Summary
활성된 슬러지 입자의 형태와 크기는 다양 한 방법을 사용 하 여 측정 하는 중요 한 매개 변수. 부정확 비 대표 샘플링, 차선 이미지 및 주관적인 분석 매개 변수에서 발생 한다. 이러한 오류를 최소화 하 고 쉽게 측정, 우리는 오픈 소스 소프트웨어 파이프라인을 포함 하 여 모든 단계를 지정 하는 프로토콜을 제시.
Abstract
그 치료 폐수 등 실험적인 bioreactors 입자의 크기와 모양이 중요 한 매개 변수를 포함 합니다. 예를 들어 크기와 활성된 슬러지 flocs의 모양 수는 눈금에서 조건을 나타내고 슬러지는 헤어 청 징 제에서 침전 하는 얼마나 잘에 직접적인 영향을 합니다.
입자 크기와 모양 모두 misleadingly '간단한' 측정 있습니다. 많은 미묘한 문제가, 종종 비공식 프로토콜에 unaddressed 샘플링, 이미징, 및 입자를 분석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 샘플링 방법 편견 수 있습니다 또는 충분 한 통계적 인 힘을 제공 하지. 샘플 스스로 가난 하 게 유지 될 수 있습니다 또는 동원 정지 하는 동안 변경 받 다. 이미지는 충분 한 품질;의 않을 수 있습니다. 겹치는 입자, 분야, 확대율, 그리고 다양 한 잡음의 깊이 수 모든 결과가 가난한. 잘못 지정 된 분석 편견, 수동 이미지 임계 처리 및 시장 세분화에 의해 생산 등 발생할 수 있습니다.
경제성 및 처리량 재현성 함께 바람직한 있습니다. 저렴 한 가격, 높은 처리량 방법 더 자주 입자 측정, 입자의 수천을 포함 하는 많은 이미지를 설정할 수 있습니다. 저렴 한 시 약, 일반적인 해 현미경, 그리고 자유롭게 사용할 수 오픈 소스 분석 소프트웨어를 사용 하는 방법에 반복, 액세스할 수, 재현, 부분적으로 자동화 된 실험 결과 수 있습니다. 또한, 이러한 방법의 제품 잘 서식, 정의 그리고 데이터 분석 소프트웨어, 실험실 내에서 분석 및 실험실 사이 공유 하는 데이터를 완화 하 여 쉽게 이해할 수 있습니다.
우리는 이러한 제품을 생산 하는 데 필요한 단계를 자세히 설명 하는 프로토콜을 제시 포함: 샘플링, 샘플 준비 및 동원 정지 천, 디지털 이미지 수집, 디지털 이미지 분석과 실험 관련 그림 생성의 예는 분석 결과입니다. 우리는 또한이 프로토콜을 지원 하기 위해 오픈 소스 데이터 분석 파이프라인 포함.
Introduction
이 방법의 목적은 특히 활성된 슬러지 flocs 및 에어로빅과 립1 를 포함 하는 생물 반응 기에서 입자의 크기와 모양 분포를 결정 하기 위한 잘 정의 된, 반복, 그리고 부분적으로 자동화 된 방법을 제공 하는 , 2.이 방법은 뒤에 있는 근거 경제성, 단순, 처리량, 향상 하 고 우리의 기존 사내 프로토콜3,4, 반복성, 다른 입자 측정 및 공유를 용이 하 게 하 고 데이터의 비교입니다.
두 개의 광범위 한 카테고리의 입자 측정 분석-산란5같은 자질을 사용 하 여 직접 이미징 및 날개 식 방법 있다. 날개 식 방법과 자동화 될 수 있다 큰 처리량, 비록 장비는 비싸다. 더하여, 날개 식 방법을 정확 하 게 입자6의 동일한 크기를 확인할 수 있습니다, 하는 동안 그들은 제공 하지 않습니다 자세한 모양 정보7.
셰이프 데이터에 대 한 필요 때문에 우리는 기반으로 우리의 방법을 직접 영상. 높은 처리량 이미징 방법 몇 가지 존재 하는 동안 그들은 전통적으로 비싼 상용 하드웨어 또는 사용자 지정 구축된 솔루션8,9를 요구 했다. 우리의 방법은 일반적인, 저렴 한 하드웨어 및 처리량, 감소에서 고통 비록 많은 분석10에 필요한 최소 보다 훨씬 더 많은 입자 이미지를 생성 하는 소프트웨어를 개발 되었습니다.
중요 한 샘플링 및 이미지 수집 단계 기존 프로토콜 지정 하지 않을 수 있습니다. 다른 프로토콜 (예: ad hoc 임계 처리11) 주관적인 편견을 소개 하는 수동 단계를 지정할 수 있습니다. 자유롭게 사용할 수 있는 분석 소프트웨어와 결합 된 샘플링, 동원 정지 및 이미지 수집 단계를 지정 하는 잘 정의 된 메서드는 실험실 내에서 이미지 분석 및 실험실 비교 강화할 것 이다. 이 프로토콜의 주요 목표는 워크플로 및 동일한 샘플에 대 한 다른 실험실에서 재현 가능한 결과를 이끌어야 하는 도구를 제공.
이미지 분석 과정을 정상화, 외 인기 있는 데이터 분석 패키지13,14, 완화 실험이이 파이프라인에 의해 생성 하는 데이터 사용을 위해 적당 한 잘 정의 된, 잘 서식 파일12 에 기록 된 특정 분석 (예: 사용자 지정 그림 세대)와 연구소 간에 공유 촉진 데이터입니다.
이 프로토콜은 특히 입자 모양 데이터, 날개 식 방법에 대 한 액세스를 필요가 없습니다, 그들의 자신의 이미지 분석 파이프라인을 개발 하 고 그들의 데이터를 다른 사용자와 쉽게 공유 하고자 하고자 하지 않습니다 연구자에 대 한 제안
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Protocol
1. 입자 분석에 대 한 샘플을 수집
- 통계 분석10 에 대 한 충분 한 입자를 생산할 예정 이다 특정 원자로 대 한 샘플 볼륨을 결정 (> 500) 입자 중복을 피하고 있는 동안.
- 혼합된 액의 샘플 당 0.5 ~ 2 mL의 범위는 250와 5000 mg/l. 사이 혼합된 액 일시 중지 고체 (MLSS)와 활성된 슬러지 샘플에 대 한 충분 한 가정
- 그렇지 않으면, 3 테스트 한 천 배지 0.5, 2, 및 샘플 (2.7 통해 1.2 단계)의 5 mL을 사용 하 여 준비 합니다.
- 시각적으로 견적을 (해당 되는 경우) 샘플 볼륨 최고의 단계 1.1에에서 나열 된 조건에 맞는.
- 입자는 여전히 0.5 mL 샘플에 대 한 중복 추가 0.5, 1 및 2 mL의 인산 염 버퍼 식 염 수를 0.5 mL 샘플 단계 2.1 전에 희석 해야 합니다 결정을 희석 3 0.5 mL 샘플 1.1.2와 1.1.3 단계를 반복 합니다.
참고: 단계 1.1 − 1.1.4 실험 당 한 번 수행만 필요 또는 원자로 내용을 변경 등 후속 측정 더 이상 나열 된 기준을 충족 하는 경우에 1.1 단계.
- 잡아 ~ 40 mL 비 커 또는 50 mL 원심 분리기 튜브, 부드럽게 혼합 하 고 즉시 15ml 원심 관으로 잘 혼합된 잡아의 결정된 샘플 볼륨을 붓는에 의해 원자로의 잘 혼합된 부분에서 대표적인 샘플을 취득. 정한 단계 1.1.4 필요한 샘플을 희석.
참고: 프로토콜 일시 중지할 수 있습니다 여기 하 고 샘플 최대 48 시간 동안 냉장 (4 ° C)에서 저장 될 수 있습니다. 샘플을 동결 하지 않습니다.
주의: 일반적인 보존 미디어 (예: 포름알데히드/formamide) 적합 하지 않습니다. 오픈 컨테이너와 함께에서 접시의 큰 표면 영역 열 광원, 그리고 잠재적으로 가난 하 게 통풍이 현미경 설치 프로그램에서 이미지 품질에 작은 이익을 위해 불필요 하 게 위험 조건 생산.
2. 준비 스테인드, 고정 입자에의 한 천 배지
- 1% (w/v) 메 틸 렌 블루의 5 µ L 각 샘플을 다음 모자를 더하고 부드럽게 혼합 3 최소 시간에 반전. 실 온에서 30 분 더 이상 하지만 적어도 5 얼룩을 샘플 수 있습니다.
- 이온된 수 한 천 7.5% (w/v)의 샘플 당 약 10 mL를 준비 합니다.
참고: 한 천 미리 생산 고 소독 하는 경우에, 불명확 하 게 저장 될 수 있습니다. Agarose 대체 될 수 있습니다, 하지만 실질적으로 이미지를 개선 하지 않습니다. - 전자 레인지 또는 물 목욕을 사용 하 여 한 천 녹과 약간 사용 하기 전에 냉각 수 있습니다. 천이 완전히 녹아 쉽게 따른다 확인 합니다. 한 천의 단단한 소 품질 이미지 다르게, 얼룩 것입니다.
- 원심 분리기 튜브 6.5 및 9 mL 사이 총 튜브 볼륨을가지고 충분 한 녹은 7.5% (w/v) 한 전송.
- 원심 분리기 튜브를 개괄 하 고 부드럽게 혼합을 3 번 이상 반전.
- 자신을 멀리 또는 후드 모자를 가리키는 동안 뚜껑을 엽니다. 관 내용을 부드럽게 흔들어 전체, 부드러운 코팅과 입자의 시각적으로 균일 한 분포를 달성 하기 위해 요리 100 m m 플라스틱 페 트리 접시에 붓으십시오.
주의:는 agar에서 열 튜브에 약간의 압력을 생성할 수 있습니다. 이 종종 가청 히스를 생성 하 고 뜨거운 agar의 작은 방울을 추방 하는. - 접시는 agar 굳은 때까지, 5 분 이상 실 온에서 냉각 수 있습니다.
참고: 프로토콜 수 있습니다 수 일시 중지 여기. 스토어 도금 거꾸로 하 고 냉장 (4 ° C)에서 최대 48 시간 동안 (예, 봉인 비닐 봉지에에서 또는 파라핀 영화) 밀봉.
3. stereomicroscope와 디지털 카메라를 사용 하 여 입자 이미지 획득
- 10 x 20 x 확대를 할 수는 stereomicroscope의 현미경 스테이지 발견된 격판덮개 얼굴을 놓습니다. 심지어, 확산 조명 LED 조명 스탠드 또는 가벼운 접시 같은 장비를 사용 하 여 샘플을 아래에서 밝히는.
- 오픈 이미지 캡처 소프트웨어, 사진, 현미경 빛 경로 설정 되어 있는지 확인 하 고 카메라 목록에서 적절 한 카메라 클릭 합니다.
- 나타나도록 여러 입자 초점면에 소프트웨어에 큰, 잘 정의 된 가장자리와 현미경을 조정 합니다. 10-20 x의 확대를 사용 하 여 상대적으로 깊은 초점 평면을 유지 하면서 입자를 측정.
- 일시적으로 한 천 배지를 제거 하 고 무대에는 마이크로미터를 놓습니다. 마이크로 미터에 눈금 표시 이미지 캡처 소프트웨어에 크게 집중 될 때까지 잘 초점을 조정 합니다.
- 이전 보정 하는 경우 현재 배율에 대 한 마이크로 비율에 있는 픽셀을 기록 합니다.
- 클릭 하 여 확대/축소를 100%로 설정 확대 > 실제 크기 를 선택 하 고 옵션 > 보정 다음 0 및 200 µ m 졸업식에 중심 수직 막대는 마이크로 미터의 긴 축 따라 주요 뷰포트에서 빨간 교정 바 정렬. 보정 대화 상자에서 현재 확대 수준과 200 µ m의 실제 길이 입력 합니다.
- 만약 이미 보정 메뉴 모음에서 선택 확대 하 고 선택 현재 확대율 레벨 보정을 확인.
- 선택 측정 > 라인 > 임의의 선. 0 졸업은 마이크로 미터의 긴 축 교차 클릭 하십시오. 200와 긴 축에 교차로에서 다시를 클릭 합니다. A 정확한 교정 표시 약 200 µ m. 삭제 선을 그것을 눌러 삭제를 클릭 하 고 확인 상자에서 예 를 누르면.
참고: 카메라 및 교정 선택에 대 한 지시는이 하드웨어를 위해 사용 되는 소프트웨어를 특정. 비슷한 기능 다른 이미징 소프트웨어에서 사용할 수 있어야. 목표는 미크론 비율 정확한 입자 크기 측정에 대 한 이미지의 픽셀을 결정 하는.
- 선택 측정 > 라인 > 임의의 선. 0 졸업은 마이크로 미터의 긴 축 교차 클릭 하십시오. 200와 긴 축에 교차로에서 다시를 클릭 합니다. A 정확한 교정 표시 약 200 µ m. 삭제 선을 그것을 눌러 삭제를 클릭 하 고 확인 상자에서 예 를 누르면.
- 한 천 배지를 장착 하 고 이미징 소프트웨어에 최대 세부 사항을 달성 하기 위해 정밀한 초점을 조정.
- 최대 이미지 품질 달성 이미징 소프트웨어를 조정 합니다.
- 비트 깊이 카메라 사이드바의 비트 깊이 패널에서 라디오 버튼을 선택 하 여 허용 되는 최대 값을 늘립니다. 카메라 사이드바의 색상/회색 패널에서 적절 한 라디오 단추를 선택 하 여 회색 음영 이미지를 수집 하는 소프트웨어를 설정 합니다.
- 노출과 히스토그램 사이 모든 오픈 사이드바 패널을 축소 합니다. 1.0으로 이득을 감소 하 고 깨끗 한 이미지에에서 나타납니다 뷰포트 히스토그램 히스토그램 상자의 양쪽 끝으로 잘립니다 하지 배포로 나타날 때까지 때까지 노출을 증가.
- 피하기 위하여 히스토그램과 부족을 조정 합니다. 카메라 측면 표시줄의 막대 그래프 패널에서 최저 값 밖에 그냥 히스토그램의 왼쪽된 경계 및 높은 값 밖에 그냥 오른쪽 경계를 밀어.
- 저장 이미지는 압축 되지 않은 TIFF이미지 메타 데이터에 배율 정보를 포함 하 여, 사용 하는 파일 > 다른 이름으로 저장 TIFF 형식을 선택 하 고 되도록 교정 정보 저장 상자 대화 상자 확인 합니다.
참고: 저장 공간 보정을 포함 하는 이미지 메타 데이터 수집 프로그램 간에 달라질 수 있습니다. 피지15, 파이프라인에 의해 사용 하는 기본 소프트웨어 가장 일반적인 이체를 이해 한다. 중요 한 정보를 기록 하는 픽셀 높이, 너비, 및 관련된 장치입니다. - 어느 모바일 단계를 사용 하 여 또는 수동으로 접시 자체를 이동, 이전 이미지를 왼쪽에서 오른쪽과 오른쪽에서 왼쪽으로 사이 격판덮개; 아래로 이동 하는 경로 다음 중복 되지 않는 다른 지역 선택 로 알려진 ' lawnmower 검색 무늬 '. 3.6 단계를 반복 하 여 충분 한 이미지 캡처 적어도 500 시각적으로 예상된 입자, 더는 더 나은 생산 됩니다.
참고: 대안 패턴 (예:., 원형, 임의의) 허용 하지만 보고 되어야 한다. 디지털 봉합 생산 통해 모자이크에 조합에 대 한 여러 개의 겹치는 이미지 획득 결과 파일 크기는 크게 다운스트림 처리와 바느질에서 유물을 방해 소개 될 수 있습니다 하 고 현재 권장 되지 않습니다. - 잠재적인 후속 이미징에 대 한 이미지 분석 후 때까지 접시를 유지 합니다. 마지막 영상, 후 생물 폐기물에 대 한 적절 한 폐기.
4. 측정 하 고 분석 하는 입자 실루엣
- 필요한 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 설치
- 피지를 설치 (지침에 국립 보건원의 ImageJ v1.52e의 향상된 된 버전: https://imagej.net/Fiji/Downloads
- 지침에 따라 이미 존재 하지 않을 경우 git를 설치: https://git-scm.com/downloads
- Git 저장소16을 복제 하 여 입자 분석 코드를 취득 합니다.
- 명령줄에 입력 하 여 코드의 최신 버전을 검색:
git 클론 https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis.git- 분석 코드 다음 README.md 텍스트 파일에 있는 지침은 복제 저장소의 최상위 디렉터리에 설치 합니다.
참고: git을 사용 하는, 최신 버전의 코드를 자동으로 검색 됩니다. Git를 사용할 수 없는 경우 그것은 또한에서 릴리스 페이지에 zip 파일로 코드 다운로드 수: https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis/releases
- 분석 코드 다음 README.md 텍스트 파일에 있는 지침은 복제 저장소의 최상위 디렉터리에 설치 합니다.
- 명령줄에 입력 하 여 코드의 최신 버전을 검색:
- 선택적 매개 변수와 함께 처리 하는 디렉터리를 나열 하는 텍스트 파일을 편집 합니다. 매개 변수 및 예제 목록에 대 한 예/분석 하위 디렉터리를 참조 하십시오.
- 입력 하 여 명령줄에서 분석을 실행 합니다.
< 피지-경로 > \ImageJ-win64.exe-콘솔-매크로 SParMorIA-SludgeParticle_Morphological_Image_Analysis < paramsfile >
여기서 < 피지-경로 > ImageJ win64.exe가 있는 디렉토리와 < paramsfile > 분석 설치를 설명 하는 텍스트 파일의 위치는
참고: 실행 파일의 이름을 달라질 수 있습니다, 따라서 운영 체제 피지에 설치. 수와 이미지의 크기에 따라 분석 시간 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다 그리고 자동으로 실행 됩니다. - 품질 관리 검사를 수행
- 지정 된 출력 디렉터리의 오버레이 하위 디렉터리에 있는 품질 관리 파일을 검사 합니다. 스 퓨 리 어스, 누락, 그리고 저조한 캡처된 입자, 모든 배경 일치 하지 않는 회색된 윤곽선으로 명백한 이미지 note 같은 예제 그림 3 을 참조 하십시오. 입자 자료는 이제 실험 관련 분석 그림 생성에 대 한 준비.
- 유명한 파일 및/또는 입자 무시 하 Id 분석 코드에 지정 하 여 전체 접시 또는 개별 입자를 거부 합니다. 예제/검열 관련 연구 및 Python 코드 저장소에서를 참조 하십시오.
- 각 이미지에 지정 된 출력 디렉터리의 결과 하위 디렉터리에 깔끔한12 쉼표로 구분 된 텍스트 파일 저장에 대 한 이미지 분석 결과 사용 하 여 실험 구체적인 수치를 생성 합니다. 결과 파일을 읽는 방법의 예제를 보려면 예제/인물/R 및 예/인물/파이썬 하위 디렉터리를 참조 하십시오.
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Representative Results
생성 된 파일
그림 1 에 나와 있는 프로세스 분석 이미지 당 두 개의 파일을 생산할 예정 이다. 첫 번째 파일은 쉼표로 구분 된 값 (CSV) 텍스트 파일 개별 입자에 해당 하는 각 행과 열 영역, 순환 성, 견고성 등 다양 한 입자 통계 설명 ImageJ 수동17에 정의 된. 예제 CSV 파일 추가 정보 및 예제/데이터 디렉터리에 포함 됩니다.
그림 1: 프로토콜의 4 개 주요 단계를 설명 하는 그래픽 워크플로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
두 번째 파일 GIF 이미지 파일을 오버레이 그림2 원래 식별 반투명 지역 대표 이미지 입자와 품질 관리 (QC)에 사용 하기 위해 만들어진 것입니다. 입자 식별 및 세그먼트화의 품질 신속 하 게 수동으로 평가 다음 수 있습니다. 입자 임계 처리 방법 이지만 완벽 한18, 그림 2 는 수락 가능한 결과의 한 예로 제공 됩니다. 품질 이미지 탈환, 하거나 충분 한 데이터를 사용할 수, 단순히에서 제거 추가 처리 될 수 합니다.
그림 2: 품질 관리 (QC) gif 이미지 분석 파이프라인에 의해 생성의 예. 주요 이미지 15 x의 확대입니다. 발췌는 디지털 이미지에서 개별 입자를 식별 하는 숫자를 표시 하도록 확대 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
QC 이미지를 평가할 때 가지 세 가지 일반적인 오류 발견
1. 입자 경계에 정확 하 게 준수 하는 실패
2입니다. 입자를 식별 하기 위해 실패
3. 유물 포함을 인해: 비 입자 구성 요소 (예: 거품), 또는 임계 처리에서 오류
이 오류의 예는 그림 3에서 설명 됩니다. 불 쌍 한 입자 경계 식별 및 세그먼트화 종종 입자 사이 그림 3a에서보듯이-죽음의 결과 이다. 불 쌍 한 조명 입자 (그림 3b, 파란색 단색 원)와 인 위 거짓 입자 (그림 3b, 빨간 점선된 원) 식별 하 두 실패 발생할 수 있습니다. 비 입자 문제가, 거품, 원생 동물, 균 류, 등 metazoans, 같은 그림 3 c에서 tardigrade 또한 가짜로로 식별할 수 있습니다 입자.
그림 3: 품질 관리 분석 하는 동안 검색 하는 일반적인 오류. (한) 불 쌍 한 입자 경계 탐지. (b) 스 퓨 리 어스 입자 (빨강 파선된 타원) 그리고 돌아가려면된 입자 (블루 솔리드 타원). (c) 비-이물질 개체입니다. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
전체 이미지를 거부 하는 것이 쉽습니다. 그러나, 그것은 품질 관리 이미지에 입자 식별자를 사용 하 여 (그림 2, 삽입) 개별 입자를 거부 하. 이 방식은 특히 유용 문제 (비 입자 포함) 등 기타 유용한 이미지에서의 경우 그림 3 c. 예 하의 이렇게 재현할 수 및 보고 방식에 포함 됩니다 github 저장소의 예제/검열 디렉토리.
작은 최소 직경 지정 된 경우 (< 10 픽셀), 이미지 노이즈를 가짜로 입자로 식별 될 수 있습니다. 이러한 경우에, 이미지 수 여전히 허용 있을 수 있습니다 추가 다운스트림 분석은 제거 하는 때 그들의 존재. 미만 ~ 200 픽셀19의 입자를 구성 하는 경우으로 셰이프 데이터 회의론으로 처리 한다.
그림 세대
이미지 분석에서 결과 CSV 파일 깔끔한12 및 수 있습니다 쉽게 결합 하 고 분석 연구원의 선호 하는 소프트웨어 패키지에 (ggplot2와 파이썬 또는 dplyr22 seaborn21 팬더20 같은23 r에서). 그러나, 필요한 정확한 그림 유형 연구 질문 및 결과 반드시 달라 집니다. 가능한 그림의 예 (그림 4) 아래 포함 되어 있으며 CSV 파일에서 그것을 생성 하기 위해 해당 코드를 사용할 수 github16에.
그림 4: 실험 관련 그림 이미지 파이프라인에 의해 생성 하는 CSV 데이터에서 생성의 예. 이 예제에서는 시간이 지남에 따라 두 실험 원자로 사이 입자 분포는 표시 하 고 연구원에 의해 질적 메타 데이터와 결합. 생성 코드 및 데이터에 대 한 예/인물/R을 참조 하십시오. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
이미지 분석 시스템은 상당히 강력 하 고 불 쌍 한 이미지 제거 되도록 품질 관리 조치는, 비록 샘플링, 접시 준비, 및 이미지 수집에 특정 문제에 적절 한 관심을 향상 시킬 수 모두 데이터의 정확도의 비율 이미지 품질을 전달 합니다.
샘플링 농도
대표 하는 샘플 촬영 되었습니다 가정, 가장 중요 한 단계는 충분 한 입자는 입자 겹치는 그리 집중 하는 동안 대표9 와 효율적인 분석을 위한 존재입니다.
이 총 중단된 한 고체의 넓은 범위에 약 0.5 ~ 2 mL의 혼합된 액에 대응 있다 하지만 실험 관련 결정 할 수 있습니다. 지나치게 집중의 예는 지나치게-희석, 그리고 적절 한 입자 농도 기준으로 그림 5 에 나와 있습니다. 얼룩은 또한 영향을 입자 농도. -희석 지나치게 스테인드, 모호한 입자 밑 희석 최적의 임계 처리에 대 한 충분 한 대비와 입자를 생산 하지 않을 수 있습니다 발생할 수 있습니다.
그림 5: 참조 이미지 표시 입자 농도 너무 집중, 허용, 및 지나치게 희석. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
염료 농도
얼룩 샘플에 추가 금액은 중요 하 고 정확한 금액 sludges 사이 다를 수 있습니다. 샘플의 0.5 ~ 2 mL 당 1% (w/v) 메 틸 렌 블루의 약 5 µ L '출혈'과 입자의 모양을 왜곡 없이 임계 처리에 대 한 충분 한 대비를 제공 합니다.
거기는 아무 단일 이상적인 농도; 명암과 선명도 사이의 균형을 선택 해야 합니다. 그림 6 에서는 슬러지의 2 mL 당 1% 메 틸 렌 블루의 5, 25 및 50 µ L로 얼룩진 3 샘플에서이 거래를 보여 줍니다. 이 거래와 무게 때 가끔 저조한 대조 입자 (그림 6a) 이다 선호 제대로 확인할 blob (그림 6c).
그림 6: 증가 얼룩 농도 입자 대비 향상 하지만 관찰된 경계 왜곡. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
플레이트 스토리지
동원 정지, 후 적어도 3 일 동안 냉장 (4 ° C)에서 접시를 저장할 수 있습니다. 이것은 보수 기간 동안 그것은 성장과 염료 확산 오염 발생 합니다. 접시 아래에 설명 된 문제를 표시 하지 아직도 3 일 후에 몇 군데 있습니다. 너무 오랫동안 저장 하는 경우 기존 입자 수 있습니다 계속 성장 하 고 것입니다 그림 7a에서 볼 수 있는 얼룩의 색조를 유지 하면서 다른 입자의 초점면에 나타납니다. 곰 팡이 포자와 같은 표면 오염 물질 또한 스토리지의 긴 기간 후에 성장할 수 있습니다. 이들은 일반적으로 얼룩의 색상을 차지 하지 것입니다 하 고 그림 7b에서 볼 수 있듯이 다른 초점 평면에 나타납니다. 경우에 따라 자라 난 또는 얼룩의 발생 여부 불분명, 같은 그림 7b의 아래와 그림 7 c의 센터 이다. 원인에 그 등 접시는 그것의 유용한 수명을 넘어 세 표시
그림 7: 참조 이미지 자라 난 접시의 유용한 수명을 넘어 저장 된 신호를 보여주는. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
접시 준비
육체적으로 준비 하는 한 천 배지-지나치게 두꺼운 천 및 과도 한 소용돌이와 관련 된 두 가지 문제가 있다. 첫 번째 경우 (그림 8), 입자 대부분 초점에 입자의 이미지를 취득 하 고 어려운 다양 한 깊이에 중단 될.
그림 8: 과도 한 양의 agar 사용 하 여 모호한 입자 결과로 초점면 보다 두꺼운 샘플을 생산할 예정 이다. 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
두 번째 경우에서 접시의 다른 섹션에서 결과 바이어 싱 입자 (그림 9a)의 비 균등 분포를 생성 소용돌이 (그림 9b, c. 일반적으로, 더 이상 7 mL agar의 100 mm 페 트리 접시를 커버 하는 데 필요한 하 고만 부드러운 손 동작 균등 하 게 요리를 커버 하는 데 필요한.
그림 9: 접시 준비 하는 동안 지나치게 격렬 한 소용돌이 비 균일 입자 분포 (a), 바이어 싱 쪽으로 더 큰 (b)와 (c) 입자 작은 접시의 섹션으로 표시 됩니다. 접시는 100 밀리미터 직경, 현미경 확대 15 x. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
현미경 이미징
품질에 영향을 미치는 두 가지 주요 이미지 수집 문제 있다. 첫 번째 문제는 대부분 입자의 초점면에 있는 보장 합니다. 낮은 확대에 조차 많은 활성된 슬러지 입자의 크기는 조 악한 초점을 약간 조정 없이 많은 입자 것 약간 초점, 부정확 한 입자 측정을 소개. 이미지가는 100% 완벽 하 게 초점을 맞춘 입자; 포함 됩니다. 그림 8 및 그림 5b 가난 하 고 수락 가능한 초점의 각각 예입니다.
노출 수준 구성 두 번째 주요 문제. 손실 된 데이터와 가난한 세분화11이미지 결과 제대로 노출. 또한, 염료의 고대비 데이터의 유효 동적 범위 감소, 좁은 막대 그래프를 생성할 수 있습니다. 불 쌍 한 노출 방지와 동적 범위를 증가 하는 이미지를 캡처 전에 히스토그램의 상위 및 하위 범위를 조정할 수 있다. 예의, 아래, 그리고 허용 노출 포함 됩니다 아래 그림10에서.
그림 10: 참조 이미지 보여주는 가난 하 고 허용 이미지 노출입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 방법의 장점은 그것 제공 하는 전체 프로세스를 포괄 하는 특정 조건입니다. 또한, 우리는 소프트웨어 파이프라인 내에서 실험실 분석을 완화 하 고 추진 연구실 사이 비교 데이터 제공. 이 방법의 주요 한계는 그 초점을 맞춘 모든 입자를 계속 필요가 방지 높은 배율, 작은 작은 크기-특히 filamentous 구조와 입자에 대 한 자사의 유틸리티 제한. 이 방법의 미래 방향 고급 이미지 분석 기법 (특히 소음 감소24,25, 높은 동적 범위 이미징, 초점 스태킹26,27및 기계 학습을 통합할 수 있는 보조 임계 처리, 세분화, 및 분류28 주요 이미지 수집 개선 기계 단계8 을 제어 하 고 '전체 접시' 모자이크 아카이브 생성 소프트웨어를 통합할 것 이다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 CBET 1336544에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
피지, R 및 파이썬 로고 다음 상표 정책에 따라 사용 됩니다.
파이썬: https://www.python.org/psf/trademarks/
R: https://www.r-project.org/Logo/ 에 나열 된 참조에 의해 SA 4.0 라이센스 당: https://creativecommons.org/Licenses/by-sa/4.0/
피지: https://imagej.net/Licensing
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% Bleach solution | Chlorox | 31009 | For workspace disinfection. |
| 15 mL centrifuge tube with cap | Corning | 430790 | Per sample. |
| 50 mL Erlenmeyer flask | Corning | 4980-50 | Other vessels are suitable so long as they can contain > 40 mL of sample and allow mixing |
| 500 mL Kimax Bottle | Kimble-Chase | 14395-50 | Or otherwise sufficient for agar handling |
| Agar | BD | 214010 | Solid, to prepare 7.5% gel. 7 mL per sample. |
| Data analysis software | N/A | N/A | R or Python are suggested |
| Deionized water | N/A | N/A | Sufficient to prepare stain and agar. If unavailable, tap should be fine. |
| Desktop computer | N/A | N/A | Image analysis is not CPU intensive, any 'ordinary' desktop computer circa 2017 should be sufficient. |
| External hard drive | Seagate | STEB5000100 | Not fully required, but extremely useful given the number an size of images. 2 or more TB of storage suggested. |
| FIJI | NIH | version 1.51d | Version is ImageJ core. Plugins are updated as of writing. Available at: https://imagej.net/Fiji/Downloads |
| GIT | Open Source | version 2.19.1 or later | Available at: https://git-scm.com/ |
| Image capture software | ToupView | version 3.7.5177 | Any compatible with camera, may come with camera. Should allow saving TIFF images with spatial calibration data. |
| Mechanical (X/Y) Stage | OMAX | A512 | Not fully required, but greatly aids image acquisition. |
| Methylene blue | Fisher | M291-100 | Solid, to prepare 1% w/v solution. 5 uL solution per sample. |
| Microscope camera | OMAX | A35140U | Any digitial camera compatible with microscope. Resolution providing at least 5 um per pixel at 10x magnification and a dynamic range of at least 8 bits per pixel per color channel is suggested. |
| Optical Stage Micrometer | OMAX | A36CALM1 | Or otherwise sufficient for spatial calibration. |
| Petri dish, 100 mm | Fisher | FB0875712 | 1 per sample. |
| PPE | N/A | N/A | Standard lab coat, gloves, and eyewear. |
| Sparmoria macro | NCSU | version 0.2.1 | Available at github repository : https://github.com/joeweaver/SParMorIA-Sludge-Particle-Morphological-Image-Analysis |
| Stereo/dissecting microscope | Nikon | SMZ-2T | Should provide 10 to 20x magnficiation and allow digital photos either with a buit-in camera or profide a mounting point for a CCD. |
References
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