Summary
이 프로토콜 lysine-티로신-페닐알라닌 (KYF) tripeptide로 안정 된 올레 acids-platinum(II) 공액 nanoemulsion 합성 하는 효율적인 방법을 설명 합니다. 된 KYF는 공액의 자기 조립을 통해 가벼운 합성 조건에서 nanoemulsion 양식.
Abstract
Nanoemulsion 올레 acids-Pt(II) 코어와 리-티로신-페닐알라닌 (KYF) 코팅 (KYF-Pt-네브라스카)를 생산 하는 방법을 설명 합니다. KYF-Pt-NE Pt(II) 10 wt. %에 캡슐화, 107 ± 27 및 부정적인 표면 충전의 직경. KYF-Pt-NE 안정적인 물과 혈 청, 이며 생물학적으로 활성. KYF에 fluorophore의 활용 생물 학적 영상에 적합 한 형광 nanoemulsion의 합성을 허용 한다. nanoemulsion의 합성 수성 환경, 그리고 짧은 KYF 펩타이드와 올레 acids-platinum(II) 공액의 자기 조립을 통해 KYF-Pt-NE 형태에서 수행 됩니다. 자기 집합 프로세스 솔루션의 온도, 기판의 어 금 니 비율 및 기판 추가의 흐름 속도에 따라 다릅니다. 중요 한 단계 등 합성 중 최적의 교 반 속도 유지, 자기 조립, 충분 한 시간을 허용 미리 원심 집중 장치에는 nanoemulsion 점차적으로 집중.
Introduction
최근 몇 년 동안, 나노 약물 전달 및 bioimaging1,2,,34이러한 생물 의학 응용 프로그램에 대 한의 공학에 관심을 증가 되었습니다. 나노 기반 시스템의 많은 자주 통합 한 배합 내의 여러 구성 요소를 필요로 합니다. 종종 지질 또는 고분자에 기반한 빌딩 블록 다 그들의 물리 화학적 특성으로 그들의 생체 적합성 및 biodegradability, 궁극적으로 nanostructure1, 의 기능에 영향을 미칠 수 있습니다 5,6. 단백질 및 펩 티 드, 등 생물학 파생된 자료 오래 그들의 시퀀스 유연성7,8인 다기능 nanostructures의 유망 부품으로 인정 되었습니다. 높은 순서 supramolecular 아키텍처 헬리컬 형성으로 자기 조립 하는 펩 티 드 리본9,10, 섬유 건설 기계11,12, 그리고 더 많은, 따라서 건물에 방법을 포장 하단-최대를 사용 하 여 biomolecule 기반 하이브리드 nanostructures13접근.
의학 및 생명 공학, 특히 항 암 제 치료14 와 심혈 관 질환15 뿐만 서 항생제 개발16,17, 대사에 대 한 응용 프로그램에 대 한 펩 티 드 탐험 되어 장애18, 그리고 감염19. 작은 펩 티 드 치료제 임상 시험20받고 백 이상 있다. 펩 티 드 들 수정 하 고 저렴 한 비용에 합성 빠른 있습니다. 또한, 그들은 생 분해성는 크게 그들의 생물 학적 및 제약 응용 프로그램21,22를 용이 하 게. 구조 부품으로 펩 티 드를 사용 하 여 포함 반응, 펩타이드 기반 나노 입자의 제어 릴리스23,,2425,26 히드로 플랫폼 공학 , 27, 펩타이드 기반 바이오 센서28,,2930,31또는 바이오 전자 장치32,,3334. 중요 한 것은, 페닐알라닌을 포함 하는 2 개 또는 3 개의 아미노 산 성 잔류물을 가진 조차 짧은 펩 티 드 가이드 발견 됐다는 자기 조립35,,3637 를 처리 하 고 안정 된 유화38 만들 .
혼자와 함께 다른 에이전트39,40백 금 기반의 약물, 그들의 높은 효 험 때문 많은 암 치료 regimens에 사용 됩니다. 백 금 화합물 monoadducts 및 intrastrand 또는 interstrand 크로스 링크를 형성 하 여 DNA 손상 유도. Pt-DNA 병 변 세포 기계 장치에 의해 인식 되 고, 복구 하지 세포 apoptosis. Pt(II) 암 세포 죽음에 기여 하는 가장 중요 한 메커니즘은 DNA 전사41,42의 억제. 그러나, 백 금 치료의 혜택은 심각한 부작용을 유발 하는 Pt(II)의 조직의 독성에 의해 점감 된다. Pt(II)43, DNA에 도달 플래티넘의 하위 치료 농도 수시로 귀착되는의 낮은 임상 투약을이 끈다. 결과적으로 DNA 수리 Pt(II) 저항을 취득 하 고 암 세포 생존에 기여 한다. 플래티넘 항 암 치료 저항 항 암 제 치료와 치료 실패44,45의 주요 원인에 중요 한 문제입니다.
우리 조직의 순환에 차폐 효과 제공 하 고 Pt II 유발 부작용을 줄이기 위해 Pt(II) 에이전트를 캡슐화 하는 안정적인 nanosystem를 개발 했습니다. 시스템은 KYF tripeptide nanoemulsion (KYF-Pt-네브라스카)46를 가진 안정 된 올레 acids-Pt(II) 코어를 기반으로 합니다. KYF-Pt-네브라스카, 올레산는 tripeptide의 아미노산의 구성 요소는 식품 및 의약품 안전 청 (FDA) 일반적으로 인정으로 안전 (그 라) 상태. KYF-Pt-NE47nanoprecipitation 메서드 사용 하 여 준비가 되어 있습니다. 즉, 올레 acids-Pt(II) 공액 유기 용 매에 녹아 있는 고 dropwise KYF 용액 (그림 1) 37 ° c.에 추가 솔루션은 KYF-Pt-니의 자기 조립을 허용 몇 시간 동안 흔들 nanoemulsion 10 kDa 원심 집중 장치에 집중 하 고 물으로 세 번 세척. fluorophore와 KYF의 화학 수정 형광 FITC-KYF-Pt-NE의 합성을 바이오 메디컬 이미징에 대 한 적합 한 수 있습니다.
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Protocol
1입니다. 올레산 Acids–Platinum(II) 공액의 합성
- Cisplatin의 활성화
- 60 ° c.에 물 (예를들면, nanopure)의 4 ml cisplatin의 50 밀리 그램 (0.167 mmol)을 일시 중단
- Cisplatin의 솔루션을 물 0.5 ml에서 AgNO3 dropwise 55.2 mg (0.325 mmol)을 추가 하 고 60 ° c.에 적어도 2 시간에 대 한 반응을 저 어 AgCl의 흰색 침전 반응의 진행을 나타내는 형성할 것 이다.
- 10%와 테스트를 수행 하는 경우 활성화 반응 완료를 확인 하려면 솔루션에서 무료+ Ag 이온의 존재에 대 한 HCl. 시험 부정 이어야 한다 (아무 추가 AgCl 침전을 형성 한다).
- 10 분 동안 3,220 x g 에서 반응 혼합물을 원심 고 AgCl의 흰색 침전을 제거 합니다.
- 상쾌한을 수집 하 고 0.2 m m 주사기 필터를 통해 필터링. 플래티넘의 존재에 대 한 상쾌한 SnCl2 결정을 파스퇴르 피 펫을 통해 솔루션의 2-3 방울을 적용 하 여 테스트 합니다. 테스트 경우 백 금 깡통의 좌표 복잡의 색상은 어두운 노란색/주황색 긍정적 이다.
- 두 번째 단계에 대 한 활성화 된 Pt(II)는 상쾌한 사용.
- 활성화 된 Pt(II)와 올레 산의 반응
- 60 ° c.에 물 3 ml에서 올레산 (0.333 mmol)의 94.2 mg을 일시 중단
- 물의 1 mL에서 NaOH의 13.3 mg (0.333 mmol)을 추가 하 고 단계의 1.1 활성화 된 Pt(II)의 솔루션 혼합
- 저 어 2 h 반응 60 ° C에서 그리고 다음 실 온에서 하룻밤. 원유 제품은 기름 갈색/노란색 침전 이다.
- 10 분 동안 3,220 x g 에서 반응 혼합물을 원심 고는 상쾌한을 제거 합니다. 회전 증발 기를 사용 하 여 25 ° C에서 원유 제품 건조. 이기와 여러 세척 하 여 제품을 정화. 순수한 올레 acids–Pt(II) 공액의 마지막 색깔은 옅은 노란색 이다.
2. KYF-Pt-네브라스카의 합성과 FITC 표시 Nanoemulsion FITC-KYF-Pt-NE
- 붙일 레이블된 tripeptide FITC KYF KYF tripeptide의 합성
- KYF 표준 고체 펩 티 드 화학을 사용 하 여 음성 합성. 다음 표준 조건 커플링을 사용 하 여 각 아미노산 연결: 왕 수 지 (2.19 mmol), 보호 Fmoc 아미노산 (4.38 mmol), 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium tetrafluoroborate (TBTU) (4.38 mmol)과 diisopropylethylamine (DIPEA) (8.76 mmol)입니다. Dimethylformamide (DMF)에 TBTU와 아미노산을 분해 및 DIPEA.
- 사용 전에 h 1에 대 한 DMF의 25 mL Fmoc-L-페 4 alkoxybenzyl 알코올 수 지 (0.382 meq/g)의 5.7 g를 담근 다.
- 5 분 동안 20 %piperidine / DMF 용액의 15 mL와 L-페닐알라닌 아미노산의 아민 그룹을 deprotect, 용 매를 삭제 하 고 20 분 주기 세척을 반복 합니다.
- 다음 용 매와 1 분에 대 한 수 지를 세척: DMF, 이소프로필 알코올 (IPA), DMF, IPA, DMF, IPA, DMF, DMF. 각 세척 후 용 매를 버리십시오.
- 수 지에서 무료 NH2 그룹의 존재를 확인 하기 위해 카이 저 테스트 수행 (하위 참조)와 긍정적인 (수 지 씨는 보라색), Fmoc-L-티로신 아미노산을 추가 하 고 결합을 수행 하는 경우 하룻밤.
- 카이 저 별도 병에 테스트 솔루션을 준비 합니다.
- 5 g에 에탄올 100 mL ninhydrin의 분해.
- 80 g에 에탄올 20 mL에 페 놀의 분해.
- 0.001 M와 칼륨 시안 화물의 용액 2 mL를 혼합
pyridine의 98 mL입니다. - 끓는 물에 5 분에서 샘플을 열 솔루션을 테스트 하는 각 카이 저 2-3 방울을 추가 합니다.
- 카이 저 테스트를 수행 하는 두 번째 아미노산의 성공적인 결합, 시 및 부정적인 deprotection 프로토콜 (2.1.3 2.1.5 단계)와 함께 진행 하는 경우. Fmoc 페닐알라닌 아미노산 프로세스를 반복 합니다.
- 각 세척 용 매를 삭제 후 모든 아미노산의 결합, 시의 DMF, IPA, DMF, 메탄올, dichloromethane diethyl 에테르 5 mL와 함께 1 분 동안 수 지를 씻어. 추가 처리를 위해 수 지를 저장 합니다.
- FITC와 펩 티 드를 수정 하려면 다음 단계 (2.1.7-2.1.9)에 대 한 수 지의 절반을 사용 합니다. 수정 되지 않은 KYF tripeptide를 얻으려면 2.1.10에서 시작 하는 절차를 따릅니다.
- 6-azidohexanoic 산 KYF N3 KYF의 N 맨끝 아미노산을 수정 합니다. 이 위해, 믹스 1 g (0.382 mmol) KYF 왕 수 지와 120.1 mg (0.764 mmol)의 6-azidohexanoic 산의 245.2 mg (0.764 mmol) TBTU와 DMF의 30 mL에 DIPEA의 197.1 mg (1.528 mmol)의. 실 온에서 반응 밤새 저 어.
- 클릭 반응을 통해 propargyl fluorescein와 KYF N3 의 합성에서 KYF FITC를 가져옵니다. 이 위해, CuI 고체의 3.78 mg (0.019 mmol), propargyl fluorescein, 71.9 mg (0.193 mmol)와 DIPEA의 2.24 mg (0.017 mmol) 253 mg (0.097 mmol) KYF N3 왕 수 지의 혼합. 반응 갈색 녹색에서 색상을 변경 해야 합니다.
- 24 시간 후 1 분 또는 5 번, 메탄올과 물 몇 번이 고, DMF 및 물 몇 번이 고, DMF와 IPA의 5 mL와 함께 dichloromethane 및 diethyl 에테르에 대 한 수 지를 몇 번이 고 씻어. 각 세척 후 용 매를 버리십시오.
- Trifluoroacetic 산 (TFA) 솔루션 수 지에서 KYF FITC 또는 KYF 펩 티 드를 쪼개 다/triisopropylsilane (팁) /H2O 95/2.5/2.5의 비율에서 3 시간 이상.
- 감기 diethyl 에테르, 차가운 에테르로 세 번 세척 및 진공에서 다음 건조에 원유 펩 티 드를 침전.
- Pt(II) (FITC-KYF-Pt-네브라스카)와 KYF-Pt-NE FITC KYF 안정화 nanoemulsion의 합성
- 소 프로 파 놀의 1.5 ml에서 올레 acids–Pt(II) 공액 및 장소 5 mL 주사기에 10 mg (0.0126 mmol)을 분해.
- 주사기 펌프에 올레 acids–Pt(II) 공액으로 주사기를 놓고 0.1 mL/min로 흐름을 설정 합니다.
- FITC KYF Pt 네브라스카를 합성 하기 위해 FITC KYF KYF의 1 밀리 그램 (0.00219 mmol)의 1mg (0.00105 mmol)을 녹 (FITC의 몰 비율을 1:2-KYF:KYF) 물 20 mL에 37 ° c.에 해결책의 온도 조정 FITC fluorophore의 photobleaching을 피하기 위해 알루미늄 호 일 컨테이너의 벽을 커버. 합성 KYF-Pt-NE, 물 20 mL에 KYF tripeptide의 2mg (0.0044 mmol)을 녹이 고 37 ° c.에 해결책의 온도 조정
- FITC-KYF/KYF 또는 KYF tripeptide의 솔루션에 dropwise 올레 acids–Pt(II) 켤레를 추가 합니다. 후드 아래이 단계를 수행 합니다.
- 유기 용 매를 증발 하 고 실 온에서 하룻밤 솔루션을 저 어는 FITC-KYF-Pt-NE 또는 KYF-Pt-니의 자기 조립
- FITC-KYF-Pt-NE 또는 KYF-Pt-NE 원심 집중 장치에 집중 (10 k MWCO), 및 nanopure 물 4 mL로 세 번 세척.
- 4 ° c.에 KYF-Pt-NE와 FITC-KYF-Pt-NE 수성 솔루션 저장
- 원자 흡수 분 광 법 (AAS), 다음 제조 업체의 가이드48을 사용 하 여 백 금 콘텐츠에 대 한 분석.
- 10 %HCl 솔루션에서 플래티넘 표준 보정 곡선에 대 한 준비 (AAS에 대 한 효과적인 범위는 100 1200 ppb (부품 당 십억) 사이).
- 아쿠아 레 지아 (3:1 집중된 염 산 및 질소 산의 혼합물)의 단계 2.2에서 100 µ L에서 KYF-Pt-NE 솔루션의 50 µ L를 녹이 고 실 온에서 하룻밤 둡니다. 물 1 mL의 최종 샘플 볼륨에 도달 850 µ L를 추가 합니다. AAS를 사용 하 여 샘플을 분석 합니다. 마지막 산 농도 모든 분석된 샘플에서 10% 이어야 한다.
- Ppb에 태평양 표준시 농도의 독서를 기록 하 고 계산 샘플 (샘플 희석 및 nanoemulsion의 초기 볼륨에 대 한 계정)에 최종 플래티넘 콘텐츠.
3. FITC-KYF-Pt-NE의 세포질 통풍 관의 confocal 영상
- 6 난소 암 세포 선 (A2780, CP70, SKOV3, OV90, TOV21G, 및 ES2), 챔버, 당 104 셀 x 4.7의 밀도에 4 잘 챔버 confocal 요리에 씨 하 고 37 ° c.에 하룻밤 문화 사전
- 24 시간 후 셀 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)을 세 번 세척 하 고 세포 배양 매체에서 FITC-KYF-Pt-NE와 품 어 (구체적인 내용을 라인 셀 단계 6.1 참조) 37 ° c.에서 15 분
- 부 화, 이후 미디어를 제거 하 고 3 회 PBS로 세포 세척.
- -20 ° C에서 5 분에 대 한 차가운 메탄올을 가진 세포를 해결 하 고 1 mL의 PBS로 3 회 세척.
- 0.1의 1 mL로 세포를 permeabilize 트리톤 X 세척 실 온에서 10 분 동안 세 번와 %1 mL PBS의.
- 1 시 50 분에서 알 렉 사 Fluor 647 (1 mL)으로 활용 하는 LAMP1 항 체와 90 분에 대 한 셀을 품 어 실 온에서 PBS에 희석. 다음으로, 3 회 PBS로 세포 세척.
- DAPI 재고 솔루션 (1 mg/mL) 1 mg/mL PBS에 희석. 그런 다음, 각 약 실에 희석된 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 실 온에서 15 분 동안 품 어. 3 회 PBS로 세포 세척.
- 설치 매체를 사용 하 여 슬라이드에 coverslips를 탑재 합니다.
- 405의 여기 파장에서 라이브 셀 confocal 현미경을 사용 하 여 셀을 이미지 nm, 488 nm 및 633 nm. 다음과 같이 검색 매개 변수를 설정: 0.2%를 더 이상 1%, 피 놀 리 1 공기 단위, 레이저 전력 이득 마스터 650-750, 디지털 오프셋 0.
- 이미징 소프트웨어에 오픈 이미지입니다. 표시 된 이미지에서 그래픽 을 선택 하 고 삽입 눈금 막대, 이미지에 눈금 막대를 삽입 하려면 선택.
4. 약물 방출 연구
- PBS에서 약물 방출 연구를 실시 합니다. 각각 7.4, 6.8 및 5.0 3 PBS 버퍼의 pH 값을 조정 합니다.
- 적절 한 pH PBS 버퍼의 180 μ에 KYF-Pt-NE의 5 μ를 희석, 3.5 kDa MWCO 미니 투 컵 전송 및 PBS에서 37 ° C에서 품 어.
- 2, 4, 6, 24, 48, 및 140 h에서 각 3 미니 투 석 튜브에서 버퍼를 제거 하 고 AAS에 의해 백 금 농도 측정. 2.2.8 단계에 따라 모든 샘플을 준비 하지만 500 µ L 샘플의 최종 볼륨을 조정할.
5. 세포 배양 방법
- 문화 셀 A2780, CP70, SKOV-3, OV-90, 비 네-21 G, ES-2 세포 배양 매체 (DMEM) 10% (A2780, CP70 SKOV-3, ES-2) 또는 (비 네-21 G, OV-90) 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 보충에 L-글루타민과 페니실린/스 라인. 모든 셀 5% CO2, 37 ° c.에 물 포화 분위기 성장
- 시드 3 x 10 각 96 잘 접시와 체 외 배양 실험에 대 한 사전 문화 하룻밤에5 셀. 준비 물에 KYF-Pt-NE, cisplatin, 및 carboplatin 솔루션. KYF-Pt-네브라스카 carboplatin와 각 셀 라인 cisplatin의 농도 맞게 Pt(II)의 농도 조정 합니다. 37 ° c.에 72 시간 동안 품 어
- 부 화, 후 색도계 분석 결과 (MTT 세포 증식 분석 결과)를 사용 하 여 세포 생존 능력을 평가 합니다. 짧게, 매체를 제거 하 고 각 매체에 MTT 고 2 h 37 ° c.에 대 한 품 어 10%의 110 μ를 추가 그럼 각 음을 100 μ 세제를 추가 하 고 37 ° c.에 5 h에 대 한 품 어
- 570에서 흡 광도 확인 nm 플레이트 리더를 사용 하 여. 부터 Z-테스트 및 P-테스트와 통계 분석을 사용 하 여 결과 분석 합니다.
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Representative Results
KYF-Pt-NE이이 프로토콜을 사용 하 여 준비의 가장 대표 이미지는 그림 2A에 표시 됩니다. KYF-Pt-NEs 형태학, 잘 분산에 구형 하 고 균일 한 크기에 있습니다. KYF-Pt-NEs, 200 측정, 최소 3 편 이미지에서 직접 측정의 핵심 직경 107 ± 27 nm 이다. KYF-Pt-네브라스카, 동적 빛 분광학 (DL)을 사용 하 여 분석의 유체역학 직경 240 발견 되었다 0.156의 증가할수록 인덱스 nm. 제타 잠재력 KYF-Pt-북동 물에서의-60.1의 평균 값과 3 개의 독립적인 종합에 대 한 결정 했다 뮤직 비디오. 잠재력의 높은 크기의 정립, 좋은 콜 로이드 안정성을 나타냅니다 그리고 부정적인 표면 충전은 올레 산의 이온 COO- 표면 그룹. 전자 포인트 KYF 8.59, 이며 따라서 그것은 긍정적으로 중립 pH에 위탁.
세포 막 교차 하는 nanoemulsions의 능력 붙일 레이블된 FITC-KYF-Pt-NE 및 난소 암 세포 선을 사용 하 여 시험 되었다. 결과 그림 2B에서 제공 됩니다. FITC-KYF-Pt-NEs (녹색)는 cytosol에서 배포 하지만 아직 리소좀 (레드)과 관련 된 했다에 명확 하 게 볼 수 있습니다. 이 결과 KYF-Pt-선 세포를 입력 하 고 세포내 마약 배달 차량으로 사용할 수 있습니다 보여 줍니다.
KYF-Pt-NEs와 FITC-KYF-Pt-NEs의 안정성은 DL와 평가 했다. 몇 개월 동안 물에 nanoemulsions의 직경 측정 되었다 고 결과 그림 3에 표시 됩니다. 두 공식의 유체역학 직경 스토리지, 320에에서 4 개월 동안 천천히 증가 (KYF-Pt-네브라스카) 및 240 nm (FITC-KYF-Pt-네브라스카), 하지만 nanoscale 차원 보존 되었다. 이 결과 시간의 오랜 기간 동안 효과적으로 안정화 nanoemulsions을 KYF tripeptide는 나왔다.
Pt(II) 캡슐화 효율과 nanoemulsion에서 릴리스 AAS로 측정 되었다. KYF-Pt-NE Pt(II) 농도 10 wt.% 수 설립 되었다. Pt(II) 출시 KYF-Pt-NE에서 pH에서 7.4 (생리), 6.8 (종양의 interstitium)49및 5.0 (endosomal)50 그림 4A에서 제공 됩니다. Pt(II) 릴리스는 동안 pH 6.8 및 5.0에서 출시의 32.8%와 47.5%, 각각 4 h, 이후에 출시 된 Pt(II)의만 20.8%와 pH 7.4에 느린. 같은 추세가 계속 24 시간 후, 6 일 후. 이 결과 KYF-Pt-네브라스카에서 Pt(II) 방출은 pH 의존, 그리고 조직의 순환에 지연 고은 nanoemulsions 종양으로 이동 되 면 가속 될 수를 나타냅니다.
KYF-Pt-NE의 생물 학적 활동 생체 외에서 이미징 연구에서 같은 난소 암 세포 라인을 사용 하 여 설립 되었다. 셀 IC50 각 셀 라인에 대 한 해당 KYF-Pt-NE 농도에 72 h에 대 한 KYF-Pt-NE와 인 큐베이 팅 했다. 생존 MTT 분석 결과 사용 하 여 평가 했다 그리고 결과 셀만, KYF-NE, 올레산 acids-Pt(II) 공액, carboplatin, cisplatin를 비교 했다. KYF-Pt-NE의 생물 학적 활동의 결과 그림 4B에 표시 됩니다. KYF-Pt-NE A2780 isogenic 세포 선의 생존 능력 (Pt 구분) 및 CP70 (Pt 저항 하는) 44.3%, 46.2%로 각각 감소. Carboplatin, 임상 관련 아날로그 18.5% (A2780)와 9.6% (CP70)만 생존 능력을 감소. 세포의 죽음에 큰 KYF-Pt-NE 효과의 동일한 추세 뿐만 아니라 다른 셀 라인에 걸쳐 관찰 되었다. Pt(II) 중요 한 비 네-21 G 세포의 생존 동안 carboplatin 단지 16.5%에 의해 생존을 낮추는 결과 KYF-Pt-NE를 가진 외피 후 55.9%로 감소 되었다. OV-90 셀 중간 Pt(II) 저항, 생존 55.3% (KYF-Pt-네브라스카), 23.9% (carboplatin)로 낮아졌다. 두 강한 암 세포 선, ES-2 및 SKOV-3, 보였다 감소 생존 45.9%, 54.3%로 각각 KYF-Pt-네브라스카, 10.3% (ES-2) 및 carboplatin의 16.8% (SKOV-3).
Cisplatin 대 KYF-Pt-NE의 생물 활성도 비교 했다. Cisplatin의 독성 프로 파일51인해 병원에서 더 이상 선호 하는 1 세대의 Pt II 기반 에이전트입니다. 두 셀 라인, SKOV 3과 비 네-21 G, 생존 능력 감소가 했다 15%, 40%로 큰 각각 KYF-Pt-NE 보다 위해 cisplatin에 대 한. 나머지 셀 라인에서 KYF-Pt-NE의 활동 cisplatin (A2780, CP70, OV-90), 비교 또는 약간 낮은 (ES-2). 올레산 acids-Pt(II) 공액 생물학적 활성도 발견 되었습니다. 그러나, KYF-Pt-NE Pt(II) 활동에 nanoformulation의 의미를 나타내는 테스트, 셀 라인의 대부분에는 공액 보다 생존에 더 높은 감소를 보여주었다.
Nanoparticulate 시스템의 생물 학적 응용 프로그램에서는 생물학 관련 미디어에 안정성, 따라서 KYF-Pt-NE의 안정성 20% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 평가 되었다 고 결과 그림 4C에 표시 됩니다. 우리 보육의 1 일 후 혈 청에 KYF-Pt-NE opsonization의 증거를 발견.
그림 1입니다. Nanoemulsions (맨 위) 및 nanoemulsion 준비 (아래)의 회로도의 부품. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. KYF-Pt-NE (A)와 난소 암 세포에 의해 FITC KYF Pt-NE (녹색) 이해의 confocal 현미경 이미지의 TEM 이미지 (핵은 파란색와 리소좀은 빨강) (B). 스케일 바 10 μ m입니다. 이 그림 Bioconjugate 화학 2018, 29, 2514-2519 허가 적응 되었습니다. 46 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. 안정성 KYF-Pt-NE와 FITC KYF-Pt-북동 물에서. 각 지점을 나타냅니다 평균 및 표준 편차 p 와 N = 3의 <0.005. 이 그림 Bioconjugate 화학 2018, 29, 2514-2519 허가 적응 되었습니다. 46 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. KYF-Pt-NE 안정성과 생물 학적 활동. (A) Pt(II) 다른 pHs (PBS, 37 ° C)에서 PBS 버퍼에 KYF-Pt-NE에서 출시. KYF-Pt-NE (B)를 가진 72 h 외피 후 다른 난소 암 세포의 세포 생존 능력. 각 열 의미와 N = 3의 표준 편차를 나타내는 및 p <0.005. 농도 일정 각 셀 라인에 있으며 다음과 같습니다: 4.92 m m (A2780), 8.80 m m (CP70) 2.46 m m (브-21 G), 9.84 m m (SKOV3), 7.38 m m (ES-2), 19.7 m m (OV-90). KYF-Pt-NE 및 올레 acids–Pt(II) 공액의 농도 Pt(II) 콘텐츠 AAS에 의해 측정 기준 조정 되었다. 약어: "Carbpt"-carboplatin; "KYF-NE"-KYF tripeptide 코팅 nanoemulsion; "KYF-Pt-NE"-KYF tripeptide 코팅 nanoemulsion 포함 된 Pt(II); Cispt-cisplatin; Pt-올레-올레 acids–Pt(II) 켤레입니다. (C) 혈 청에서 KYF-Pt-NE 안정성. 이 그림 Bioconjugate 화학 2018, 29, 2514-2519 허가 적응 되었습니다. 46 저작권 2018 미국 화학 사회입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
Nanoemulsion 합성에 중요 한 단계는 기판의 어 금 니 비율 조정, 등 올레 acids–Pt(II) 추가 중 온도 흐름 속도 제어를 유지, 자기 조립, 충분 한 시간을 제공 하는 제품을 사용 하 여 정화를 원심 농축 기 열입니다. 이러한 매개 변수는 크기 KYF-Pt-NE;의 형태에 영향 따라서, 특히 적절 한 어 금 니 비율을 유지 하 고 합성 상태를 올바르게 조정 하는 것이 중요 하다.
Nanoemulsion 합성 (3 단계) 동안 기판의 비율 자기 집합 프로세스에 대 한 중요 하 고 제품의 최종 크기를 결정 합니다. KYF 올레 acid-Pt(II) 어 금 니 비율을 1:3 이며 물에 KYF tripepide의 최적 농도 0.2 m m. 또한, 단계 3.1에서에서 올레 acid-Pt(II) 공액을 분해 하는 데 사용 하는 유기 용 매 혼합할 수 있는 물, 여과 시스템 호환 되며 실 온에서 쉽게 증발 하는.
중요 한 단계 중 하나는 KYF 솔루션 (3.4 단계) 올레 acid-Pt(II) 공액의 dropwise 추가 이다. 흐름 수 없습니다 느린 0.1 mL/min 보다 빠르고 하지 0.2 mL/min, 보다 최적의 속도 nanoemulsion의 강 수를 일으킬 수 있기 때문에. 또한, 올레 acids–Pt(II) 공액 600 rpm에서 저 어 접시에 혼합물을 교 반 하면서 37 ° C에서 KYF 솔루션에 추가 되어야 합니다. 일단 올레 acid-Pt(II)의 모든 추가 되었습니다, 솔루션 실내 온도 및 교 반 속도 150 rpm을 감소에 유지 되어야 한다. 3.5 단계 실 온에서 실시 한다. 에 대 한 최적의 시간에 자기 조립을 KYF-Pt-NE (3.5 단계)의 24 시간.
제품은 nanoemulsion 사전 집중 되는 동안 침전 수 있습니다 위험이 있다.입니다. 따라서,는 nanoemulsion 원심 집중 장치에 centrifuged 되 고 전에 추가 물으로 묽 게 되며 2,465 x g보다 더 빠르게 회전 하는 것이 좋습니다. 희석된 nanoemulsions 스핀, 사이 aliquots에서 원심 집중 장치에 추가 되어야 하 고 부분을 추가 하기 전에 nanoemulsion 필터에 혼합 한다.
올레산 이외의 지방산 유도체와 양식 nanoemulsions 수 테스트 되지 않았습니다 그리고 아직 결정 될 것 이다. 미래의 응용 프로그램에는 올레산으로 공동 어셈블리를 촉진 하기 위하여 다른 펩 티 드를 사용 하 여를 포함할 수 있습니다. 또한, 비-백 금 기반의 약물과 올레 산 성 어원이 같은 말은 nanoemulsions의 잠재적인 코어로 사용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 충돌이 있지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 SC2CA206194 부여 국립 암 연구소에서 재정 지원을 인정 합니다. 아니 경쟁 금융 관심 선언 됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluronium tetrafluoroborate (TBTU) |
ANASPEC INC.: | AS-20376 | SPPS |
| 4-well chamber confocal dish | Lab-Tek II, Thermo Fisher Scientific | 154526 | For imaging |
| 6-bromohexanoic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 24477 | Click modification for peptide |
| A2780 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Barnstead Nanopure | Thermo Fisher | D11901 | water filtration system |
| BUCHI rotavapor R-3 | Buchi | Z568090 | For solvent removal and sample drying |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811F | For platinum complex separation |
| Cis-dichlorodiamineplatinum (II) 99% | Acros Organics | 19376-0050 | in vitro tests |
| CP70 | Generously doanted by professor John Martignetti from The Mount Sinai Hospital | Ovarian cancer cell line | |
| Digital water bath | VWR | 97025-134 | For warming up media for cell culture |
| Dynamic Light Scattering (DLS) | Brookhaven Instrument Corporation | For nanoparticle size measurments | |
| ES-2 | ATCC | CRL-1978 | ovarian cancer cell line |
| Fmoc-L-Lys(Boc)-OH 99.79% | Chem-Impex INT’L INC. | 00493 | SPPS |
| Fmoc-L-Phe 4-alkoxybenzyl alcohol resin (0.382 meq/g), | Chem-Impex INT’L INC. | 01914 | SPPS |
| Fmoc-LTyr(tBu)-OH 98% | Alfa Aesar | H59730 | SPPS |
| HERACELL 150i CO2 incubator | Thermo Scientific Fisher | incubator | |
| High pressure syringe pump | New Era | 1010-US | For platinum complex addition in nanoparticle synthesis |
| Hotplate/stirrer | VWR | 12365-382 | For sample stirring and heating |
| LAMP-1 Antibody(cojugated with Alexa Fluor 647) | Santa Cruz Biotechnology | sc-18821 AF647 | For imaging |
| N,N-diisopropylethylamine (DIPEA) | Oakwood Chemical | 005027 | SPPS |
| Ninhydrin 99% | Alfa Aesar | A10409 | Kaiser test |
| Oleic acid | Chem-Impex INT’L INC. | 01421 | For platinum complex synthesis |
| OV90 | ATCC | CRL-11732 | Ovarian cancer cell line |
| PBS | Corning | 21-031-CV | For cell wash |
| Permount mounting medium | Fisher Chemical | SP15-100 | For imaging |
| Phenol | Fisher Chemical | A92500 | Kaiser test |
| Phosphotungstic acid | Fisher Chemical | A248-25 | negative stain for TEM |
| Piperidine 99% | BTC | 219260-2.5L | SPPS |
| Platinum AAS standard soultion | Alfa Aesar | 88086 | 1000ug/ml for calibration curve |
| Propargyl bromide 97% | Alfa Aesar | L10595 | For alkyne modification of fluoresceine |
| Scientific biological cabinet | Thermo Scientific Fisher | 1385 | Bio-hood for cell culture |
| Self-Cleaning Vacuum System | Welch | 2028 | Vacuum pump for rotavapor |
| Silver nitrate | Acros Organics | 19768-0250 | Cisplatin activation |
| SKOV3 | ATCC | HTB-77 | Ovarian cancer cell line |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S313-1 | For platinum complex synthesis |
| Tin (II) chloride | Sigma Aldrich | 208256 | Test for Platinum presence |
| TOV21G | ATCC | CRL-11730 | Ovarian cancer cell line |
| Trifluoroacetic acid 99% (TFA) | Alfa Aesar | L06374 | SPPS |
| Triisopropylsilane (TIPS) | Chem-Impex INT’L INC. | 01966 | SPPS |
| Triton-X | Sigma Aldrich | T8787-100ML | For imaging |
| Uranine powder 40% | Fisher Scientific | S25328A | For alkyne modification of fluoresceine |
| Vivaspin 20 (10000 MWCO) | Sartorious | VS2001 | For Nanoparticle wash and condensation |
| VWR Inverted Microscope | VWR | 89404-462 | For cell culture monitoring |
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