Summary
Este protocolo describe un método basado en la clasificación celular para la purificación y la cultura de las neuronas GABAérgicas fluorescentes o glutamatérgicas de la neocorteza y el hipocampo de ratones o ratas postnatales.
Abstract
El objetivo general de este protocolo es generar cultivos neuronales purificados derivados de cualquiera de las neuronas GABAérgicas o glutamatérgicas. Las neuronas purificadas pueden cultivarse en medios definidos durante 16 días in vitro y son susceptibles a cualquier análisis realizado típicamente en cultivos disociados, incluyendo análisis electrofisiológicos, morfológicos y de supervivencia. La principal ventaja de estas culturas es que los tipos celulares específicos se pueden estudiar selectivamente en ausencia de influencias externas complejas, como las derivadas de las células gliales u otros tipos de neurona. Sin embargo, al planear experimentos con células purificadas, es importante tener en cuenta que las neuronas dependen fuertemente de los medios con forma de glia para su crecimiento y supervivencia. Además, las neuronas glutamatérgicas dependen adicionalmente de factores secretados por la glia para el establecimiento de la transmisión sináptica. Por lo tanto, también Describimos un método para coculturar las neuronas y las células gliales en una disposición que no es de contacto. Utilizando estos métodos, hemos identificado las principales diferencias entre el desarrollo de las redes neuronales GABAérgicas y glutamatérgicas. Por lo tanto, estudiar las culturas de las neuronas purificadas tiene un gran potencial para promover nuestra comprensión de cómo el sistema nervioso se desarrolla y funciona. Además, las culturas purificadas pueden ser útiles para investigar la acción directa de agentes farmacológicos, factores de crecimiento o para explorar las consecuencias de las manipulaciones genéticas en tipos celulares específicos. A medida que más y más animales transgénicos estén disponibles, etiquetando tipos de células de interés específicos adicionales, esperamos que los protocolos descritos aquí crezcan en su aplicabilidad y potencial.
Introduction
La clasificación celular es una herramienta poderosa para el aislamiento de las células vivas de interés de una mezcla heterogénea de células. Las celdas se pueden clasificar en función de los criterios de tamaño y forma, así como la expresión de los marcadores fluorescentes1,2. A menudo, los anticuerpos conjugados con fluoróforos se utilizan para etiquetar distintos tipos de células al apuntar a los antígenos superficiales específicos de la célula3,4. Alternativamente, los animales transgénicos o los sistemas de entrega viral han sido diseñados para expresar fluoróforos bajo los promotores específicos de la célula5,6. Históricamente, el desarrollo de herramientas y animales transgénicos fue costoso y requiere mucho tiempo. Más recientemente, la disminución de los costos y las dificultades técnicas han provocado un aumento drástico en el número de líneas de reportero disponibles. A medida que la disponibilidad de herramientas transgénicas y animales reporteras sigue creciendo, también debería la utilidad y aplicabilidad de los métodos de ordenación celular basados en fluorescencia.
Recientemente demostramos que la clasificación celular de animales transgénicos se puede aplicar rutinariamente para purificar las neuronas primarias en preparación para el cultivo celular7. Al clasificar las células de ratas o ratones, hemos sido capaces de aislar y cultivos de neuronas fluorescentes, que expresan proteínas de reportero fluorescente específicamente en cualquiera de las neuronas GABAérgicas o glutamatérgicas6,8,9. Mediante el estudio de estas culturas neuronales purificadas, hemos sido capaces de identificar una diferencia importante en la forma en que las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas dependen de los factores secretados por la glia para el establecimiento de la transmisión sináptica7. Adicionalmente, mediante la coculturación de células gliales con neuronas purificadas, pudimos extenderlo en observaciones previas demostrando el papel crítico que desempeñan las células gliales en el crecimiento y la supervivencia de las neuronas10,11. Así, a través de una combinación de ordenación celular y cultivo celular, pudimos estudiar no sólo el desarrollo de tipos específicos de neuronas en aislamiento, sino que pudimos investigar la influencia de las células gliales en su función.
Presentamos aquí un protocolo para la purificación y la cultura de las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas de la corteza y el hipocampo de ratones transgénicos o ratas. También presentamos un método para la co-cultura sin contacto de neuronas purificadas y células gliales, adaptado de Geissler et al.12. Con el fin de generar cultivos GABAérgicos purificados, hemos ordenado las neuronas fluorescentes de VGAT-Venus-A Wistar ratas8 o vgat-Venus ratones13, que expresan selectivamente una variante de proteína fluorescente amarilla mejorada (Venus) en > 95% de neuronas GABAérgicas corticales. Para generar cultivos glutamatérgicos purificados, hemos ordenado las neuronas fluorescentes de NexCre; Ai9 ratones6,9, que expresan tdtomato en neuronas glutamatérgicas corticales. Todo el procedimiento de ordenación y cultivo se puede realizar dentro de 3-4 h y se puede utilizar para generar cientos de cultivos replicantes adecuados para el análisis electrofisiológico, morfológico y de supervivencia celular. El método es simple, reproducible y puede producir cultivos neuronales purificados que son mayores que 97% puros para el tipo de célula de interés.
Protocol
Todos los procedimientos y el mantenimiento de los animales se realizaron de conformidad con las directrices institucionales, la ley alemana de bienestar animal y la Directiva 86/609/CEE del Consejo Europeo relativa a la protección de los animales, en presencia de permisos de los locales autoridades (LaGeSo Berlin, T-0215/11).
Nota: Este protocolo describe la cultura de las neuronas purificadas a partir de un solo Ratón transgénico o cachorro de rata (día de postnatal 0 – 2). Todas las técnicas deben realizarse en condiciones estériles. Todas las soluciones deben esterilizarse utilizando un filtro de 0,2 μm (ver tabla de materiales). Los cubreobjetos de vidrio y las herramientas de disección deben esterilizarse por calor durante 3 h a 185 ° c.
1. Revestimientos de vidrio de recubrimiento con poli-L-lisina
- Prepare cubreobjetos de vidrio descongelando una alícuota de 5 mL de 200 μg/mL de solución de poli-L-lisina (PLL). Diluir esta solución de stock a 20 μg/mL añadiendo 45 mL de agua pura de grado de inyección. Filtrar-esterilizar la solución en un nuevo tubo cónico de 50 mL. Etiquete este tubo como "PLL estéril".
Nota: Utilice agua almacenada a temperatura ambiente para acelerar el proceso de descongelación. - Agregue 100 cubreobjetos de vidrio estériles, redondos y de 12 mm a la solución PLL estéril. Agitar el tubo cada 5 – 10 minutos, durante 2 – 3 minutos, para asegurar el recubrimiento incluso. Cubra los cubreobjetos de esta manera durante 1 h.
Nota: Se prefiere la cobertura de vidrio redondo de fabricación alemana (diámetro = 12 mm), ya que proporcionan una superficie de cultivo fiable y encajan fácilmente en los pozos de una placa de cultivo celular de 24 pozos. - Después de 40 min de recubrimiento PLL, tomar 2 trozos de papel tisú y ponerlos planos en el gabinete de flujo. Esterilice el papel usando etanol al 70%, luego aplanar para eliminar los pliegues y dejar secar.
- Después de recubrir los cubreobjetos de vidrio durante 1 h con PLL, quite el exceso de solución PLL y agregue agua estéril de grado de inyección. Agitar suavemente los cubreobjetos por 2 – 3 s para permitir la eliminación del exceso de PLL. Repita este paso de aclarado 2 veces adicionales.
- Retire el exceso de agua y luego transfiera los cubreobjetos al papel de tejido estéril. Separe con cuidado cada tapon con fórceps curvados y deje secar.
Nota: Los cubreobjetos que no se separan fácilmente se pueden descartar. Alternativamente, se puede añadir una pequeña cantidad de agua para ayudar a la separación. - Una vez seco, transfiera los cubreobjetos a una placa de cultivo de 24 pozo.
Nota: Los coverslips deben estar listos aproximadamente 30 min – 1 h antes de comenzar el proceso de disección. Las placas se pueden almacenar en una incubadora a 37 ° c y 5% CO2 hasta que se requiera.
2. disociación de hipocampal y tejido cortical
- Preparación de soluciones de cultivo celular
- Para la disociación del tejido neural, primero descongele una alícuota de 40 mL de tampón de cultivo celular (composición [in mM]: 116 NaCl, 5,4 KCl, 26 NaHCO3, 1,3 Nah2po4, 1 MgSO4· 7H2o, 1 CACL2· 2H2o, 0,5 EDTA · 2Na · 2H2O y 25 D-glucosa, pH = 7,4). Mida 12 mL de tampón de cultivo celular en un tubo cónico de 15 mL; etiqueta como "BSA". Mida 5 mL de tampón de cultivo celular en un tubo de 15 mL diferente; etiqueta como "papaína". Incubar ambos tubos en un baño de agua durante 15 min a 37 ° c.
- Filtrar-esterilizar el búfer de cultivo celular restante, etiquetar como "buffer-estéril" y almacenar a 4 ° c hasta que sea necesario.
- Pesar 120 mg de albúmina sérica bovina (BSA) y añadir al tubo etiquetado "BSA". Pesar 7 mg de papaína y añadir al tubo etiquetado "papaína". Devuelva ambos tubos al baño de agua durante 15 min.
Nota: Es útil añadir una pequeña cantidad de tampón al bote de pesaje para facilitar la transferencia del polvo de papaína. - Una vez que todos los polvos se hayan disuelto, esterilice cada solución en un tubo cónico de 15 mL. Para la papaína de tubo, etiquetar la solución filtrada como "papaína-estéril". Para el tubo BSA, divida la solución de BSA estéril en 3 tubos, cada uno conteniendo 4 mL de solución de BSA. Etiquete cada tubo como "BSA-estéril" y ya sea "1", "2" o "3". Volver todos los tubos de nuevo al baño de agua y continuar incubar a 37 ° c hasta que sea necesario.
- Preparación para la disección de tejidos
- Tomar una sola pieza de papel de filtro de 35 mm (ver tabla de materiales) y esterilizar con 70% de etanol; dejar secar en la tapa de una placa de Petri de 100 mm, en un gabinete de flujo.
- Coloque las tijeras, fórceps, bisturí y espátula (ver tabla de materiales) necesarios para la disección del hipocampo y la corteza.
- Coloque placas Petri de 2 35 mm y una placa de Petri de 100 mm que contenga papel filtrante estéril en un lugar accesible en el centro del gabinete de flujo.
- Recoger NexCre transgénico; Ai9 y VGAT las crías de ratón Venus que deben ser diseccionadas. Utilice una lámpara fluorescente con filtros de excitación y emisión apropiados (consulte la tabla de materiales) para discriminar a los cachorros fluorescentes de los compañeros de littermate salvajes.
- Inmediatamente antes de diseccionar animales, llene cada plato de Petri de 35 mm con un tampón de cultivo celular estéril y refrigerado.
Nota: Una placa de Petri es para limpiar las herramientas entre disecciones, y la otra es para recolectar el hipocampo y la corteza.
- Disección de tejido
- Tan pronto como se vierte el búfer de cultivo celular, decapitar un día postnatal 0 – 2 Ratón transgénico o rata cachorro usando grandes, tijeras afiladas y utilizar una placa de Petri estéril de 100 mm para transferir la cabeza en el gabinete de flujo. Use fórceps, tijeras y una espátula para transferir cuidadosamente el cerebro de un cachorro transgénico a un papel de filtro estéril.
- Utilice un bisturí de tipo 22 para diseccionar el cerebelo y separar los 2 hemisferios. Utilice una pequeña espátula para rodar los hemisferios lateralmente. En cada hemisferio, presione suavemente para que la corteza entre en contacto con el papel de filtro. Mueve suavemente las regiones del medio cerebro para revelar el hipocampo y la corteza.
Nota: Tenga cuidado de no aplicar demasiada presión al presionar hacia abajo en los hemisferios o las células pueden ser aplastadas. - Usa un bisturí o una espátula para separar el hipocampo y la corteza de cada hemisferio. Transfiera el tejido diseccionado a una placa de Petri de 35 mm que contenga un tampón de cultivo celular refrigerado.
Nota: Si diseccionan varios animales, almacene un tampón de cultivo celular estéril en un tubo cónico de 50 mL sobre hielo. Después de cada disección, transfiera el tejido diseccionado al tampón de cultivo celular refrigerado. - Después de la disección exitosa del tejido cortico-hipocampal, transfiera la solución de papaína estéril del baño de agua al gabinete de flujo. Utilice una Piera Pasteur de 3 mL para transferir el hipocampo diseccionado y la corteza a la tapa de una placa Petri estéril de 35 mm. Picar en un movimiento entrecruzado, utilizando la parte plana de un bisturí de tipo 22, hasta que el tejido esté en trozos pequeños.
- Utilice una pequeña cantidad de solución de papaína para transferir el tejido picado de la tapa de la placa de Petri al tubo de papaína estéril. Devolver el tubo de papaína al baño de agua e incubar el tejido a 37 ° c durante 25 min.
- Durante la incubación de papaína, conforman una solución completa de medios de fluorescencia. Descongelar una alícuota de 1 mL de B27, una alícuota de 0,5 mL de Glutamax y una alícuota de 0,5 mL de pluma-estreptococo. Alícuota 48,5 mL de Hibernate un medio de fluorescencia baja a un tubo cónico de 50 mL. Agregue B27, Glutamax y Pen-Strep a la solución. Agitar bien la solución, luego esterilizar el filtro y etiquetar como "Hibernate A complete media" (con fecha e iniciales). Incubar a 37 ° c en un baño de agua.
- Después de la incubación del papaína, transfiera el tubo de papaína y los tubos de BSA estériles al gabinete de flujo. Utilice una Piera Pasteur de 1 mL para extraer sólo el tejido cortico-hipocampal del tubo de papaína en el tubo de BSA 1.
Nota: Tenga cuidado de minimizar la transferencia de la solución de papaína excesiva.
- Disociación de las células
- Con el fin de romper cualquier grumos grandes de tejido, triturar el tejido varias veces utilizando una PIFA Pasteur de 1 mL. Después de esto, triturar el tejido 7 veces usando una punta fina de Pipetas Pasteur. Dejar reposar el tejido durante 30 s, permitiendo que trozos más grandes de tejido se sedimenten.
- Después de 30 s, transferir el 1 mL inferior de la solución y el tejido de BSA-tubo 1 a BSA-tubo 2. Triturar el tejido en la BSA-tubo 2 varias veces utilizando una fina punta Pasteur pipetas.
- Después de la trituración, transferir de nuevo la parte inferior 1 mL de tejido y la solución de BSA-tubo 1, pero ahora a BSA-tubo 3. Triturar el tejido en el tubo de BSA 3 varias veces utilizando una fina punta Pasteur.
- Después de la trituración, transferir toda la solución y el tejido de los tubos 2 y 3 en BSA-tubo 1. Triturar otras 2-3 veces y centrifugar a 3.000 x g durante 3 min.
- Durante la centrifugación, conforman los medios neuronales basales A completos (media de la NBA). Aliquot 48,5 mL de los medios de la NBA a un tubo cónico de 50 mL e incubar a 37 ° c en un baño de agua. Etiqueta este tubo "NBA Only". Además, descongele una alícuota de 1 mL de B27, una alícuota de 0,5 mL de Glutamax y una alícuota de 0,5 mL de Pen-Strep a temperatura ambiente.
- Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante del tejido pelado y vuelva a suspender las células en 2 mL de medios completos. Utilice una Piera P1000 para triturar el tejido hacia arriba y hacia abajo 20 veces.
Nota: Tenga cuidado de no pipetear las células con demasiada fuerza. Si se aplica demasiada presión, las células pueden dañarse. - Utilice una Pile Pasteur de 1 mL para filtrar la suspensión celular a través de un tamiz de celda de 30 μm en un tubo de muestra de poliestireno.
Nota: Si la suspensión de la célula no pasa inmediatamente a través del tamiz de la célula, puede ser necesario presionar en la parte superior del tamiz con un guante estéril para iniciar el flujo. Este paso importante evita que se obstruyan los clasificador de celdas. - Para recoger las neuronas después de la clasificación, prepare los tubos de recolección pipeteando 300 μL de medios completos al número necesario de tubos de polipropileno.
- La suspensión celular ya está lista para ser llevada al clasificador celular para su clasificación. Tomar la suspensión celular, tubos de recolección extra y repuestos medios completos en caso de dilución de la muestra se requiere.
3. clasificación celular de las neuronas purificadas GABAérgicas o glutamatérgicas
Nota: Para minimizar la posibilidad de contaminación bacteriana durante la ordenación, enjuague el tubo de muestra del clasificador con etanol al 70% durante al menos 5 minutos antes de la clasificación. Los parámetros de ordenación detallados varían entre los instrumentos, las consideraciones fundamentales son las siguientes.
- Durante el primer orden de celda, establecer niveles de fluorescencia de fondo de las células sin etiquetar mediante la clasificación y la comparación de las células de un animal de tipo salvaje.
- Para cada tipo de célula fluorescente que se debe clasificar, elija los filtros de excitación y emisión apropiados. Excitar las proteínas de Venus y TdTomato usando longitudes de onda de excitación de 488 nm o 531 nm, respectivamente. Detecte la luz emitida a través de los conjuntos de filtros de emisión 530/40 y 575/30, respectivamente.
- Añadir tubos de recolección de polipropileno, conteniendo 300 μL de medios completos, al clasificador celular para la recolección celular.
- Para una alta pureza, ordene celdas fluorescentes con etiquetas brillantes (vea la figura 1B , por ejemplo, parcelas de puntos de celdas ordenadas).
- Después de la clasificación, para obtener resultados óptimos, realice una prueba de pureza de las celdas ordenadas para estimar los niveles de pureza. Tenga en cuenta que la tasa de recuperación típica de las celdas después de la clasificación es entre 70 – 80%.
- Anote el número de celdas ordenadas en cada tubo de recolección. Este valor viene dado por el instrumento de ordenación celular.
Nota: La clasificación celular se puede realizar utilizando una boquilla de 70 μm (presión de fluido de vaina de 70 psi) o una boquilla de 100 μm (presión de fluido de 20 psi).
4. el cultivo de neuronas ordenadas
- Después de la clasificación celular, transfiera las células recolectadas a 2 mL de tubos centrífugas de fondo redondo, utilizando una pita Pasteur de 1 mL. Centrifugar las células a 3.000 x g durante 3 min para formar un pellet de células.
Nota: Para ayudar a identificar la ubicación del pellet de la célula, orientar los tubos de la centrífuga de fondo redondo con la bisagra de la tapa hacia afuera, lo que permite que el pellet de la célula se forme en la parte posterior del tubo de la centrífuga (es decir, en el mismo lado del tubo como la bisagra). - Durante la centrifugación, añadir 1 mL de B27, 0,5 mL de Glutamax y 0,5 mL de Pen-Strep a los 48,5 mL de los medios pre-calentados de la NBA. Agitar bien la solución, luego filtrar esterilizar y etiquetar como "media completa de la NBA" (con fecha e iniciales). Volver al baño de agua hasta que sea necesario.
- Después de la centrifugación, utilice una Piera Pasteur de 1 mL para transferir el sobrenadante a un tubo de centrífuga diferente (conserve el sobrenadante en caso de que el pellet de células se haya perturbado). Vuelva a suspender el pellet de la célula en la cantidad necesaria de medios pre-calentados de la NBA para lograr una densidad celular de 1.000 células/μL. Vuelva a suspender las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una Piera P200 o P1000.
- Para confirmar la presencia de células disociadas, Compruebe la solución celular bajo un microscopio, utilizando una lente objetivo de 4x o 10X. Alternativamente, pipetear una pequeña cantidad de solución celular en un coberteo y verificar bajo el microscopio. Si hay un gran número de células presentes, el sobrenadante del paso 4,3 puede desecharse.
- Antes de enchapado las células, vórtice a una velocidad media de 2 – 3 s para asegurar una suspensión celular incluso. Tras el vórtex, pipetee rápidamente 10 μL de la suspensión de la célula al centro de cada coverslip. Después de pipetear las células, devuelva rápidamente cada plato a la incubadora (5% CO2/37 ° c) e incube durante 1 h.
Nota: Si la adición de células a múltiples placas de 24-Well, asegurar densidades de células incluso por vórtex celdas entre placas. - Después de 1 h, alimente las células con 500 μL de medios pre-calentados de la NBA y regrese a la incubadora.
Nota: Al alimentar las células, es importante pipetear el medio suavemente por el lado del pozo para evitar el desprendimiento de la célula. Para experimentos cortos (< 16 días), no es necesario alimentar a la densidad anterior. Al chapar una mayor densidad de células, es posible que se requieran intervalos de alimentación más frecuentes (ver discusión).
5. cultivos de apoyo glial enriquecido de astrocitos
Nota: La producción de cultivos gliales14 y el uso de insertos de cultivo celular se ha descrito anteriormente12. En Resumen, los cultivos de glí enriquecido con astrocitos se derivan del tejido cortico-hipocampal (con meninges removidos; P2 – P5), que se han cultivado durante una semana en una placa de 20 μg/mL con recubrimiento de PLL de 6-Well, en suero complementado con medios DMEM.
- Para co-cultivo de neuronas purificadas y células gliales, pasaje de las células gliales confluentes al número requerido de insertos de cultivo celular (tamaño de poro de 0,4 μm-ver tabla de materiales). Para pasar las células, retire una placa de 6 pocillos que contenga células gliales confluentes de la incubadora y lave 2 pozos, 2 veces, con 2 mL de suero salino (PBS) precalentado (37 ° c).
- Aspirar la solución PBS y utilizar una pitaina P1000 para añadir 1 mL de tripsina precalentada (37 ° c) (1:250)/EDTA (0,25%/0,02%) solución a cada pozo.
- Devuelva la placa de 6-Well a la incubadora y compruebe cada 2 – 3 minutos para el desprendimiento de la célula.
- Una vez que se ha producido un desprendimiento de células significativo, pipetear las células y la solución celular suavemente hacia arriba y hacia abajo usando una Piera Pasteur de punta fina, para ayudar a desapego y separación de las células individuales.
- Transfiera la solución celular a un tubo cónico de 15 mL y centrifugue a 3.000 x g durante 3 min.
- Vuelva a suspender las células utilizando una pipería P1000 en 5 mL de media completa de la NBA pre-calentada (37 ° c), pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que el pellet de células esté en solución.
- Realice un recuento de células utilizando un hemociómetro o un contador de células automatizado.
Nota: Después de 7 días en la cultura, aproximadamente 750000-1000000 células pueden ser cosechadas de cada pozo de una placa de 6-well. - Placa 40.000 células gliales a cada inserción de cultivo celular en una gota de 500 μL (80 células/μL).
- Después de permitir que las células se adhieran durante 1 h, utilice fórceps estériles para transferir insertos de cultivo celular cubiertos por glial a placas de 24-Well que contengan neuronas purificadas. Retire el exceso de medios de la superficie de los insertos de cultivo celular (aproximadamente 300 μL).
Nota: Como las burbujas de aire a menudo pueden quedar atrapadas debajo de los insertos de cultivo celular, puede ser necesario inclinar suavemente los insertos para desalojar estas burbujas. Si se añaden más células gliales a la plaquita de cultivo celular, pueden requeritarse más pasos de lavado y centrifugación para eliminar el exceso de tripsina, lo que puede ser perjudicial para la supervivencia celular.
Representative Results
La disociación y la clasificación celular de las neuronas fluorescentes del tejido cortico-hipocampal de rata o ratón transgénico se pueden realizar en aproximadamente 3 – 4 h. El resultado es una población de neuronas fluorescentes altamente puras, que pueden cultivarse en cultivo durante 16 días.
Para generar cultivos purificados, los animales transgénicos se identificaron por primera vez utilizando una lámpara fluorescente con conjuntos de filtros apropiados (ejemplos de VGAT de fluorescencia fluorescente de Venus y NexCre; Ai9 PUP ratón se muestran en la figura 1A). Tras la identificación de animales transgénicos, se disoció el tejido diseccionado, y las neuronas más fuertemente fluorescentes se clasificaron para producir una población celular purificada. Ejemplo de diagramas de puntos de intensidad de fluorescencia para NexCre; Las neuronas de ratón Venus Ai9 y VGAT, obtenidas durante el FACS, se muestran en la figura 1B. Cuando se optimiza, es posible cosechar entre 500.000 y 800.000 células de la corteza y el hipocampo del individuo P0-2 NexCre; Ratones Venus Ai9 o VGAT. Las celdas se pueden clasificar a una velocidad ascendente de 600 eventos/s. se realizaron estimaciones de pureza celular utilizando DAPI como marcador nuclear (figura 1C). Al clasificar las células fuertemente positivas, una pureza de más de 97% se puede lograr rutinariamente7.
Después de la clasificación exitosa, las neuronas chapadas deben aparecer redondas en forma, tener una membrana lisa y se deben ver para germinar neuritas después de aproximadamente 1 h in vitro (figura 2A, B). Por 7 días in vitro, aunque algunas muertes celulares pueden ser evidentes, las células viables deben estar presentes en todas las condiciones de cultivo (figura 2C, D). A los 12 – 16 días in vitro, utilizando las grabaciones de abrazadera de células enteras y el llenado de biocytin15, es posible investigar el desarrollo morfológico y electrofisiológico de las neuronas purificadas (figura 3). Análisis de cultivos purificados revela que tanto glutamatérgica y las neuronas GABAérgicas fueron capaces de extender axones y dendritas de sus cuerpos celulares (figura 3a, B) y retener la capacidad de generar potenciales de acción en respuesta a las inyecciones de corriente despolarizante suprathreshold (Figura 3C, D). En particular, sin embargo, después de la purificación, sólo las neuronas GABAérgicas recibieron cantidades significativas de transmisión sináptica espontánea, y las neuronas glutamatérgicas reciben muy poca transmisión sináptica en ausencia de células gliales (figura 3E , F) 7.
Como hemos informado anteriormente, las células en cultivos purificados tienden a sobrevivir más mal que las de cultivos sin clasificar y tienen dendritas y axones significativamente más pequeñas7. Para superar estos déficits, hemos adaptado y aplicado métodos para apoyar el desarrollo de cultivos purificados con células gliales12,14. La composición celular de nuestras culturas de soporte gliales (DIV7) se muestra en la figura 4a. Estas culturas contenían en su mayoría astrocitos positivos de proteína ácida fibrilar gliales (GFAP), pero también contenían algún racimo de molécula de diferenciación (CD11b) de microglia positiva y oligodendrocitos positivos de la proteína básica de mielina (MBP). Después de la DIV 7, estas células pueden ser pasadas a insertos de cultivo celular para proporcionar apoyo sin contacto de neuronas purificadas (Figura 4B, C). El análisis de las co-culturas de la glia-neurona revela que aproximadamente 40.000 células gliales fueron suficientes para mejorar la supervivencia y el crecimiento a largo plazo de las neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas purificadas (Figura 4D, E)7. Además, el análisis electrofisiológico revela que las neuronas glutamatérgicas, cocultivadas con células gliales, eran altamente activas y tenían una actividad de red fuertemente aumentada (porcentaje de neuronas glutamatérgicas soportadas por gliales disparando ráfagas de acción potencialidades: 62%; n = 28; Figura 4F , G). El apoyo glial es por lo tanto importante no sólo para promover el crecimiento de la neurona y la supervivencia, sino también para promover la transmisión sináptica y el establecimiento de la actividad de la red en las culturas glutamatérgicas.
Figura 1: purificación de las neuronas glutamatérgicas y GABAérgicas. (A) imágenes que muestren la señal fluorescente de la expresión transgénica de TdTomato en nexcre; Ratones Ai9 (arriba) y Venus en ratones Venus VGAT (parte inferior). Barras de escala = 5 mm. (B) diagramas de dispersión de intensidad de la fluorescencia de TdTomato y Venus de células disociadas cortico-hipocampales de nexcre; Ratones Ai9 (arriba) y ratones Venus VGAT (abajo). Se seleccionaron las neuronas TdTomato o Venus fuertemente fluorescentes para su clasificación (indicadas por las cajas de entrada). (C, izquierda) Imágenes confocales de neuronas positivas ordenadas TdTomato (arriba) y Venus (inferior). (C, derecha) Imagen fusionada que muestra las células Co-teñidas con DAPI (en pseudocolor azul). La fluorescencia de TdTomato es endógena y permanece fuerte a pesar de la fijación (en pseudocolor magenta). La expresión Venus se mejora utilizando una combinación de un anticuerpo primario dirigido contra el anticuerpo secundario conjugada GFP y Alexa Fluor-488 (en pseudocolor verde). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: cultivo celular de glutamatérgica purificada o neuronas GABAérgicas. (A) imágenes combinadas de infrarrojos (campo brillante) y de señal fluorescente superpuesta de TdTomato (izquierda) y Venus (derecha) de neuronas positivas cultivadas durante 1 h in vitro. Las flechas blancas indican la ubicación de las neuritas en crecimiento. (B) imágenes confocales de las neuronas positivas TdTomato (izquierda) y Venus (derecha) cultivadas durante 1 h in vitro. (C, D) Campo brillante (arriba) y combinado de campo brillante e imágenes fluorescentes (abajo) de TdTomato (C) y Venus de neuronas positivas (D) cultivadas durante 7 días in vitro (DIV). Las flechas blancas muestran la ubicación de los núcleos condensados de las células muertas. Las flechas de colores identifican las neuronas etiquetadas con fluorescentemente. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: propiedades morfológicas, electrofisiológicas y sinápticas de las neuronas purificadas. (A, B) Imágenes confocales de TdTomato (A) y las neuronas positivas de Venus (B) en la DIV 13 y la DIV 14, respectivamente. Las células se presentan en negro utilizando una tabla de buscar invertida para ayudar a la visualización de la neurita. Los insets muestran la señal fluorescente expresada por las neuronas identificadas. (C, D) La respuesta de voltaje de una neurona positiva de TdTomato (C) y Venus (D) a hiperpolarizante (200 a-20 pA, en pasos de 20 pA) y despolarizante (200 pA) pulsos de corriente, obtenida por las grabaciones de parches-Clamp de células enteras. Los insets muestran las neuronas grabadas correspondientes. El potencial de la membrana en reposo de cada célula se indica a la izquierda de la traza de grabación. (E, F) Las grabaciones representativas de la tensión-abrazadera (10 s) obtenidas de TdTomato (E) y de las neuronas positivas de Venus (F). Los eventos postsinápticos excitatorios espontáneos (EPSC) se registraron a partir de neuronas positivas de TdTomato, mantenidas en un potencial de retención de 50 mV. Los eventos postsinápticos inhibitorios que ocurren espontáneamente (IPSC) se registraron a partir de las neuronas positivas de Venus mantenidas en un potencial de retención de 0 mV. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: apoyar el desarrollo de la neurona con Co-cultura gliales. (A) imágenes confocales de cultivos gliales inmunolados para proteína ácida fibrilar gliales (GFAP, izquierda), racimo de molécula de diferenciación (CD11b, medio) y proteína básica de mielina (MBP, derecha). Las células gliales fueron cultivadas para DIV 7. (B) imágenes de insertos de cultivos celulares utilizados para cocultivo de células gliales con neuronas purificadas en una disposición sin contacto. (C) un esquema del arreglo espacial utilizado para la co-cultura de las neuronas y la glía. (D, E) Imágenes confocales de TdTomato (D) y de las neuronas positivas de Venus (E), cultivadas durante 14 días, en ausencia (izquierda) o presencia (derecha) de soporte gliales. (F, G) Corriente-las grabaciones de la abrazadera (60 s) de TdTomato (F) y las neuronas positivas de Venus (G) cultivadas durante 14 días en ausencia (arriba) o presencia (abajo) de apoyo gliales. Las neuronas se registraron en su potencial de membrana en reposo (presentado a la izquierda de cada traza de grabación). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Describimos aquí un método que combina la ordenación y el cultivo de las neuronas primarias para generar cultivos de células neuronales purificadas. Este método tarda alrededor de 1 h más que un típico protocolo de la cultura neuronal disociada primaria, pero permite la generación de cientos de cultivos replicados que contienen tipos neuronales específicos. Las neuronas purificadas, que se pueden cultivar en aislamiento durante al menos 16 días, extienden axones y dendritas y pueden disparar trenes repetitivos de potenciales de acción (figura 2 y figura 3). Es importante destacar que estas células son susceptibles a los mismos análisis experimentales que las culturas neuronales disociadas primarias regulares, incluyendo análisis electrofisiológicos, morfológicos y de supervivencia. Un gran beneficio de trabajar con estas culturas purificadas es que el desarrollo de tipos específicos de células se puede estudiar aisladamente. Para apoyar el desarrollo de las culturas purificadas, también presentamos un protocolo para coculturar neuronas purificadas con células gliales. Como se ha mostrado anteriormente, la coculturación de neuronas purificadas con células gliales mejora su supervivencia, crecimiento y puede promover la formación de la red7 (figura 4). Por lo tanto, presentamos aquí una combinación de métodos que deben continuar el estudio de las interacciones de la neurona y pueden resultar útiles para estudiar el desarrollo y la interacción entre otros tipos de células de interés.
Estudios sobre las culturas de las neuronas glutamatérgicas purificadas han revelado conocimientos fundamentales en la forma en que las células gliales secretan factores que promueven el desarrollo de las redes neuronales y la formación de sinapsis16,17,18 . En general, los métodos para purificar tipos específicos de neurona se han aplicado con mayor éxito al estudio del desarrollo de las neuronas glutamatérgicas en lugar de las neuronas GABAérgicas. Esto ha conducido a una disparidad en nuestra comprensión de cómo se desarrollan estos dos tipos de células. Dado que las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas difieren significativamente en términos de su anatomía, fisiología y orígenes del desarrollo, es vital que estudiemos las neuronas GABAérgicas en su propio derecho, para entender mejor su función y fisiología. Utilizando el protocolo presentado aquí, hemos identificado previamente diferencias importantes en la forma en que las neuronas GABAérgicas y glutamatérgicas dependen de factores secretados por la glia para el establecimiento de la transmisión sináptica7. Al publicar este protocolo esperamos que otros puedan profundizar en las interacciones importantes entre las neuronas y las células gliales.
En este protocolo, describimos un método de ordenación celular basado en citometría de flujo, que hemos utilizado para purificar las neuronas GABAérgicas o glutamatérgicas de diferentes líneas de roedores transgénicos. Las neuronas GABAérgicas positivas de Venus se clasificaron a partir de ratones Venus de VGAT13 o ratas8 y las neuronas glutamatérgicas positivas de tdtomato se clasificaron de nexcre; Ai9 ratones (criados originalmente de NexCre9 y Ai9 reportero Lines6, ver Turko et al., 20187). En los últimos años, debido a los avances tecnológicos, la generación de animales transgénicos se ha vuelto significativamente más fácil. Como tal, la disponibilidad de animales que expresan moléculas fluorescentes, en muchos tipos diferentes de células, ha crecido rápidamente. Esto, a su vez, aumentó el uso y aplicabilidad de la clasificación de células activadas por fluorescencia. Mientras que los métodos alternativos para aislar las células de interés actualmente existen16,19,20, son algo obstaculizados por su dependencia de la disponibilidad de anticuerpos adecuados para la superficie natural Antígenos. Esto limita su versatilidad en comparación con los métodos de clasificación de células basadas en fluorescencia, que ya se pueden utilizar para clasificar las células de los muchos animales de reportero transgénicos específicos de la célula que ya están disponibles. Sin embargo, cuando se optimizan, los métodos de clasificación basados en anticuerpos pueden ser rápidos y de alto rendimiento, y pueden incluso preservar mejor la anatomía celular, permitiendo la purificación de las células con sus axones y dendritas intactas21. Por lo tanto, los métodos de clasificación de anticuerpos deben tenerse en cuenta al decidir una estrategia de clasificación. En última instancia, el tipo de célula de interés, la edad a la que se ordenarán las células, la disponibilidad de animales transgénicos o antígenos superficiales y el número de células necesarias serán los factores determinantes a la hora de elegir la estrategia de clasificación más adecuada.
Aunque la clasificación celular basada en fluorescencia es un método simple y reproducible para purificar las células, se debe tener cuidado durante ciertos pasos del protocolo para preservar la calidad de la célula. Por ejemplo, después de cada paso de centrifugación, es importante asegurarse de que el pellet de la célula se vuelve a suspender lo más rápido posible y que las células se han recuperado con éxito. Ocasionalmente, el pellet de células puede ser perturbado cuando se retira el sobrenadante. Por lo tanto, se aconseja, entre los pasos de centrifugación, comprobar la presencia de células bajo el microscopio para descartar cualquier pérdida extensa de células. Después del recubrimiento celular, se debe permitir que las células se adhieran al menos a 1 h antes de alimentarse. Si las células se alimentan demasiado pronto, algunas células pueden quedar desalojados de la cobertura, reduciendo así la densidad de la cultura. Después de 1 h en la cultura, es prudente evaluar la salud celular. Si las células no aparecen sanas (un ejemplo de células sanas se muestra en la figura 2A), o hay una muerte celular significativa, entonces esto puede ser una indicación de un problema durante el procedimiento de disociación o clasificación. Otra consideración importante, al cultivar cualquier tipo de célula, es tener cuidado al administrar los medios de cultivo celular. Los soportes de la NBA contienen rojo fenol, que actúa como indicador de pH22. Si los medios se vuelven demasiado amarillos en color, entonces esto indica que el pH es demasiado ácido; Si el medio se vuelve demasiado rosado, entonces esto indica que la solución es demasiado alcalina. Las soluciones de stock abiertas durante largos periodos de tiempo, particularmente los medios que se cotizan en tubos cónicos, tienden a ser más alcalinas con el tiempo. Por lo tanto, se aconseja que los medios completos de la NBA se completen cada semana y los medios completos cada dos semanas (los buffers medios en condiciones atmosféricas y por lo tanto deben ser más estables). Teniendo en cuenta estos puntos, debe ser posible establecer cultivos celulares purificados en cualquier laboratorio con acceso a los equipos de clasificación celular y cultivo celular.
En la mayoría de nuestros experimentos elaboramos cultivos purificados a partir de un solo animal. Sin embargo, cuando se purifican las células para análisis bioquímicos, puede ser necesario agrupar varios animales para ordenarlos. Hemos ordenado con éxito hasta 8 ratones embrionarios (día embrionario 13 animales) utilizando el protocolo anterior (datos no mostrados). Sin embargo, si se van a clasificar más animales, puede ser necesario aumentar el volumen de ambas soluciones de papaína y BSA (descritas en los pasos 2.1.1 – 2.1.4) para acomodar el aumento de la cantidad de tejido. Adicionalmente, si más células están chapadas en cultivo, entonces un horario de alimentación más frecuente puede ser necesario. Como punto de partida, las células se pueden alimentar cada 7 días mediante la eliminación de 100 μL de medios acondicionados y la adición de 200 μL de medios de la NBA completos y frescos. En aras de la viabilidad de la neurona, si se ordenan más animales, se debe pensar en minimizar el tiempo de ordenación tanto como sea posible. Esto a menudo requiere la optimización cuidadosa de los análisis descendentes para el uso eficiente de las células purificadas. Hemos ordenado rutinariamente las neuronas de ratón a tasas de 600 eventos/s, hasta 500.000-800.000 células por animal (día postnatal 0 – 2). Sin embargo, esto fue sin la optimización exhaustiva de las velocidades y condiciones de clasificación. Por lo tanto, deben ser posibles mejoras adicionales en la velocidad de clasificación y el rendimiento.
Las neuronas purificadas requieren medios con un contenido de glia para su supervivencia. Esto ha sido demostrado previamente por el cultivo de neuronas y células gliales por separado, antes de tratar las neuronas con medios con aire acondicionado gliales10. En nuestros experimentos, elegimos apoyar las neuronas purificadas cultivando las células gliales en inserciones de cultivo celular semi-permeable, que se colocan dentro de la placa de cultivo celular. Este método se ha aplicado con éxito para estudiar proteínas de matriz extracelular derivadas de la glia y su interacción con las neuronas12. El no-contacto, pero el soporte continuo proporcionado por este método tiene una serie de ventajas en comparación con la cultura separada de las células. En particular, la co-cultura de las células gliales con neuronas permite la regulación y acondicionamiento continuos de los medios de cultivo celular, que se asemeja más a la situación in vivo. Además, la co-cultura continua de las células permite la retroalimentación potencial señalización entre las neuronas y la glia, que no es posible en cultivos separados. En nuestro protocolo, si es necesario, se puede omitir fácilmente el método de co-cultivo continuo y se puede realizar un tratamiento clásico de las neuronas con medios con forma de glia.
En Resumen, el protocolo presentado aquí tiene como objetivo proporcionar al lector una base sólida de la que puedan establecer sus propios experimentos de cultivo celular purificados. Predecimos que la disponibilidad de animales transgénicos y construcciones virales seguirá aumentando en un futuro previsible. Por lo tanto, es probable que las técnicas de clasificación celular basadas en la fluorescencia se vuelvan aún más ampliamente utilizadas y valiosas.
Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros competidores.
Acknowledgments
A los autores les gustaría agradecer el excelente apoyo técnico proporcionado por Jenny Kirsch y Ana Teichmüller en las instalaciones centrales de citometría de flujo, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Berlín. Nos gustaría agradecer a Jie Song por su ayuda con el análisis de supervivencia. También nos gustaría agradecer a Rita Loureiro por su ayuda para capturar las imágenes de ratones fluorescentes y Christian Ebner para la lectura crítica del protocolo. Las ratas transgénicas VGAT-Venus fueron generadas por DRS. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi e y. Kawaguchi en el Instituto Nacional de Ciencias fisiológicas, Okazaki, Japón, usando pCS2-Venus proporcionada por el Dr. A. Miyawaki. Este trabajo fue apoyado por el Consejo alemán de investigación (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG EXC 257 a IV).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin/EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | - | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | - |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | - |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | - |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | - |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | - |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long/5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | - | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
References
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