Summary
Ce protocole détaille une méthode monocouche, sans sérum, pour générer efficacement des cellules hépatocytes à partir de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en 18 jours. Cela implique six étapes que les hPSC se différencient séquentiellement en types de cellules intermédiaires tels que la strie primitive, endoderm définitif, prégut postérieur et progéniteurs de bourgeons hépatiques avant de former des cellules hépatocytes.
Abstract
Le foie détoxifie les substances nocives, sécrète des protéines vitales et exécute des activités métaboliques clés, soutenant ainsi la vie. Par conséquent, l'insuffisance hépatique, qui peut être causée par une consommation chronique d'alcool, une hépatite, un empoisonnement aigu ou d'autres insultes, est une affection grave qui peut entraîner des saignements, une jaunisse, un coma et, éventuellement, la mort. Cependant, les approches pour traiter l'échec de foie, aussi bien que des études de la fonction et de la maladie de foie, ont été bloquées en partie par l'absence d'un approvisionnement abondant des cellules humaines de foie. À cette fin, ce protocole détaille la différenciation efficace des cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en cellules hépatocytes, guidée par une feuille de route développementale qui décrit comment le destin du foie est spécifié à travers six étapes consécutives de différenciation. En manipulant les voies de signalisation développementale pour favoriser la différenciation du foie et pour supprimer explicitement la formation de destins cellulaires indésirables, cette méthode génère efficacement des populations d'ancêtres de bourgeons hépatiques humains et de cellules hépatocytes par les jours 6 et 18 de la différenciation de la CFP, respectivement. Ceci est réalisé par le contrôle temporel-précis des voies de signalisation développementale, exercé par de petites molécules et des facteurs de croissance dans un milieu de culture sans sérum. La différenciation dans ce système se produit dans les monocouches et donne des cellules hépatocyte-comme qui expriment les enzymes caractéristiques d'hépatocyte et ont la capacité d'engraft un modèle de souris de l'échec chronique de foie. La capacité de générer efficacement un grand nombre de cellules hépatiques humaines in vitro a des ramifications pour le traitement de l'insuffisance hépatique, pour le dépistage des médicaments, et pour les études mécanistes de la maladie du foie.
Introduction
Le but de ce protocole est de différencier efficacement les cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) en populations enrichies d'ancêtres de bourgeons hépatiques et de cellules hépatocytes2. L'accès à un approvisionnement prêt des progéniteurs humains de foie et des cellules hépatocyte-comme accélérera des efforts pour étudier la fonction et la maladie hépatiques et pourrait permettre de nouvelles thérapies cellulaires de transplantation pour l'échecde foie 3,4, 5. Cela s'est avéré difficile dans le passé depuis hPSCs (qui comprennent les cellules souches embryonnaires et induites pluripotentes) peut se différencier en tous les types cellulaires du corps humain; par conséquent, il a été difficile de les différencier exclusivement en une population pure d'un seul type cellulaire, comme les cellules hépatiques6.
Pour différencier précisément les hPSC en cellules hépatiques, il est d'abord essentiel de comprendre non seulement comment les cellules hépatiques sont spécifiées, mais aussi comment les types de cellules non hépatiques se développent. La connaissance de la façon dont les cellules non hépatiques se développent est importante pour supprimer logiquement la formation de lignées non hépatiques pendant la différenciation, guidant ainsi exclusivement les hPSC vers un destin de foie2. Deuxièmement, il est essentiel de délimiter les multiples étapes de développement par lesquelles les HPSC se différencient vers un destin de foie. On sait que les hPSC se différencient séquentiellement en plusieurs types de cellules connus sous le nom de strie primitive (APS), endoderm définitif (DE), foregut postérieur (PFG) et progéniteurs de bourgeons hépatiques (LB) avant de former des cellules hépatocytes (HEP). Des travaux antérieurs ont révélé les signaux spécifiant le destin du foie et les signaux qui ont supprimé la formation de différents types de cellules non hépatiques (y compris les progéniteurs de l'estomac, du pancréas et de l'intestin) à chaque choix de lignée développementale2, 7 Annonces , 8.
Collectivement, ces idées ont donné lieu à une méthode monocouche sans sérum pour différencier les hPSC s'orientent vers les stries primitives, l'endoderm définitif, le foregut postérieur, les progéniteurs de bourgeons hépatiques et enfin, les cellules hépatocytes2. Dans l'ensemble, la méthode consiste à ensemencer des hPSC dans une monocouche à une densité appropriée, à préparer six cocktails de médias de différenciation (contenant des facteurs de croissance et de petites molécules qui régulent diverses voies de signalisation du développement), et séquentiellement l'ajout de ces médias pour induire la différenciation au cours de 18 jours. Pendant le processus, aucun passage des cellules n'est nécessaire. Il convient de noter, parce que cette méthode comprend explicitement des signaux qui suppriment la formation de non-foie cell-types, cette approche de différenciation1 génère plus efficacement progéniteurs du foie et les cellules hépatocytes-like par rapport à existant méthodes de différenciation2,9,10,11,12. En outre, le protocole décrit dans ce texte permet la génération plus rapide d'hépatocytes qui expriment finalement des niveaux plus élevés de facteurs et d'enzymes de transcription hépatique que ceux produits par d'autres protocoles9,10 , 11 Ans, états-unis ( , 12.
Le protocole décrit ici présente certains avantages par rapport aux protocoles actuels de différenciation. Tout d'abord, il implique la différenciation monocouche des hPSC, ce qui est techniquement plus simple par rapport aux méthodes de différenciation tridimensionnelle, telles que celles qui reposent sur des corps embryonnaires13. Deuxièmement, cette méthode exploite une avancée récente par laquelle les cellules endoderm définitives (un précurseur précoce des cellules hépatiques) peuvent être générées efficacement et rapidement dans les 2 jours suivant la différenciation hPSC2,7, permettant ainsi la suite production d'hépatocytes avec une pureté accrue. Troisièmement, dans les comparaisons côte à côte, les cellules hépatocytes produites par cette méthode2 produisent plus d'ALBUMIN et expriment des niveaux plus élevés de facteurs et d'enzymes de transcription hépatique comparés aux hépatocytes produits dans d'autres méthodes10, 11,12.
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Protocol
1. Préparation des médias de différenciation
REMARQUE: Consultez le Tableau des matériaux pour obtenir de l'information sur les matériaux et les réactifs utilisés.
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Préparation des supports de base définis chimiquement (MDP)
REMARQUE : Les CDM2, CDM3, CDM4 et CDM5 sont des médias définis chimiquement qui sont utilisés comme supports de base pour différencier les hPSC des cellules hépatiques à divers stades. La composition de ces médias se trouve dans le tableau 1.- Pour faire CDM2 ou CDM3, préparez une solution de stock contenant de l'alcool polyvinyle (PVA). Dissoudre 0,5 g de poudre de PVA dans 50 ml du Moyen dudulbecco modifié d'Iscove (IMDM) pour générer un stock de PVA de 10 mg/mL.
REMARQUE: Étant donné que le PVA ne se dissout pas facilement, préparer le mélange PVA/IMDM dans un flacon conique avec une agitation continue à 50 oC sur un coussin chauffant; l'agitation peut être facilement réalisée à l'aide d'un agitateur magnétique. - Une fois que le PVA est dissous de façon homogène dans imDM, retirez la solution PVA du coussin chauffant et laissez-la refroidir à température ambiante.
- Utilisez un filtre stérile de 0,2 m pour filtrer la solution PVA.
- Préparer le CDM2 et le CDM3 en combinant le PVA filtré à partir de l'étape 1.1.1 et divers composants achetés commercialement tels que décrits dans le tableau 1 et le tableau des matériaux. Utilisez des unités de filtre stériles de 0,2 m pour filtrer tous les supports.
REMARQUE: Le milieu de base peut être stocké à 4 oC, mais pour une durée de plus de 2 mois. - Préparer les autres médias de base CDM4 et CDM5 après le tableau 1.
- Pour faire CDM2 ou CDM3, préparez une solution de stock contenant de l'alcool polyvinyle (PVA). Dissoudre 0,5 g de poudre de PVA dans 50 ml du Moyen dudulbecco modifié d'Iscove (IMDM) pour générer un stock de PVA de 10 mg/mL.
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Préparation des médias de différenciation
- Pour préparer des solutions de stock pour les petites molécules et les facteurs de croissance, reconstituez-les selon les recommandations des fabricants. Pour le stockage, aliquot dans des tubes stériles pour réduire les cycles de gel-dégel et de garder à -20 oC ou comme recommandé.
REMARQUE: La composition du milieu de différenciation à utiliser à différentes étapes de différenciation est décrite dans le tableau 2 et dans les étapes suivantes. - Pour préparer le milieu de différenciation, décongelez d'abord les petites molécules congelées et/ou les facteurs de croissance à température ambiante. Ensuite, aliquot sur la quantité requise de milieu de base. Enfin, préparer le support de différenciation finale en ajoutant les petites molécules spécifiées et les facteurs de croissance au milieu de base aux concentrations appropriées (tableau 2).
REMARQUE: Le milieu de différenciation fraîchement préparé devrait idéalement être utilisé le même jour; sinon, il peut être stocké à 4 oC et utilisé dans les trois jours. - À l'aide d'une pointe de pipette, mélanger le milieu de différenciation plusieurs fois pour s'assurer que les suppléments sont distribués de façon homogène avant d'ajouter le milieu aux cellules (p. ex., ajouter 1 ml de milieu de différenciation à chaque puits d'une plaque de 12 puits).
- Pour préparer des solutions de stock pour les petites molécules et les facteurs de croissance, reconstituez-les selon les recommandations des fabricants. Pour le stockage, aliquot dans des tubes stériles pour réduire les cycles de gel-dégel et de garder à -20 oC ou comme recommandé.
2. Les hPSC de semencesur des plaques aux densités définies pour la différenciation
- Plastiques de culture cellulaire de manteau qui seront employés pour l'ensemencement avec des hPSC.
- Décongeler la matrice (p. ex., Geltrex) à 4 oC pendant la nuit avant le jour de l'utilisation.
- Le lendemain, diluer la matrice 1:100 en ajoutant 500 l de la matrice en 50 ml de froid du moyen de l'aigle modifié (DMEM)/F12 de Dulbecco. Puisque la matrice est un hydrogel qui polymérise de façon irréversible lors de l'exposition à la température ambiante, lorsque vous travaillez avec la matrice, gardez toujours les tubes de matrice et les médias sur la glace.
- REMARQUE: La matrice dissoute 1:100 dans Le DMEM/F12 peut être stockée à 4 oC, mais doit être utilisée dans les 2 mois.
- Pour enrober une plaque de culture de la matrice, pipette la matrice diluée dans le nombre requis de puits en utilisant juste assez de volume de solution de matrice pour couvrir la surface du puits (par exemple, ajouter 0,5 ml de matrice à un puits d'une plaque de 12 puits ou 1 ml à un puits d'un 6- bien plaque). Si nécessaire, secouez doucement la plaque pour vous assurer que la solution de matrice a entièrement recouvert le fond du puits.
- Laisser la plaque recouverte de matrice dans un incubateur de 37 oC pendant au moins 60 min. À cette température, la matrice polymérise pour former une fine pellicule au fond du puits.
- REMARQUE: Les plaques recouvertes de matrice peuvent être conservées dans l'incubateur de 37 oC et utilisées dans les 3 jours tant que la matrice ne s'est pas asséchée.
- Aspirez la solution de matrice restante des puits enduits immédiatement avant l'ensemencement des puits avec des hPSC.
- Passaging et ensemencement des plaques enduites avec hPSCsNOTE: L'agent de dissociation contient des enzymes qui dissocient les cellules et il est important de laisser hPSCs dans l'agent de dissociation pour aussi court d'une période de temps que possible.
- Pour ensemencer les plaques de culture recouvertes de matrice avec des hPSC avant la différenciation, cultivez des hPSC indifférenciés à la confluence de la moyenne mTeSR1 disponible dans le commerce (Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant. Il est essentiel de passer hPSCs avant qu'ils ne deviennent entièrement confluents, comme hPSCs peuvent se différencier spontanément à la confluence élevée.
REMARQUE : Les hPSC doivent être karyotypés pour s'assurer qu'il n'y a pas d'anomalies chromosomiques avant de les utiliser pour des expériences. Les hPSC utilisés pour ce protocole de différenciation ont été maintenus dans les médias mTeSR1 et adoptés comme amas avec EDTA pour minimiser les anomalies karyotypic. Les hPSC karyotypiquement-anormaux ne devraient pas être employés pour la différenciation, car ils peuvent proliférer anormalement rapidement ; ainsi les densités de cellules-ensemencement recommandées ici ne sont pas appropriées pour les cellules karyotypiquement-anormales. - Pour semer les hPSC pour la différenciation, aspirez mTeSR1 de la plaque de cultures hPSC en grande partie confluente et ajoutez l'agent de dissociation acheté commercialement (Tableau des matériaux) pour dissocier les HPSC, en utilisant juste assez d'agent de dissociation pour couvrir la surface de la bien ou plat sur lequel les cellules se développent (p. ex., ajouter 0,5 ml de l'agent de dissociation par puits d'une assiette de 12 puits, 1 ml par puits d'une assiette de 6 puits ou 3 ml par plat de 10 cm).
- Incuber les hPSC dans l'agent de dissociation à 37 oC pendant 5 min ou jusqu'à ce que certaines colonies commencent à se détacher. Appuyez doucement sur le fond du puits/plaque plusieurs fois; après plusieurs minutes de dissociation, la plupart des colonies hPSC devraient librement entrer en suspension.
- Pour déloger les hPSC dissociés de la plaque, ajouter 2 mL/puits de DMEM/F12 si vous travaillez avec une plaque de 6 puits (ou 1 mL/puits si vous travaillez avec une plaque de 12 puits) pour diluer l'agent de dissociation. Utiliser une pipette sérologique de 5 ml pour faire une pipette de haut en bas à plusieurs reprises pour laver toutes les cellules de la surface du puits; recueillir les cellules simples en suspension dans un tube conique de 50 ml. Laver la plaque une deuxième fois avec le même volume de DMEM/F12 pour assurer la récupération de tous les hPSC.
- Pour le tube conique de 50 ml contenant les cellules, ajouter le DMEM/F12 pour diluer le volume d'origine de l'agent de dissociation de 1:5-1:10 (p. ex., si le volume initial de l'agent de dissociation était de 1 mL, ajuster le volume total de la suspension cellulaire à 10 mL avec DMEM/F12 pour diluer l'agent de dissociation à 1:10)
- Centrifuger les hPSC collectés dans un tube conique de 50 ml à 350 x g pendant 3 min à 4 oC à des cellules à granulés.
- En attendant que les cellules pellet, aspirez la matrice de la plaque dans laquelle le hPSCS sera ensemencé. Ensuite, ajoutez des quantités suffisantes de mTesR1 complétées par 1 M de thiazovivine obtenue commercialement (un inhibiteur pharmacologique de ROCK) aux puits récepteurs pour les couvrir (p. ex., ajouter 0,5 mL mTeSR1 par puits d'une plaque de 12 puits ou 1 ml de mTeSR1 par puits d'une plaque de 6 puits).
REMARQUE: Thiazovivin à une faible concentration est inclus à cette étape pour améliorer la survie des cellules individuelles et donc la densité d'ensemencement ultérieure des hPSC. - Après avoir centrifué les hPSC, aspirez soigneusement le supernatant, en laissant les hPSC granulés au fond du tube conique. Le supernatant contient un agent de dissociation qui inhibera l'adhérence subséquente des hPSC et, par conséquent, il est important d'aspirer la grande majorité du supernatant avant de procéder.
- Resuspendre la pastille cellulaire en mTeSR1 complétée par 1 M de thiazovivin. À l'' intenté d'une pipette p1000, trituratez délicatement 2 à 3 fois pour resuspendre uniformément la pastille cellulaire en une seule suspension cellulaire. Ne pas sur-triturate la pastille cellulaire car une force mécanique excessive endommagera les hPSC et entraînera une mauvaise survie cellulaire.
- Après la suspension des hPSC, immédiatement pipette 10 l de la suspension dans un hémocytomètre et compter le nombre de cellules. Il est important de les cellules pipette pour compter aussi rapidement que possible, que la gravité conduira à hPSCs naturellement s'installer dans le fond du tube de 50 ml, ce qui confondra le comptage cellulaire précis.
- Ajuster le volume des hPSC suséifiés avec le mTeSR1 thiazovivin-supplémenté pour atteindre la concentration de cellules désirée pour le placage. Par exemple, après ajustement du volume de hPSC suspendus, ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire par puits pour ensemencer 160 000 à 250 000 cellules dans chaque puits d'une plaque de 12 puits, atteignant ainsi un volume total de 1 ml dans chaque puits (0,5 mL de support a été ajouté au puits à l'étape 2.2.7). Si des puits plus grands ou plus petits sont utilisés, augmenter ou réduire les nombres de cellules à l'échelle en fonction de la hausse ou de la baisse en conséquence.
REMARQUE: Il est important de semer les hPSC à la densité cellulaire indiquée. Les hPSC trop-confluents ne se différencient pas efficacement et les hPSC sous-confluents ne survivront pas bien pendant la différenciation. - Secouez la plaque en un motif de croix (à gauche, puis à droite; vers l'avant, puis vers l'arrière) plusieurs fois pour s'assurer que les cellules sont réparties uniformément sur la plaque/puits. Ne pas faire tourbillonner la plaque dans un mouvement circulaire, car les cellules s'installeront au centre de la plaque /puits. Typiquement, les hPSC commenceront à adhérer à la surface du puits dans un délai de 3 à 30 min. Permettre aux cellules de se développer pendant au moins 24 h avant d'initier la différenciation.
- Pour ensemencer les plaques de culture recouvertes de matrice avec des hPSC avant la différenciation, cultivez des hPSC indifférenciés à la confluence de la moyenne mTeSR1 disponible dans le commerce (Tableau des matériaux) selon le protocole du fabricant. Il est essentiel de passer hPSCs avant qu'ils ne deviennent entièrement confluents, comme hPSCs peuvent se différencier spontanément à la confluence élevée.
3. Différenciation des hPSC dans les cellules endodermales et les progéniteurs de foie
- Après que les HPSC ont été plaqués pendant au moins 24 heures (comme décrit à l'étape 2.2.12), avant de procéder à la différenciation, vérifiez la morphologie des cellules sous un microscope de contraste de phase, en mettant l'accent sur le diamètre et la densité des colonies plaquées de HPSC.
REMARQUE: Idéalement, les amas devraient être facilement espacés et de taille et de densité appropriées dans tout le puits avant l'étape 3.2. Les grandes colonies (environ 400 m) ou les petites colonies (environ 200 m) de HPSC ne sont pas utilisables pour la différenciation (figure 4). Les signaux de différenciation n'agiront pas uniformément dans les grandes colonies de HPSC, ce qui entraînera une différenciation inefficace. Les colonies trop petites ne survivent pas bien pendant les 3 premiers jours de différenciation du HPSC dans ce protocole de différenciation. Si la densité des HPSC ensemencés est correcte, les colonies de hPSC formeront souvent des « ponts » de cellules entre elles et la confluence globale sera de 30 à 50 % avant d'ajouter le milieu de différenciation du jour 1 (figure 4). - Si la taille des colonies est idéale à l'étape 3.1, passez au premier jour de différenciation, ce qui entraîne une différenciation des hPSC en stries primitives antérieures (APS).
- Préparer le milieu de différenciation APS du jour 1 en mélangeant tous les réactifs décrits dans le tableau 2 à l'aide du MDP 2 (tableau 1 et section 1.2) comme milieu de base. Pipet à mélanger plusieurs fois pour assurer une distribution uniforme des composants dans les médias.
- Aspirer pour enlever le mTeSR1 complété par le thiazovivin des hPSCplaqués et laver brièvement les hPSC avec les supports IMDM. Ne pas laver avec du phosphate tamponné saline (PBS) au lieu de L'IMDM, car PBS manque d'ions de calcium (Ca2)et est donc toxique pour les hPSC; il perturbera la morphologie cellulaire.
- Après le bref lavage IMDM, ajouter le jour 1 moyen aux hPSCs. Enregistrez l'heure et placez les cellules dans l'incubateur de 37 oC
- Poursuivre les étapes de différenciation ultérieures en préparant (tableau 2) et en ajoutant le milieu de différenciation respectif aux cellules les jours respectifs (à 24 heures d'intervalle) de différenciation à la même heure de la journée (figure 1). Remplacer par des médias frais tous les jours, même si les jours consécutifs de différenciation utilisent les mêmes supports de différenciation. Entre les changements de médias, lavez les cellules une fois avec des milieuis IMDM pour enlever les cellules mortes et les restes des composants moyens précédents.
- Au fur et à mesure que la différenciation progresse au-delà du stade des bourgeons hépatiques, le nombre de cellules augmente et, par conséquent, ajoute plus de médias à chaque puits de la plaque pour s'assurer que la quantité de facteurs de différenciation et de nutriments n'est pas limitante. Par exemple, ajouter 1 mL de milieu de différenciation à chaque puits de 12-bien initialement les jours 1 à 6 de différenciation, mais ajouter 1,5-2 mL de médias de différenciation ultérieures sur les derniers jours de différenciation (jours 7 à 18 de différenciation).
4. Caractérisation des cellules endodermales et des progéniteurs de foie par Immunostaining
- Préparer le tampon de blocage : sérum d'âne de 10 % et 0,1 % Triton X100 en salin tamponné par phosphate déionisé (DPBS).
- Préparer tampon de coloration: 1% sérum d'âne - 0,1% Triton X100 dans DPBS.
- Aspirer le milieu des cellules dans la plaque de 12 puits.
- Ajouter 4 % de paraformaldéhyde (en DPBS) pendant 15 min à température ambiante pour fixer les cellules, puis laver les cellules deux fois avec dPBS.
- Ajouter le tampon de blocage pendant 1 h à température ambiante pour bloquer et perméabiliser les cellules fixes.
- Aspirez la solution de blocage et ajoutez l'anticorps primaire dilué dans le tampon de coloration. (Voir tableau des matériaux pour les rapports de dilution des anticorps.)
- Tainer les cellules pendant la nuit à 4 oC.
- Laver les cellules trois fois avec 0,1% Triton X100 dans DPBS.
- Ajouter la tache secondaire d'anticorps dans le tampon de coloration pendant 1 h à température ambiante. (Voir tableau des matériaux pour les dilutions d'anticorps secondaires.)
- Retirer l'anticorps secondaire et ajouter le DAPI pendant 5 min à température ambiante pour effectuer une contre-tache nucléaire.
- Laver deux fois avec 0,1% Triton X100 en DPBS pour enlever l'excès d'anticorps et de DAPI.
- Effectuer une microscopie de fluorescence avec un Zeiss Observer D1. Vous pouvez également conserver la plaque à 4 oC jusqu'à ce que l'imagerie soit effectuée. Pour les résultats attendus, voir Figure 3.
5. Caractérisation des progéniteurs de foie par fluorescence activée Cell-triing (FACS) Analyse
REMARQUE: Utilisez LE FACS pour quantifier avec précision le pourcentage de cellules LB différenciées AFPMD qui émergent au jour 6 de la différenciation. Suivez les mêmes étapes pour quantifier le pourcentage d'hépatocytes différenciés ALBMD au jour 18 de la différenciation.
- Conjuguer un anticorps anti-AFP.
- Ajouter r-phycoerythrin à l'anticorps anti-AFP à une concentration de (0,55 g/L) à l'aide d'un kit de conjugaison R-phycoerythrin (voir Tableau des matériaux).
REMARQUE: Assurez-vous que les anticorps sont purifiés et reconstitués dans des tampons qui ne contiennent pas d'amines. Veiller à ce que la quantité d'anticorps utilisée dans une réaction d'étiquetage soit inférieure à la quantité d'EP (c.-à-d. 60 g d'anticorps avec 100 g d'EP). Une mauvaise conjugaison des anticorps peut conduire à des résultats peu fiables. - Ajouter 1 l de réactif modificateur pour 10 l d'anticorps à étiqueter. Mélanger délicatement.
- Retirez le mélange R-PE (100 l) et pipette le mélange ci-dessus directement dans le matériau R-PE lyophilisé.
- Placez le bouchon en arrière et laissez le flacon debout pendant 3 h dans l'obscurité à température ambiante.
- Après l'incubation pendant 3 h ou plus, ajouter 1 l de réactif quencher pour 10 l d'anticorps utilisés. Le conjugué peut être utilisé après 30 min.
- Conserver les anticorps conjugués à 4 oC.
- Laver les hPSC différenciés ou indifférenciés en format 6 puits avec DMEM/F12.
- Traiter brièvement avec un agent de dissociation (1 ml/puits dans une assiette de 6 puits) pendant 5 min à température ambiante jusqu'à ce que les cellules se détachent. Récolte et tache à la fois hPSC indifférencié et différencié cellules progénitrices du foie identique et d'analyser en parallèle dans la même expérience pour assurer la spécificité de la coloration des anticorps.
- Appuyez doucement sur le plat Petri pour détacher les cellules. Utilisez une pipette p1000 pour détacher les cellules de la plaque et recueillir les cellules dans un tube conique de 50 ml. Assurez-vous que les cellules se sont pour la plupart détachées avant de passer à l'étape suivante. Par la suite, lavez les puits deux fois plus à l'abri du tampon 1xDPBS pour recueillir les cellules résiduelles.
- Dans le tube conique de 50 ml, diluer l'agent de dissociation en 5 volumes de tampon DPBS 1x. Triturate rigoureusement 3-4 fois avec une pipette p1000 pour s'assurer que toutes les cellules sont dissociées en cellules simples.
REMARQUE: Il est impératif de générer des cellules uniques avant la centrifugation ou les amas par la suite ne peut pas être dissocié avec facilité. Cependant, ne pas sur-triturate car cela peut endommager l'intégrité cellulaire. Comptez le nombre de cellules et utilisez la proportion recommandée de cellules par rapport aux anticorps, qui a déjà été optimisée pour une détection minimale de fond et de signal maximal. - Tube conique centrifugecontenant contenant la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à 4 oC.
- Aspirez le supernatant avec soin de ne pas déranger la pastille cellulaire.
- Resuspendre soigneusement le granule cellulaire dans un tampon de fixation/perm pour générer une suspension unicellulaire et fixer sur la glace à 4 oC pendant 20 min. Note pour transférer à un tube microcentrifuge de 2 ml. En outre, l'utilisation d'un tube microcentrifuge de 2 ml à cette étape permet au granule de cellules de déposer au coin en forme de V du tube, minimisant la perte cellulaire pendant les lavages.
- Laver chaque granule avec 1,8 ml de tampon de perm/lavage deux fois. Resuspendre la pastille cellulaire à fond dans le tampon de perm/lavage par pipette mélangeant 6 fois avec une pipette p1000. Ensuite, centrifugeuse, retirer le supernatant et répéter le processus de lavage avec 1,8 ml de tampon de perm/lavage.
- Resuspendre le granule cellulaire dans un tampon de perm/lavage de sorte qu'il y aura 100 l/tache individuelle et transférer acquit ensuite la suspension cellulaire dans un tube microcentrifuge de 2 ml.
REMARQUE: Il est impératif de générer une suspension à une seule cellule à cette étape avant la coloration des anticorps. Les agrégats de cellules ne seront pas tachés et confondront ainsi l'analyse FACS. En outre, l'utilisation d'un tube microcentrifuge de 2 ml à cette étape permet au granule de cellules de déposer au coin en forme de V du tube, minimisant la perte cellulaire pendant les lavages. - Après avoir resuspendu les cellules dans le tampon FACS, les aliquot dans des tubes individuels de 2 ml (pour les échantillons de contrôle non tachés et les échantillons tachés d'anticorps).
- Tache avec anti-AFP-PE 0,33 L pour 150 000 cellules pendant 30 min à température ambiante dans l'obscurité. Par exemple, pour une tache individuelle de 100 l, tache comme suit : 0,33 l d'un PE AFP et 100 l de tampon de perm/lavage. Resuspendre les cellules avec p200 pipette bien pour assurer la coloration uniforme.
REMARQUE: Seul pipette-mix et ne vortex que cela peut réduire la stabilité des protéines. - Laver, resuspendre les cellules deux fois en 1-2 ml de tampon de perm/lavage (1,9 ml/tache individuelle) et centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Laver les cellules avec pas moins de 1-2 ml de tampon de perm/lavage pour assurer un lavage suffisant.
REMARQUE: Seul le mélange de pipette s'est mélangé et ne vortex pas car cela peut réduire la stabilité des protéines. Après centrifuging, aspirer le supernatant soigneusement pour empêcher des cellules de déloger et enlever autant de supernatant que possible pour réduire au minimum le report d'anticorps et assurer un lavage plus complet. - Resuspendre chaque granule lavé dans 300 'L de tampon de perm/lavage et le filtrer à travers un filtre de 100 m dans un tube FACS pour filtrer de gros amas de cellules avant l'analyse FACS.
- Analyser les cellules d'une cytométrie de flux FACS Aria sur le canal PE. Analyser un minimum de 10 000 événements pour chaque tache individuelle, et analyser les événements en vertu de l'analyse FSC-A/SSC-A, sélectionner les singlets cellulaires en gating sur FSC-W/FSC-H suivi de SSC-H/SSC-W.
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Representative Results
Après 24 h de différenciation APS, les colonies adopteront généralement une morphologie différente de celle des colonies indifférenciées concomitantes avec une perte de la frontière lumineuse qui circonscrit généralement les colonies de hPSC. Morphologiquement, les cellules primitives de strie ont généralement des frontières déchiquetées et sont plus écartées et moins compactes que hPSCs-ceci est évocateur d'une transition épithéliale-à-mesenchymal pendant que les cellules pluripotentes d'épiblastse différencient et entrent dans le primitif strie in vivo. Si la taille de la colonie des HPSC avant la différenciation était trop grande, il y aura un centre surélevé qui comprend des cellules indifférenciées. Les cultures contenant de si gros amas devraient être jetées, car ces centres de colonies indifférenciés confondront la différenciation ultérieure. Si des amas de la bonne taille et de la densité ont été plaqués, la différenciation APS est très reproductible et uniforme, générant une population de strie primitive mixL1-Gfpde 99,3 à 0,1 % (MIXL1 est un marqueur de strie primitif)7. Notez qu'une certaine mort cellulaire est observée après 24 h de différenciation APS.
Au jour 2 de la différenciation, les cellules stries primitives se sont différenciées en cellules endoderm définitives de jour 2, dont la grande majorité expriment SOX17 (Figure 2) et FOXA2. Dans des dizaines d'expériences indépendantes avec 14 lignes hESC et hiPSC (y compris H1, H7, H9, HES2, HES3, BJC1, BJC3, HUF1C4 et HUF58C4), cette approche a généré de façon évolutive, cohérente et efficace des populations d'endoderm définitifs purs (94,0 % et 3,1 %)7. Cette méthode pour générer l'endoderm définitif des hPSCs donne des pourcentages plus élevés de CXCR4-PDGFRA- populations endodermal par rapport à d'autres approches endoderm-formation2,14.
Au jour 3 de la différenciation, l'endoderm s'est différencié en ancêtres qui apparaissent de forme polygonale (Figure 1). Plus tard, par 6 jours de différenciation, les ancêtres de l'avant-out se différencient en progéniteurs de bourgeons hépatiques exprimant l'AFP, TBX3, et HNF4A (figure 3). Sur trois lignes hESC (H1, H7, H9 hESC), cette méthode génère le jour 6 AFP- progéniteurs de foie forment à une efficacité de 89,0 à 3,1% (Figure 2). Enfin, après 18 jours de différenciation hépatique des hPSC, des cellules de type albumINet hépatocyte apparaissent. Morphologiquement, ils apparaissent épithéliales, formant des bordures lumineuses qui rappellent la bile canaliculi (figure 1). À ce stade, le cytoplasme du jour 18 hépatocytes dérivés de hPSC semble plus sombre que le noyau (Figure 1).
Figure 1 : Schéma de stratégie de différenciation et de morphologie des hPSC indifférenciés, différenciant l'endoderm et les cellules hépatocytes. Le processus de différenciation et la chronologie ont été montrés. Abréviations: d - jour, hPSC - cellules souches pluripotentes humaines, APS - strie primitive antérieure, DE - endoderm définitif, PFG - foregut postérieur, LB - progéniteurs de bourgeons hépatiques, HP - progéniteurs d'hépatocytes, HEP - hépatocytes comme les cellules. Barre d'échelle de 400 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Pourcentage de strie primitive MIXL1MD, jour 2 SOX17MD endoderm définitif (def), jour 6 Des progéniteurs de bourgeons hépatiques de l'AFP et des populations d'hépatocytes ALBMD, comme le montre le FACS. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse immunostaining des progéniteurs hépatiques du jour 6. hPSC ont d'abord été différenciés en progéniteurs de bourgeons hépatiques, qui ont été immunostained pour les facteurs de transcription de bourgeon sliver HNF4A (rouge), TBX3 (vert) aussi bien que le marqueur cytoplasmique de bourgeon de foie AFP (rouge). Les noyaux ont été contrecarrés avec DAPI (bleu) pour évaluer le nombre total de cellules. Barre d'échelle de 50 m. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Densité d'ensemencement cellulaire des HPSC. Faible (gauche) et densité appropriée (au milieu et à droite) des cellules ensemiées. Barre d'échelle de 1 000 m. La flèche indique des « ponts » entre les colonies de cellules. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
| Milieu de base | Composition du milieu de base |
| CDM2 | 1:1 IMDM/F12, 0.1% m/v PVA, 1% lipides concentrés, 0.7 'g/mL insuline recombinante humaine, 15 'g/mL Transferin, 18 nM 1-thioglycerol |
| CDM3 | 1:1 IMDM/F12, 0,1% m/v PVA, 1% lipides concentrés, 10% KOSR |
| CDM4 | 1:1 IMDM/F12, 1% lipides concentrés, 15 'g/mL Transferin |
| CDM5 | CMRL, 10% KOSR, 1% Glutamax |
Tableau 1 : Composition des médias définis chimiquement CDM2, CDM3, CDM4 et CDM5.
| Étapes de différenciation | durée | Facteurs | Doses | Milieu de base |
| Jour 1 Primitive Streak | 1 jour | Activin Activin | 100 ng/mL | |
| CHIR99201 (en) | 3 M | CDM2 | ||
| PI103 (pi103) | 50 nM | |||
| FGF2 (en) | 10 ng/mL | |||
| Jour 2 Endoderm définitif | 1 jour | Activin Activin | 100 ng/mL | |
| DM3189 (en) | 250 nM | CDM2 | ||
| PI103 (pi103) | 50 nM | |||
| Jour 3 Postérieur Foregut | 1 jour | A83-01 | 1 M | |
| TTNPB (en anglais) | 75 nM | CDM3 | ||
| BMP4 (en) | 30 ng/mL | |||
| FGF2 (en) | 10 ng/mL | |||
| Jour 6 Liver Bud progéniteurs | 2 jours | Activin Activin | 10 ng/mL | |
| C59 (en) | 1 M | CDM3 | ||
| BMP4 (en) | 30 ng/mL | |||
| Forskoline | 1 M | |||
| 1 jour | Activin Activin | 10 ng/mL | ||
| CHIR99201 (en) | 1 M | CDM3 | ||
| BMP4 (en) | 30 ng/mL | |||
| Forskoline | 1 M | |||
| Jour 12 Progéniteurs hépatiques | 6 jours | BMP4 (en) | 10 g/mL | |
| Osm | 10 ng/mL | |||
| Dexaméthasone | 10 M | |||
| Forskoline | 10 M | CDM4 | ||
| Ro4929097 Ro4929097 | 2 M | |||
| AA2P (En) | 200 g/mL | |||
| insuline | 10 g/mL | |||
| jour 18 Hépatocytes | 6 jours | Dexaméthasone | 10 M | |
| Forskoline | 10 M | CDM4 ou | ||
| Ro4929097 Ro4929097 | 2 M | CDM5 | ||
| AA2P (En) | 200 g/mL | |||
| insuline | 10 g/mL |
Tableau 2 : Composition des supports de différenciation.
| problème | Raison possible | Solution proposée |
| Les cellules au centre de la colonie ne différencient pas | i) La taille des colonies était excessivement grande, les cellules au milieu de grandes colonies n'étaient pas accessibles aux signaux de différenciation | i) Vérifier le comptage des cellules technqiue. |
| ii) Répartition inégale des amas qui fusionnent au centre du puits (ou de sa périphérie), formant de très grandes colonies | ii) Secouer la plaque de façon croisée pour répartir uniformément les amas pendant le placage, et vérifier sous un microscope avant de la placer dans l'incubateur | |
| iii) Les cellules ont reçu des signaux de différenciation insuffisants | iii) Ajouter des volumes adéquats de supports de différenciation : ajouter 1 ml de milieu par puits dans une assiette de 12 puits et 3 ml par puits dans une assiette de 6 puits | |
| Faible efficacité de la différenciation | i) Démarrage de la culture cellulaire partiellement différenciée | i) Utiliser un nouveau lot de hPSC indifférenciés de haute qualité |
| ii) Les colonies étaient trop densément enseies, formant une feuille de cellules | ii) Les cellules de semence et les cellules de compte avec précision pour la différenciation, et secouent uniformément pour les distribuer | |
| iii) Les médias résiduels et les signaux indésirables n'ont pas été lavés en raison d'un lavage inadéquat | iii) Le mTeSR1 résiduel ou le support d'induction de l'étape précédente de la différenciation bloquera la différenciation ; laver les cellules avec IMDM avant d'ajouter le milieu de différenciation | |
| iv) Le lavage trop dur; des conditions de lavage inappropriées perturberont gravement la morphologie cellulaire | iv) Avant d'ajouter l'un ou l'autre moyen de différenciation, lavez brièvement avec imDM. L'utilisation de DPBS (ou de médias avec une osmolarité ou de médias froids différents) ou d'un lavage prolongé compromettra la morphologie et la viabilité des cellules | |
| v) Période prolongée ou raccourcie des étapes de différenciation, plus longue ou plus courte que celle recommandée. | v) Adhérer aux horaires recommandés pour chaque étape de différenciation. |
Tableau 3 : Problèmes potentiels et causes et solutions possibles.
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Discussion
Cette méthode permet la génération de populations enrichies d'ancêtres de bourgeons hépatiques, puis de cellules semblables à des hépatocytes, à partir de hPSC. La capacité de générer des populations enrichies de cellules hépatiques humaines est importante pour l'utilisation pratique de ces cellules. Les méthodes précédentes pour produire des hépatocytes à partir des hPSCont ont donné des populations impures de cellules contenant des cellules de foie et non-foie qui, sur la transplantation dans des rongeurs, ont produit l'os et le cartilage en plus du tissu de foie15. Par conséquent, la suppression explicite de la différenciation non-foie est essentielle pour générer des populations de foie enrichiquiillées qui pourraient convenir à une variété d'applications.
Notamment, le placage contrôlé des HPSC à la première étape est essentiel pour une différenciation efficace en aval. Il est important de plaquer avec précision les hPSC à une certaine densité pour la différenciation, et de répartir uniformément ces hPSC sur le puits ou la plaque pendant le processus de placage. Par exemple, pour chaque puits d'une plaque de 12 puits, les graines sont de 160 000 à 250 000 HPSC par puits; dans l'ensemble, il est impératif de titrer la densité d'ensemencement cellulaire et, en fin de compte, de tester la densité cellulaire qui convient à chaque lignée cellulaire (Figure 4). Si trop de hPSC sont ensemants par puits, ils formeront de grandes colonies, ce qui aura une incidence négative sur l'efficacité de la différenciation, car les cellules au milieu des grandes colonies sont moins accessibles aux signaux de différenciation par rapport aux cellules proches de la périphérie; colonies de tailles hétérogènes présenteront également des problèmes similaires. Si les densités cellulaires sont trop faibles (p. ex., en dessous de 200 000 cellules/puits d'une plaque de 12 puits), il se peut qu'il n'y ait pas suffisamment de matériel pour la différenciation et que l'on observe une mort cellulaire importante. La méthode de passage et d'ensemencement décrite ci-dessus génère constamment des amas de hPSC de taille appropriée pour la différenciation en aval.
Une limitation de cette méthode est que les cellules hépatocyte-comme générées ne sont pas identiques aux hépatocytes adultes, car les cellules hPSC-dérivées expriment toujours le marqueur de foie immature AFP. En outre, l'activité enzymatique de CYP3A4 est approximativement 55 fois plus basse dans ces cellules hPSC-dérivées d'hépatocyte-comme comparées aux hépatocytes humains adultes primaires. Un défi à venir sera de faire mûrir ces cellules hépatocytes dérivées du hPSC en cellules adultes à part entière. Une deuxième limitation est que la différenciation efficace est extrêmement dépendante de la densité de départ des cellules et, par conséquent, il est très important de semer à la densité recommandée et de les disperser uniformément à travers la plaque (tableau 3).
Dans l'ensemble, ce protocole produit des progéniteurs de bourgeons hépatiques et des cellules hépatocytes à une pureté de 89,0 à 3,1 % dans au moins 3 lignées de hPSC. Deuxièmement, les cellules hépatocyte-comme ont exprimé des enzymes de foie, ont sécrété l'ALBUMIN humain et ont exprimé des niveaux plus élevés de gènes de foie que les cellules produites utilisant des approches existantes de différenciation. Enfin, les cellules hépatocytes résultantes non seulement présentent certaines fonctions d'hépatocyte in vitro, mais surtout elles peuvent fonctionner dans une certaine mesure in vivo, car elles peuvent engraft un modèle de souris des dommages chroniques de foie et améliorer la survie à court terme2 .
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions Bing Lim pour ses discussions et le Stanford Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine pour le soutien de l'infrastructure. Ce travail a été soutenu par le California Institute for Regenerative Medicine (DISC2-10679) et le Stanford-UC Berkeley Siebel Stem Cell Institute (à L.T.A. et K.M.L.) et le Stanford Beckman Center for Molecular and Genetic Medicine ainsi que les Anonymous, Familles Baxter et DiGenova (à K.M.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geltrex | Thermofisher Scientific | A1569601 | |
| 1:1 DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| 0.2 μm pore membrane filter | Millipore | GTTP02500 | |
| mTeSR1 | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Thiazovivin | Tocris Bioscience | 3845 | |
| Accutase | Gibco or Millipore | Gibco A11105, Millipore SCR005 | |
| IMDM, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31980030 | |
| Ham's F-12 Nutrient Mix, GlutaMAX™ Supplement | Thermofisher Scientific | 31765035 | |
| KOSR, Knockout serum replacement | Thermofisher Scientific | 10828028 | |
| Poly(vinyl alcohol) | Sigma-Aldrich | P8136 | |
| Transferrin | Sigma-Aldrich | 10652202001 | |
| Chemically Defined Lipid Concentrate | Thermofisher Scientific | 11905031 | |
| Human Activin | R&D | 338-AC | |
| CHIR99201 | Tocris | 4423 | |
| PI103 | Tocris | 2930/1 | |
| Human FGF2 | R&D | 233-FB | |
| DM3189 | Tocris | 6053/10 | |
| A83-01 | Tocris | 2939/10 | |
| Human BMP4 | R&D | 314-BP | |
| C59 | Tocris | 5148 | |
| TTNPB | Tocris | 0761/10 | |
| Forskolin | Tocris | 1099/10 | |
| Oncostatin M | R&D | 295-OM | |
| Dexamethasone | Tocris | 1126 | |
| Ro4929097 | Selleck Chem | S1575 | |
| AA2P | Cayman chemicals | 16457 | |
| Human recombinant Insulin | Sigma-Aldrich | 11061-68-0 |
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