotica in vivo delle cellule stromali mesenchymale umane ottenute da intero cordone ombelicale (hUC-MSC) nell'attenuazione della lesione polmonare indotta dalla bleomicina. I topi C57BL/6 ricevono una singola iniezione endotracheale di bleomycin (1,5 U/kg di peso corporeo) seguita da una doppia infusione di hUC-MSC (2,5 x 105)nella vena posteriore, 24 h e 7 giorni dopo la somministrazione della bleomycina. Al sacrificio ai giorni 8, 14, o 21, vengono analizzati i cambiamenti infiammatori e fibrotici, il contenuto di collagene e la presenza di hUC-MSC nel tessuto polmonare espiantato. L'iniezione di bleomycin nella trachea del topo consente il targeting diretto dei polmoni, portando a un'estesa infiammazione polmonare e fibrosi. La somministrazione sistemica di una doppia dose di hUC-MSC provoca la rapida smussatura della lesione polmonare indotta dalla bleomicina. Intravenosamente infuso hUC-MSC sono transitoriamente intrisi nei polmoni di topo, dove esercitano la loro attività antinfiammatoria e antifibrotica. In conclusione, questo protocollo è stato applicato con successo per il test preclinico di hUC-MSC in un modello murino sperimentale di fibrosi polmonare umana. Tuttavia, questa tecnica può essere facilmente estesa sia per studiare l'effetto di diverse sostanze somministrate endotrachealmente sulla patofisiologia dei polmoni sia per convalidare nuove terapie sistemiche antinfiammatorie e antifibrotiche.
Introduction
La fibrosi polmonare è un processo patologico progressivo caratterizzato dall'eccessiva deposizione di componenti della matrice extracellulare, principalmente collagene di tipo I, nell'interstizio polmonare, che porta a una funzione polmonare compromessa. È il segno distintivo di diverse malattie polmonari umane con un'eziologia diversa e rappresenta un fattore prognostico clinico povero. Poiché le terapie attuali sono piuttosto limitate di1, i modelli murini continuano ad essere uno strumento essenziale sia per l'ulteriore indagine dei meccanismi patogeni che influenzano l'insorgenza e la progressione della malattia, sia per sviluppare nuovi antifibrotici strategie2,3.
Ad oggi, la somministrazione di bleomycin è stato il modello più comunemente applicato di fibrosi polmonare indotta sperimentalmente4. Accanto a più metodi di fornitura (tra cui per via endovenosa, intraperitoneale, sottocutanea e inalazionale), le iniezioni intratracheali o endotracheali di bleomycin sono emerse come le rotte più utilizzate4,5. Il metodo che descriviamo qui è stato sviluppato per evitare l'effetto scottante della bleomycin sulla mucosa tracheale. L'esterno della trachea e la visualizzazione attraverso un microscopio operativo, infatti, è possibile ottenere l'instillazione dell'intero volume della soluzione di bleomycina direttamente nelle vie aeree inferiori senza fuoriuscite nelle vie aeree superiori. Quando sono disponibili le competenze chirurgiche e la strumentazione richieste, questo metodo consente l'induzione sicura, robusta e riproducibile dell'infiammazione polmonare e della fibrosi, come riportato di seguito.
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Protocol
Tutte le cure e le procedure sperimentali per gli animali sono state approvate dal Ministero della Salute italiano (autorizzazione n. 456/2016-PR) e eseguite secondo le convenzioni della Dichiarazione di Helsinki.
1. Topi
- Dopo averli acquisti, lasciare che i topi si acclimatino per almeno 7 giorni prima dell'iniezione.
NOTA: I topi sono stati alloggiati nell'impianto animale in condizioni prive di agenti patogeni, sono stati mantenuti a temperatura e umidità costanti su un ciclo di luce/buio di 12 h e hanno avuto libero accesso all'acqua e al cibo pellet standard. - Utilizzare topi c57BL/6 femminili e iniettarli a 12-16 settimane di età.
2. Iniezione endotracheale di bleomycin
- Preparazione Bleomycin
AVVISO: Sulla base del sistema di classificazione ed etichettatura delle sostanze chimiche (GHS) globalmente armonizzato, la bleomycina è classificata come pericolo per la salute GHS08.- Preparare la bleomycin sotto un cappuccio chimico.
- Per ottenere la concentrazione di lavoro desiderata (0,05 U/100 l), risospendere 15 U di solfato di leomilina in 30 mL di salina sterile.
- Mescolare con cura il campione invertendo il tubo per evitare la formazione di coaguli.
- Etichettare correttamente il tubo con la data di sospensione, conservarlo a 4 gradi centigradi e utilizzare il suo contenuto entro 24 ore.
- Prima dell'instillazione, eclicazione della soluzione per la bleomycina alla temperatura ambiente.
NOTA: In questo esperimento, una singola dose di peso corporeo di 1,5 U/kg di bleomycin è stata utilizzata per indurre lesioni polmonari nei topi C57BL/6. Tuttavia, ogni ceppo del topo ha una sensibilità diversa alla bleomycin6,7. La titolazione della bleomycina deve essere eseguita per determinare la dose ottimale nel ceppo del topo utilizzato per gli esperimenti.
- Anestesia
- Preparare l'anestesia sciogliendo 0,2 g di 2,2,2 tribromoetanolo in 9 mL di salina sterile e 1 mL di etanolo assoluto (a una concentrazione di lavoro di 20 mg/mL).
- Mescolare accuratamente invertendo il tubo per evitare la formazione di coaguli.
- Etichettare correttamente il tubo con la data di preparazione, conservarlo a 4 gradi centigradi al buio e utilizzarlo entro 3 giorni.
- Anestesizzare i topi con un'iniezione intraperitoneale di 250 - L di soluzione tribromoetanolo (a una dose finale di 200 mg/kg di peso corporeo) per topo, utilizzando una siringa da 1 mL e un ago da 26 G.
NOTA: Con questa dose, i topi sono incoscienti per almeno 20 min. Se necessario, regolare il dosaggio in base alla risposta del topo, in consultazione con il veterinario. - Monitorare la respirazione del mouse. La frequenza respiratoria rallenterà leggermente. Dopo alcuni minuti, pizzica uno dei piedi del mouse per verificare la mancanza di riflesso del pedale.
- Iniezione endotracheale
- Mantenere le condizioni asettiche durante tutta la procedura. Utilizzare strumenti e materiali chirurgici sterili, indossare guanti sterili ed evitare il contatto con qualsiasi superficie non sterile.
- Sdraiati sul topo anetizzato sulla schiena su una piattaforma chirurgica e tenerlo in posizione fissando delicatamente le gambe con strisce di nastro chirurgico.
NOTA: Si consiglia di toccare delicatamente le gambe del mouse per evitare che il mouse scivoli lontano dalla piattaforma chirurgica durante la sua rotazione (passaggio 2.3.10). - Posizionare il mouse su un tappetino riscaldato per mantenere la temperatura rettale stabile a 37 gradi centigradi durante l'intervento. Misurare la temperatura rettale da una sonda rettale.
- Iperestendere delicatamente il collo del mouse mettendo un "pillow", ad esempio, un rotolo di cotone dentale, sotto la sua regione cervicale.
- Rade delicatamente la gola con una lama da rasoio.
- Rimuovere i capelli dall'area chirurgica con alcool e disinfettare la pelle del topo più volte con 1% soluzione povidone-iodio.
- Pizzicare la pelle con un paio di pinze anatomiche e fare una breve incisione in corrispondenza del muscolo sternoioide del topo, utilizzando un paio di forbici smussate con manico ad anello.
NOTA: L'incisione della pelle è di circa 0,5 cm di lunghezza. Il pezzo di pelle corrispondente che viene rimosso è così piccolo che non creerà alcuna tensione nel collo del mouse. - Fermare l'emorragia con bastoncini di cotone.
- Esternare la trachea per dissezione smussata, pulendola delicatamente dal grasso e da altri tessuti.
- Ruotare la piattaforma chirurgica per orientare il mouse con la testa verso l'operatore.
NOTA: Questa posizione consente all'operatore, durante l'iniezione, di inclinare la siringa in modo che segua il percorso naturale della trachea direttamente ai polmoni. - Posizionare il mouse al microscopio operativo per facilitare la visualizzazione della trachea. Regolare l'illuminazione e impostare l'ingrandimento (tra 1 e 1,2), messa a fuoco e nitidezza. La trachea può essere facilmente distinta come un tubo bianco traslucido, e gli anelli tracheali sono chiaramente visibili.
- Mescolare la soluzione di bleomycin pipettando delicatamente, e aspirare 100 gradi l in una siringa da 0,5 ml con un ago da 25 G, evitando la formazione di bolle.
- Una volta che la trachea in chiaramente visualizzato, forarlo con attenzione con la punta dell'ago ad un angolo di 30 gradi (Figura 1A).
- Instillare lentamente 100 l di bleomycin o sterile salina (controllo del veicolo) direttamente nel lume della trachea. Attendere alcuni secondi fino a quando l'intero volume viaggia lungo l'ago, e quindi rimuoverlo dalla trachea.
- Osservare alcuni secondi di apnea, che si verifica quando l'ago è inserito correttamente nella trachea in modo che il mouse inali immediatamente l'intero volume del liquido.
- Se il mouse non inala il liquido, monitorarne attentamente la respirazione e regolare la posizione dell'ago. Se il mouse smette di respirare, rimuovere immediatamente l'ago e consentire al mouse di riprendere la respirazione normalmente prima di reinserirlo.
- Scartare in modo sicuro la siringa e l'ago dopo l'iniezione.
- Chiudere la fascia sottocutanea e la ferita cutanea con una sutura assorbibile 5-0.
NOTA: Quando non completamente riassorbito, rimuovere le suture 7-10 giorni dopo l'intervento chirurgico.
- Recupero degli animali
- Posizionare il mouse iniettato su un lato su una piastra di riscaldamento per il recupero.
- Monitorare la respirazione del topo e osservare il topo fino a quando non inizia a muoversi e riacquista recumbency sternale e piena coscienza.
- Una volta che è confermato che il mouse è in buone condizioni, riportarlo alla gabbia originale. Non restituirlo alla compagnia di altri animali fino a quando non è completamente recuperato.
- Per garantire analgesia prolungata ed evitare qualsiasi dolore post-intervenziale residuo, somministrare sottocutaneamente buprenorphine (a una dose finale di 0,05 mg/kg di peso corporeo) per toottare ogni 12 h dopo l'iniezione endotracheale.
- Esaminare i topi per 24 h dopo l'iniezione endotracheale di camicicina e farlo due volte al giorno. Monitorare i topi per difficoltà respiratorie, perdita di peso, anomalie di comportamento, e per qualsiasi segno di morbilità.
3. Coda infusione vena di cellule stromali del cordone ombelicale umano
- Preparazione cellulare
NOTA: L'isolamento, la caratterizzazione e la coltivazione di cellule stromali che simeliache dal cordone ombelicale umano è stato precedentemente descritto8,9,10. l'hUC-MSC deve essere manipolato e infuso ausiliale; pertanto, eseguire tutti i passaggi sotto un cappuccio sterile.- Espandere l'hUC-MSC in 75 cm2 flaconi di coltura ai primi passaggi (1-3 massimo).
NOTA: l'hUC-MSC deve essere confluente del 70% al giorno della loro infusione in topi. - Lavare le cellule con 10 mL di salina sterile (PBS) tampone di fosfato a temperatura ambiente.
- Aggiungere 2 mL di prove e incubare le cellule a 37 gradi centigradi per circa 1 min, fino a quando non iniziano a staccarsi.
- Neutralizzare la frupsina aggiungendo 8 mL di hUC-MSC mezzo completo contenente 10% siero bovino fetale (FBS).
- Raccogliere le cellule con centrifuga a 350 x g per 10 min.
- Risospendere il pellet in salina sterile e contare le cellule utilizzando una camera di Bérker. Preparare la sospensione cellulare per l'infusione diluindo le cellule ad una concentrazione finale di 2,5 x 105 in 200 - L di salina sterile per topo. Preparare una sospensione cellulare in eccesso per garantire che ci sia abbastanza volume per infondere tutti i topi.
- Conservare le cellule sul ghiaccio prima dell'infusione. Infusione entro poche ore, come descritto nella sezione 3.3.
- Espandere l'hUC-MSC in 75 cm2 flaconi di coltura ai primi passaggi (1-3 massimo).
- Anestesia
NOTA: Al fine di ridurre al minimo il rischio di danneggiare la vena della coda del topo durante l'iniezione, il mouse non deve muoversi. Pertanto l'anestesia è stata preferita rispetto alla semplice contenimento del mouse.- Anestesizzare i topi del 4% di inalazione isoflurane in una camera di induzione.
- Monitorare la respirazione del mouse. La frequenza respiratoria rallenterà leggermente. Dopo alcuni minuti, pizzica uno dei piedi del mouse per verificare la corretta anestesizzazione.
- Infusione della vena della coda
- Una volta confermata l'incoscienza, posizionare il topo sotto una cappa sterile per l'infusione endovenosa hUC-MSC asettica.
- Mantenere l'anestesia generale durante l'esperimento tramite una maschera facciale con un flusso continuo di 1,5% isoflurane.
- Per promuovere la vasodilazione e consentire un'iniezione più facile, immergere la coda del topo in acqua tiepida per 2 min.
- Mescolare la sospensione cellulare pipettando delicatamente per assicurarsi che le cellule non formano grumi. Aspirate 200 -L in una siringa da 1 mL con un ago da 26 G, evitando la formazione di bolle.
- Tenere la coda del mouse per la punta e raddrizzare delicatamente.
- Individuare la vena laterale della coda del topo; grattale delicatamente con un bisturi e pulirlo con il 70% di etanolo.
NOTA: Viene eseguito delicatamente raschiamento della coda per rimuovere i capelli, rendendo il sito di iniezione più liscio e pulito. - Partendo dalla parte distale della coda, inserire l'ago nella vena ad un angolo di 15 gradi e infondere lentamente 200 l di hUC-MSC o salina sterile (controllo del veicolo) (Figura 1B).
- Monitorare l'infusione endovenosa di successo dal liquido che entra nella vena senza resistenza e da una mancanza di stravaganza. Attendere alcuni secondi fino a quando l'intero volume viaggia lungo l'ago, e quindi rimuoverlo dalla vena.
- Per prevenire il sanguinamento, applicare brevemente la pressione sulla ferita d'entrata con una garza sterile.
- Scartare in modo sicuro la siringa e l'ago dopo l'infusione.
- Recupero degli animali
- Posizionare il mouse infuso su un lato su una piastra di riscaldamento per il recupero.
- Monitorare la respirazione del topo e osservare il topo fino a quando non inizia a muoversi e riacquista recumbency sternale e piena coscienza.
- Una volta che è confermato che il mouse è in buone condizioni, riportarlo alla gabbia originale. Non restituirlo alla compagnia di altri animali fino a quando non è completamente recuperato.
- Esaminare i topi per 24 h dopo l'infusione della vena della coda e ogni altro giorno, per monitorare il loro stato di salute e rilevare tempestivamente eventuali sofferenze o segni patologici.
4. Espianto di organi e lavorazione dei tessuti
- Sacrificare i topi nei giorni 8, 14 o 21 dopo la somministrazione della bleomycina (Figura 1C) per sovradosaggio di anestetico iniettabile.
- Accisa la trachea e i polmoni e lavali immediatamente in PBS ghiacciato.
- Agganciare i polmoni giusti in azoto liquido e conservarli a -80 gradi centigradi per una successiva analisi molecolare10.
- Gonfiare i polmoni sinistra con il 4% di paraformaldeide e fissarli in una soluzione di formalina 10% neutra-buffered per 24 h; poi, disidratarli in serie di alcol graduati, eliminarli in xilene, e incorporarli in paraffina10.
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Representative Results
Lesione polmonare sono state indotte da una singola iniezione endotracheale di 1,5 U/kg di peso corporeo di sonfato per la bleomicina in 100 l di salina sterile. Gli animali di controllo hanno ricevuto un'iniezione endotracheale di pari volume di salina. Due scatti di hUC-MSC (2,5 x 105 in 200 gradi l di salina sterile) sono stati infusi nella vena della coda del topo, 24 h e 7 giorni dopo la somministrazione di bleomycin. Gli animali di controllo hanno ricevuto un'infusione endovenosa di un volume uguale di sterile salina. I topi sono stati sacrificati per l'espianto polmonare e l'elaborazione dei tessuti nei giorni 8, 14 e 21 dopo la somministrazione di bleomycin (Figura 1).
Abbiamo dimostrato che un'instillazione diretta della bleomycin nella trachea del topo ha permesso una rapida diffusione ai polmoni, con conseguente infiammazione estesa, fibrosi progressiva e una distorsione della loro architettura normale, coerentemente con studi precedenti 11. I cambiamenti istopatologici polmonari sono stati valutati dall'ematosilia-eosina (H&E) e dalla colorazione rossa picrosiria10, e la fibrosi è stata confermata da un aumento del contenuto di idrossiproline e dalla deposizione di collagene (Figura 2). I cambiamenti infiammatori nel tessuto sono stati valutati da un sistema di punteggio istologico basato sull'infiltrazione infiammatoria intorno a bronchioli, bronchi e vasi sanguigni, e polmonite interstiziale osservata nelle sezioni del polmone macchiate di ematossina10. Dopo l'iniezione di bleomycin, il punteggio di Ashcroft delle sezioni polmonari è progressivamente aumentato da un valore medio di 1,5 al giorno 8 a un valore medio di 4,5 al giorno 14 e di 6,5 al giorno 2110. La doppia infusione di hUC-MSC nella vena della coda del topo in gran parte attenuato lesione polmonare indotta da bleomicina, con riduzione significativa, anche se non completa abrogazione, sia dell'infiltrazione infiammatoria che dell'estensione della fibrosi ad ogni punto ( figura 2). L'immunostaining con anticorpi specifici10 ha mostrato che l'hUC-MSC infuso ha raggiunto rapidamente ed efficacemente i polmoni murini, anche se sono state rilevate solo poche cellule, con un numero decrescente dal giorno 8 al giorno 21 (Figura 3). Come riportato in precedenza12, questi dati suggeriscono una rapida dislocazione delle cellule dal sito di lesioni, nonostante il loro prolungato effetto protettivo. È stata eseguita la colorazione immunoistochimica (IHC) di hUC-MSC, anche nei campioni trattati con salina, ma non è stata possibile rilevare alcuna cellula, data l'assenza di foci infiammatori che attraggono hUC-MSC.
Figura 1: Schema del protocollo sperimentale. (A) I topi hanno ricevuto una singola iniezione endotracheale (e.t.) di 1,5 U/kg di peso corporeo di bleomycin per indurre lesioni polmonari (giorno 0). (B) Una doppia infusione endoveva (i.v.) di 2,5 x 105 cellule stromali mesenchymal umane ottenute da cordoni ombelicali interi (hUC-MSC) è stata eseguita 24 h (giorno 1) e 7 giorni (giorno 7) dopo la somministrazione di ebrionomi. (C) Una cronologia delle iniezioni e dei momenti di sacrificio è mostrata qui. I gruppi di topi sono stati sacrificati ai giorni 8, 14 e 21 dopo l'amministrazione della bleomycin (rispettivamente 24 h, 7 giorni e 14 giorni dopo la seconda infusione di hUC-MSC). Questa cifra è stata modificata da Moroncini et al. 10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: hUC-MSC downregulate bleomicina indotta infiammazione polmonare e fibrosi. (A e B) Rappresentativo immagini microscopiche (10x ingrandimento) di ematosilia-eosina (H&E) e colorazione rossa picrosiria di sezioni polmonari ottenute da C57BL/6 topi, 21 giorni dopo l'iniezione endotrache di sterile salina (salina) o bleomycin (bleomycin), il seguito da un'infusione endovenosa di hUC-MSC (bleomycin-hUC-MSC) o salina sterile (bleomycin-saline). I controlli salini hanno dimostrato la normale architettura polmonare. Gli infiltrati infiammatori diffusi sono stati osservati 21 giorni dopo la lesione della bleomycina, con una grave distorsione dell'architettura polmonare e la formazione di foci fibroti. Le alterazioni indotte dalla bleomicina sono state significativamente attenuate dal trattamento hUC-MSC, ma non dalla salina. (C) Contenuto di idrossicoltura ai giorni 8, 14 e 21 nei polmoni di topi C57BL/6 che hanno ricevuto i suddetti trattamenti. I risultati sono la media : SD (n - 8 per gruppo), espressa in percentuale del valore ottenuto da topi trattati con salina endotracheale e sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. -P < 0,05,P < 0,01, rispetto ai mouse trattati con la bleomycina. (D) I livelli di espressione del mouse Col1A1 in mRNA polmonare intero ottenuti ai giorni 8, 14 e 21 da topi C57BL/6 che hanno ricevuto i suddetti trattamenti. I risultati sono la media : SD (n - 5 per gruppo) e sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti effettuati in triplice copia. -P < 0,05,P < 0,01, rispetto ai mouse trattati con la bleomycina. Questa cifra è stata modificata da Moroncini et al. 10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rilevamento di hUC-MSC nel tessuto polmonare. (A e B) Immagini microscopiche rappresentative (rispettivamente 200x e 400x magnificazione) di immunostaining con anticorpi anti-HLA-1 di sezioni polmonari ottenute da topi C57BL/6 che ricevono bleomycin endotracheali seguita da all'HUC-MSC. Le frecce rosse indicano hUC-MSC macchiate di positivo. (C) GAPDH umano valutato dalla reazione quantitativa della catena della polimerasi in tempo reale (PCR) in mRNA intero estratto da hUC-MSC coltivato prima dell'infusione (infuso hUC-MSC) o dal tessuto polmonare nei giorni 8, 14 e 21 dei topi endotrachealC che ricevono bleomycin seguita da hUC-MSC per via endovenosa (bleomycin-hUC-MSC). I risultati sono la media : SD (n - 5 per gruppo) e sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti effettuati in triplice copia. Da notare che la fonte della trascrizione umana GAPDH in questo protocollo sperimentale può essere fornita esclusivamente dall'hUC-MSC intravfuso. Questa cifra è stata modificata da Moroncini et al. 10. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La somministrazione endotrale è la via preferenziale per la consegna di agenti esogeni nei polmoni. Da diversi anni, l'iniezione diretta di bleomycin nella trachea è stata ampiamente utilizzata per indurre la fibrosi polmonare13 e, recentemente, sono state sviluppate tecniche non invasive più avanzate per realizzare questo14,15 ,16.
Il metodo descritto di seguito offre diversi vantaggi significativi rispetto ad alcune potenziali limitazioni. L'iniezione della trachea richiede un intervento chirurgico, portando con sé il potenziale per le complicazioni causate dalla procedura stessa, insieme alla necessità di sedazione animale profonda. Pertanto, sono necessarie una buona preparazione e pratica nel perfezionamento della procedura. Inoltre, per ridurre al minimo la sofferenza del topo, è imperativo impostare la dose appropriata di anestetico secondo il ceppo del topo e alla risposta individuale e mantenere una rigorosa osservazione dello stato di sedazione animale. Tuttavia, abbiamo osservato un tasso di mortalità molto basso e un recupero ottimale degli animali dall'anestesia. La ketamina e la xilola possono essere utilizzate per l'anestesia, così come il tribromoetanolo. Tuttavia, nei topi, la dose efficace di ketamina e xilola è vicina alla dose letale; così, possono facilmente indurre un arresto respiratorio. Al contrario, il dosing tribromoetanolo può essere facilmente regolato ed è, quindi, un agente anestetico preferibile. Dopo l'iniezione endotracheale di bleomycin nella trachea, non abbiamo osservato alcun effetto avverso. I topi erano liberi dalla febbre e non sono stati osservati segni di infiammazione o infezione intorno alla trachea e alla ferita della pelle. Pertanto, non c'era bisogno di profilassi antibiotica. Inoltre, l'uso di un microscopio operativo garantisce un'elevata fiducia nel successo, consentendo all'operatore di monitorare con precisione il corretto posizionamento dell'ago nella trachea del topo prima dell'instillazione, riducendo così al minimo il rischio di danneggiarlo.
L'iniezione endotracheale di bleomycin si traduce in una potente risposta infiammatoria e fibrotica in entrambi i polmoni e può essere vista come un metodo robusto per generare modelli murini sperimentali di malattie polmonari interstitiali umane (ILD). Tuttavia, come precedentemente documentato7, la risposta fibrotica alla bleomicina nei topi è dipendente dalla tensione e legata al genere e all'età. Pertanto, è fondamentale per il successo del protocollo trovare la dose tollerabile di bleomycin in ogni ambiente sperimentale. I topi femminili sono stati utilizzati in questo studio perché l'interesse principale in questa ricerca era la malattia polmonare interstiziale associata alla sclerosi sistemica, che è una malattia ampiamente prevalente nelle femmine giovani adulte. I topi di età di tre o quattro mesi sono stati scelti perché questa è l'età in cui entrano nella fase adulta (i topi raggiungono la maturità sessuale a 8-12 settimane di età)17. Pertanto, sono considerati topi giovani adulti e sono preferibili rispetto agli animali più giovani, poiché la fibrosi polmonare non è comune negli individui molto giovani. Sono inoltre preferibili rispetto agli animali più anziani da studi precedenti18 hanno dimostrato che i topi invecchiati hanno mostrato alterazioni del fenotipo fibroblasto polmonare, portando ad una maggiore suscettibilità alla degrado e alla fibrosi dopo lesioni polmonari, che potrebbe rappresentare una possibile distorsione nel modello sperimentale qui presentato.
L'infusione di vene della coda è un modo semplice, affidabile e non invasivo per garantire la consegna rapida ed efficace dei farmaci al flusso sanguigno. Può essere facilmente eseguito con semplici attrezzature mediche, formazione manuale breve e costi ridotti.
Il protocollo sperimentale qui descritto, modificato da studi pubblicati in precedenza19,20,21, esiste di una doppia infusione endovenosa di 2,5 x 105 hUC-MSC per migliorare l'innesto cellulare nel topo polmoni e il loro effetto terapeutico. Infatti, poiché la procedura non è traumatica, può essere ripetuta nello stesso animale, ma si raccomanda un periodo di 7 giorni tra due iniezioni consecutive, per consentire la riparazione di eventuali ferite vasali. Inoltre, abbiamo usato l'inalazione dell'isoflurane per anesizzare i topi C57BL/6 durante la procedura, per evitare lesioni alla vena della coda in caso di movimenti improvvisi degli animali.
In conclusione, questo protocollo è stato applicato con successo per indurre in modo efficiente la fibrosi polmonare nei topi C57BL/6 e per convalidare l'effetto antifibrotico in vivo di hUC-MSC. Questo metodo può essere utilizzato anche per la somministrazione di farmaci o agenti diversi dalla bleomycina nelle vie respiratorie, al fine di generare diversi modelli sperimentali di malattia polmonare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione RF-2011-02352331 da Italiano Della Salute (a Armatondo Gabrielli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
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