Summary
Här presenterar vi en effektiv metod för att undersöka den antifibrotiska aktiviteten av intravenöst infunderade humana mesenkymala stromaceller som erhållits från hela navelsträngen efter induktion av lungskada av en endotrakeal injektion av bleomycin i C57BL /6 möss. Detta protokoll kan lätt utvidgas till prekliniska tester av andra Therapeutics.
Abstract
Pulmonell fibros är ett kännetecken för flera mänskliga lungsjukdomar med en annan etiologi. Eftersom nuvarande terapier är ganska begränsade, musmodeller fortsätter att vara ett viktigt verktyg för att utveckla nya antifibrotiska strategier. Här erbjuder vi en effektiv metod för att undersöka in vivo antifibrotisk aktivitet av mänskliga mesenkymala stromaceller som erhållits från hela navelsträngen (Huc-msc) i förmildrande bleomycin-inducerad lungskada. C57BL/6 möss får en enda endotrakeal injektion av bleomycin (1,5 U/kg kroppsvikt) följt av en dubbel infusion av hUC-MSC (2,5 x 105) i svans venen, 24 h och 7 dagar efter bleomycin administrering. Vid offer vid dag 8, 14, eller 21, inflammatoriska och fibrotiska förändringar, kollagen innehåll, och hUC-MSC närvaro i explanterad lungvävnad analyseras. Injektionen av bleomycin i mus luftstrupen tillåter direkt inriktning av lungorna, vilket leder till omfattande lunginflammation och fibros. Den systemiska administreringen av en dubbel dos av hUC-MSC resulterar i tidig avtrutning av den bleomycin-inducerad lungskada. Intravenöst infunderas hUC-MSC är transitivt enympade i mus lungorna, där de utövar sin anti-inflammatorisk och antifibrotisk aktivitet. Sammanfattningsvis har detta protokoll framgångsrikt tillämpats för prekliniska tester av hUC-MSC i en experimentell musmodell av mänsklig lungfibros. Emellertid, denna teknik kan lätt utvidgas både för att studera effekten av olika endotrakeellt administrerade ämnen på patofysiologin i lungorna och att validera nya antiinflammatoriska och antifibrotiska systemiska terapier.
Introduction
Lungfibros är en progressiv patologisk process som kännetecknas av överdriven avsättning av extracellulära matrix komponenter, främst typ I kollagen, i lungan interstitium, vilket leder till försämrad lungfunktion. Det är kännetecknande för flera mänskliga lungsjukdomar med en annan etiologi och representerar en dålig klinisk prognostisk faktor. Eftersom nuvarande terapier är ganska begränsade1, musmodeller fortsätter att vara ett viktigt verktyg både för ytterligare utredning av de patogena mekanismer som påverkar uppkomsten och utvecklingen av sjukdomen och för att utveckla nya antifibrotiska strategier2,3.
Hittills har administrationen av bleomycin varit den vanligaste modellen av experimentellt inducerad pulmonell fibros4. Förutom flera leverera metoder (inklusive intravenös, intraperitoneal, subkutan, och inhalational), intratrakeal eller endotrakeal injektioner av bleomycin har dykt upp som de mest använda rutterna4,5. Den metod som vi beskriver här har utvecklats för att undvika skållning effekten av bleomycin på trakeal slemhinnan. I själva verket, genom att exteriorizing luftstrupen och visualisera det genom ett operativsystem Mikroskop, är det möjligt att uppnå instillation av hela volymen av bleomycin lösning direkt i den nedre luftvägarna utan några spill i de övre luftvägarna. När nödvändig kirurgisk expertis och instrumentering finns tillgängliga, möjliggör denna metod för säker, robust och reproducerbar induktion av lunginflammation och fibros, som rapporteras nedan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur vårds-och försöks förfaranden godkändes av det italienska hälsoministeriet (bemyndigande n. 456/2016-PR) och genomfördes enligt förklaringen från Helsingfors konventionerna.
1. möss
- Efter att ha köpt dem, låt mössen att vänja sig i minst 7 dagar före injektionen.
Obs: möss var inhysta i djuret anläggningen under patogen-fria förhållanden, upprätthölls under konstant temperatur och luftfuktighet på en 12 h ljus/mörker cykel, och fick fri tillgång till vatten och standard pellets mat. - Använd kvinnliga C57BL/6 möss och injicera dem vid 12 till 16 veckors ålder.
2. endotrakealinjektion av bleomycin
- Bleomycin beredning
Varning: baserat på det globalt harmoniserade klassificerings-och märkningssystemet för kemikalier (GHS) klassificeras bleomycin som en GHS08 hälsorisk.- Förbered bleomycin under en kemisk huva.
- För att uppnå önskad arbets koncentration (0,05 U/100 μL), Omsuspendera 15 U av frystorkat bleomycinsulfat i 30 mL steril saltlösning.
- Blanda försiktigt provet genom att invertera röret för att undvika koagelbildning.
- Korrekt etikett röret med datum för resuspension, förvara den vid 4 ° c, och använda dess innehåll inom 24 h.
- Innan instillationen, jämvikt den bleomycin lösningen till rumstemperatur.
Anmärkning: i detta experiment, en engångsdos av 1,5 U/kg kroppsvikt av bleomycin användes för att inducera lungskada i C57BL/6 möss. Ändå, varje mus stam har en annan känslighet för bleomycin6,7. Titrering av bleomycin bör utföras för att bestämma den optimala dosen i den mus stam som används för experimenten.
- Anestesi
- Förbered anestesi genom att lösa upp 0,2 g 2, 2, 2-tribromöthanol i 9 mL steril saltlösning och 1 mL absolut etanol (med en arbets koncentration på 20 mg/mL).
- Blanda noga genom att invertera röret för att undvika koagulering.
- Korrekt etikett röret med datum för beredning, förvara den vid 4 ° c i mörker, och använda den inom 3 dagar.
- Anesthetize möss med en intraperitoneal injektion av 250 μL tribromoethanol lösning (vid en slutlig dos på 200 mg/kg kroppsvikt) per mus, med hjälp av en 1 mL spruta och en 26 G nål.
Obs: med denna dos är mössen medvetslösa i minst 20 minuter. Vid behov, justera doseringen enligt musrespons, i samråd med veterinären. - Övervaka musen andning. Andningsfrekvensen blir något långsammare. Efter några minuter, nypa en av mus fötterna för att kontrollera avsaknaden av pedal reflex.
- Endotrakealinjektion
- Upprätthålla aseptiska förhållanden under hela proceduren. Använd sterila kirurgiska instrument och material, Använd sterila handskar och Undvik kontakt med någon icke-steril yta.
- Ligg ner den sövda musen på ryggen på en kirurgisk plattform och håll den på plats genom att försiktigt fästa benen med kirurgiska band remsor.
Observera: skonsam tejvning av mus benen rekommenderas för att undvika att musen glider bort från den kirurgiska plattformen under dess rotation (steg 2.3.10). - Placera musen på uppvärmd matta för att hålla rektaltemperaturen stabil vid 37 ° c under hela insatsen. Mät rektal temperaturen med en rektalsond.
- Försiktigt hyperextend musen halsen genom att placera en "kudde", till exempel, en Dental bomull rulle, under dess livmoderhalscancer.
- Försiktigt raka halsen med ett rakblad.
- Ta bort hår från det kirurgiska området med alkohol och desinficera musen huden flera gånger med 1% povidon-jod lösning.
- Nyp huden med ett par anatomiska tång och göra ett kort snitt i korrespondens av musen sternohyoid muskler, med hjälp av ett par ring-hanteras, böjda trubbig sax.
Anmärkning: snittet av huden är ca 0,5 cm i längd. Motsvarande hudbit som avlägsnas är så liten att det kommer att skapa någon spänning i mus halsen. - Stoppa blödningen med bomullspinnar.
- Exteriorize luftstrupen av Blunt dissektion, försiktigt rengöra den från fett och andra vävnader.
- Vrid den kirurgiska plattformen för att orientera musen med huvudet mot operatören.
Obs: denna position gör det möjligt för operatören, under injektionen, att vinkla sprutan så att den följer den naturliga vägen av luftstrupen direkt till lungorna. - Placera musen under ett operativ Mikroskop för att hjälpa till med visualisering av luftstrupen. Justera belysningen och Ställ in förstoringen (mellan 1 och 1,2), fokus och skärpa. Luftstrupen kan lätt särskiljas som en vit genomskinlig slang, och trakealringarna är tydligt synliga.
- Blanda bleomycin lösningen genom att försiktigt Pipettera, och aspirera 100 μL i en 0,5 mL spruta med en 25 G nål, undvika bubbelbildning.
- När luftstrupen i tydligt visualiseras, försiktigt punktera den med nålspetsen i en vinkel på 30 ° (figur 1a).
- Långsamt ingjuta 100 μL av bleomycin eller steril saltlösning (fordonskontroll) direkt in i lumen av luftstrupen. Vänta några sekunder tills hela volymen färdas nedför nålen och ta sedan bort den från luftstrupen.
- Observera några sekunder av apné, som uppstår när nålen är korrekt insatt i luftstrupen så att musen kommer omedelbart inhalera hela volymen av vätskan.
- Om musen inte inhalera vätskan, noggrant övervaka dess andning och justera nålpositionen. Om musen slutar andas, ta genast bort nålen och låt musen återuppta andningen normalt innan du sätter tillbaka den.
- Kassera sprutan och injektionsnålen på ett säkert sätt efter injektionen.
- Stäng den subkutana fascian och hud såret med en 5-0 resorberbar sutur.
Anmärkning: när inte helt återabsorberas, ta bort suturer 7-10 dagar efter operationen.
- Djur återvinning
- Placera den injicerade musen på sin sida på en värmedyna för återhämtning.
- Övervaka musen andning och observera musen tills den börjar röra sig och återfår sternala vilo och fullt medvetande.
- När det bekräftas att musen är i gott skick, returnera den till den ursprungliga buren. Returnera den inte till företaget med andra djur förrän den har återhämtat sig helt.
- För att säkerställa långvarig analgesi och undvika kvarvarande post-interventionell smärta, administrera subkutant buprenorfin (vid en slutlig dos på 0,05 mg/kg kroppsvikt) till mus varje 12 h post endotrakeal injektion.
- Undersök möss för 24 h efter endotrakealinjektion av bleomycin och gör det två gånger om dagen. Övervaka möss för andningsbesvär, viktminskning, beteendeavvikelser, och för alla tecken på sjuklighet.
3. svans venen infusion av humant navel Strängs mesenkymala stromaceller
- Cell beredning
Anmärkning: isolering, karakterisering, och odling av mesenkymala stromaceller från mänskliga navelsträngen har tidigare beskrivits8,9,10. hUC-MSC bör aseptiskt manipuleras och infunderas; utför därför alla steg under en steril huva.- Expandera hUC-MSC i 75 cm2 odlingsflaskor till tidiga passager (1 – 3 maximum).
Obs: Huc-MSC bör vara 70% konfluenta på dagen för deras infusion i möss. - Tvätta cellerna med 10 mL steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid rumstemperatur.
- Tillsätt 2 mL trypsin och inkubera cellerna vid 37 ° c i ca 1 min, tills de börjar lossas.
- Neutralisera trypsin genom att tillsätta 8 mL hUC-MSC komplett medium som innehåller 10% foster bovint serum (FBS).
- Samla cellerna genom centrifugering vid 350 x g i 10 min.
- Omsuspendera pelleten i steril saltlösning och räkna cellerna med en Bürkerkammare. Förbered cellsuspensionen för infusion genom att späda cellerna till en slutlig koncentration av 2,5 x 105 i 200 μl steril saltlösning per mus. Förbered en överflödig cellsuspension för att säkerställa att det finns tillräckligt med volym för infusion av alla möss.
- Förvara cellerna på is före infusionen. Inom några timmar, som beskrivs i avsnitt 3,3.
- Expandera hUC-MSC i 75 cm2 odlingsflaskor till tidiga passager (1 – 3 maximum).
- Anestesi
Obs: för att minimera risken för skador på mus svans ven under injektionen får musen inte röra sig. Därför anestesi har föredragit över enkla mus hindra.- Anesthetize möss med 4% isofluran inandning i en induktions kammare.
- Övervaka musen andning. Andningsfrekvensen blir något långsammare. Efter några minuter, nypa en av mus fötterna för att kontrollera om ordentlig anestetization.
- Infusion av svans ven
- När medvetslöshet har bekräftats, Placera musen under en steril huva för aseptiska hUC-MSC intravenös infusion.
- Underhåll allmän anestesi hela experimentet via en ansiktsmask med ett kontinuerligt flöde av 1,5% isofluran.
- För att främja vasodilatation och möjliggöra en lättare injektion, blöt mus svans i varmt vatten för 2 min.
- Blanda cellsuspensionen genom att försiktigt Pipettera för att se till att cellerna inte bildar klumpar. Aspirera 200 μL i en 1 mL spruta med en 26 G nål, undvika bubbelbildning.
- Håll mus svans av spetsen och försiktigt räta den.
- Lokalisera den laterala venen av musen svans; skrapa försiktigt med en skalpell och torka av den med 70% etanol.
Obs: försiktigt skrapning av svansen utförs för att ta bort hår, vilket gör injektionsstället smidigare och renare. - Med början från den distala delen av svansen, sätt in nålen i venen i en 15 ° vinkel och sakta ingjuta 200 μL av hUC-MSC eller steril saltlösning (fordonskontroll) (figur 1b).
- Övervaka den framgångsrika intravenösa infusionen genom att vätskan kommer in i venen utan resistens och av brist på extravasering. Vänta några sekunder tills hela volymen färdas nerför nålen och ta sedan bort den från venen.
- För att förhindra blödning, Tryck kort på posten såret med en steril gasväv.
- Kassera sprutan och injektionsnålen på ett säkert sätt efter infusionen.
- Djur återvinning
- Placera den infunderade musen på sin sida på en värmedyna för återhämtning.
- Övervaka musen andning och observera musen tills den börjar röra sig och återfår sternala vilo och fullt medvetande.
- När det bekräftas att musen är i gott skick, returnera den till den ursprungliga buren. Returnera den inte till företaget med andra djur förrän den har återhämtat sig helt.
- Undersök möss för 24 h efter svans venen infusion och varannan dag, att övervaka deras hälsostatus och upptäcka eventuella lidande eller patologiska tecken tidigt.
4. organ explantat och vävnads behandling
- Offra mössen vid dag 8, 14 eller 21 efter bleomycin-administreringen (figur 1c) genom överdosering av injicerbart bedövningsmedel.
- Punktskatter på luftstrupen och lungorna och omedelbart tvätta dem i iskall PBS.
- Snap-Freeze rätt lungor i flytande kväve och förvara dem vid-80 ° c för en efterföljande molekylär analys10.
- Blås upp de vänstra lungorna med 4% PARAFORMALDEHYD och fixera dem i 10% neutral-buffrad formalin lösning för 24 h; sedan, torka dem i graderad alkohol-serien, rensa dem i xylen, och bädda in dem i paraffin10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lung skada inducerades av en enda endotrakealinjektion av 1,5 U/kg kroppsvikt av bleomycinsulfat i 100 μL steril saltlösning. Kontrolldjuren fick en endotrakeal injektion med en likvärdig volym saltlösning. Två skott av hUC-MSC (2,5 x 105 i 200 μl av steril saltlösning) infunderas i musen svans ven, 24 h och 7 dagar efter bleomycin administrering. Kontrolldjuren fick en intravenös infusion av en likvärdig volym steril saltlösning. Möss offrades för lung explantat och vävnads behandling vid dag 8, 14 och 21 efter bleomycin-administreringen (figur 1).
Vi visade att en direkt instillation av bleomycin i mus luftstrupen tillät en snabb diffusion ner till lungorna, vilket resulterar i omfattande inflammation, progressiv fibros, och en snedvridning av deras normala arkitektur, konsekvent med tidigare studier 11. lung histopatologiska förändringar bedömdes av hematoxylin-eosin (H & E) och picrosirius rödfärgning10, och fibros bekräftades av ett ökat hydroxyprolininnehåll och kollagen deposition (figur 2). Inflammatoriska förändringar i vävnad bedömdes av en histologisk poängsystem baserat på den inflammatoriska infiltrationen runt bronkioler, bronker, och blodkärl, och interstitiell lunginflammation observerades i hematoxylin-eosin färgade lungor avsnitt10. Efter bleomycin-injektionen ökade Ashcroft-poängen för lung sektioner successivt från ett medelvärde på 1,5 vid dag 8 till ett medelvärde på 4,5 vid dag 14 och av 6,5 vid dag 2110. Den dubbla infusionen av hUC-MSC i mus svans ven i stort sett försvagade bleomycin-inducerad lungskada, med signifikant minskning, även om inte fullständig upphävande, av både den inflammatoriska infiltration och omfattningen av fibros vid varje tidpunkt ( Figur 2). Immunofärgning med specifika antikroppar10 visade att infunderas Huc-MSC snabbt och effektivt nådde mus lungor, även om endast ett fåtal celler upptäcktes, med ett minskande antal från dag 8 till dag 21 (figur 3). Som tidigare rapporterat12, dessa data tyder på en snabb förskjutningar av cellerna från platsen för skadan, trots deras långvariga skyddande effekt. Immunohistokemi (IHC) färgning av hUC-MSC utfördes, även i saltlösning-behandlade prover, men ingen cell kunde upptäckas, med tanke på avsaknaden av inflammatoriska Foci locka hUC-MSC.
Figur 1: schematiskt av experiment protokollet. (A) möss fick en endotrakeal (e.t.) injektion av 1,5 U/kg kroppsvikt av bleomycin för att inducera lungskada (dag 0). (B) en dubbel intravenös (i.v.) infusion av 2,5 x 105 humana mesenkymala stromaceller som erhållits från hela navelsträngen (Huc-msc) utfördes 24 timmar (dag 1) och 7 dagar (dag 7) efter administrering av bleomycin. (C) en tidslinje för injektioner och stunder av uppoffring visas här. Möss grupper offrades vid dag 8, 14, och 21 efter bleomycin administrationen (dvs 24 h, 7 dagar, och 14 dagar efter den andra hUC-MSC infusion, respektive). Denna siffra har modifierats från Moroncini et al. 10. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: hUC-MSC downreglera bleomycin-inducerad lunginflammation och fibros. (A och B) Representativa mikroskopiska bilder (10X förstoring) av hematoxylin-eosin (H & E) och picrosirius rödfärgning av lung sektioner erhållna från C57BL/6 möss, 21 dagar efter endotrakealinjektion av steril saltlösning (saltlösning) eller bleomycin (bleomycin), senare också följt av en intravenös infusion av hUC-MSC (bleomycin + hUC-MSC) eller steril saltlösning (bleomycin + saltlösning). Saltlösning kontroller visat normal lung arkitektur. Utbredda inflammatoriska infiltrat observerades 21 dagar efter bleomycin skadan, med en allvarlig snedvridning av lung arkitektur och bildandet av fibrotiska Foci. Bleomycin-inducerad förändringar var signifikant försvagades av hUC-MSC behandling men inte med saltlösning. (C) Hydroxyprolin innehåll vid dag 8, 14 och 21 i LUNGORNA av C57BL/6 möss som fick ovannämnda behandlingar. Resultaten är medelvärdet ± SD (n = 8 per grupp), uttryckt som en procentandel av det värde som erhålls från endotrakeal saltlösning-behandlade möss och är representativa för tre oberoende experiment. *P < 0,05, * *p < 0,01, jämfört med bleomycin-behandlade möss. (D) mus Col1A1 uttrycks nivåer i hela lungan mRNA erhålls vid dag 8, 14, och 21 från C57BL/6 möss som fått ovannämnda behandlingar. Resultaten är medelvärdet ± SD (n = 5 per grupp) och är representativa för tre oberoende experiment utförda i triplicate. *P < 0,05, * *p < 0,01, jämfört med bleomycin-behandlade möss. Denna siffra har modifierats från Moroncini et al. 10. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: detektion av hUC-msc i lungvävnad. (A och B) representativa mikroskopiska bilder (200x respektive 400x förstoring) av immunofärgning med anti-HLA-1-antikroppar från lung sektioner erhållna från C57BL/6 möss som fick endotrakeal bleomycin följt av intravenös hUC-MSC. De röda pilarna indikerar positivt färgade hUC-MSC. (C) humant GAPDH bedömt av kvantitativ realtid polymeras kedjereaktion (PCR) analys i hela mRNA utvinns ur odlade Huc-MSC före infusion (infunderas Huc-msc) eller från lungvävnad vid dag 8, 14, och 21 av C57BL/6 möss som fick endotrakeal och därefter av intravenös hUC-MSC (bleomycin + hUC-MSC). Resultaten är medelvärdet ± SD (n = 5 per grupp) och är representativa för tre oberoende experiment utförda i triplicate. Notera, källan till mänskliga GAPDH avskrift i detta experimentella protokoll kan tillhandahållas uteslutande av intravenöst infunderas hUC-MSC. Denna siffra har modifierats från Moroncini et al. 10. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Endotrakeal administration är den förmåns väg för att leverera exogena agenter i lungorna. Sedan flera år, direkt injektion av bleomycin i luftstrupen har använts i stor utsträckning för att inducera pulmonell fibros13 och, nyligen, mer avancerade, noninvasiv teknik har utvecklats för att uppnå detta14,15 ,16.
Den metod som beskrivs här ger flera meningsfulla fördelar jämfört med vissa potentiella begränsningar. Injektion av luftstrupen kräver en kirurgisk intervention, bär med sig potentialen för komplikationer som orsakas av själva förfarandet, tillsammans med behovet av djupa djur sedering. Därför behövs bra förberedelser och övning i att finslipa proceduren. Förutom, för att minimera mus lidande, är det absolut nödvändigt att fastställa lämplig dos av bedövningsmedel enligt musen stam och till den individuella responsen och att upprätthålla en noggrann observation av djurens sedering tillstånd. Ändå observerade vi en mycket låg dödlighet och optimal djur återhämtning från anestesi. Ketamin och xylazin kan användas för anestesi, samt tribromoethanol. Emellertid, hos möss, den effektiva dosen av ketamin och xylazin är nära den dödliga dosen; Sålunda, de kan lätt framkalla en andningsstillestånd. Omvänt, tribromoethanol dosering kan lätt justeras och är, sålunda, en föredra bedövningsmedel. Efter endotrakealinjektion av bleomycin i luftstrupen, vi observerade inte några negativa effekter. Mössen var fria från feber och inga tecken på inflammation eller infektion observerades runt luftstrupen och hud såret. Därför fanns det inget behov av antibiotikaprofylax. Dessutom säkerställer användningen av ett operativ Mikroskop ett stort förtroende för framgång genom att låta operatören att noggrant övervaka korrekt placering av nålen i musen luftstrupe före instillation, vilket minimerar risken för att skada den.
Endotrakeal injektion av bleomycin resulterar i en potent inflammatorisk och fibrotisk respons i båda lungorna och kan ses som en robust metod för att generera experimentella musmodeller av mänskliga interstitiella lungsjukdomar (ILD). Men, som tidigare dokumenterade7, fibrotiska svar på bleomycin hos möss är stam-beroende och kön-och åldersrelaterade. Därför är det avgörande för framgången med protokollet att hitta den tolerabla dosen av bleomycin i varje experimentell miljö. Honmöss användes i denna studie eftersom det huvudsakliga intresset för denna forskning var interstitiell lungsjukdom associerad med systemisk skleros, vilket är en sjukdom som i stor utsträckning förekommer hos unga vuxna kvinnor. Tre-till fyra månader gamla möss valdes eftersom detta är den ålder då de bara in i vuxen fasen (möss uppnår sexuell mognad vid 8-12 veckors ålder)17. Därför anses de vara unga vuxna möss och är att föredra framför yngre djur, eftersom lungfibros inte är vanligt hos mycket unga individer. De är också att föredra framför äldre djur sedan tidigare studier18 har visat att åldern möss uppvisade förändringar i lung fibroblast fenotyp, vilket leder till en ökad känslighet för förfall och fibros efter lungskada, som kan representera en möjlig bias i den experimentella modell som presenteras här.
Svans venen infusion är en enkel, pålitlig, och noninvasiv sätt att säkerställa snabb och effektiv leverans av läkemedel till blodomloppet. Den kan enkelt utföras med enkel medicinsk utrustning, kort manuell träning och sänkta kostnader.
Det experimentella protokoll som beskrivs här, modifierad från tidigare publicerade studier19,20,21, finns i en dubbel intravenös infusion av 2,5 x 105 Huc-MSC för att förbättra cellengrafet i musen lungorna och deras terapeutiska effekt. I själva verket, eftersom förfarandet är icke-traumatiskt, det kan upprepas i samma djur, men en period av 7 dagar mellan två på varandra följande injektioner rekommenderas, för att möjliggöra gottgörelse av eventuella av sår. Dessutom använde vi isofluran inandning för att söva C57BL/6 möss under förfarandet, för att undvika svans ven skada i händelse av plötsliga djur rörelser.
Sammanfattningsvis, detta protokoll har tillämpats framgångsrikt för att effektivt framkalla lungfibros i C57BL/6 möss och att validera in vivo antifibrotisk effekt av Huc-MSC. Denna metod kan också användas för att administrera läkemedel eller agenter än bleomycin in i luftvägarna, för att generera olika experimentella modeller lungsjukdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag RF-2011-02352331 från Ministero Italiano della Salute (till Armando Gabrielli).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| C57BL/6 mice | Charles River | Jax Mice Stock n. 000664 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol (Avertin) | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| Barraquer Micro Needle Holder | Lawton | 62-3755 | |
| Bleomycin sulfate | Sigma-Aldrich | B1141000 | |
| Bürker chamber | Brand | 718905 | |
| Culture Flasks | EuroClone | ET7076 | |
| Disposable razors | Unigloves | 4080 | |
| Dissecting Forceps | Aesculap Surgical Instruments | BD311R | |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | |
| Heating pad | 2Biological Instruments | 557023 | |
| Isoflurane Vet | Merial Italia | N01AB06 | |
| Operating Microscope | Carl Zeiss | Model OPM 16 | |
| TrypLE Select Enzyme | Gibco | 12563-029 | |
| Vannas Micro Scissors | Aesculap Surgical Instruments | OC498R | |
| Vicryl Plus 4/0 Absorbable Suture, FS-2 needle 19 mm | Ethicon | VCP392ZH |
References
- Iudici, M., et al. Where are we going in the management of interstitial lung disease in patients with systemic sclerosis? Autoimmunity Reviews. 14 (7), 575-578 (2015).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M.
- Mouratis, M. A., Aidinis, V. Modeling pulmonary fibrosis with bleomycin. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 17 (5), 355-361 (2011).
- Moeller, A., Ask, K., Warburton, D., Gauldie, J., Kolb, M. The bleomycin animal model: a useful tool to investigate treatment options for idiopathic pulmonary fibrosis? International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 40 (3), 362-382 (2008).
- Moore, B. B., et al. Animal models of fibrotic lung disease. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (2), 167-179 (2013).
- Schrier, D. J., Kunkel, R. G., Phan, S. H. The role of strain variation in murine bleomycin-induced pulmonary fibrosis. American Review of Respiratory Disease. 127 (1), 63-66 (1983).
- Phan, S. H., Kunkel, S. L. Lung cytokine production in bleomycin-induced pulmonary fibrosis. Experimental Lung Research. 18 (1), 29-43 (1992).
- Capelli, C., et al. Minimally manipulated whole human umbilical cord is a rich source of clinical-grade human mesenchymal stromal cells expanded in human platelet lysate. Cytotherapy. 13 (7), 786-801 (2011).
- Beeravolu, N., et al. Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta. Journal of Visualized Experiments. (122), e55224 (2017).
- Moroncini, G., et al. Mesenchymal stromal cells from human umbilical cord prevent the development of lung fibrosis in immunocompetent mice. PLoS One. 13 (6), e0196048 (2018).
- Shahzeidi, S., Jeffery, P. K., Laurent, G. J., McAnulty, R. J. Increased type I procollagen mRNA transcripts in the lungs of mice during the development of bleomycin-induced fibrosis. European Respiratory Journal. 7 (11), 1938-1943 (1994).
- Lee, R. H., et al. Intravenous hMSCs improve myocardial infarction in mice because cells embolized in lung are activated to secrete the anti-inflammatory protein TSG-6. Cell Stem Cell. 5 (1), 54-63 (2009).
- Scotton, C. J., Chambers, R. C. Bleomycin revisited: towards a more representative model of IPF? American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 299 (4), L439-L441 (2010).
- Cai, Y., Kimura, S. Noninvasive intratracheal intubation to study the pathology and physiology of mouse lung. Journal of Visualized Experiments. (81), e50601 (2013).
- Thomas, J. L., et al. Endotracheal intubation in mice via direct laryngoscopy using an otoscope. Journal of Visualized Experiments. (86), e50269 (2014).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Dutta, S., Sengupta, P. Men and mice: Relating their ages. Life Sciences. 152, 244-248 (2016).
- Sueblinvong, V., et al. Predisposition for disrepair in the aged lung. American Journal of Medical Sciences. 344 (1), 41-51 (2012).
- Moodley, Y., et al. Human umbilical cord mesenchymal stem cells reduce fibrosis of bleomycin-induced lung injury. American Journal of Pathology. 175 (1), 303-313 (2009).
- How, C. K., et al. Induced pluripotent stem cells mediate the release of interferon gamma-induced protein 10 and alleviate bleomycin-induced lung inflammation and fibrosis. Shock. 39 (3), 261-270 (2013).
- Lee, R. H., et al. TSG-6 as a biomarker to predict efficacy of human mesenchymal stem/progenitor cells (hMSCs) in modulating sterile inflammation in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (47), 16766-16771 (2014).
